半定量PCR

半定量PCR（精选7篇）

半定量PCR 篇1

RT-PCR是一种常用的具有很高灵敏度和特异性的基因表达检测方法。RT-PCR(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction)是以RNA为模板,在反转录酶的作用下,由人工合成引物介导生成c DNA第一链,以此再作为聚合酶链反应的模板,在Taq DNA聚合酶作用下,扩增产生大量DNA片断。该方法理论上有一个单拷贝c DNA模板即可完成扩增,因此它比较适合作基因表达的定量研究。RT-PCR方法有定量RT-PCR和半定量RT-PCR法,定量PCR法对实验仪器和样本处理的要求较高,而半定量PCR法对试验条件的要求不高,它的主要特点是选择一个比较标准(control),以消除试验误差,样本间用于比较的值不是绝对值,而是相对值,因此称半定量RT-PCR法。本文就半定量RT-PCR的原理、技术、操作步骤和注意事进行综述。

1 提取组织总RNA

1.1 组织材料的获取

一般我们获取的组织材料首先要经过液氮速冻,然后-70℃冰箱保存。需要强调的是,从取材开始就要注意进行无RNA酶操作。在我们获取多个组织材料时,不能将组织材料装入自封袋或塑料袋再放入液氮中冷冻,否则自封袋容易破裂,使得组织掉入液氮。我们的做法是:取组织之前先准备好干净、消过毒的铝箔片,做好标记,取完组织,立即包裹,放入液氮冷冻,然后-70℃冰箱保存。

1.2 组织总RNA的提取

总RNA的提取是RT-PCR反应中关键的第一步,因为RNA提取质量的好坏直接关系到后面c DNA的合成和PCR的扩增。因此所提的总RNA要求纯度高、完整性好并达到一定的浓度。由于m RNA半衰期短,又容易被RNA酶降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能造成污染,因此在全部实验操作过程中我们建议:设立一个专用RNA提取的超净工作台,操作人员一律戴口罩和帽子,使用一次性手套,且要经常更换,原则上是手离开超净工作台就应换一次手套。实验所用的玻璃器皿均在0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中过夜处理,再用蒸馏水冲净,高压灭菌1 h,于干燥烘箱中烘干备用。凡是不能用高温处理的塑料容器等用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。实验所需配置的试剂也要用0.1%的DEPC水处理。注意DEPC是剧毒,有致癌作用,因而使用时需小心。

从组织提取总RNA的方法很多。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,一般按照试剂盒说明书操作,可快速有效地提取到高质量的总RNA。整个提取RNA的过程都必须在低温下或冰上进行。

1.3 总RNA纯度分析

按说明书提取组织总RNA,提取的组织总RNA用30μL的DEPC水溶解即得总RNA提取液。对所提的总RNA必须用紫外分光光度计或者使用核酸测定仪测定总RNA的纯度和浓度,以便在反转录的过程中进行定量。用1%甲醛变性凝胶电泳,EB染色,紫外光下观察RNA,如果能够清楚的看见28S、18S和5S 3条带,而且28S条带的宽度是18S的2倍时,表明RNA的完整性较好。在测定时RNA溶液浓度时,RNA溶液必须充分混匀,其吸光度值OD260/OD280的值在1.8~2.0之间时,说明纯度比较高,可以继续往下做。

2 合成反转录c DNA第一链

由总RNA反转录成c DNA第一链时,所取的总RNA的量必须要一样多,而且应在1μg以上,这样才能保证各组样本总RNA中所需检测m RNA量的差异。因此在进行反转录之前必须对所提取的总RNA浓度进行调整,使所要进行反转录的RNA稀释到同一浓度,然后再进行反转录。

从组织细胞提取的总RNA用反转录试剂盒可以得到c DNA第一链。许多生物公司都有现成的反转录试剂盒。这里强调一点,一个反转录试剂盒可以作很多次反转录,所以可以几个人合起来买,以节省试验经费。

3 优化PCR反应体系

利用RT-PCR对m RNA进行半定量分析,最关键的是优化试验条件,构建最佳的PCR反应体系。下面就从以下几个方面寻求构建PCR扩增的最佳反应体系。

3.1 引物的设计和选择

PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决定的。引物的好坏往往是PCR反应成败的关键。根据目的基因的m RNA序列正确设计引物,除满足引物设计的基本要求外,还应考虑目的基因和内标引物的预期退火温度,二者应尽量相符,引物序列进行比对,二者应无同源性,而且目的基因与内标基因的扩增的条带应相隔一定的距离(最少200 bp以上),以便于观测结果及密度扫描。同时我们也可以借鉴别人设计的引物,或者使用通用引物。

3.2 内标的选择

半定量RT-PCR检测基因m RNA相对表达水平必须要用在各种条件下表达水平稳定、表达量适中的看家基因作内对照。看家基因(housekeeping gene)是维持细胞最低限度功能所不可少的基因,这类基因在所有类型的细胞中都进行表达,这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的,而且在动物体内表达稳定,外界环境变化一般不会改变它的表达水平,所以叫看家基因,也有的叫持家基因或管家基因。

为了客观地比较不同样本中目的基因表达量的多少,消除由于反转录时总RNA浓度差异造成的误差,要选择合适的内标基因。其中最常用的GAPDH,β-actin,18Sr RNA。我们可以根据实际情况的不同,选择不同的内标基因作参照。

3.3 同管扩增或异管扩增的选择

同管扩增是内标基因和目的基因在同一个管内进行扩增。异管扩增是将二者分开来扩。

PCR扩增反应是酶促反应,遵循酶促反应定律。PCR扩增反应最初是以线性递增,即扩增产物呈指数累积,产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR技术正是利用产物与模板的这一线性关系,通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。但是随着酶活性下降和溶液中反应物的消耗,扩增反应会达到一个平台,进入平台期。在平台期继续扩增,低水平表达的目的RNA可能会增加,并与高水平表达的目的RNA浓度相近。因此选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见和定量,也可使扩增反应在到达平台期前的线性范围内进行。

半定量RT-PCR的关键是要保证所有样品的可比性,这就需要内标基因和目的基因进行同管扩增,但是,由于内标基因表达水平太高,常常是目的基因还在线性期,内标基因已经达到平台期,这样在进行同管扩增时,目的基因就会由于内标基因的竞争而受到抑制,从而降低扩增效率。因此有时采用异管扩增。但是,在将内标和目的基因分别扩增时,由于样品RNA及模板c DNA的量难以控制,使半定量RT-PCR测定值可信度降低。这样如何解决上面的问题就成了关键。

首先对循环数按照一定梯度设计好,然后对目的基因和内标进分别进行同管和异管扩增,然后电泳扩增产物,电泳结果经凝胶成像系统扫描分析各电泳条带的光密度值,以目的基因和内标基因的光密度值之比作为目的基因的相对表达量,对相对表达量值取对数,以对数值作为纵坐标,循环数作为横坐标,作出曲线图。然后找出二者的线性区和平台区,最后确定最佳的扩增循环数。

对相对表达量值取对数值是为了降低光密度扫描系统本身的系统差异。对所取的对数值进行统计分析,算出分管扩增时重复PCR扩增带来的批内差异,最终确定误差范围(2倍最大差异)。当两样品之间的差异小于2倍最大差异时,我们认为该差异是由系统造成的,两样品之间差异不显著,可以进行分管扩增。同时与同管扩增时的差异进行比较,若同管扩增的差异超过误差范围,即大于2倍最大差异,就采用异管扩增。

4 凝胶电泳及凝胶成像和定量分析

根据目的基因片段的大小配制适宜浓度的凝胶,将PCR扩增产物与微量溴酚蓝混合,在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶上进行电泳(溴化乙啶是一种诱变剂,操作时必须带专用的手套)。一般跑电泳都用琼脂糖凝胶。边杉等报道通过控制起始模板量,减少PCR循环数使目的基因的扩增处于PCR扩增指数期,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术,通过比较PCR扩增产物量的变化以分析目的基因表达水平的差异[4]。鉴定PCR扩增产物是否与预期的结果一致,一般采用标准Marker比较法,限制酶切图谱法,Southern杂交和核苷酸测序法等,其中最简单也最常用的是标准Marker比较法。选用Marker时,尽量选用含有与扩增产物相对应的条带的Marker。

电泳结束后,在凝胶电泳成像系统下拍照,并用其自带的分析软件对电泳结果进行定量分析,一般测定电泳条带的IOD值(intergrated optical density),目的基因相对表达量为其电泳条带的IOD值与内标基因的电泳条带的IOD值的比值,然后对数据进行统计分析,作出结论。

5 问题和展望

目前已有许多改进的检测方法和技术用于定量分析m RNA表达量,但在研究不同实验条件下特异基因表达水平的差异时,半定量RT-PCR因其费用低、普通实验室容易做到而被经常使用。然而,在将内标基因和特异基分别扩增时,由于样品RNA及模板c DNA的量难以控制,使半定量RT-PCR测定值可信度降低。尽管对试验研究而言,结果必须有好的重复性和精确性,但多数研究的焦点并不是检测转录水平微小的变化或确切的分子数目,而是检测其表达水平变化是否显著。所以半定量RT-PCR法分析m RNA水平相对变化能够满足许多研究的要求。如果将内标和特异基因在同一个管中扩增,只要反应参数选择得当,消除可能产生的引物对间的竞争,半定量RT-PCR完全可以准确地反映基因表达水平的变化。

在基因表达的分析中,m RNA转录的稳态水平是检测组织的基因表达活性的最方便的参数之一。用于基因表达量测定的方法也越来越多,应用范围也越来越广泛。但现有的用于比较个体之间的m RNA表达量的方法均具有不可避免的缺点,因而限制了其进一步的推广使用,而且并没有哪一种技术方法适合于所有研究的问题,最佳的策略是根据所要研究问题的特点,选择不同的方式或创造性的将几种方法结合使用。总之,从取组织样品开始到最后结果的分析,每一步都要严格操作,从而确保RT-PCR半定量检测基因表达水平结果的准确和可靠。

实时荧光定量PCR应用技术综述 篇2

1 实时荧光定量PCR技术的基本原理

实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来, 其基本原理是相同的, 主要不同之处是其定量的体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出, 利用荧光信号积累, 实时监测整个PCR进程, 在PCR循环中, 测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值 (Threshold Cycle) 概念, Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数, 是PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号, 可以用于定义一个样本的C值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线, 然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率, 所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数 (R2>0.99) , 这样才能认为实验的过程和数据是可信的, 使用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量PCR仪都有软件, 可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类

目前, Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种, 也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测, 这些方法有着相近的灵敏感度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子, 如SYBR greenⅠ。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法, 在PCR反应体系中, 加入过量SYBR greenⅠ荧光染料, SYBR greenⅠ荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何ds DNA序列的扩增, 不需要探针的设计, 使检测方法变得简便, 同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何ds DNA结合, 因此它也能与非特异的ds DNA (如引物二聚体) 结合, 使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲 (Melting Curve) 分析的软件加以解决。由于SYBR GreenⅠ对PCR有一定的抑制性, 并且荧光强度较低, 稳定性差。近来试剂公司针对SYBR GreenⅠ存在的缺点开发了一些性能改进的染料, 如SYBR GreenⅠ、SYBR Green ER、Eva Green TM等。荧光定量PCR所用到的探针可分为以下几类:内掺式染料、序列特异性探针、特异性引物、阴阳探针。

2.1 SYBR GreenⅠ染料

反应体系中, 加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。其优点是对模板没有选择性, 使用方便, 非常方便, 但也易与容易与非特异性双链DNA结合, 产生假阳性, 可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件。

2.2 Taqman探针

目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TagMan系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶 (例如Taq酶) 的5'-3'活性所降解, 探针的5'端有一荧光报告基团, 3'端有一荧光淬灭基团, 当两个基团相互先靠近的时候, 由于发生能量传递作用, 报告基团不能发出荧光, 但随着扩增反应的进行, 5'端的报告基团随着探针的水解而脱落下来, 不再与淬灭发生能量传递作用, 从而能发出荧光, 被信号探测器所捕获。针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题, 2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3′端采用了非荧光性的淬灭基因, 吸收报告基团的能量后并不发光, 大大降低了本底信号的干扰。此外, MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽, 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好, 荧光背景更低, 使得信噪比更高。

2.3 Scorpions

它由两个寡核苷酸分子组成, 一个是引物, 另一个是带荧光分子的探针, 但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连, 在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 不发荧光。变性阶段, 探针的发夹结构会解开, 在退火时则与模板相结合, 形成线性分子, 报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上, 要求绝对保守, 长度为25~32bp, Tm在68~70度之间, 探针的5'端不能为G, 避免多个碱基同时出现, 尤其要避免4个G同时出现, 另外, 探针应靠近上游引物。

2.4 分子信标

分子倍标 (Molecular Beacon) 是一种单链DNA形成的发夹结构, 在其一端有一报告基团, 在另一端有一淬灭基团, 当它形成发夹结构时, 由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 两者之间发生荧光信号能量共振转移, 当热循环温度达到分子Beacon的解链温度时, 其构象改变, 与模板结合而完全伸展成线性分子, 使得FRET消失, 报告基团发出荧光信号。荧光基团被激发时, 淬灭作用被解除, 发出激发光子。

3 实时荧光定量PCR技术的实验方法

3.1 RT-PCR

以RNA为起始实验材料。分为两种: (1) 一步法, 反转录反应和PCR反应在同一反应管中进行。操作简单、反应连续、污染几率低, 适合于病原体的检测。 (2) 二步法, 反转录反应和PCR反应分两步进行, 反转录反应液 (cDNA) 作为PCR反应的模板, 适合于mRNA表达量的解析。

3.2 PCR

以DNA材料为起始实验。

4 实时荧光定量PCR技术存在的问题及应用前景

实时荧光定量PCR技术由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点, 是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法, 与传统的PCR技术相比, Real-time Q-PCR的不足之处是 (1) 由于运用了封闭的检测, 减少了扩增后电泳的检测步骤, 因此也就不能监测扩增产物的大小; (2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性, 从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式检测的应用能力; (3) 目前Real-time Q-PCR实验成本比较高, 从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展, 目前Real-time QPCR已成为科研的主要工具, 使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的研究手段, 该技术未来的应用前景是非常广阔的将成为生物定量分析的强有力段。

摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系, 经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度, 其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法, 而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比, 实时定量PCR能够更加快速、灵敏, 并有效地对核酸进行实时定量检测。

浅谈临床定量PCR实验室管理 篇3

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增105~107倍,将检测阈值降至1~10拷贝用于基因表达检测,使低拷贝临床标本的检测成为可能。荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。该技术使PCR实现了从定性到定量的革命性飞跃,具有特异性较强、灵敏度高,简便快速等优点。近年来,PCR技术在临床医学中得以快速应用,特别是在肝炎、结核、艾滋病、性病、SARS等病原微生物诊断以及部分遗传性疾病诊断和癌症的辅助诊断等方面的应用[1,2,3]。

2 临床定量PCR实验室管理

临床定量PCR实验室由卫生部管理,依据国家卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)、《临床基因扩增检验实验室工作规范》(卫检字[2002]8号)、《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(2002-1-14)、《临床基因扩增实验室申请表》及《临床基因扩增实验室验收表》执行。实验室申办程序包括:(1)填写调查表,由省临检中心审核;(2)正式填写申请表,上报卫生部临检中心;(3)评审由卫生部、省专家参加,并报省卫生厅备案;(4)合格单位名单由卫生行政部门在媒体公示。临床定量PCR实验室应具备以下条件:标准的实验室设计设置、专业的技术人员、标准操作程序(SOP)和质量管理文件等。

2.1 实验室设置及人员管理

在实验室设计上,建立单流向、一体化的临床定量PCR实验室是安全准确进行基因扩增检验和保障生物安全的重要措施[4]。其具有理想的布局结构、标准的风向设置、严谨的防护措施、简明洁净的外观、合适的环境条件与参数等。它具体包括建设好“3个实验区”(试剂准备区、标本制备区和PCR扩增区及其各自缓冲区)和“3个系统”(单向气流控制系统、单向物品传送系统、生物安全控制系统)。对于人员管理,首先应制定一系列规章制度。检验人员要严格遵守操作规程,制定日常工作中的质量控制流程,严格执行查对制度和考核制度,具有实事求是的工作作风。检验人员必须满足以下条件:(1)经有资质的单位培训,考试合格取得上岗证后持证上岗。(2)专业主管为本科以上学历和中级以上职称3 a以上工作经历。(3)工作人员须有专业技术职称。(4)培训单位须由省卫生厅指定,经卫生部临检中心认可。

2.2 实验室操作规程的规范化

建立符合当今实验室的管理模式,形成管理文件,包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序(SOP)等。质量手册主要包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员管理、实验室设施环境、仪器设备、生物防护措施、标准操作程序、标本管理、记录、报告、应急处理及实验室的工作制度等。SOP文件是最具体、最具可操作性,也是使用频率最高的文件,其精髓就是使所有与实验室检验质量有关的环节都有章可循,要让每一个操作人员都了解并严格遵照执行管理制度和标准操作程序。此外,所有实验的原始资料均应存档;所有的记录均应规范登记在册;原始登记表应记录试剂来源、批号,质控血清的来源及测定值,并注明是否在控;检验者及审核者应签名。如果实验结果对临床诊断有决定意义,其样本应留存,至少要与病历的保存期一致。规范化的管理和操作保证了实验结果的准确性和可靠性,而且便于各项数据资料的核实。

3 临床定量PCR实验室的质量控制

PCR技术自Mullis创立以来广泛应用于多种疾病检测,但PCR测定不同于一般临床检测,由于其灵敏性很高,即使有极少量DNA污染也会造成假阳性,因此对实验条件要求非常严格。检验者在操作过程中必需牢固树立“无基因观念”,严格操作规程,防止一切可能的污染,包括以前的扩增产物、天然基因组DNA、试剂配置、气溶胶、实验所用的器具等。一旦发生污染,实验即不能进行,而且查找污染源非常困难,因此避免发生污染重在预防,并贯穿于PCR检测的全过程。因此质量控制在PCR检测过程中尤为重要。

3.1 室内质量控制

室内质量控制是指一个实验室内部对所有影响质量的各个环节进行系统控制。目的是控制本试验室常规工作的精密度,提高常规工作前后的一致性。临床PCR实验室应开展所有检验项目的室内质量控制,并做好记录和分析[5]。PCR检测包括标本采集、核酸提取、基因扩增、产物检测等步骤,每个步骤都应有相应的质控措施。其中最关键的是标本采集和核酸提取,按照卫生部临床检验中心《临床基因扩增实验室工作规范》严格执行。室内质控贵在坚持,重在不断总结提高。

3.2 室间质量评价

室间质量评价是实验室质量控制体系中的重要部分,是保证患者检验结果及其报告的准确性和可靠性,以及各实验室间结果可比性的重要手段。卫生部临床检验中心组织的全国性室间质量评价活动现已扩展到细菌、免疫、血液、体液、治疗药物监测、分子诊断等领域。临床PCR实验室应积极参加省、市及卫生部临床检验中心组织的各项活动,如实验室室间质量评价、质量评价总结会议、研讨会和学习班,各医院间相互学习、沟通和交流,不断改进和完善本实验室的质量管理。实事求是地汇报室间质评结果,认真地研究反馈的评价信息。接受卫生部或省临检中心的现场调查,如果1个质评项目连续2次成绩不合格,整改并停止项目收费3个月。及时发现问题,做好失控分析和记录,找出问题所在,采取相应措施,力求实验室结果准确、可靠、及时、可比,更好地服务于临床。

4 小结

随着PCR实验室管理方法的不断完善,新试剂盒的相继推出,实验室设备的改良及实验方法的不断改进,定量PCR技术已经发展成为日益强大和用途广泛的技术。此外,PCR技术不同于常规的检验技术,必须按照PCR实验室的一系列要求开展工作才能保证操作的安全性和结果的可靠性。可以预计,PCR技术将会给临床医学检验方法带来一场巨大的变革,并逐步进入我国卫生机构的各级实验室,更好地为临床某些疾病的早期诊断和治疗提供服务。

参考文献

[1]Khodakov D A,Zakharova N V,Gryadunov D A,et al.An oligonu-cleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1,HBV and HCV[J].Biotechniques,2008,44(2):241-248.

[2]Yu C H,Liu L T,Liu S,et al.Enhanced-real time PCR:a highly sensitive method for SARS-coronavirus detection[J].Beijing Da Xue Xue Bao,2006,38(2):211-213.

[3]Matsenko N U,Rijikova V S,Kovalenko S P.Comparison of SYBR Green I and TaqMan real-time PCR formats for the analysis of her2gene dose in human breast tumors[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(2):240-244.

[4]江其生,金济民,李峰生,等.单流向一体化临床定量PCR实验室的优化设计与设备配置[J].医疗卫生装备,2006,27(9):34-36.

半定量PCR 篇4

关键词：实时荧光定量PCR技术,优点与缺陷,应用情况,研究探讨

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈,与常规PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点,使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

在实时荧光定量PCR技术中,它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是,当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线,所以,依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系,因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。

相比于常规PCR,实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环,模板的初始量可以定量分析。简言之,实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增,正比于产品的对数扩增样品的DNA含量,因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。

2 实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷

2.1 实时荧光定量PCR技术的优势

与传统的PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处,具体如下[2]:

(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究,极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用;

(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度:科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量,检测极限能够实现10 cells/样品[4];

(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量,简便快捷:对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线,通常可以超过7个数量级以上;

(4)实时荧光定量PCR技术安全性高:在样品的定量检测在PCR反应完成后,没有进一步的后续处理,减少了工作量,以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide,EB)等诱变风险的过程。

2.2 实时荧光定量PCR技术的缺陷

实时荧光定量PCR技术是一种高效,灵敏,安全的分子生物学手段,已经成为主流定量核酸的技术之一,但此技术还不是很成熟,在使用过程中还存在一些缺陷,具体如下[1,2,3]:

(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的,这会对实验结果的准确性有一定的影响;

(2)标准曲线制作过程是非常复杂的,目前还没有统一的标准方法,这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性;

(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确,目前的大多数研究是基于平均份数进行评估,其精度是可疑的;

(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术,目前在我国还没有广泛的应用基础;

(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。

2.3 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示,荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S r DNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nir S)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)种类的丰度,说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量,表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量,发现分布相对均匀,泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospira spp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的总量进行了定量监测。

在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol,PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测,研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大,并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析,结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升,系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eae A和rfb E进行实时荧光定量PCR检测,表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数,表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级,腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcy A基因进行了定量的分析,实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。

3 结语

半定量PCR 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

实验标本选自2013年11月1~30日南京医科大学附属淮安第一医院(以下简称“我院”)检验科体检者的肘静脉新鲜EDTA抗凝血2 mL,共40例,其中男19例,女21例,年龄38~79岁,平均(61.46±11.58)岁。本研究获得我院医学伦理委员会审查通过,所有入选者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度

使用富士核酸提取系统提取基因组DNA,操作严格按照说明书进行。微量紫外分光光度计测DNA的浓度与纯度,OD260/280为1.7~1.9为合格,记录DNA的浓度。使用TB缓冲液将待测样本DNA浓度稀释至7 ng/μL,任意选取一样本作为标准品,使用Milli-Q超纯水按1︰2.5的比例将标准品DNA浓度依次等比稀释为45、18、7.2、2.88、1.152 ng/μL,并放于-20℃冰箱保存备用。端粒长度的测定参照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反应使用的引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,序列如下:telg 5′-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3′;telc 5′-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3′;hbgu 5′-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3′;hbgd 5′-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3′。反应体系:SYBR GreenⅠMaster(罗氏公司)7.5μL,样本DNA 5μL(待测样本DNA含量为35 ng,标准品含量依次为225、90、36、14.4、5.76 ng),端粒引物telg、telc终浓度均为500 nmol/L;单拷贝基因引物HBGU、HBGD终浓度均为200 nmol/L。反应在同一块384孔板上进行,标准品和待测样本均设置3复孔,另外设置以相同体积的超纯水作为DNA的阴性对照,亦为3个复孔。使用仪器为Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)。反应条件为Ⅰ:95℃15 min;Ⅱ:94℃15 s,49℃15 s,2个循环;Ⅲ:94℃15 s,62℃10 s,74℃15 s,84℃10 s,85℃15 s,38个循环。反应结束后建立熔解曲线。从Light Cycler480v1.5拷出原始数据,使用软件“Conversion from Light Cycler480 to LinReg PCR”将其转换并导入Lin Reg PCR(v12.15)软件进行分析。

1.2.2 Southern blot测量平均TRF长度

实验前进行琼脂糖凝胶电泳检验待测DNA的完整性,使用罗氏试剂盒Telo TAGGG Telomere Length Assay(罗氏公司)完成平均TRF的测定,琼脂糖、尼龙膜亦购于该公司,实验参照试剂盒提供的步骤进行。具体为:限制性内切酶Hinf I和Rsa I酶切基因组DNA(1.2μg,包括试剂盒提供的对照DNA)2 h,将酶切DNA连同地高辛标记的marker放于0.8%琼脂糖凝胶中以5 V/cm的电压电泳10 cm,使用毛细管转移法将DNA转移至带正电荷尼龙膜上,120℃烘烤30 min,使用试剂盒提供的杂交液42℃预杂交1 h后,用地高辛标记的端粒探针42℃杂交3 h,洗膜后,加入显影底液,并将尼龙膜放入LAS-4000数字成像系统中进行连续曝光,曝光时间15~20 min,选择曝光强度最适宜的一张照片进行TRF长度测定。使用图像处理软件Image J(v1.44p),根据公式TRF=∑(ODi)/∑(ODi/Li)计算平均TRF长度。其中,ODi表示位置i的光密度值,Li表示位置i的marker长度,不同批次的结果根据control DNA进行校正。

1.3 观察指标

①观察PCR产物的熔解曲线、端粒与单拷贝基因的标准曲线;②观察T/S比值的重复性,计算批内变异系数及批间变异系数;③分析T/S比值与平均TRF长度的相关性。

2 结果

2.1 熔解曲线、标准曲线及相对T/S比值的计算

PCR产物的熔解曲线如图1所示,熔解曲线为两个完全分开的双峰,Tm值分别为78℃和91℃,分别为端粒扩增产物和单拷贝基因扩增产物。分别计算各个浓度标准品端粒和单拷贝基因的平均Ct值,并以DNA含量的对数值log[DNA]作横坐标,以Ct值作纵坐标,在Microsoft Excel中绘制端粒和单拷贝基因的标准曲线,得出R2值和公式(图2)。从图中可以看出,端粒和单拷贝基因的标准曲线R2均>0.99,且两条标准曲线几乎平行,说明端粒和单拷贝基因扩增效率相近,提示在225~5.76 ng范围内,使用该标准曲线计算待测样本的端粒长度可靠。将各个待测样本的原始Ct值代入公式,进行幂转换,得到每个待测样本相对于标准品的端粒的纳克数(T)和单拷贝基因的纳克数(S),最后计算3个复孔T/S比值的平均值,即得到每个待测样本相对于标准品的T/S比值。

2.2 T/S比值的重复性检验

计算每个待测样本3个复孔T/S比值的变异系数,然后计算39个样本变异系数的几何均数,得出批内变异系数为2.9%。为了检验该MMQPCR方法的批间重复性,同样的39个样本于第2天进行重复测量,仍为3个复孔,且保证每个样本在384孔板上的位置与前一次不同,以减少位置效应。两次独立实验各个样本T/S均值的相关性见图3,可以发现线性回归线的斜率接近于1,且在Y轴上的截距接近于零。计算两次实验每对样本T/S比值的变异系数,最后求得39对样本变异系数的几何均数,即批间变异系数为3.4%。

2.3 T/S比值与平均TRF长度的相关性分析

计算39个样本DNA的平均T/S比值为1.13±0.21,平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,从图4可以看出两种不同方法测得的结果存在明显相关性(R2=0.6706,P<0.001)。

3 讨论

MMQPCR将端粒和单拷贝基因置于同一个反应管中扩增,利用端粒和单拷贝基因丰度和产物Tm值的差异,使用SYBR Green染料在一个循环中顺序收集端粒荧光信号和单拷贝基因荧光信号。该方法与传统多重PCR不同的是两个目标基因的扩增并不是同时进行。端粒首先扩增并在74℃收集信号,由于端粒的丰度远比单拷贝基因高,此时单拷贝基因的Ct值仍在基线水平以下,因此74℃的Ct值仅代表端粒。温度继续升高到85℃,因为此时端粒产物已完全解链,释放DNA聚合酶用于单拷贝基因的扩增,由于单拷贝基因引物5′端被加了“GC钳”,提高了退火温度,使其在85℃仍能扩增,因此此时收集的荧光仅代表单拷贝基因产物。该方法与之前的PCR方法比较,试剂和模板用量以及时间均减少了一半,更为重要的是消除了模板起始量不同对结果产生的影响,减少了批内误差。

扩增效率是影响定量PCR可靠性的最重要因素[14],由于实时定量PCR通过Ct值来计算模板的起始量,因此所有样本的扩增效率一致显得很重要。端粒的定量PCR利用两个基因的扩增来计算端粒长度,其中任何一个都有可能存在效率误差,因而对效率误差尤为敏感。有文献报道了端粒定量PCR可接受的效率范围为95%~103%[16],但这个范围只是象征性的,如果所有的样本的扩增效率一致,具体的数值并不重要,80%和100%一样可靠,因为导致效率误差的是样本之间扩增效率的差别[15]。另一个与扩增效率有关的问题与标准品有关。端粒定量PCR通过外部标准曲线法计算端粒长度,一般来说应使用任一个待测样本,或多个样本的混合作为标准品。因为在血样本的保存及DNA的提取过程中有很多化学物质可抑制PCR反应,如乙醇、酚、EDTA等[17],而标准品与待测样本来源相同可以控制抑制因子对PCR的影响,从而减少标准品与待测样本之间的效率误差[15]。相反,使用购买的高度纯化的标准品[18]和来自细胞系的标准品[19,20]则不能消除抑制因子的影响。

本实验在罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪上进行端粒与单拷贝基因的扩增,利用LinRegPCR软件进行数据分析,解决了仪器自带软件无法分析数据的问题,从而拓宽了MMQPCR方法测定端粒长度的应用范围。与传统的Southern blot方法比较,MMQPCR方法具有省时、简便的特点,可高通量处理大量样品。

摘要：目的 在罗氏Light Cycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应(MMQPCR)方法测定端粒长度。方法 在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度(相对T/S比值),并与DNA印迹法(Southern blot)测得的平均末端限制性片段(TRF)长度作比较。结果 MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13±0.21,Southern blot方法测量平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,两种方法测定结果的相关性分析R2=0.6706(P<0.001)。结论 本研究建立的MMQPCR方法测定端粒长度重复性好、省时、简便、可靠,可高通量处理大量样品。

半定量PCR 篇6

1 材料与方法

1.1 毒株

鹅细小病毒病毒GPVS1株、鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒, 均为华南农业大学禽病实验室保存。

1.2 主要试剂

SYBR Green Realtime PCR Master MixPlus, 购于广州美津生物技术有限公司;PCR试剂、RNA抽提试剂盒, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.3 GPV-VP基因的扩增和克隆

参考GenBank中鹅细小病毒B株VP基因的核苷酸序列, 根据其保守区域的序列设计特异性引物扩增GPV-VP基因。引物序列:上游引物GPV-VP-PCR-F 5′-TGATTCTGCCCTCCCTTCCA-3′;下游引物GPV-VP-PCR-R 5′-TGATGAACACCGAGTCTTCCTTAC-3′。引物由上海基康生物技术有限公司合成。

1.4 PCR反应

取含GPVS1株的番鸭胚尿囊液经100 ℃水浴10 min, 然后冰浴5 min, 15 000 r/min离心10 min;取上清液作模板进行PCR。反应体系:模板DNA 3 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, GPV-VP-PCR-F (25 pmol/μL) 0.5 μL, GPV-VP-PCR-R (25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 16 μL, 总体积为25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 54 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。按广州瑞真生物技术有限公司的Gel Extraction Kit说明书纯化目的片段, 将该目的片段连接到pMD18-T载体, 重组质粒pMD18-T-VP经PCR与双酶切鉴定后进行测序。RNA病毒 (尿囊液) 的提取按照产品说明书操作。反转录采用20 μL体系:RNA 9.5 μL, 随机引物1 μL, 10×RT Buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, RNA酶抑制剂0.5 μL, AMV反转录酶1 μL, 加灭菌去离子水至20 μL。混匀, 室温下作用10 min, 接着42 ℃水浴1 h, 即为cDNA。

1.5 实时荧光定量PCR试验

1.5.1 引物及PCR条件

以上述重组质粒为模板, 选择保守序列设计荧光定量PCR 特异性引物, 序列为GPV-VPRT-PCR-F 5′-TTCTCCTACCACTCCCGCTACTT-3′;GPV-VPRT-PCR-R 5′- TGGTCTACATTTCCAGCA2GTTTGT-3′。扩增的目的片段是VP基因序列中3 011～3 144 bp的134 bp片段。pMD18-T-VP稀释10倍测定其在波长280 nm的吸光度值, 计算DNA的浓度和拷贝数。然后以标准质粒10倍梯度稀释溶液为模板, 根据SYBR GreenⅠReal-time PCR试剂盒说明, PCR反应中各组分如下:2×SYBRmixL 10 μL, GPV-VPRT-PCR-F (10 μmol/L) 0.4 μL, GPV-VPRT-PCR-R (10 μmol/L) 0.4 μL, ddH2O 6.2 μL, pMD18-T-VP 3 μL, 总体系为20 μL。荧光定量PCR反应程序:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s;60 ℃退火15 s, 72 ℃延伸40 s, 共38个循环。荧光定量PCR反应结束后制作熔解曲线, 反应程序:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 40 s, 95 ℃ 15 s。

1.5.2 特异性检测

用引物GPV-VPRT-PCR-F/R对实验室保存的鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒等进行PCR检测。

1.5.3 灵敏度分析

将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5×102个拷贝/μL, 以各梯度稀释液为模板进行PCR反应。最低起始模板浓度即为该Real-time PCR反应的灵敏度。

2 结果

2.1 pMD18-T-VP重组质粒的构建结果

以病毒DNA为模板进行PCR反应, PCR 产物大小约407 bp。将PCR产物克隆进pMD18-T载体, 经PCR扩增和双酶切鉴定后, 最终测序结果证明重组质粒为阳性。该测序结果与GenBank中公布的GPV核衣壳蛋白基因序列的相似性为98.3% (见图1) 。

2.2 荧光定量PCR 结果

2.2.1 扩增曲线分析

将标准质粒pMD18-T-VP进行10倍梯度稀释后, 选取3.5×104～3.5×107个拷贝/μL的稀释样品作为模板进行PCR反应, 扩增曲线见图2。模板浓度越高, Ct值越小, 即扩增曲线越早进入对数期。阴性对照在36个循环后出现扩增现象, 熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。

2.2.2 标准曲线分析

PCR扩增结束后, 根据起始模板浓度和相应的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数r2 =0.975, 扩增效率E=86.2% (见图3) 。

2.2.3 熔解曲线分析

目的产物熔解温度为88 ℃, 引物二聚体熔解温度为82 ℃。在3.5×102个拷贝/μL的模板浓度下, 虽然也有相同熔解温度产物的产生, 但是其扩增Ct值已经与空白对照很相近, 结果为阴性 (见图4) 。

2.2.4 灵敏度分析

从扩增曲线可见, 当模板浓度为3.5×103个拷贝/μL时, 荧光定量PCR 可以扩增出特异性产物。当模板浓度为3.5×102个拷贝/μL时, PCR反应虽然能扩增出相同熔解温度的条带, 但是其Ct值已经基本与空白对照重合。因此, 该SYBR GreenⅠReal-time PCR 方法检测灵敏度为3.5×103个拷贝/μL。

2.2.5 重复性试验结果

对于不同浓度的模板, 4个平行样品之间的Ct值差异不显著, 表明该方法具有很好的重复性 (见图5) 。

2.2.6 特异性检测结果

针对实验室保存的与鹅细小病毒共感染的其他病毒鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒进行特异性检测。图6为GPV的扩增曲线, 其余模板均为阴性, 即该引物对GPV具有很好的特异性 (见图6) 。

3 讨论

试验建立的针对鹅细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法在病毒3.5×103～3.5×107个拷贝/μL的浓度范围内具有很好的检测效果。荧光定量PCR 技术较其他技术有灵敏度高的显著特点, 因此试验同时要严防污染问题, 即需要实验人员良好的操作技能和实验室的洁净环境。

在临床上, 仅依靠症状和病理变化不能很好地区分鹅细小病毒病和其他鹅病毒病。目前, 用于诊断鹅细小病毒的病毒分离培养和中和试验存在诸多弊端, 例如:达不到快速、准确诊断;依赖操作人员的技术判断误差较大;容易与其他鹅病毒病 (鹅源新城疫、鹅流感) 感染相混淆;更为重要的是不能很好地用于早期临床诊断 (敏感性差) 。而实时荧光定量RT-PCR的敏感性高、特异性强、操作方便, 便于早期临床检测[5], 但也存在技术操作复杂、成本高以及不能很好地现场应用等缺点[6]。本试验建立的鹅细小病毒实时荧光定量PCR检测方法可以结合传统的诊断方法, 为该病的防制提供技术支持, 但该方法与荧光杂交探针实时PCR方法相比, 其检测特异性、灵敏性还有待提高。

参考文献

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半定量PCR 篇7

关键词：乙型肝炎病毒DNA,荧光定量PCR,试剂

乙型肝炎仍然是严重威胁我国公众健康的公共卫生疾病。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法定量检测HBV-DNA对慢性乙型肝炎的诊断、治疗和预后判断具有重要意义[1,2]。目前已有多家国内公司生产HBV DNA定量试剂盒,其中临床应用最广的是深圳匹基生物技术公司、上海科华生物技术公司和广州达安公司生产的试剂。由于扩增目的片段的不同及其技术平台不同,不同试剂的敏感性、特异性、准确率等存在一定差异[3]。本文选用3种最常用的HBV DNA荧光定量PCR试剂盒,对我院随机抽取的一批待测患者血清进行HBV DNA定量检测,以横向比较3种试剂检测结果之间是否存在差异。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机抽取门诊及病房采集的血标本共70例。抽取清晨空腹静脉血3~5 m L于无菌真空管中,离心10 min后分离血清,将血清转入1.5 m L无菌离心管中备用。

1.2 仪器与试剂

本试验所用HBV DNA荧光定量PCR试剂分别购自国内3家公司的试剂A、B、C,批号分别为2009007、20090601和20090401,检测下限分别为1×103拷贝/m L、5.0×102拷贝/m L和5.0×102拷贝/m L。PCR采用美国Applied Biosystem公司生产的ABI 7300基因扩增仪。

1.3 方法

HBV-DNA定量检测:同一份标本采用3种试剂进行平行检测,具体操作和结果判定参照试剂盒说明书进行(3种试剂检测结果不相符者,用原方法重复检测1次,并参考患者乙肝3对定量结果)。

1.4 统计学分析

所有数据用SPSS 13.0统计软件进行分析,采用方差分析。数据采用均数±标准数表示。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 整体扩增效率分析

79例样本经3种试剂扩增后,3种扩增曲线均基线平坦,拐点明显,平台期峰值较一致,曲线间平行度良好,标准曲线r值均大于0.99,符合试剂说明书结果判定要求,结果见图1~3。

2.2 3种试剂HBV DNA定量结果比较

采用3种试剂对79例标本进行检测,检测结果(log10 copies/m L)分别是A(7.34±1.64)、B(7.27±1.67)、C(6.09±1.48)。采用方差分析对3者检测结果进行总体比较,结果F=4.106,P<0.05;组间比较试剂A与C、试剂B与C相比,P<0.05;试剂A与B相比,P>0.05。在102~103之间试剂A无法检测(低于检测下限),而试剂B、C分别能检出4例和2例样本有乙肝病毒复制;在103~108之间试剂A与B检测结果无显著差别,见表1。

注:试剂A、B与试剂C相比,有显著性差异(P<0.05);试剂A与B相比,差异无统计学意义(P>0.05)

2.3 3种试剂阳性率、灵敏度、特异性、符合率结果

试剂A阳性率41.77%(33/79);试剂B阳性率45.57%(36/79);试剂C阳性率41.77%(33/79)。3种试剂结果一致者66例,总符合率83.54%;不相符者13例,其中试剂A阴性者8例,阳性者5例;试剂B阴性者3例,阳性者10例;试剂C阴性者8例,阳性者5例。13例标本乙肝3对定量结果HBs Ag结果均为阳性。试剂A、C的灵敏度均为77.78%,低于试剂B;而特异性高于试剂B,见表2。

3 讨论

乙型肝炎作为我国最为常见的感染性疾病之一,抗病毒治疗是其常用的治疗方法。HBV-DNA定量检测现已广泛应用于临床,可直接反映HBV复制状况,对临床判断患者的传染性及指导用药具有重要参考价值[4]。

实时定量PCR是一种准确度高、重复性好、灵敏度高而且快速检测临床标本HBV-DNA的方法,在所有商业化检测方法中检测范围最宽[5,6,7,8,9,10]。国际上以COBAS Amplicor系统作为检测HBV-DNA的金标准,但试剂昂贵,难以在我国推广使用。目前国内生产的HBV-DNA定量PCR试剂有很多种,但这些试剂在检测灵敏度、检测范围和低拷贝样本的检测精密度等方面参差不齐,且检测方法的敏感度和特异性将决定检测病毒反弹的时间和准确性[5]。为保证检验结果准确可靠,选择一种灵敏度高,检测范围宽、精密度高以及费用低廉的试剂至关重要。

本研究结果显示,试剂A、B、C检测阳性率分别为41.77%(33例)、45.57%(36例)和41.77%(33例)。3种试剂检测结果共有13例样本不符,其原因可能为:(1)厂家引物保守序列设计不同或者是试剂引物设计序列与HBV某些基因型不相匹配所致。(2)乙型肝炎病毒发生变异与某一试剂所设计的引物不匹配。(3)由于试剂质量或操作误差引起。

结果显示,试剂A、B对79例样本的检测结果比较没有显著性差异,但分别与试剂C相比均有显著性差异,表明试剂A、B总体性能优于试剂C。试剂A的灵敏度、特异性及符合率分别为77.78%、88.37%、83.54%,在本院已应用于临床HBV-DNA定量检测数年,临床反映良好,在卫生部临检中心室间质评及宁夏临检中心室间质评活动中均取得满意成绩,且出厂前经国际标准品校正,是一种复合临床要求、适用于临床应用的试剂。试剂B、C在102~103之间分别能检出4例和2例样本有乙肝病毒复制,而试剂A无法检测(低于检测下限),表明在低拷贝样本中存在一定的漏检率,即存在假阴性现象。PCR的假阴性问题涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节,十分复杂,但本研究用3种试剂进行复核可大大降低HBV-DNA的假阴性。

综上所述,试剂A、B具有较好的灵敏度和稳定性、较低廉的价格和简便的操作,总体性能优于试剂C,适于临床使用,试剂C有待校准或改进。对低拷贝标本应结合血清标志物检测和其他检查结果以及临床症状综合判断以排除假阴性的可能。由于试剂盒的质量是影响临床PCR测定的决定性因素之一,因此,为保证检验质量,临床基因扩增实验室必须选择质量好且符合自己实验室要求、与本实验室仪器相匹配的试剂盒应用于临床检测。

参考文献

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