定量PCR

定量PCR（精选10篇）

定量PCR 篇1

聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。该技术被广泛应用于基础研究, 成为分子生物学、鉴别遗传疾病和快速检测病毒和病菌感染必不可少的研究工具。由于传统的PCR技术存在, 不能准确定量, 且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点, 使其应用受到局限。对PCR产物进行准确定量成为PCR技术发展的重要方向。定量PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) 先后出现了多种方法, 目前为止, 其中结果最为可靠的就是实时荧光定量PCR (Rea1 Time Fluorescent Quantitative PCR, Real-time QPCR) 。1996年, 美国Applied Biosystems公司首先推出实时荧光定量PCR技术。该项技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 利用荧光信号来实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板浓度进定量分析。其特点有: (1) 用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量, 进行实时动态连续的荧光监测, 避免终点定量的不准确, 并且消除了标本和产物的污染, 且无复杂的产物后续处理过程。 (2) 荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA, 或荧光探针特异结合目的检测物等方法获得, 大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确。Realtim Q-PCR可以应用于m RNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。

1 实时荧光定量PCR技术的基本原理

实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来, 其基本原理是相同的, 主要不同之处是其定量的体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出, 利用荧光信号积累, 实时监测整个PCR进程, 在PCR循环中, 测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值 (Threshold Cycle) 概念, Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数, 是PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号, 可以用于定义一个样本的C值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线, 然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率, 所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数 (R2>0.99) , 这样才能认为实验的过程和数据是可信的, 使用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量PCR仪都有软件, 可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类

目前, Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种, 也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测, 这些方法有着相近的灵敏感度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子, 如SYBR greenⅠ。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法, 在PCR反应体系中, 加入过量SYBR greenⅠ荧光染料, SYBR greenⅠ荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何ds DNA序列的扩增, 不需要探针的设计, 使检测方法变得简便, 同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何ds DNA结合, 因此它也能与非特异的ds DNA (如引物二聚体) 结合, 使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲 (Melting Curve) 分析的软件加以解决。由于SYBR GreenⅠ对PCR有一定的抑制性, 并且荧光强度较低, 稳定性差。近来试剂公司针对SYBR GreenⅠ存在的缺点开发了一些性能改进的染料, 如SYBR GreenⅠ、SYBR Green ER、Eva Green TM等。荧光定量PCR所用到的探针可分为以下几类:内掺式染料、序列特异性探针、特异性引物、阴阳探针。

2.1 SYBR GreenⅠ染料

反应体系中, 加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。其优点是对模板没有选择性, 使用方便, 非常方便, 但也易与容易与非特异性双链DNA结合, 产生假阳性, 可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件。

2.2 Taqman探针

目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TagMan系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶 (例如Taq酶) 的5'-3'活性所降解, 探针的5'端有一荧光报告基团, 3'端有一荧光淬灭基团, 当两个基团相互先靠近的时候, 由于发生能量传递作用, 报告基团不能发出荧光, 但随着扩增反应的进行, 5'端的报告基团随着探针的水解而脱落下来, 不再与淬灭发生能量传递作用, 从而能发出荧光, 被信号探测器所捕获。针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题, 2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3′端采用了非荧光性的淬灭基因, 吸收报告基团的能量后并不发光, 大大降低了本底信号的干扰。此外, MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽, 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好, 荧光背景更低, 使得信噪比更高。

2.3 Scorpions

它由两个寡核苷酸分子组成, 一个是引物, 另一个是带荧光分子的探针, 但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连, 在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 不发荧光。变性阶段, 探针的发夹结构会解开, 在退火时则与模板相结合, 形成线性分子, 报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上, 要求绝对保守, 长度为25~32bp, Tm在68~70度之间, 探针的5'端不能为G, 避免多个碱基同时出现, 尤其要避免4个G同时出现, 另外, 探针应靠近上游引物。

2.4 分子信标

分子倍标 (Molecular Beacon) 是一种单链DNA形成的发夹结构, 在其一端有一报告基团, 在另一端有一淬灭基团, 当它形成发夹结构时, 由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 两者之间发生荧光信号能量共振转移, 当热循环温度达到分子Beacon的解链温度时, 其构象改变, 与模板结合而完全伸展成线性分子, 使得FRET消失, 报告基团发出荧光信号。荧光基团被激发时, 淬灭作用被解除, 发出激发光子。

3 实时荧光定量PCR技术的实验方法

3.1 RT-PCR

以RNA为起始实验材料。分为两种: (1) 一步法, 反转录反应和PCR反应在同一反应管中进行。操作简单、反应连续、污染几率低, 适合于病原体的检测。 (2) 二步法, 反转录反应和PCR反应分两步进行, 反转录反应液 (cDNA) 作为PCR反应的模板, 适合于mRNA表达量的解析。

3.2 PCR

以DNA材料为起始实验。

4 实时荧光定量PCR技术存在的问题及应用前景

实时荧光定量PCR技术由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点, 是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法, 与传统的PCR技术相比, Real-time Q-PCR的不足之处是 (1) 由于运用了封闭的检测, 减少了扩增后电泳的检测步骤, 因此也就不能监测扩增产物的大小; (2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性, 从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式检测的应用能力; (3) 目前Real-time Q-PCR实验成本比较高, 从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展, 目前Real-time QPCR已成为科研的主要工具, 使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的研究手段, 该技术未来的应用前景是非常广阔的将成为生物定量分析的强有力段。

摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系, 经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度, 其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法, 而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比, 实时定量PCR能够更加快速、灵敏, 并有效地对核酸进行实时定量检测。

关键词：实时荧光定量PCR,荧光染料

定量PCR 篇2

尊敬的校领导：

自我校2012年提出“五大工程”以来，人才队伍实力与水平得到显著提升，同时我们也清醒地认识到现在高校所面临的生存危机，应对危机唯有发展壮大我校的软实力：大力发展特色学科、特色专业；大力开发研究秦巴山区优势生物资源，立足于秦巴山区，服务于全国。然而，我校在科研仪器设备配置方面还有待提高，我学科现需购置实时荧光定量PCR仪，申购理由如下：

高通量的检测和定量核酸序列的实时定量PCR系统，在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。广泛应用于肿瘤的分子诊断，新药筛选，基因表达研究，转基因研究，单核苷酸多态性（SNP）及突变分析，病原体的分子检测，遗传分析等。

关于实时荧光定量PCR仪功能介绍：我校位于秦巴山区，秦巴山区素有“天然药库”之称，有着丰富的生物资源。随着世界科研水平的发展，目前我校的仪器设备已不能满足科研工作的要求。在对秦巴山区优势中药材功能基因的研究中：（1）对功能基因的发育阶段表达、组织表达情况分析；（2）检测功能基因RNAi干扰效率：功能基因的作用研究中，要对功能基因沉默表达（RNAi）分析，检测RNAi的干扰效率要用到实时荧光定量。（3）对功能基因相关基因表达模式分析。

作为一所

院校，拥有一台性能良好的实时荧光定量PCR仪，是学校发展和从业教师的需求。可行新分析：

（1）研究功能基因，实时荧光定量PCR仪是必不可少的仪器设备；（2）实时荧光定量PCR仪操作简单，经过简单培训即可学会；（3）试剂耗材费

（4）应用广泛

科研领域都在用 主要技术指标：

热循环系统

新型半导体

96/384孔

可升级选配低密度芯片 光学系统

氩离子激光器 全波长光栅 冷CCD 扫描模式

全程扫描

软件系统

Primer Express 3.0探针引物设计软件 SDS 软件 绝对定量 相对定量 等位基因分析 阴阳性结果自动判断

反应系统

最低可在35分钟内完成PCR实验

5ul反应体积（选配低密度芯片可至1ul）

配套试剂盒

30万基因表达试剂盒 200万SNP试剂盒 可代客定做引物模板 专业转基因 致病菌筛选试剂盒 主要性能：

全波长光栅分光，添加新染料无需更换滤光片，同时检测8种以上荧光染料，最大限度实现多重定量，SNP分析等应用。

完备，多样，专用的软件，无需人工计算，完成定量实验

多组份荧光校正软件，一体化硬件设计，辅助ROX荧光，保证定量结果的准确性和高分辨率（装机指标，5000和10000达到2倍的拷贝数）

齐备的试剂盒 帮助客户完成高要求的实验

9、可为客户提供安装操作鉴定（IQ/OQ）验证文件服务，以符合GLP/GMP对生产设备的要求。

技术参数：

（1）色荧光，可用于多重PCR检测（2）激发光源寿命

（3）检测器：

成像系统，无时间差，保证结果的准确（4）温度控制系统：半导体控温（5）温度准确性≤±0.05℃（6）温度控制范围：

（7）动力学线性范围：

个数量级，区分

拷贝两倍差异浓度的样本，其致信度高达多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做参比荧光，同时，软件支持无参比染料设置（9）试剂开放，耗材开放，（10）仪器性能有原厂装机试剂盒验证（11）灵敏度：

（12）激发/发射滤光片：是否支持客户自行添加染料。（13）可检测450～750nm连续波长

（14）数据分析：可同时分析

色荧光PCR数据；有无绝对定量、相对定量功能；可否选择多个看家基因进行数据处理；可否自动根据扩增效率对数据进一步处理，得到更加准确可靠的结果；软件支持分析无限制数量的数据文件，增大反应通量；具有等位基因、熔解曲线分析功能；软件支持进行加样重复及生物学重复结果的统计。

定量PCR 篇3

关键词：南美白对虾；肝胰腺；SOD；PO；荧光定量PCR

中图分类号： S945.4+9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0290-02

南美白对虾属甲壳类动物，其免疫主要为非特异性免疫。包括体液免疫中的一些非特异性的酶或因子来进行的[1-2]。抗氧化酶是无脊椎动物机体非特异性免疫的一个重要方面，其中SOD是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系统中起关键作用的酶，不仅具有清除体内自由基的作用，而且在机体免疫调节中具有重要的作用[3-4]。酚氧化酶（PO）是一种含铜的氧化还原酶，能够催化单酚羟化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素。其反应链的短暂中间产物拥有很高的生物毒性，能够抑制病原体胞外蛋白酶以及几丁质酶的活性，属于一种酶级联反应系统，在南美白对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用[5-9]。

目前检测南美白对虾免疫活性因子通常是通过采集血清，采用生化反应方法检测免疫相关酶。由于采集过程及检测过程，酶活性极易受外界环境的影响，常导致检测结果波动性很大，检测的可靠性受影响。酶的产生是通过基因的转录、翻译及后加工形成的，其转录水平也可反映机体的免疫状态。虾肝胰腺是其血细胞产生的主要场所，肝胰腺组织免疫因子的转录表达也可作为评价机体免疫能力的指标之一。荧光定量PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法，能对低丰度mRNA水平进行定量分析[10]。设计特异性强的引物以及合适的反应条件是利用荧光定量PCR检测南美白对虾免疫相关因子的关键。本发明设计的引物及反应条件可同时用于检测南美白对虾肝胰腺SOD和PO的转录相对定量表达检测，为今后准确分析其南美白对虾免疫状态提供新的方法。

1材料与方法

1.1材料

南美白对虾来自浙江省绍兴县某养殖场，SYBGreen反应预混液购自Bio-Rad公司，M-MLV酶、dNTP、RNase抑制剂购自TaKaRa（大连）公司，Trizol购自Invotrigen公司。

1.2肝胰腺总 RNA的提取

取南美白对虾完整肝胰腺组织，加入500 μL Trizol裂解液，用研磨棒研磨，等彻底匀浆后，取50 μL匀浆液加入1 mL Trizol 继续裂解5 min。其余匀浆液置-80 ℃保存备用，或将完整肝胰腺在液氮中速冻后置于于-80 ℃下保存。使用时将组织全部碾磨后，取100 mg加入1 mL Trizol裂解，其余组织粉末置-80 ℃保存备用。

取出的50 μL匀浆液或100 mg组织粉末继续裂解5 min后，12 000 r/min条件下离心2 min，吸取上清至新的离心管。加入200 μL三氯甲烷，涡旋混匀，12 000 r/min条件下离心15 min，吸取上清。加入等体积异丙醇，颠倒混匀数次，静置10 min，12 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清。用500 μL DEPC水配制的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min 条件下离心 5 min，弃去上清。100 μL DEPC水溶解RNA。 测定RNA浓度和纯度后，-80 ℃保存备用。

1.3引物设计与合成

引物是根据GenBank公布的南美白对虾SOD（登录号：AY486424.1）、PO（登录号：JN393011.1）及β-actin内参基因序列（登录号：JF288784.1），由软件Primer Premier 5.0设计和手工修改后获得（表1），均由苏州金维智生物科技有限公司合成。

1.4cDNA合成

取1 μg 总RNA为模板，加入1 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 50 mmol/L Oligo（dT）15，加DEPC水至总体积6.25 μL，65 ℃变性5 min，冰上骤冷2 min。上述反应液加入2 μL 5× M-MLV buffer、0.25 μL RNA酶抑制剂、0.5 μL MMLV逆转录酶、1 μL 10 mmol/L二硫苏糖醇，使最终反应总体积达 10 μL。42 ℃反应1 h后，65 ℃孵育10 min，cDNA合成完毕。表1荧光定量PCR所用引物

检测基因名称引物序列（5′→3′）扩增长度（bp）SOD SOD-F：CGCCCTTGAACCTCACATCT；SOD-R：ATTGCGCTTACGTCATTGGC135POPO-F：AATGACCGCGTTGAGGAGTT；PO-R：AGTGGGATCTTCAGCTTGCC134β-actin（内参）β-actin-F：CGAGCGAGAAATCGTTCGTG；β-actin-R：GAATGAGGGCTGGAACAGGG187

合成的cDNA加入90 μL无菌双蒸水，用于后续荧光定量PCR扩增。1.5荧光定量的反应体系及条件

取5 μL上述合成的cDNA稀释液作为扩增模板，加入2×Sybgreen反应预混液12.5 μL，分别加入5 μmol/L相应特异性上、下游引物各0.5 μL，加6.5 μL无菌双蒸水，使反应总体系达25 μL，置于荧光定量PCR仪上进行PCR反应。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；60～90 ℃熔解曲线。

2结果与分析

2.1荧光定量PCR扩增效果

从扩增曲线可以看出，SOD、PO及内参基因β-actin的扩增曲线均较好，曲线拐点清楚，基线平，无上扬现象；SOD的CT值为23.85，PO的CT值为28.33，能较好地反映各基因的表达差异（图1）。通过CT值计算该样品中SOD和PO表达量相对于β-actin的表达量分别为0.140 63、0.006 30倍。

2.2荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线

从扩增产物的熔解曲线看，SOD、PO及内参基因β-actin均为单峰，且峰值较高（图2），表明各扩增产物的特异性较好，且扩增效率较高。

2.3荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测

将荧光定量PCR的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果显示SOD、PO及内参基因β-actin的各扩增产物的条带单一，亮度较好，并能一定程度上看出各基因的表达差异（图3）。进一步证实了其较好的扩增效率和较高的扩增特异性。

3结论与讨论

非特异性免疫因子的测定是评估南美白对虾免疫状态的主要指标，建立可靠的检测方法对于南美白对虾的免疫学研究、抗病育种研究等都具有重要意义。传统的体液免疫指标的测定常采用酶法检测，但易受多种因素干扰，测定值偏差较大。近几年，随着分子生物学迅猛发展，荧光定量PCR方法开始被广泛应用于多种免疫因子定量检测[11-12]。荧光定量PCR检测方法的可靠性与所设计引物的特异性和扩增有效性密切相关。本方法针对SOD和PO等2个重要的非特异免疫指标设计了特异性较好、扩增效率较高的引物，建立了利用荧光定量PCR方法对南美白对虾肝胰腺SOD、PO的检测方法。该方法特异性强，敏感性高，克服了酶法测定易波动的问题，适合南美白对虾免疫活力的评估。

与酶法检测技术比较，本方法所提供的南美白对虾肝胰腺SOD、PO的荧光定量PCR检测方法具有以下优点：（1）所采用的肝胰腺组织较对虾血液采集更容易。（2）所采集的组织直接用Trizol处理或通过速冻方式保存，可有效减少RNA降解；较血清采集过程可能发生的溶血或其他导致酶失活的因素更易于控制，保证结果的可靠性。（3）设计的引物特异性好，扩增效率高，提高了检测的准确性。（4）采用相对定量方式，通过与内参基因表达量的对比，可同时测定多个免疫相关因子。

参考文献：

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定量PCR 篇4

目前PCV-2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸分子杂交技术等,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想,因此生产实践中需要一种快速、特异、敏感的PCV-2检测技术来准确检测圆环病毒病,并为该病的防治提供事实和理论依据。本试验旨在对比新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室建立的常规PCR和荧光定量PCR检测方法的优缺点,为实验室或者临床中PCV-2的准确、快速检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光定量PCR仪,购自Bio-Rad公司;普通PCR仪,购自Eppendorf公司;琼脂糖,购自Invitrogen公司;PCR试剂盒、DL-2 000 Marker等,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 标准阳性模板

包含PCV-2-ORF2全基因的重组质粒p MD-PCV-2-ORF2,新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室构建保存。

1.3 标准阳性模板的制备

培养含p MD-PCV-2-ORF2的工程菌,提取质粒,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,并计算标准品的拷贝数。将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝数/μL后再倍比稀释成含质粒数量分别为109,108,107,106,105,104,103,102,101,100拷贝数的标准阳性模板,-80℃保存,备用。

1.4 引物设计与合成

1.4.1 荧光定量PCR引物和探针的设计

根据Gen Bank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物和Taq-Man探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成,探针的5'端用FAM标记,3'端用TAMRA标记,扩增目的片段长度为106 bp。具体序列如下。

引物F(上游):5'-CCCTATGTAAACTACTCCT C-3';引物R(下游):5'-GGAAGTAATCAATAGTG-GAAT C-3'。

探针序列:5'-(FAM)ACCATAACCCAGCCCT-TCTCC(TAMRA)-3'。

1.4.2 普通PCR引物和探针的设计

根据GenBank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物,扩增目的片段长度为494 bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列如下。

引物P1(上游):5'-CACGGATATTGTAGTCCT-GGT-3';引物P2(下游):5'-CGCACCTTCG-GATATACTGTC-3'。

1.5 反应条件

1.5.1 荧光定量PCR反应条件

经过反复试验确定出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中Premix Ex Taq 12.5μL,上、下游引物(终浓度为10μmol/L)各0.5μL,探针(终浓度为10μmol/L)0.25μL,模板DNA 2μL,去离子水9.25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,57.4℃退火延伸30 s,40个循环。

1.5.2 普通PCR反应条件

经过反复试验选出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中上游引物P1 1μL,下游引物P2 1μL,10×PCR Buffer(Mg Cl2Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,La Taq(2.5 U/μL)0.25μL,模板DNA 5μL,去离子水11.25μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,54℃退火40 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,置紫外灯下观察。

1.6 临床样品检测

临床送检的158份病料用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 重组质粒浓度的测定

提取的p MD-PCV-2-ORF2质粒,经核酸蛋白分析仪测定其质量浓度为449.9 ng/μL,并计算其拷贝数为9.84×1010拷贝数/μL,OD260/OD280值为1.80,符合纯度要求。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

根据重组质粒浓度测定结果,选择106,105,104,103,102,101拷贝数/μL 6个梯度浓度的质粒为模板,制作标准曲线(见图1)。标准曲线斜率为-3.354,轴截距为35.337,线性方程为Y=-3.354X+35.337,相关系数r为0.999,表明线性关系很好。

2.3 荧光定量PCR敏感性试验

以10倍系列稀释的p MD-PCV-2-ORF2标准质粒(1.0×106~1.0×101拷贝数/μL)为模板进行扩增,1.0×101拷贝数/μL仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为1.0×101拷贝数/μL。荧光曲线见图2。

2.4 普通PCR特异性与敏感性试验

选用101~1010拷贝数/μL 10个梯度浓度的质粒为模板进行扩增,凝胶电泳结果显示:当模板浓度≤1.0×104拷贝数/μL时,无法扩增出特异性目的条带。凝胶电泳检测结果见图3。

2.5 临床样品检测

对临床送检的158份病料用常规PCR法和荧光定量PCR法进行检测,结果见表1。荧光定量PCR法比常规PCR法的检出率高出8.86个百分点,表明荧光定量PCR法更加敏感。

-.PCR阴性对照;M.DL-2 000 Marker;1~10.101~1010拷贝数/μL。

3 讨论

断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年首次在加拿大的SPF猪群中被发现,随后在世界范围内广泛流行,自2001年起,我国的一些猪场也发现了PMWS[3]。PMWS主要侵害6~12周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及黄疸,造成病猪免疫机能下降、生产性能降低。现已证明PCV-2是导致PMWS的主要病原,特别是在有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)存在的情况下,该病的阳性率更高[4],是当前严重危害我国养猪业的重要疫病之一。

圆环病毒病的确诊需要进行病毒分离,PCV-2在细胞上不产生细胞病变,且需将PCV-2盲传多代后才能使病毒有效增值,有时连续传代会导致病毒抗原性的改变,因此病毒的分离费力耗时,不适合快速诊断。国内外已有多种诊断试剂盒,如ELISA、IFA等,但其非特异性较高,且价格昂贵。常规PCR方法可以快速、敏感、特异地定性检测PCV-2,具有简单、易操作、设备价格较低、人员素质要求不高的优点,但也存在非特异性扩增造成的假阳性结果需要PCR后处理的缺点。荧光定量PCR可以对样品中的病毒含量进行准确的定量检测,具有结果直观、灵敏度高、特异性强的优点[5],同时也存在设备及试剂价格较高、对人员的素质要求较高、在基层推广性低的缺点。

参考文献

[1]ALLAN G M,mc NEILLY F,KENNEDY S,et al.Isolation of porcine circovirus 2 like viruses frompigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

[2]李海超,王娟,黄秀梅,等.猪圆环病毒2型免疫应答机制研究进展[J].动物医学进展,2014,35(2):105-109.

[3]吕艳丽,杨汉春,郭鑫.用PCR方法检测猪圆环病毒Ⅱ型[J].中国兽医学报,2002,22(6):552-554.

[4]张治涛,李玉峰,姜平,等.猪圆环病毒2型感染的检测与流行病学调查[J].中国兽医学报,2008,28(3):227-231.

定量PCR 篇5

二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反响)

在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步调，在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA 按 2 n 方法呈指数形式扩增。

PCR 一次循环的具体反响步调为：

A.变性：加热反响系统至 95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。

B.退火：逐渐低落溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板 Tm 值的 5℃左右），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反响温度升至中温 72℃，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒 DNA 的提取与制备(1).碱裂解法：

染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差别：

A.高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性；

B.当以高盐缓冲液调治其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并生存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的卵白质和多糖等物质； B.通已往卵白液和漂洗液将杂质和其它细菌身分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。

3.质粒 DNA 的定量阐发（紫外分光光度法）：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.种种差别的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 卵白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反响 DNA 的纯度； A260/A280=1.8

DNA 纯净 A260/A280<1.8

体现样品中含卵白质（芳香族）或酚类物质

A260/A280>1.8

含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。

4.质粒 DNA 的酶切判定：

限制性内切酶是 DNA 重组操纵历程中所使用的根本东西。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其四周的特异位点结合，并在结合位点切割双链 DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的巨细决定于琼脂糖的浓度。

DNA 分子在碱性情况中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：差别的 DNA，分子量巨细及构型差别，电泳时的泳动率就差别，从而分出差别的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比干系).三、质料与要领：

：

（一）实验质料：

：

1.PCR 仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 质料：菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光卵白 GFP)】、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2.质粒 DNA 的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管 质料：溶液 P1（S1）、溶液 P2(S2）、溶液 P3（S3）、去卵白液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH5α 3.质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）

仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 质料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ 4.质粒 DNA 的酶切判定 仪器：1.5ml 的 EP 管、微量加样枪 质料：无菌水、10×M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳

仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 质料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液（二）实验要领

1..PCR..质粒 DNA 的提取与制备

准备目的 DNA：菌液煮沸 10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液 取 0.2 ml PCR 反响管一只，用微量加样枪按下述顺序分别参加：灭菌去离子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物 1(10 mol/L)1μl、引物 2(10 mol/L)1μl、菌液 5μl 将装有 PCR 反响体系的 PCR 反响管放入 PCR 仪上进行如下操纵：

①94℃预变性5分钟后开始以下循环 ②循环为94℃——30 秒，50℃——30 秒，72℃ ——1 分钟。循环为 30 次 ③72℃ 5 分钟 ④4 ℃

保温 取 1.5ml 培养物参加 Eppendorf 管中 将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中

13000rpm x 1min，弃上清

将 PCR 反响管置台式离心机中瞬时离心

3.质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法）

参加 250μl 溶液 S1，吹打，使细菌沉淀疏散，彻底悬浮

参加 250μl 溶液 S2，颠倒 4～6 次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮

参加 350μl 溶液 S3，立即温和混匀 6~8 次。13000rpm 离心 10min，小心取上清液（500-800μl）

将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm 离心 3min，弃滤液

参加 500μl 去卵白液(W1)，13000rpm 离心 1min，弃滤液

向吸附柱中参加 700μl 漂洗液 W2，13000rpm 离心 1min，弃滤液；重复一遍 空柱 13000rpm 离心 1min，然后室温安排 3min，使残留乙醇挥发 取出吸附柱，放入一个洁净的离心管中，在吸附膜的中间加 50μl 洗脱缓冲液(Eluent)，室温安排 1min，13000rpm 离心 1min 洗脱质粒 DNA，-20℃生存备用 清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿参加适量的蒸馏水刷洗，2~3 次。并用滤纸擦拭洁净 空白比较比色测定 向比色皿参加 98ul 蒸馏水，进行 Blank 调零 再向比色皿参加 2ul 的质粒 DNA，于紫外分光光度计上进行‘sample’测定，记录相关数据

4..质粒 DNA 的酶切判定

5.琼脂糖凝胶电泳

四、结果与讨论 ：

（一）实验现象 1.参加溶液 P1，出现悬表现象； 2.参加溶液 P2,温和混匀，溶液会变得清亮； 在一个洁净的 1.5mlEP 管中按顺序依次参加下述试剂

无菌水 9.0μl、10×M 酶切缓冲液 2.0μl、质粒 DNA 7.0μl、Hind III(15U/ul)1.0μl、EcoR I(12U/ul)

1.0μl 小心混匀试剂，将 EP 管置于恒温水浴箱中 37℃1.5 小时。

取质粒 DNA、经酶切反响后的 DNA 片段和 PCR扩增的 DNA 各 6μl 于三个 EP 管中并做好标记 往每个 EP 管中参加 1μlGelview 染料，室温安排一分钟 用微量加样枪分别各吸取 10ul，按序号参加到电泳仪的凝胶孔中 电泳 30 分钟

取出凝胶 紫外光下视察，拍照

3.参加溶液 P3,有白色絮状沉淀生成； 4.电泳时，可视察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度差别。

在紫外检测仪条件下，可以视察到差别的物质出现差别的电泳带。

（二）实验结果

原始实验数据 丈量次数

质粒 DNA 浓度（ug/ml）

Ratio 比值(A260/A280)

148

1.46

1.52

115

1.45平均值

123

1.47

电泳后的图片

A:PCR 目的条带

B:酶切片段

C:质粒 DNA

（四）实验阐发 1.由上数据可知，Ratio=1.47

A260/A280<1.8

表明样品中含有较多的卵白质（芳香族）

2.在图片中，其他三类 DNA 与 Maker 相比力，可知质粒 DNA 的分子巨细在 2500bp-3500bp，酶切反响的质粒 DNA 片段分子巨细在 2800-3000bp 和 400-500 左右，PCR 的 DNA 分子巨细在 400-500bp。根本切合预期。

（四）实验讨论 1.质粒 DNA 中出现三条带，分别对应超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒 DNA。这三种差别构型的分子有差别的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型 DNA、线性分子、开环状分子。, 2.对付实验结果中：A260/A280<1.8 的可能原因为：

A.在质粒 DNA 的提取实验的“取上清液”步调中吸入沉淀导致引入较多的卵白杂质，进而导致后续实验中因卵白质量较多而难以去除。

B.可能为试剂污染引起杂质卵白的引入。

3.实验中需注意的事项：

用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不消换吸头，每次换差别试剂时要记得换一个新吸头。

在 PCR 中，如果配好的反响液较多沾到管壁上，要将 PCR 反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液会合于管底，然后才将反响管放到基因扩增仪上。

在质粒 DNA 提取的实验中，参加溶液 S2 时，时间不能太久，行动要温柔，轻轻颠倒频频。

在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。

在电泳中，Geldview 有毒，切勿用手打仗。

思考题：

（1）碱裂解法提取质粒时，溶液 I、II、III 的作用分别为？ 答：

溶液 I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA 的降解作用；有利于溶酶体的作用。

溶液 II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和卵白质变性。

溶液 III：酸性条件下质粒 DNA 复性，变性卵白-SDS+线性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。

（2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反响效率？ 答：

①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。

②酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能凌驾反响体系的 1/10 体积，并且最大反响体系最好不要小于 20 ul，且酶切反响中甘油浓度应低于 5%。

③底物 DNA 的纯度：主要污染 DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反响应尽量纯化底物。

定量PCR 篇6

关键词：实时荧光定量PCR技术,优点与缺陷,应用情况,研究探讨

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈,与常规PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点,使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

在实时荧光定量PCR技术中,它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是,当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线,所以,依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系,因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。

相比于常规PCR,实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环,模板的初始量可以定量分析。简言之,实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增,正比于产品的对数扩增样品的DNA含量,因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。

2 实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷

2.1 实时荧光定量PCR技术的优势

与传统的PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处,具体如下[2]:

(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究,极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用;

(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度:科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量,检测极限能够实现10 cells/样品[4];

(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量,简便快捷:对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线,通常可以超过7个数量级以上;

(4)实时荧光定量PCR技术安全性高:在样品的定量检测在PCR反应完成后,没有进一步的后续处理,减少了工作量,以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide,EB)等诱变风险的过程。

2.2 实时荧光定量PCR技术的缺陷

实时荧光定量PCR技术是一种高效,灵敏,安全的分子生物学手段,已经成为主流定量核酸的技术之一,但此技术还不是很成熟,在使用过程中还存在一些缺陷,具体如下[1,2,3]:

(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的,这会对实验结果的准确性有一定的影响;

(2)标准曲线制作过程是非常复杂的,目前还没有统一的标准方法,这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性;

(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确,目前的大多数研究是基于平均份数进行评估,其精度是可疑的;

(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术,目前在我国还没有广泛的应用基础;

(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。

2.3 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示,荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S r DNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nir S)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)种类的丰度,说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量,表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量,发现分布相对均匀,泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospira spp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的总量进行了定量监测。

在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol,PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测,研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大,并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析,结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升,系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eae A和rfb E进行实时荧光定量PCR检测,表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数,表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级,腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcy A基因进行了定量的分析,实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。

3 结语

定量PCR 篇7

该病的主要临床症状是精神沉郁,食欲废绝;行为上无方向感的游泳,甚至停止游泳;皮肤上出现苍白的块斑和水泡;鳍、鳞片、口腔、腹部出血或充血;患病鱼出现症状后1~2 d内死亡。

该病毒适合培养温度为21℃,只对锦鲤鳍细胞系敏感,产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊断方法不多,主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。目前,很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧光定量PCR方法,该方法以其敏感性、特异性高,污染少,可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒VR52标准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法,利用一对特异性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法,以期为KHV感染提供快速、特异的诊断方法。

1 材料和方法

1.1 毒株

KHV标准毒株VR52购自ATCC R公司。鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠。

1.2 试剂和仪器

组织基因组DNA提取试剂盒(DV811A),Taq DNA聚合酶,PCR反应试剂盒,质粒提取试剂盒,PMD-18T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,Takara Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,DNA分子量Marker,DNAgreen,焦磷酸二乙酯(DEPC)均购自宝生物工程(大连)有限公司,其他试剂均为国产或进口分装。核酸蛋白分析仪Gene.specv为Hitachi Naka Instruments Co.Ltd公司产品。荧光PCR仪ABI7000 Sequence Detection Systems为ABI公司、普通PCR仪PTC-200 Peltien Thermal Cycler为MJ Research公司产品。凝胶成像仪Gel Doc TMXR为BIO-RED公司产品,高速冷冻离心机3K30为德国SIGMA公司。

1.3 FQ-PCR标准品的制备

1.3.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank上公布的AB375391 KHV胸苷激酶(TK)基因的保守序列,利用Premier5.0引物设计软件设计两条引物,送上海生工合成。引物序列如下:

上游引物TK1为:5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′下游引物TK2为:5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′

1.3.2 TK基因的扩增

将KHV标准毒VR52接种KF细胞,待出现细胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸,做为扩增的模板。提取过程按照说明书进行操作。PCR扩增体系如下:25 L的体系,DNA模板3 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,引物TK11 L(10 p M),引物TK21 L(10 p M),Taq酶(5U/L)0.2 L,DEPC处理水补到25 L。反应条件为94℃5 min;95℃1 min,52℃1 min,72℃1 min,40个循环;72℃10 min;4℃保温。扩增片段大小为409 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。

1.3.3 TK基因的克隆与鉴定

利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将TK基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书),将回收的产物与PMD-18T Vector连接16 h。连接体系:PMD-18T Vector 1 L,PCR产物1 L,DEPC处理水3 L,连接液5 L。将连接产物转化到DH5感受态细胞,加入IPTG和X-Gal,涂在Amp+琼脂平板上,次日挑取4个白色单个菌落,分别进行PCR鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养基中,37℃摇床过夜,利用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.4 质粒标准品浓度的计算

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值,判断其纯度(OD260nm/OD280nm>1.8者为纯品),然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/L)×1 L]×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023个/mol),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;660是每个碱基的平均分子量;重组质粒的总长度为3101bp。标准品作10倍梯度稀释,–20℃保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.4.1 引物和Taq Man探针的设计与合成

以1.3中PCR扩增的片段为模板,利用Beacon Designer 5.0软件设计了1对特异引物和Taq Man探针,引物和探针均由大连宝生物有限公司合成,探针的5′端用荧光基团FAM标记,3′端用淬灭基团TAMRA标记。引物及其Taq Man探针序列见表1。扩增长度为116bp。

1.4.2 荧光定量PCR反应体系及条件

反应体系:25 L的总体系,DNA模板5 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,上游引物1 L(10 p M),下游引物1 L(10 p M),探针0.8 L(10 p M),Taq酶(5 U/L)1 L,DEPC处理水补到25 L。置荧光定量PCR仪中,反应条件为94℃3 min;94℃15 s,60℃30 s,72℃1 min,5个循环;94℃10 s,60℃40 s,40个循环,收集荧光信号。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。

1.4.3 标准曲线的制备

将KHV标准品质粒做10倍系列稀释,采用优化好的条件进行实时荧光定量PCR。根据质粒拷贝数和对应的Ct值,利用SDS1.2分析软件得到标准曲线。

1.4.4 FQ-PCR特异性试验

用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒,检测KHV引物和探针的特异性。

1.4.5 FQ-PCR重复性试验

对FQ-PCR模板进行10倍系列稀释,并做2组平行样,检测其重复性。

2 结果

2.1 KHV TK基因特异性片段的扩增

目的片段大小为409 bp,经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2.2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定

将目的片段与PMD-18T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5,经过Amp+的琼脂平板的培养,挑取阳性克隆菌,提取质粒,并测序。经0.8%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小为3 101 bp,结果如图2所示。测序结果显示,质粒中含有目的片段。以质粒为模板,进行常规PCR鉴定,扩增出409 bp的目的片段,如图3所示,说明质粒构建成功,取2号管对应的质粒做标准品,用于荧光定量PCR方法的建立。

2.3 重组质粒浓度的测定

提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定,其质量浓度为32.85 g/m L,OD260nm/OD280nm比值为1.825,符合纯度要求。根据每个阳性质粒含3101bp,所提质粒DNA溶液浓度可换算为1.6×1010个拷贝/L。

2.4 引物和探针最佳使用浓度的确定

以相同浓度的阳性核酸为模板,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下,以循环阈值(Ct值)最小,荧光强度增加值(Rn)最大,若两者不一致,优先以Ct值为准,矩阵法优选后,引物和探针的最佳浓度分别为0.4 p M和0.32 p M。

2.5 FQ-PCR标准曲线的建立和回归方程的确定

对标准阳性质粒10倍系列稀释,以优化的条件进行Taq Man FQ-PCR扩增。利用SDS1.2分析软件,以Ct值为纵坐标,质粒DNA拷贝数的对数为横坐标,获得一条标准曲线,如图4所示。可见,在1.6×10~1.6×105拷贝之间,测得的数值基本在一条直线上,与Ct值有良好的相关性,相关系数R2=0.992,说明各个浓度组相关性非常好,可以对病毒进行可靠的定量检测,此阳性质粒可作为FQ-PCR的标准品。质粒在稀释到10-9仍能检测到荧光信号,对应16个拷贝数,该方法检测的灵敏度为16个病毒拷贝数,灵敏度较高。图中,标准曲线的斜率为-3.09,截距为20.96,可以得出拷贝数N与Ct值之间的线性关系表达式即回归方程:Ct=-3.09Ig N+20.96。待测样品的Ct值可直接从仪器中读取,通过回归方程,可确定样品中核酸的含量。

2.6 FQ-PCR重复性试验

将KHV核酸做梯度稀释,做两组重复样,结果如图5所示,重复样Ct值之间相差0.1左右,重复性较好。

2.7 FQ-PCR特异性实验

分别对IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒,用建立好的KHV FQ-PCR的反应体系,进行扩增。如图6所示,只有KHV有扩增曲线,呈现出良好的特异性。

3 讨论

目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soliman等[3]、Gunimaladevi等[4]报道采用LAMP法能高度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒;乌日琴等[5]、刘荭等[6]也初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定性分析的手段。而本文建立的FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的使用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测的特点;FQ-PCR克服了常规PCR的许多缺点,如普通PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果,费时费力,并且紫外线和溴化乙锭对人体又有害,这些复杂的过程增加了假阳性的机会,FQ-PCR具有扩增与自动分析一体化,缩短了检测时间。本文建立的FQ-PCR检测方法,具有高灵敏性、高特异性、操作时间短,可做为KHV检测首选的方法。

本文FQ-PCR标准品的构建是荧光定量PCR方法建立的基础,本文选用6个稀释度的标准阳性质粒模板,建立的标准曲线,相关系数为0.992,表明拷贝数与Ct值相关性良好,本试验最低可检出16个病毒拷贝,说明灵敏度较高。因此本研究构建的检测KHV的标准品可用于FQ-PCR检测。

由于FQ-PCR可定量检测病毒数量的特点,可做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有力的参考,有很好的应用前景和研究价值。

参考文献

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[2]张立峰,刘晶,苏世敏.一种新发现的鱼类病毒KHV在国外的流行和研究现状[J].中国动物检疫,2003,20(2):41~43.

[3]Soliman H,El-Matbouli M.An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus(KHV)infection by loop-mediated isothermal amplifi cation[J].J Virol,2005,17(2):83.

[4]Gunimaladevi I,Kono T,Venugopal M N,et al.Detection of koi herpesvirus in common carp,Cyprinus carpio L.,by loop-mediated isothermal amplification[J].J Fish Dis,2004,27(10):583~589.

[5]乌日琴,刘中勇,黄宝春.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[J].检验检疫科学,2005,15(2):6~8.

定量PCR 篇8

1 材料与方法

1.1 毒株

鹅细小病毒病毒GPVS1株、鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒, 均为华南农业大学禽病实验室保存。

1.2 主要试剂

SYBR Green Realtime PCR Master MixPlus, 购于广州美津生物技术有限公司;PCR试剂、RNA抽提试剂盒, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.3 GPV-VP基因的扩增和克隆

参考GenBank中鹅细小病毒B株VP基因的核苷酸序列, 根据其保守区域的序列设计特异性引物扩增GPV-VP基因。引物序列:上游引物GPV-VP-PCR-F 5′-TGATTCTGCCCTCCCTTCCA-3′;下游引物GPV-VP-PCR-R 5′-TGATGAACACCGAGTCTTCCTTAC-3′。引物由上海基康生物技术有限公司合成。

1.4 PCR反应

取含GPVS1株的番鸭胚尿囊液经100 ℃水浴10 min, 然后冰浴5 min, 15 000 r/min离心10 min;取上清液作模板进行PCR。反应体系:模板DNA 3 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, GPV-VP-PCR-F (25 pmol/μL) 0.5 μL, GPV-VP-PCR-R (25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 16 μL, 总体积为25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 54 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。按广州瑞真生物技术有限公司的Gel Extraction Kit说明书纯化目的片段, 将该目的片段连接到pMD18-T载体, 重组质粒pMD18-T-VP经PCR与双酶切鉴定后进行测序。RNA病毒 (尿囊液) 的提取按照产品说明书操作。反转录采用20 μL体系:RNA 9.5 μL, 随机引物1 μL, 10×RT Buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, RNA酶抑制剂0.5 μL, AMV反转录酶1 μL, 加灭菌去离子水至20 μL。混匀, 室温下作用10 min, 接着42 ℃水浴1 h, 即为cDNA。

1.5 实时荧光定量PCR试验

1.5.1 引物及PCR条件

以上述重组质粒为模板, 选择保守序列设计荧光定量PCR 特异性引物, 序列为GPV-VPRT-PCR-F 5′-TTCTCCTACCACTCCCGCTACTT-3′;GPV-VPRT-PCR-R 5′- TGGTCTACATTTCCAGCA2GTTTGT-3′。扩增的目的片段是VP基因序列中3 011～3 144 bp的134 bp片段。pMD18-T-VP稀释10倍测定其在波长280 nm的吸光度值, 计算DNA的浓度和拷贝数。然后以标准质粒10倍梯度稀释溶液为模板, 根据SYBR GreenⅠReal-time PCR试剂盒说明, PCR反应中各组分如下:2×SYBRmixL 10 μL, GPV-VPRT-PCR-F (10 μmol/L) 0.4 μL, GPV-VPRT-PCR-R (10 μmol/L) 0.4 μL, ddH2O 6.2 μL, pMD18-T-VP 3 μL, 总体系为20 μL。荧光定量PCR反应程序:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s;60 ℃退火15 s, 72 ℃延伸40 s, 共38个循环。荧光定量PCR反应结束后制作熔解曲线, 反应程序:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 40 s, 95 ℃ 15 s。

1.5.2 特异性检测

用引物GPV-VPRT-PCR-F/R对实验室保存的鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒等进行PCR检测。

1.5.3 灵敏度分析

将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5×102个拷贝/μL, 以各梯度稀释液为模板进行PCR反应。最低起始模板浓度即为该Real-time PCR反应的灵敏度。

2 结果

2.1 pMD18-T-VP重组质粒的构建结果

以病毒DNA为模板进行PCR反应, PCR 产物大小约407 bp。将PCR产物克隆进pMD18-T载体, 经PCR扩增和双酶切鉴定后, 最终测序结果证明重组质粒为阳性。该测序结果与GenBank中公布的GPV核衣壳蛋白基因序列的相似性为98.3% (见图1) 。

2.2 荧光定量PCR 结果

2.2.1 扩增曲线分析

将标准质粒pMD18-T-VP进行10倍梯度稀释后, 选取3.5×104～3.5×107个拷贝/μL的稀释样品作为模板进行PCR反应, 扩增曲线见图2。模板浓度越高, Ct值越小, 即扩增曲线越早进入对数期。阴性对照在36个循环后出现扩增现象, 熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。

2.2.2 标准曲线分析

PCR扩增结束后, 根据起始模板浓度和相应的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数r2 =0.975, 扩增效率E=86.2% (见图3) 。

2.2.3 熔解曲线分析

目的产物熔解温度为88 ℃, 引物二聚体熔解温度为82 ℃。在3.5×102个拷贝/μL的模板浓度下, 虽然也有相同熔解温度产物的产生, 但是其扩增Ct值已经与空白对照很相近, 结果为阴性 (见图4) 。

2.2.4 灵敏度分析

从扩增曲线可见, 当模板浓度为3.5×103个拷贝/μL时, 荧光定量PCR 可以扩增出特异性产物。当模板浓度为3.5×102个拷贝/μL时, PCR反应虽然能扩增出相同熔解温度的条带, 但是其Ct值已经基本与空白对照重合。因此, 该SYBR GreenⅠReal-time PCR 方法检测灵敏度为3.5×103个拷贝/μL。

2.2.5 重复性试验结果

对于不同浓度的模板, 4个平行样品之间的Ct值差异不显著, 表明该方法具有很好的重复性 (见图5) 。

2.2.6 特异性检测结果

针对实验室保存的与鹅细小病毒共感染的其他病毒鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒进行特异性检测。图6为GPV的扩增曲线, 其余模板均为阴性, 即该引物对GPV具有很好的特异性 (见图6) 。

3 讨论

试验建立的针对鹅细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法在病毒3.5×103～3.5×107个拷贝/μL的浓度范围内具有很好的检测效果。荧光定量PCR 技术较其他技术有灵敏度高的显著特点, 因此试验同时要严防污染问题, 即需要实验人员良好的操作技能和实验室的洁净环境。

在临床上, 仅依靠症状和病理变化不能很好地区分鹅细小病毒病和其他鹅病毒病。目前, 用于诊断鹅细小病毒的病毒分离培养和中和试验存在诸多弊端, 例如:达不到快速、准确诊断;依赖操作人员的技术判断误差较大;容易与其他鹅病毒病 (鹅源新城疫、鹅流感) 感染相混淆;更为重要的是不能很好地用于早期临床诊断 (敏感性差) 。而实时荧光定量RT-PCR的敏感性高、特异性强、操作方便, 便于早期临床检测[5], 但也存在技术操作复杂、成本高以及不能很好地现场应用等缺点[6]。本试验建立的鹅细小病毒实时荧光定量PCR检测方法可以结合传统的诊断方法, 为该病的防制提供技术支持, 但该方法与荧光杂交探针实时PCR方法相比, 其检测特异性、灵敏性还有待提高。

参考文献

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定量PCR 篇9

1 实时荧光定量PCR的原理

实时荧光定量PCR技术, 是指在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。在荧光定量PCR中, 对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号, 随着反应时间的延续, 监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线。在PCR 反应早期, 产生荧光的水平不能与背景明显区别, 而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期, 在PCR反应处于指数期的某一点检测PCR产物的量, 并由此可以推断模板最初的含量[2]。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数, 荧光定量PCR采用参数“Ct”值, Ct值 (cycle threshold) 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明, 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 起始拷贝数越多, Ct值越小[3]。利用已知起始拷贝数的标准品可以绘制出标准曲线;因此, 只要获得未知样品的Ct值, 即可从标准曲线上推算出该样品的起始拷贝数[4]。

2 实时荧光定量PCR的检测方法

随着分子生物学技术的不断发展, 迄今已建立了一系列的实时定量PCR技术检测方法。具体包括2大类, 即探针类和染料类。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;染料类如SYBR Green Ⅰ则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。

2.1 Taqman 探针

该探针是长度为20~24 bp的寡核苷酸, 在其5′末端标记1个荧光报告基团, 3′末端标记1个荧光淬灭基团, 其序列与2个引物包含序列内的1段DNA 模板完全互补。该方法是当探针保持完整时利用Taq 酶 (5′→3′外切酶) 的活性淬灭基团吸收发射的荧光。当有特异的而不是非特异的PCR 发生时, Taq酶同时发挥其5′→3′外切酶活性, 将与模板杂交的探针切碎, 报告基团与淬灭基团分离, 淬灭作用被解除, 荧光信号释放, 通过检测系统就可以观察到信号的变化, 荧光信号的累积与PCR 产物形成呈正相关。每扩增1条DNA 链, 就有1个游离的荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与PCR 产物的形成完全同步。利用标准模板系列绘制出标准曲线, 结合各样品的Ct值, 可以确定样品的起初模板量[5]。由于探针与目标片段之间的特异杂交产生荧光信号, 因而此方法可通过探针增强检测的特异性, 且能够提供多重检测功能。但Taqman探针检测法也存在一定的不足, 如淬灭难以彻底、本底较高、定量时容易受酶活性的影响、探针成本较高等使其无法普及应用。

2.2 TaqmanMGB 探针

TaqmanMGB 探针是在Taqman 探针的基础上改进的, 在探针的3′端增加了小槽黏结剂 (MGB) 分子, 这种物质能够结合在双链DNA小沟部位。MGB 可将探针的TM值提高10 ℃左右, 从而使其能够分辨1个碱基的差别, 如完全配对则有荧光信号, 若有1个碱基不匹配则没有信号, 而且连在MGB分子后面的是非荧光物质的淬灭基团, 从而使这种探针具备更好的淬灭效果, 且无背景荧光、荧光标记灵活、荧光信号的信噪比高、退火温度高、探针短、核酸多态性 (SNP) 识别率高, 从而使TaqmanMGB 探针具备了更加广泛的应用前景。

2.3 分子信标

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针, 环部大小为15~35 bp, 能与靶DNA序列互补, 茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成, 探针的5′端与3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由状态时, 发夹结构的2个末端靠近, 使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近, 产生荧光共振能量转移 (FRET) 效应, 荧光信号被淬灭;因此, 检测不到荧光信号[6]。当有靶序列存在时, 分子信标与靶序列结合, 使分子信标的发夹结构打开呈线型, 荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离, 此时荧光报告基团不能被淬灭, 荧光检测仪器可检测到荧光。随着每次扩增产物的积累, 荧光强度增加, 可反映出每次扩增末扩增产物积累的量。分子信标法的特点是探针可循环利用, 适用于检测点突变, 特异性更明显。但探针标记较复杂, 并且要求其游离在溶液中时探针能无选择性折叠, 当茎结构的热力学温度过高时还会影响探针与靶序列杂交。

2.4 双杂交探针

双杂交探针技术是Roche公司开发的一种PCR定量技术, 使用2个杂交探针, 能提高特异性[7]。该技术是将2条探针中的1条在5′端标记荧光, 1条在3′端标记荧光, 其中一个为受体荧光基团, 另一个为供体荧光基团, 2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。在自由状态时, 供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱;因此, 只能检测到供体荧光基团发出的荧光。在PCR退火阶段中2条探针与目的基因特异性结合, 首尾连接, 使供体和受体荧光距离非常接近, 两者产生荧光共振能量转移, 使受体荧光基团发出荧光。由于荧光共振能量转移探针是靠近发光, 所以检测信号是实时信号, 而非累积信号[8]。该方法的特点是淬灭效率高, 但由于2个探针结合于模板上;因此, 会影响扩增效率, 而且需要合成2个较长的探针, 合成成本相对较高。

2.5 复合探针

复合探针结合了分子信标和杂交探针的优点, 由荧光探针和淬灭探针组成, 荧光探针长25个碱基左右, 5′端标记荧光基团, 3′端磷酸化防止被延伸, 淬灭探针长15个碱基左右, 3′端标记淬灭基团。当没有模板存在时, 2个探针结合形成复合探针, 荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收, 无荧光产生;当有模板存在时, 由于荧光探针与模板完全互补, 荧光探针优先与模板结合, 2个探针分离, 产生较强荧光。荧光强度与PCR体系中模板数量成正比, 可进行PCR定量。该方法的优点是使用非荧光淬灭剂, 本底低, 对扩增效率影响小, 探针设计、合成、标记、纯化方便, 而且探针特异性较强、灵敏度较高, 可以用来鉴别单碱基变异。

2.6 荧光标记引物

荧光标记引物是根据分子信标的原理变化而来的一种联合分子探针系统。该方法是把荧光基团标记的发夹结构序列直接与PCR引物结合, 从而使荧光标记基团直接进入PCR扩增产物。在没有单链模板的情况下, 该引物自身配对形成发夹结构使荧光淬灭;在模板存在的情况下, 引物与模板配对, 发夹结构打开, 产生荧光信号。荧光标记引物通过二级结构实现淬灭, 不需要荧光淬灭基团, 也不需要设计特异的探针序列, 能更快地发射荧光, 而且信号更为强烈。由于没有探针控制特异性;因此, 特异性要弱于探针技术。目前, 荧光标记引物主要有3种:发卡式引物、蝎子引物和LUX引物。

2.6.1 发卡式引物

发卡式引物是在分子信标的基础上发展起来的[9] , 在PCR延伸阶段整合进它们的特异性扩增子, 产生荧光信号, 其特异性依赖于引物序列。此方法能将所有的扩增产物标记上荧光分子;因此, 荧光信号响应快, 但无法区分特异性和非特异性扩增。

2.6.2 蝎状引物

蝎状引物是对发卡式引物的改进。该技术在引物与分子灯标探针之间连接1个间隔臂, 使PCR延伸反应时不能延伸至分子信标。这样非特异性扩增产物便不能产生荧光信号, 当有特异性扩增产物时, 即可与分子信标杂交, 产生荧光信号。既解决了非特异性问题, 又保留了响应快的特点, 但仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配及探针合成复杂等问题。

2.6.3 LUX引物

LUX引物法是运用高灵敏度的荧光检测系统实时监控每个循环, 并利用累积荧光强度, 通过确立Ct值的方法推测样品起始模板数从而实现定量分析。此方法的特点是仅需要设计LUX引物而不需要专门设计探针, 既节省了成本又给引物设计提供了宽松的空间[10]。由于没有探针控制特异性, 它的特异性要弱于探针技术, 但并不受引物二聚体影响, 所以特异性和灵敏度比常规PCR方法高。

2.7 SYBR Green Ⅰ荧光染料

SYBR Green Ⅰ是一种非饱和菁类荧光素, 可以嵌合于DNA双链结构的小沟中, 非特异地与dsDNA分子结合, 是应用最广泛的非探针类化学检测物[11]。在PCR反应体系中, 加入过量的SYBR Green Ⅰ荧光染料, 使其特异地与dsDNA 分子结合后, 发射荧光信号, 荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加;因此, 可被荧光探测系统检测到, 荧光强度的增加与初始模板量相关, 可以进行定量DNA分析。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA 序列的扩增, 不需要探针的设计, 检测方法简便, 降低了检测成本。 然而, 由于荧光染料能与任何dsDNA分子结合, 也能与非特异性的dsDNA分子 (如引物二聚体) 结合, 产生荧光干扰, 使试验产生假阳性结果。目前, 可以用带有熔解曲线分析的软件解决这个问题。

2.8 LC Green TM Ⅰ荧光染料

LC Green TM Ⅰ荧光染料是新出现的一种dsDNA结合染料, 能够与dsDNA分子完全结合直接加入PCR反应体系中, 高浓度的LC Green TM Ⅰ不会抑制PCR反应[12];因此, 可得到更强的荧光信号。该染料抗水解、抗热解、抗光解能力均强于SYBR GreenⅠ染料。LC Green TM Ⅰ染料法简便、快速、准确性高、成本低, 但其反应的特异性依赖于高特异性的引物。

3 实时荧光定量PCR的定量方法

实时荧光定量PCR的定量方法有2种, 即绝对定量法和相对定量法[13]。绝对定量法是用已知的标准曲线来推算未知的样本量;相对定量法是在一定样品中靶序列相对于另一参照序列量的变化, 由于每个模板Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 利用已知起始DNA浓度的标准品即可绘制出标准曲线。

3.1 绝对定量法

绝对定量法指的是用已知的标准曲线来推算未知样本的量, 此方法要预先知道标准品的浓度。将标准品稀释成不同浓度并作为模板进行PCR反应, 以标准品拷贝数的对数值为横坐标, 以测得的Ct值为纵坐标绘制出标准曲线。对未知样品进行定量时根据未知样品的Ct值, 即可从标准曲线中推出样品的起始拷贝数。

3.2 相对定量法

3.2.1 比较标准曲线的相对定量法

相对定量法指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本量的变化。由于该方法中量的表达是相对于某个参照物而言的;因此, 相对定量法的标准曲线比较容易制备, 对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中, 待测样本靶序列的量来自标准曲线, 最后必须除以参照物的量, 其他的样本为参照物量的n倍。在试验中为了准确加入反应体系的RNA或DNA, 通常在反应中扩增1个内源管家基因作为参照基因, 由于管家基因在各种组织中的恒定表达, 所以可用来作为标准, 比较来源不同的样本目的基因表达量的差异。管理基因是用于比较目的基因拷贝数, 根据内参照补偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失, 反应体系内是否存在扩增抑制因素及参照物标准化等[14]。

3.2.2 比较Ct值的相对定量法

该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段。这2个扩增反应可以在2个反应管中分别进行, 也可以在同1个反应管中进行, 测得两者的Ct值之差即ΔCt。该方法不需要标准曲线, 与标准曲线法不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量, 前提是假设每个循环增加1倍的产物, 以PCR反应的指数期得到Ct值来估算起始模板的量, 一个循环 (Ct=1) 相当于起始模板数的2倍。此方法节省试剂, 操作简便, 但由于是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的, 效率的偏移会影响对实际拷贝数的估计[8];因此, 如何优化反应体系, 使得目的基因和内参基因的扩增效率相等是该方法的难点。

4 实时荧光定量PCR的应用

实时荧光定量PCR的应用范围很广, 目前主要用于肿瘤的诊断、细胞因子表达的分析、病原体的分子检测、基因工程的研究等方面。

4.1 肿瘤的诊断

肿瘤基因遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。实时荧光定量PCR技术不但能够有效地检测基因的突变, 而且还能准确地测定表达量, 进行肿瘤的早期诊断和治疗效果及预后的判断。该技术的应用已成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。曹恒斌等应用实时荧光定量PCR方法成功证实肌细胞增强因子2与肝癌之间有密切关系。陈公琰等[15]利用实时荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达, 证实端粒酶参与了人肺腺癌Anip973/NVB细胞的MDR, 并可将端粒酶作为逆转耐药的新靶点。

4.2 细胞因子的表达分析

细胞因子在体内作为一种调节蛋白, 其表达和分泌都受到严格的调控。在某些病理情况下, 细胞因子的表达会出现异常, 通过实时荧光定量PCR技术可以对细胞因子的mRNA进行定量, 来估算其蛋白表达量, 从而可以对某些疾病进行诊断和研究。另外, 细胞因子通过调节免疫反应在机体的免疫系统中起着核心作用。为了阐明在许多炎症反应、自身免疫性疾病、器官移植排异中的免疫致病机制, 细胞因子mRNA表达谱的可靠定量就显得十分重要。实时荧光定量PCR允许被检样品中细胞因子含量极低, 同时又具有高敏感性和准确性。温立斌等利用构建的重组质粒, 成功建立了检测猪Th1、Th2型细胞因子基因的实时荧光定量PCR标准曲线和直线回归方程。

4.3 病原体的分子检测

该技术不仅能对病原体定性, 而且还能对病原体DNA或RNA序列准确定量, 同时对整个病程中潜在病原体的复活等进行动态研究, 从而对疾病进行早期诊断、药物疗效观察、病情判断及预后观察等。实时定量PCR技术的定量范围很宽, 可以快速、准确定量出高至1010, 低至101个拷贝数的病原体。目前, 该技术已应用于细菌、病毒、衣原体、支原体、寄生虫等许多病原体的检测研究。张志东等应用该技术快速检测出有口蹄疫病毒 (FMDV) 持续感染的带毒动物, 比以往的诊断方法更加快速、准确、客观。Stram Y等采用TaqmanMGB 探针方法可在10~100个病毒基因组分子范围内对病毒RNA进行定量检测牛流行热病毒。

4.4 基因工程研究

实时荧光定量PCR技术的出现不仅加强了对基因量的研究方法, 也加强了对基因质的变化研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性, 并已经被广泛应用于遗传分析[8]。

4.4.1 基因表达的研究

实时荧光定量PCR能对低丰度mRNA进行定量, 并且可在体外对细胞活性进行评估。细胞因子是一种调节蛋白, 对免疫反应和炎症反应都具有重要的调节作用, 其量的改变常与某些疾病, 如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥等有密切关系。由于得到的组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平上的检测, 所以应用实时定量PCR技术检测细胞因子mRNA表达水平显得更有意义。

4.4.2 基因突变及多态性研究

实时荧光定量PCR技术可用于检测特异性突变基因, 因为扩增DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆和宿主细胞内的生长准备, 即可在媒介生物分子纯化过程中直接测得。利用实时荧光定量PCR和间接测序方法, 可对已知DNA序列进行基因突变及多态性分析。Espasa M等[16]利用荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌靶基因单点突变, 其敏感性和特异性均获得满意的结果。

4.4.3 转基因安全检测

实时荧光定量PCR技术可用于对转基因产品的检测和定量。目前, 该技术在生物安全检测中的应用主要有:动物中基因治疗载体生物分布的确定、生物疗法中残留DNA 的定量、污染细胞库和终产物中病毒和细菌核酸的检测、病毒研究中病毒清除水平的定量、疫苗中逆转录病毒活性的特异性检测及遗传稳定性监控中转基因拷贝数的确定等。实时荧光定量PCR技术可达到简便、快速、准确地检测转基因产品的目的。

5 实时荧光定量PCR技术的展望

定量PCR 篇10

1分析前的质量控制

1.1实验室环境:严格遵守“各区独立、注意风向”, 禁止使用中央空调。

1.2仪器设备的管理:仪器设备的正确使用、维护和校准是保证PCR结果准确的前提, 对实验室中的仪器设备如扩增仪、离心机、加样器、真空泵、生物安全柜等建立一套规范化、标准的操作程序。

1.3试剂的贮存与比对:试剂一般贮存在-20℃以下。通过肉眼观察试剂盒应完整无破损, 标识清楚——厂家名称、批准文号、生产日期、有效期等;在更换不同批号的试剂时, 本实验室还建立了不同批次试剂间的比对程序;试剂现用现配, 避免提前配好。

1.4检验者素质:PCR都是微量操作, 要想获得稳定可靠的检测结果, 操作人员就需要一定的专业技术知识与经验, 要尽可能做到知其然又知其所以然。从实际工作上来看, 不同的操作者所获得的测定结果往往差异也很大, 因此, 人员培训相当重要, 尤其是内部针对性的培训[1]。

1.5标本的采集、运送、接收及编号:标本采集、运送、接收及编号是准确发放报告的基础。有些患者特别是肝病患者很多都需要长期治疗和定期复查, 经济负担非常重, 有时会出现冒用医保卡的现象, 这就需要相关人员严格执行对各类标本的查对。

2分析中的质量控制

2.1 PCR仪器的保养和校正:PCR仪是PCR扩增的关键仪器, 仪器的保养是PCR仪能正常工作的前提。实验室建立了标准化操作程序, 本实验室采用的是罗氏Light Cycler480实时荧光PCR仪, 严格按照仪器的说明书及仪器的标准操作程序进行日、周、月保养。仪器是否处于一个良好的工作状态是检验结果正确与否的重要保障。

2.2主要污染来源与防污染措施:做好PCR最重要的工作就是防治污染。实验室中主要的污染来源:①实验室样本中含有的待测微生物;②PCR扩增产物引起的残留污染。PCR扩增引起扩增产物累积增加, 如果不采取有效的防污措施, 在很短的时间内累积的气溶胶化的扩增产物就会污染实验室中的耗材、试剂和仪器设备等, 造成严重的后果。污染重在预防, 为了避免实验室污染, 获得准确、可靠的检测结果, 实验室应制定一套具体可行的污染防护措施并严格执行。防污措施:①严格实验室分区及严格遵守实验室工作制度, 不同分区的物品如加样器、笔等不得混用, 建立外来人员登记程序;②在每次实验后可使用10%次氯酸钠清洗实验室包括工作台面、加样器、离心机等, 然后再用70%乙醇或清水洗去残留次氯酸钠。本实验室每次实验结束后都将实验操作板放入10%次氯酸钠溶液中浸泡1 h, 而且盛有次氯酸钠的容器还要定期更换, 本实验室曾经有段时间阴性对照曲线总是有抬头, 经多方查找原因, 确定是没有及时更换浸泡实验操作板的容器引起的;③紫外线照射。

2.3室内质控:室内质控可以监测与控制实验室工作的精密度, 提高常规检验工作中批内、批间样本检验结果的一致性, 是用以确定检验结果是否可靠、可否发出的一项重要工作[2]。仪器、试剂、耗材、核酸提取操作等因素都会影响质控品的检测[3]。在每次实验过程中按照本实验室的室内质控要求测定阴性质控, 高、低值2种浓度的质控血清。质控样本的摆放顺序在每一次扩增检验时都相应顺延, 以保证核酸提取和扩增中所有检测结果都符合质控要求。

2.4室间质控:室间质量控制是实验室质量控制体系中重要组成部分, 是保证患者的检验结果及其报告的准确性和可靠性, 以及各个实验室间检测结果的可比性的重要手段。随着PCR技术的发展与普及, PCR检测的室间质控越来越重要。本实验室每年都积极参加省临检中心和卫生部的室间质评, 并对反馈回来的室间质评成绩进行认真分析和总结, 及时改正存在的问题。

2.5利用患者就诊资料进行质控比对:检测结果与临床情况的相关性如何, 需要掌握患者的主要临床情况, 包括患者的病情与变化情况;检测项目和其他项目的相关性, 如大三阳患者在未经抗病毒治疗下DNA很少阴性;前后检测结果的对比, 将本次检测结果与上几次检测结果进行比较等, 都是可行的方法[4]。这些可以通过医师或者患者的沟通来做到, 或者通过LIS检验系统的“报告查询”功能来实现, 从而保证实验结果的正确发出。

3分析后的质控

这一阶段质量保证的主要工作如下:检验结果的正确发出, 咨询服务, 以及对检验样品的保存及处理[5]。

3.1报告单的及时发出:检验报告单要求及时、准确、完整地发出, 保证医师能够及时的获得检验结果。同时需要有报告签发和审核程序。检验者还应切记保护患者隐私。

3.2咨询服务:实验室应主动的努力做好咨询服务这项工作, 在解释检验结果时应耐心、细致、有理有据。

3.3检验样品的保存和处理:每天实验结束后, 每份样本吸取0.5m L血清到离心管中, 放入2~8℃冰箱内保存7 d。后由卫生人员集中处理。

参考文献

[1]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社, 2012:143.

[2]李金明.感染性疾病免疫测定的室内质量控制[J].医学检验与临床, 2007, 18 (1) :3-6.

[3]陈松.法医DNA实验室的DNA污染和防范[J].刑事技术, 2007 (3) :16-20.

[4]徐忠玉.发光免疫分析的质量控制[J].检验医学与临床, 2010, 7 (3) :280-281.