竞争定量RT-PCR（精选7篇）
竞争定量RT-PCR 篇1
能量负平衡是奶牛酮病、脂肪肝等围产期能量代谢障碍性疾病的共同病理学基础。低糖血症 (肝糖异生减少) 是围产期能量代谢障碍性疾病发生发展的一个主要环节。反刍动物90%的血糖来自于肝脏糖异生, 糖异生关键酶PC (丙酮酸羧化酶) 在糖代谢过程中起重要作用, 催化丙酮酸盐生成草酰乙酸, 研究证实, PC基因丰度的变化可以反应其活性的变化, 因此PC基因m RNA水平直接反映机体糖异生的能力。但国内外应用定量RT-PCR方法检测围产期奶牛肝脏PCm RNA丰度的研究尚未见报道。本试验的目的在于探索干奶期不同能量摄入水平对围产期健康奶牛肝脏PC基因表达的影响, 从基因水平上探讨围产期奶牛糖异生的调节机制, 为纠正和缓解奶牛产后能量负平衡, 防治围产期奶牛能量代谢障碍性疾病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物的选择、分组及饲养管理
选用围产期健康荷斯坦奶牛30头, 305d的产奶量平均为7436 kg (SD=1089) , 平均体重为637 kg (SD=71) 。预饲一周后进入试验期, 试验从产前第28d开始, 将奶牛随机分为三组 (每组10头) :C组为对照组, 饲喂NRC标准日粮 (能量摄入为营养需要量的100%) , H组饲喂NRC标准增加20%日粮 (能量摄入为营养需要量的80%组) , L组饲喂NRC标准减少20%日粮 (能量摄入为营养需要量的80%组) 。分娩后各组均按中国奶牛饲养标准 (2000) 配制相同日粮, 至产后第56d结束。
1.2 试剂与仪器
反转录酶 (AMV) , RNasin购自NEB公司;Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Eco R I、Hand III、Apa I、标准分子量DNA Marker DL-2000 (分子量为2000、1000、750、500、250、100bp) 、pMD18-T Vector均购自Ta Ka Ra公司;PMD-GH质粒由本院李家奎老师构建。PCR仪Tpersonal 2000型 (German) , 高速冷冻离心机MR18·22型 (日本日立) , TGL·16G高速台式离心机 (上海安亭离心机厂) , GeneQuant核酸浓度测定仪 (英国phar2macia Biotech, Ltd公司) , 电泳仪DY2Ⅲ型 (北京六一仪器厂) , 凝胶自动成像系统 (英国UVI公司) 。
1.3 肝脏活体样品的采集
分别于产前28d、14d及产后第1、14、28、56d, 在奶牛右侧第11~12肋间, 与髂结节中央至肩关节连线的交点上, 用长12~15cm, 内径3mm长注射针头的肝脏穿刺针, 按奶牛肝穿刺技术采取肝组织20~40mg, 用生理盐水漂洗后装入塑料瓶存于液氮中待测。
1.4 肝PC mR NA表达水平的测定竞争定量R T-PCR
1.4.1 RNA完整性的确定及定量
取采集的肝脏活体样品, 提取总RNA, 1.5%琼脂糖凝胶电泳确定其完整性后, 200倍稀释测定其浓度。
1.4.2 PC m RNA竞争模板的构建
提取牛肝脏基因组, 用PC引物扩出PC基因的DNA序列, 利用其中含有的一个内含子序列, 然后再插入一段从PMD-GH质粒上酶切下的212碱基片段来构建PCc DNA竞争模板。
1.4.3 PC竞争模板浓度的确定
在同一PCR反应管中加入固定剂量的PC基因c DNA, 竞争模板按10-n倍稀释, 每个梯度均用相同的PCR体系和PCR反应条件进行扩增, PCR产物在1.5%EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。图像处理及灰度分析用TANNENG凝胶分析软件进行, 选择目的带与竞争模板带灰度相近的稀释倍数1为最终的竞争模板用量。
1.4.4 肝PC m RNA表达水平的测定
根据Genebank发表的牛PC基因序列, 设计扩增引物, 上游引物:5’-CCCCTG-GAGCGTG TGTTCGACTAC-3下游引物:5’-GGATGCC-GATGTAGCCCTG CAGGA-3’, 扩增PC基因m RNA片段大小为385bp, 扩增PC竞争模板DNA片断大小为678bp。根据测定的RNA浓度调整总RNA的体积, 使各组、每次的样品体系RNA量相同, 且均含相同量竞争模板。PCR反应体系为PCR扩增体系 (25μL) :PCc DNA模板1.0μL, PCDNA竞争模板1.0μL, 10×PCR Buffer 2.5μL, 5 U/μLTaq DNA聚合酶0.125μL, 10 mmol/L, dNTP Mixture 2.0μL, 2对上、下游引物各1.0μL, 灭菌双蒸馏水16.375μL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性45s, 60℃退火45s, 72℃延伸45s, 30个循环;最后72℃延伸10min。取5μL PCR产物在1.5%EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。图像处理及灰度分析用TAN-NONG凝胶分析软件进行, 根据PC和PC竞争模板PCR产物的面积比, 确定肝脏样品中PCm RNA表达水平。
1.5 数据处理
数据均以平均值±标准差表示, 用SPSS100软件进行分析, 组间差异显著性用ONE-WAY ANOVA (方差分析) 进行统计分析。
2 结果
2.1 肝总R NA提取的电泳结果
(如图1) 提取的总RNA有清晰、完整的三条带, A260/A280值为1.8, 符合试验纯度和逆转录要求。
M:DNA分子量标记DL2000;1、2、3:提取的总R NA
2.2不同能量摄入对奶牛肝脏PCmR NA表达水平的影响
结果见图2和表2。可见, 试验期内, L组奶牛PCm RNA丰度最高, H组最低, -14d~28d, 三组奶牛的PCm RNA丰度差异显著 (P<0.05) 或极显著 (P<0.01) , 产前1d和产后56d组间无差异, 分娩时各组PCm RNA丰度明显增加, 产后28d恢复到产前水平。
M:DNA Marker DL-2000 1-3:C组;4-6:H组;7-9:L组
3 讨论
3.1 奶牛肝PCmR NA丰度的测定方法
Greennfield等采用Northern印迹方法测定奶牛肝组织PCm RNA丰度。这些方法存在灵敏度低, 操作复杂, 环境要求苛刻, 需要采用对人体和环境有害的放射性物质进行标记。而定量RT-PCR方法与传统的RNA分析方法相比具有灵敏性高、特异性强及能对大量样本同时进行量化分析的优点。
竞争定量RT-PCR相对半定量PCR能消除管间及样本间的变异, 重复性好, 定量范围较广。因此广泛运用于细胞DNA、RNA以及病毒、细菌核酸的定量检测。本试验采用竞争定量RT-PCR检测奶牛肝PC m RNA的丰度, 通过对竞争模板浓度、循环数的确定, 使所建立的竞争定量PCR检测方法具有较好的重复性、稳定性、灵敏性, 确保实验结果可靠。由图2可见, 竞争模板 (扩增片段为678bp) 与目的基因 (扩增片段为385bp) 相差293bp, 既保证了竞争模板与目的模板扩增效率相同, 又保证扩增产物在电泳时能明显分开而利于检测。
3.2 对奶牛肝脏PC mR NA丰度的影响
试验期内, 低能组奶牛肝脏PC m RNA丰度最高, 高能组奶牛PCm RNA丰度最低, 产前14d~产后28d, 组间差异显著。尤其是分娩后1d~14d, 各组奶牛PC基因丰度均明显升高, 以低能组最为显著, 说明分娩时低能组奶牛糖异生增强, 与Greenfield的报道一致。
研究证实奶牛产前饲喂大量精料, 淀粉过瘤胃发酵, 血糖主要来自于肠道吸收, 肝糖异生减少, 导致产后肝脏对糖异生适应能力减弱, 糖异生关键酶活性降低。而低能组奶牛, 产前血糖主要来自糖异生, 肝脏适应能力强, 分娩后, 肝脏对糖异生适应能力增强, 且产前低能饲喂提高奶牛产后产后干物质摄入, 生糖先质丙酸供给充足, 上调PC基因表达, 进而提高糖异生速率。揭示产前低能饲喂奶牛促进围产期糖异生关键酶PCm RNA表达增加, 糖异生能力增强。糖异生速率除受PC的调控外, 糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK) 活性及底物 (生糖先质) 同时起到重要的控制作用, 因此有关不同能力摄入对围产期奶牛糖异生的影响, 尚需更深入的研究。
摘要：建立了奶牛肝PCmRNA丰度的竞争定量RT-PCR检测方法, 优化的PCR反应条件 (25μL) 为:60℃退火、30个循环数、1:1的PC cDNA与PC DNA竞争模板浓度比。同时应用该方法检测不同能量摄入对围产期奶牛肝PCmRNA丰度的影响, 结果表明:低能量日粮饲喂干奶期奶牛, 肝脏PC mRNA丰度升高, 而干奶期高能饲喂奶牛, 肝脏PC mRNA丰度降低。说明干奶期低能饲喂奶牛, 可以增强围产期奶牛的肝糖异生能力。
关键词：能量摄入,围产期奶牛,竞争定量RT-PCR,肝PCmRNA丰度
参考文献
[1]Greenfield RB, et al.Changes in mRNA Expres sion For Gluconeog-enic Enzymes in Liver of Dairy Cattle during the Transition to Lactation.Journal of dairy science[J].2000.83 (6) :1228-1236.
[2]徐闯.应用内含子法构建PC基因mRNA竞争RT-PCR内参照[J].中国农业科学, 2004.37 (7) :1056-1059.
[3]陈守春, 等.定量PCR技术研究概述[J].国外医学—流行病学传染病学分册, 1998, 25 (5) :231-232.
[4]王毅, 等.全自动PCR检测系统检测痰中结核分枝杆菌[J].国外医学:临床生化学与检验学分册.2002.23 (6) :333-334.
[5]Torres JM, et al.Development of a Quantitative RT-PCR Method to Study 5 alpha-reductase mRNA Isozymes in Rat Prostate in Different Androgen Status.Prostate[J].2003.56 (1) :74-79.
[6]李红梅, 等.干奶期不同能量摄入水平对产后奶牛生产性能的影响[J].中国兽医学报.2006.26 (2) :216-218.
竞争定量RT-PCR 篇2
1 提取组织总RNA
1.1 组织材料的获取
一般我们获取的组织材料首先要经过液氮速冻,然后-70℃冰箱保存。需要强调的是,从取材开始就要注意进行无RNA酶操作。在我们获取多个组织材料时,不能将组织材料装入自封袋或塑料袋再放入液氮中冷冻,否则自封袋容易破裂,使得组织掉入液氮。我们的做法是:取组织之前先准备好干净、消过毒的铝箔片,做好标记,取完组织,立即包裹,放入液氮冷冻,然后-70℃冰箱保存。
1.2 组织总RNA的提取
总RNA的提取是RT-PCR反应中关键的第一步,因为RNA提取质量的好坏直接关系到后面c DNA的合成和PCR的扩增。因此所提的总RNA要求纯度高、完整性好并达到一定的浓度。由于m RNA半衰期短,又容易被RNA酶降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能造成污染,因此在全部实验操作过程中我们建议:设立一个专用RNA提取的超净工作台,操作人员一律戴口罩和帽子,使用一次性手套,且要经常更换,原则上是手离开超净工作台就应换一次手套。实验所用的玻璃器皿均在0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中过夜处理,再用蒸馏水冲净,高压灭菌1 h,于干燥烘箱中烘干备用。凡是不能用高温处理的塑料容器等用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。实验所需配置的试剂也要用0.1%的DEPC水处理。注意DEPC是剧毒,有致癌作用,因而使用时需小心。
从组织提取总RNA的方法很多。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,一般按照试剂盒说明书操作,可快速有效地提取到高质量的总RNA。整个提取RNA的过程都必须在低温下或冰上进行。
1.3 总RNA纯度分析
按说明书提取组织总RNA,提取的组织总RNA用30μL的DEPC水溶解即得总RNA提取液。对所提的总RNA必须用紫外分光光度计或者使用核酸测定仪测定总RNA的纯度和浓度,以便在反转录的过程中进行定量。用1%甲醛变性凝胶电泳,EB染色,紫外光下观察RNA,如果能够清楚的看见28S、18S和5S 3条带,而且28S条带的宽度是18S的2倍时,表明RNA的完整性较好。在测定时RNA溶液浓度时,RNA溶液必须充分混匀,其吸光度值OD260/OD280的值在1.8~2.0之间时,说明纯度比较高,可以继续往下做。
2 合成反转录c DNA第一链
由总RNA反转录成c DNA第一链时,所取的总RNA的量必须要一样多,而且应在1μg以上,这样才能保证各组样本总RNA中所需检测m RNA量的差异。因此在进行反转录之前必须对所提取的总RNA浓度进行调整,使所要进行反转录的RNA稀释到同一浓度,然后再进行反转录。
从组织细胞提取的总RNA用反转录试剂盒可以得到c DNA第一链。许多生物公司都有现成的反转录试剂盒。这里强调一点,一个反转录试剂盒可以作很多次反转录,所以可以几个人合起来买,以节省试验经费。
3 优化PCR反应体系
利用RT-PCR对m RNA进行半定量分析,最关键的是优化试验条件,构建最佳的PCR反应体系。下面就从以下几个方面寻求构建PCR扩增的最佳反应体系。
3.1 引物的设计和选择
PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决定的。引物的好坏往往是PCR反应成败的关键。根据目的基因的m RNA序列正确设计引物,除满足引物设计的基本要求外,还应考虑目的基因和内标引物的预期退火温度,二者应尽量相符,引物序列进行比对,二者应无同源性,而且目的基因与内标基因的扩增的条带应相隔一定的距离(最少200 bp以上),以便于观测结果及密度扫描。同时我们也可以借鉴别人设计的引物,或者使用通用引物。
3.2 内标的选择
半定量RT-PCR检测基因m RNA相对表达水平必须要用在各种条件下表达水平稳定、表达量适中的看家基因作内对照。看家基因(housekeeping gene)是维持细胞最低限度功能所不可少的基因,这类基因在所有类型的细胞中都进行表达,这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的,而且在动物体内表达稳定,外界环境变化一般不会改变它的表达水平,所以叫看家基因,也有的叫持家基因或管家基因。
为了客观地比较不同样本中目的基因表达量的多少,消除由于反转录时总RNA浓度差异造成的误差,要选择合适的内标基因。其中最常用的GAPDH,β-actin,18Sr RNA。我们可以根据实际情况的不同,选择不同的内标基因作参照。
3.3 同管扩增或异管扩增的选择
同管扩增是内标基因和目的基因在同一个管内进行扩增。异管扩增是将二者分开来扩。
PCR扩增反应是酶促反应,遵循酶促反应定律。PCR扩增反应最初是以线性递增,即扩增产物呈指数累积,产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR技术正是利用产物与模板的这一线性关系,通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。但是随着酶活性下降和溶液中反应物的消耗,扩增反应会达到一个平台,进入平台期。在平台期继续扩增,低水平表达的目的RNA可能会增加,并与高水平表达的目的RNA浓度相近。因此选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见和定量,也可使扩增反应在到达平台期前的线性范围内进行。
半定量RT-PCR的关键是要保证所有样品的可比性,这就需要内标基因和目的基因进行同管扩增,但是,由于内标基因表达水平太高,常常是目的基因还在线性期,内标基因已经达到平台期,这样在进行同管扩增时,目的基因就会由于内标基因的竞争而受到抑制,从而降低扩增效率。因此有时采用异管扩增。但是,在将内标和目的基因分别扩增时,由于样品RNA及模板c DNA的量难以控制,使半定量RT-PCR测定值可信度降低。这样如何解决上面的问题就成了关键。
首先对循环数按照一定梯度设计好,然后对目的基因和内标进分别进行同管和异管扩增,然后电泳扩增产物,电泳结果经凝胶成像系统扫描分析各电泳条带的光密度值,以目的基因和内标基因的光密度值之比作为目的基因的相对表达量,对相对表达量值取对数,以对数值作为纵坐标,循环数作为横坐标,作出曲线图。然后找出二者的线性区和平台区,最后确定最佳的扩增循环数。
对相对表达量值取对数值是为了降低光密度扫描系统本身的系统差异。对所取的对数值进行统计分析,算出分管扩增时重复PCR扩增带来的批内差异,最终确定误差范围(2倍最大差异)。当两样品之间的差异小于2倍最大差异时,我们认为该差异是由系统造成的,两样品之间差异不显著,可以进行分管扩增。同时与同管扩增时的差异进行比较,若同管扩增的差异超过误差范围,即大于2倍最大差异,就采用异管扩增。
4 凝胶电泳及凝胶成像和定量分析
根据目的基因片段的大小配制适宜浓度的凝胶,将PCR扩增产物与微量溴酚蓝混合,在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶上进行电泳(溴化乙啶是一种诱变剂,操作时必须带专用的手套)。一般跑电泳都用琼脂糖凝胶。边杉等报道通过控制起始模板量,减少PCR循环数使目的基因的扩增处于PCR扩增指数期,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术,通过比较PCR扩增产物量的变化以分析目的基因表达水平的差异[4]。鉴定PCR扩增产物是否与预期的结果一致,一般采用标准Marker比较法,限制酶切图谱法,Southern杂交和核苷酸测序法等,其中最简单也最常用的是标准Marker比较法。选用Marker时,尽量选用含有与扩增产物相对应的条带的Marker。
电泳结束后,在凝胶电泳成像系统下拍照,并用其自带的分析软件对电泳结果进行定量分析,一般测定电泳条带的IOD值(intergrated optical density),目的基因相对表达量为其电泳条带的IOD值与内标基因的电泳条带的IOD值的比值,然后对数据进行统计分析,作出结论。
5 问题和展望
目前已有许多改进的检测方法和技术用于定量分析m RNA表达量,但在研究不同实验条件下特异基因表达水平的差异时,半定量RT-PCR因其费用低、普通实验室容易做到而被经常使用。然而,在将内标基因和特异基分别扩增时,由于样品RNA及模板c DNA的量难以控制,使半定量RT-PCR测定值可信度降低。尽管对试验研究而言,结果必须有好的重复性和精确性,但多数研究的焦点并不是检测转录水平微小的变化或确切的分子数目,而是检测其表达水平变化是否显著。所以半定量RT-PCR法分析m RNA水平相对变化能够满足许多研究的要求。如果将内标和特异基因在同一个管中扩增,只要反应参数选择得当,消除可能产生的引物对间的竞争,半定量RT-PCR完全可以准确地反映基因表达水平的变化。
竞争定量RT-PCR 篇3
荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度高, 并且可以有效的防止检测过程中样品的污染, 极大的提高了检测的准确性。此外荧光定量RT-PCR检测方法灵活性也好, 可一次获得样品的多个遗传信息, 这就大大的缩短了检测时间, 为A型流感病毒患者的治疗创造了最佳治疗时间。本次研究选取2011年9月至2012年3月我院收治的10例A型流感病毒感染者, 随机分为两组, 对照组5例进行常规检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。两组临床资料进行分析, 情况如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究病例10例, 其中女性6人, 男性4人, 年龄5~70岁。小孩4例和老人3例比重较大, 男女比例相当。10例患者中, 发烧咳嗽的有1例, 浑身酸痛流涕的有2例, 出汗咳嗽流涕的有1例, 发烧浑身酸痛的有2例, 发烧并且出汗的有1例, 浑身酸痛兼出汗的有1例, 发烧、浑身酸痛、出汗、咳嗽流涕的有2例。两组在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
对照组5例进行常规检测, 采用血清学检测方法和病毒分离培养方法进行检测。实验组5例采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计学软件, 计数资料行χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
实验组荧光定量RT-PCR方法检测时间短, 且具有特异高, 敏感性高的特点。这些特性对疾病治疗也有极大的帮助。对照组发现有3例病情加重, 其中1例并发淋巴系统疾病2例并发肺部细菌感染, 继发性肺炎主要症状表现为持续发烧、头痛、呕吐、恶心、嗜睡、食欲不振、吐浓痰、痰液黏稠且黄、少数痰中带血、病人面色发黄。并发淋巴系统疾病的患者表现为淋巴结中大、身体浮肿、淋巴管扩张扭曲、局部淋巴管管壁及其周围组织发生炎症细胞浸润、浸润的细胞中有大量噬酸性粒细胞。实验组有2例病人并发肺部细菌感染, 症状表现为发烧、恶心、呕吐、嗜睡惊厥等症状, 没有发现有淋巴系统病变的病例。经化验科检验, 肺部细菌感染的继发性肺炎主要是感染金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌和肺炎链球菌。实验组治疗时间为1~3周, 对照组治疗时间为2~4周, 其中有1例病情严重的为6周左右。有1例因病情恶化转移到上级医院去接受治疗。值得提醒的是, 在研究过程中发现A型流感病毒容易感染其他住院病人。而这些病人都是些免疫能力相对比较低的病患。见表1。
注:*与对照组比较1) P<0.05。
3 讨论
A型流感病毒具有很强的侵袭力, 而且对药物的治疗具有抵抗力的突变或是变异, 可以对病人的健康造成威胁。对照组并发症较高, 可能是因为血清学检测特异性和敏感性不高, 检验的准确性低从而有误诊影响到对疾病的治疗或是错误治疗诱发病毒变异, 这些因素都可能加重疾病或是引起并发症;病毒分离培养方法至少需要21d才能得到检测结果, 检测时间过长, 有些患者所感染的病毒在检验过程中可能已经发生突变或者是变异, 从而影响到治疗的效果。A型流感病毒极易突变, 不正确的治疗以及治疗时间过长均易导致突变, 从而加重治疗的困难性。而且突变后的A型流感病毒株具有更强的毒力和攻击性。此外, 耐药性也是一个不可忽视的问题, 在确诊之前采用广谱抗病毒药物, 不仅易导致耐药还可能导致突变从而贻误病机。从感染A型流感病毒的人群分析, 老人和小孩所占比重相对较大, 老人免疫系统功能退化而小孩免疫系统尚未发育好, 这两大人群共同特点就是免疫力比较差。因此加强对老人和小孩的保护也很重要。感染A型流感病毒后, 人体的免疫力降低, 原本寄居于人体的正常菌群如金黄色葡萄球菌变成致病菌, 从而引发一系列的感染。早期识别以及采取长期隔离防范措施看来对预防受到感染的免疫功能受损患者发生 (医院性) 流感病毒爆发不失为是一种谨慎的作法[1]。然而, A型流感病毒感染早期症状并不明显, 只有50%左右的有明显的类似于呼吸道感染疾病的症状。这就加重了防治的难度。到医院就诊的都是症状明显、病情较严重的患者。这就需要医院有快速的检测结果和尽早的治疗。荧光定量RT-PCR检测方法正好弥补了血清学、病毒分离检测方法的不足, 对A型流感病毒的检测时间短, 异性高, 敏感性好, 为疾病A型流感病毒感染的尽早治疗创造了条件。荧光定量RT-PCR检测方法不仅对A型流感病毒的治疗有积极作用, 而且有利于隔离传染源, 切断传播途径, 保护易感者, 减轻人们的恐慌心里和心理压力。有利于提高治愈率, 缩短治病时间, 提高病人的生活质量。
摘要：目的:探析荧光定量RT-PCR检测方法对A型流感病毒检测的快速性、敏感性和特异性以指导临床治疗。方法:选择我院2011年9月至2012年3月收治的10例感染A型流感病毒病人, 随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果:实验组的确诊率和治疗效果均高于对照组, 且所用的检测时间和治疗时间均短, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:荧光定量RT-PCR检测A型流感病毒准确率高, 对临床治疗有积极的指导作用。
关键词：荧光定量RT-PCR,A型流感病毒,检测方法
参考文献
竞争定量RT-PCR 篇4
1 材料与方法
1.1 标本
黑龙江省2012年58例散发风疹疑似病例, 采集发病早期患者的血清标本和咽拭子标本。标本在冷藏条件下运送风疹实验室。
1.2 风疹Ig M抗体测定
血清标本进行风疹Ig M抗体检测。使用德国维润赛润公司生产的试剂盒进行风疹Ig M抗体检测。
1.3 real-time RT-PCR检测
咽拭子标本进行real-time RT-PCR检测。使用QIAGEN公司生产的试剂盒进行风疹病毒RNA提取。引物、探针和反应体系采用北京金豪公司生产的试剂盒。反应结束后通过荧光定量PCR仪对结果进行判定。
2 结果
2.1 血标本采集与患者出疹时间间隔
58例风疹疑似病例血标本, 采集血标本最短时间是出疹当天采集, 最长时间是出疹后7天采集, 其中多数病例是在出疹后2~3天采集的。出疹3天内采集的血标本占总标本数的63.8%。
2.2 风疹疑似病例临床标本的检测
在58例风疹疑似病例中, 应用real-time RT-PCR法对咽拭子标本进行风疹病毒核酸检测, 结果均为阳性;应用ELISA法检测风疹Ig M抗体, 48份为阳性, 占82.8%;10份为阴性, 占17.2%。在10份阴性血清标本中, 有5例再次采集了血标本, 其风疹Ig M抗体检测结果为阳性。见表1。
3 讨论
风疹和麻疹都为发热出疹性疾病, 由于临床症状相似, 在临床上不易区分, 临床风疹病例往往可能误诊为麻疹, 因此, 在消除麻疹的关键阶段, 特异性的实验室诊断显得尤为重要[2]。
目前RV的实验室诊断主要有以下3种方法:血清学方法、病毒分离、分子生物学方法等。血清学方法 (ELISA) 是一种快速、传统的实验室诊断方法, 但由于在发病早期风疹Ig M抗体产生较少或不产生[4], 在出疹后的前3天内, 风疹特异Ig M抗体检测可能会出现50%的假阴性结果[5]。通常情况下, 患者采血时间往往处于发病的初期, 本文中患者采血时间在出疹后3天内采集的标本数占总标本数的63.8%, 所以临床上用ELISA法检测风疹Ig M抗体作为确诊指标, 会发生假阴性的结果, 造成误诊[6]。相比之下, 咽拭子采集的最佳时间是患者出疹后3天内。咽拭子标本适用于病毒分离和分子生物学检测, 但对于风疹病毒分离来说, 由于所需时间较长, 不适于对病例早期诊断, 在实际诊断中很少使用。而近年来发展起来的实时荧光定量RT-PCR技术具有敏感、快速、简便和检测时间短等优点, 适用于作病例早期诊断的实验室检测依据。本文对58例患者的血清标本和咽拭子标本检测中也证实了这一点, 用real-time RT-PCR法检测咽拭子标本阳性率为100%, 而ELISA法检测风疹Ig M抗体阳性率为83%。对于在检测阴性的10份标本中, 有5份采集了第二份血清标本, ELISA法检测风疹Ig M抗体均为阳性。由此可见, real-time RT-PCR技术更适合于作病例早期诊断的实验室检查依据, 可作为ELISA法的一个补充诊断方法。
real-time RT-PCR法和ELISA法相结合对病例进行早期诊断, 不仅可以及时发现、诊断风疹病例, 为疫情处理赢得宝贵时间, 而且还可以提高实验室诊断阳性率, 减少假阴性的发生。
参考文献
[1]Yan Y.Epidemiologic and clinical features of measles and rubella in a ruralareainChina[J].JChinMedAssoc, 2005, 68 (12) :571-577.
[2]朱贞, 许文波, 李聪勇, 等.用一种新型诊断方法-比色法免疫学实验在检测风疹病毒中的应用研究[J].中国计划免疫, 2006, 12 (6) :489-494.
[3]陈刚, 张永乐, 徐爱芳, 等.麻疹病毒荧光定量RT—PCR反应体系的建立[J].中国卫生检验杂志, 2008, 18 (9) :1797-1798.
[4]张金菊, 牛桓彩.实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用[J].国际检验医学杂志, 2011, 32 (2) :256-257.
[5]Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubella virus infection[S].2ndedition, WHO.GenevaSwitzerland, 2007.32.
竞争定量RT-PCR 篇5
IBV属于冠状病毒科,病毒基因组为单股RNA, 易发生基因突变,导致病毒血清型众多、致病性复杂[6],目前IBV仍在不断变异,不时出现新的基因型并引起抗原性变异[7,8,9,10]。在临床上,IB与新城疫、禽流感、传染性喉气管炎等疾病的症状相似,这给疾病的诊断造成了困难。目前,检测IBV的方法有血清学、分子生物学等方法[11,12,13],但这些方法在特异性、 敏感性和时效性等方面都有缺陷。近年发展起来的Real - time RT - PCR技术具有快速、灵敏、特异、定量等优点。本研究旨在建立快速检测IBV的Real time RT - PCR技术,现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1毒株
IBV H120系、新城疫病毒 ( NDV) La Sola系、禽流感病毒( AIV) 、传染性喉气管炎病毒( ILTV) 、马立克病毒( MDV) 和传染性法氏囊病毒( IBDV) ,均由广西区动物疫病预防控制中心保存。
1.2主要试剂和仪器
一步法荧光定量RT - PCR试剂盒、胶回收试剂盒、DNA/RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、p MD18 - T载体,均购自Ta KaRa公司; DH5α 感受态细胞,购自Tiangen公司; 荧光定量PCR仪( 型号为ABI Step One Plus) ,ABI公司生产。
1.3引物与TaqMan探针的设计与合成
根据Gen Bank收录的IBV基因序列保守区域, 设计1对特异性引物及相应的Taq Mam探针。引物序列: 上游引物5' - AGCAGCAATCTATTCATC - 3', 下游引物5' - CCAAGAACTTGAATGATTC - 3',扩增片段长度 为77 bp。 探针序列: JOE - TCTCAGAACTCGTGGCAGCA - BHQ1,探针的5' 端以荧光报告基团JOE标记,3'端以荧光淬灭基团BHQ1标记。 引物和探针均由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。
1.4病毒RNA的提取与cDNA合成
参照DNA/RNA提取试剂盒说明书提取鸡胚尿囊液中的总RNA,按照DNA/RNA提取试剂盒说明书用下游引物进行反转录来合成病毒c DNA。
1.5阳性标准模板的制备
对获得的c DNA进行PCR扩增,PCR反应体系: 上、下游引物各0. 2 μmol/L,5 × PCR Buffer 10 μL, Ta KaRa Ex Taq HS 0. 5 μL,c DNA 10 μL,用dd H2O补至50 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共30个循环; 72 ℃ 7 min。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的DNA片段,将目的片段与p MD18 - T载体于16 ℃ 连接过夜,转化DH5α 感受态细胞,经质粒PCR鉴定为阳性后命名为IBV - P,用核酸蛋白分析仪测定阳性质粒浓度,并换算成拷贝数。
1.6Real-timeRT-PCR方法的建立
1. 6. 1Real - time RT - PCR反应体系与反应条件的优化参考一步法荧光定量RT - PCR试剂盒推荐的反应体系和条件,在相同浓度模板和反应体系中, 采用矩阵法确定引物和探针的最佳浓度。在以上参数优化的基础上,进行荧光定量RT - PCR循环参数的优化,整个优化过程综合考虑Ct值、荧光强度、重复性等,确定反应条件。
1. 6. 2标准曲线的建立对阳性质粒标准品进行10倍梯度稀释,取浓度为3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝/μL的阳性质粒标准品作为模板,根据优化后的体系和条件进行Real - time RT - PCR反应,建立标准曲线,并得出反应的扩增效率和曲线的相关系数。
1. 6. 3敏感性试验取浓度为3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝/μL的阳性质粒标准品作为模板,根据优化后的体系和条件进行Real - time RT - PCR反应,同时以常规RT - PCR反应作为参比方法,检测其灵敏度。
1. 6. 4特异性试验分别取IBV、NDV、MDV、IBDV、AIV、ILTV的等量样 品提取病 毒RNA ( 或DNA) ,采用所建立的Real - time RT - PCR方法进行检测。
1. 6. 5重复性试验取5个10倍梯度稀释的阳性质粒标准品,按照所建立的Real - time RT - PCR方法分别进行批内、批间检测的可重复性试验。批内检测时,每个浓度设3个重复; 批间检测时,进行3次独立检测,每次间隔10 d,计算Ct值的平均值和变异系数( CV) 。
1.7临床样品的检测
对广西区动物疫病预防控制中心收集、保存的185份历年鸡肺脏、气管、脾脏等组织进行检测。将每份样品分成2份,提取病毒核酸,其中一份进行Real - time RT - PCR检测,另一份进行常规RT -PCR检测,以评价其临床实用性。
2结果与分析
2.1阳性质粒浓度的计算
经测定阳性质粒的OD260/ OD280= 1. 81,则质粒浓度为0. 094 μg/μL,其拷贝数为3. 1 ×108拷贝/μL。
2.2Real-timeRT-PCR方法的建立
2. 2. 1Real - time RT - PCR反应体系与反应条件的建立经优化确定了最终反应体系与反应条件。 反应体系: ( 总体积为20 μL) : 2 × One Step RT - PCR Buffer Ⅲ 10 μL,Ta KaRa Ex Taq HS 0. 4 μL,Prime-Script RT Enzyme Mix Ⅱ 0. 4 μL,Rox Reference Dye Ⅱ( 50 × ) 0. 4 μL,上游引物、下游引物、探针各0. 8 μL,模板RNA 3 μL,加双蒸水补至20 μL。反应条件: 42 ℃ 反转录5 min; 92 ℃ 预变性10 s; 92 ℃ 3 s,54 ℃ 收集荧光30 s,共40个循环。
2. 2. 2Real - time RT - PCR标准曲线的建立通过Real - time RT - PCR反应得到检测IBV的标准曲线,见图1。阳性质粒标准品具有良好的线性关系, 相关系数( R2) = 0. 997,扩增效率( E) = 1. 142。
2. 2. 3敏感性试验结果经检测: Real - time RT -PCR反应的最低检出限为3. 1 × 101拷贝/μL,见图2; 常规RT - PCR反应的检 测极限为3. 1 × 103拷贝/μL,见图3。Real - time RT - PCR与常规RT -PCR相比,敏感性高100倍。
2. 2. 4特异性试验结果经测定,仅IBV出现扩增曲线,而NDV、ILTV、IBDV、MDV、AIV和空白对照均未出现扩增曲线,说明针对IBV设计的检测引物和探针特异性好。
2. 2. 5重复性试验结果见表1。
由表1可知,批内检测变异系数为0. 38% ~0. 76% ,批间检测变异系数为0. 86% ~ 1. 35% ,均小于2. 00% ,说明所建立的Real - time RT - PCR方法具有良好的可重复性。
1 ~ 7. 3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝 /μL; 8. 阴性对照。
M. DL - 500 bp Marker; 1 ~ 7. 3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝 /μL。
2.3临床样品的检测结果
利用建立的Real - time RT - PCR方法,对广西区动物疫病预防控制中心收集、保存的185份病料核酸进行检测,结果显示,检出IBV 2份,阳性率为1. 08% ,检测结果与常规RT - PCR结果一致。
3讨论
本研究建立的检测IBV的Real - time RT - PCR方法特异性好,只从IBV阳性病料中检测到特异性的扩增信号,不与检测的其他常见家禽传染病病毒发生特异性反应。试验所建立的标 准曲线的R2= 0. 997,E = 1. 142,说明核酸拷贝数的对数值与Ct值之间有极显著的线性关系,优化的体系和条件很好地满足了试验要求。重复性试验得出组内和组间变异系数为0. 38% ~ 1. 35% ,说明此方法具有很好的准确性和重复性,可以稳定地用于IBV核酸的定量检测。试验建立的曲线可检测到3. 1 × 101拷贝/μL的初始模板量,检测敏感 性比常规RT - PCR提高100倍。检测量大,一次可以检测96份样品,整个反应都在密闭系统内进行,避免了样品间的污染。检测速度快,从样品处理( 包括RNA的提取、PCR等) 到试验结束,大约需要4 h,比其他血清学检测方法节省时间,准确性高。Taq Man探针只与特异性模板发生反应,假阳性率低,与SYBR GreenⅠ相比,不需要考虑引物二聚体和其他非特异性扩增[4]。
4结论
竞争定量RT-PCR 篇6
mi RNA(Micro RNA)是一类新发现的与癌症密切相关的重要分子,它在进化上极为保守。是长度约22个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA。在动物中,绝大多数mi RNA可通过与靶m RNA的3'UTRs(untranslated regions)近乎完全互补结合在转录后水平使其降解,或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成,从而在基因表达中发挥重要的调节作用[1]。在人体内大约发现的500种mi RNA,主要通过与m RNA碱基互补从而抑制目标m RNA的翻译或者降解目标m RNA,同一个mi RNA可以调节多个m RNA。Lewis[2]等预测人类至少有三分之一的基因受mi RNA调控,平均每个mi RNA调节人类200种不同的m RNA,而且多个mi RNA能够协调活动以调节一些特殊的目标靶基因。
在生物体中,mi RNA的特异性不强,往往一个mi RNA作用于多个靶基因[3],其调控主要通过两种机制调控基因的表达[4],其一是当mi RNA序列与靶基因m RNA的3'UTRs碱基近似完全互补配对时则进行切割,促使靶基因的m RNA发生降解[5];另一作用机制是mi RNA通过与靶基因m RNA的3'UTRs碱基不完全匹配结合,抑制靶基因m RNA翻译表达,进而发挥其功能,但不影响靶基因m RNA的稳定性[6]。近年来国际上对于mi RNA与乳腺癌的相关研究进展很快。研究表明,在人类乳腺癌细胞中,特定mi RNA的表达缺失或表达上调会使这些癌细胞具有潜在的转移性。
mi R-335的表达能诱导细胞形态改变减少细胞运动性,它限制细胞侵袭转移。可能与mi R-335负调控一组与肿瘤远端转移相关的靶基因转录因子SOX4细胞外基质成分钙黏蛋白C有关[7],从而抑制肿瘤细胞的转移和迁徙。重建mi R-335能够在体内水平有效抑制肿瘤细胞的肺转移和骨转移。实验主要从组织学角度出发,本次试验证明mi R-335可能在乳腺肿瘤细胞的发生、发展过程中主要起抑癌基因的作用。并且怀孕次数越多的妇女,正常组织中的mi R-335表达越高,但mi R-335的表达水平与患者的年龄、生产次数、哺乳最长时间、共哺乳时间、肿瘤大小、TMN分期、肿瘤分期、淋巴结转移、雌激素受体、孕激素受体、Her-2、P53以及ki-67等临床指标均未发现有相关性。
1 资料和方法
1.1 标本来源
本实验所采用的标本来自云南省肿瘤医院乳腺病科及解放军昆明总医院普通外科2010年6月至2010年12月外科手术切除的乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织(距离原发病灶5cm)20例。均为女性患者,平均年龄48.25岁,所有标本均经过病理学证实。患者手术前、手术中均未进行过放疗、化疗及免疫治疗等。手术切除的新鲜标本均立即放入加有RNAlater solution(AMBION)5ml的Rnase free冻存管中,并且按照厚度小于0.5cm的新鲜组织(如果厚度大于0.5cm先切薄)浸入5~10倍体积的RNAlater solution中为标准保存组织。
1.2 总RNA的提取
按照Trizol法提取组织总RNA,先称取0.05~0.1g组织,放入EP管后加入Trizol(invitrgen)1ml使用Handy pestle进行充分研磨。将研磨匀浆后的组织悬液严格按照Trizol(invitrgen)操作说明提取总RNA。提取后的样品均使用紫外分光光度仪评估RNA的浓度及纯度。
1.3 逆转录及实时荧光定量RT-PCR
c DNA的合成采用Universal c DNA synthesis kit(EXIQON),严格根据操作说明进行,每一合成反应体系中包含约2μl的5x Reaction buffer,5μl的Nucleasefree water,1μl的Enzyme mix和2μl稀释为5ng/μl的总RNA,采取42℃水浴1小时,95℃水浴5分或者PCR仪完成逆转录。实时荧光定量RT-PCR反应采用LNAtm PCR primer set(EXIQON),严格按照操作说明进行,反应总体系为10μl,其中含有SYBR Green master mix5μl,PCR primer 1μl,c DNA模板4μl。其中的引物序列由EXIQON公司提供。应用ABI-7900HT荧光定量仪进行实时荧光定量RT-PCR。在扩增mi RNA-335的同时,还扩增了U6作为内对照即内参,待测mi RNA-126的量通过2-△CT法确定△△CCT=癌组织[CT(mi RNA)-CT(U6RNA)]-癌旁正常组织[CT(mi RNA)-CT(U6RNA)]。癌组织及癌旁正常乳腺组织均经过病理学证实,实时荧光定量RT-PCR结果为3次独立实验的校正结果。
2 结果
最终所选择的mi R-335在反应体系中均能有效扩增,根据CT值间的比较,采用配对t检验法分析每一组织mi RNA-126的变化比率,用以评估mi R-335在乳腺癌和癌旁正常组织的表达情况。根据数据分析得出的结果,笔者发现癌组织中mi R-335的表达量低于正常组织中的表达量P<0.0001。数据库录入患者的各项临床指标做统计学处理,采用Spearman相关(检验水准α=0.05)分析mi R-335表达水平与患者临床各项指标之间的关系时发现怀孕次数越多的妇女,正常组织中的mi R-335表达越高(P=0.0371;相关系数=0.59242),表1。
3 讨论
实时荧光定量RT-PCR在空间表达分辨率、准确性、灵敏度、特异性等方面较之Northern杂交分析及芯片分析有绝对倾倒性的优势[8]。并且该实验采用LNA(Locked Nucleic Acid)技术,即锁核苷酸技术。它由一类新的二环高亲和性RNA类似物组成,其中通过引入2'-O,4'-C亚甲基桥,使糖-磷酸骨架的呋喃糖环被化学锁定而形成N型(内部C3')结构的RNA模拟物,LNA修饰的寡核苷酸链在与其标靶RNA分子杂交时具有前所未有的热稳定性。故在此基础上,在检测mi RNA-126时利用LNA修饰的探针做Northern杂交。用LNA修饰的探针灵敏度比末端标记的同序列DNA探针至少高出10倍,这便能节省总RNA的用量。另外值得一提的是,LNA可以改善错配识别,使得LNA介导的高亲和性杂交符合标准Watson-Crick碱基互补配对原则而不会出现碱基配对差错。
注:与正常组织ΔCT值相比,*P<0.0001
mi RNA的高度保守性在调节基因在生命活动中发挥着重要作用,其在肿瘤中的研究提示其在肿瘤诊断中将有广泛的应用价值,该领域的研究发展很快,已经成为当前生命科学研究的热点和焦点。Mattie等[9]报道,利用高通量p RT-PCR方法,mi RNA表达谱可以作为独立参数从活检标本中区分Erb B2阳性与Erb B2阴性,ER阳性与ER阴性的乳腺癌,提示可以作为新的肿瘤标志物应用于乳腺癌这样活检标本很小的肿瘤。
相对于传统DNA及m RNA水平的诊断方式而言,在时间及准确性上mi RNA能够更早地提示癌变。并且mi RNA作为重要的肿瘤抑制基因或癌基因,可以对于那些作为癌基因的mi RNA采用特异性敲除来抑制肿瘤生长,对于那些作为抑癌基因的mi RNA采用人为引入的方法来针对肿瘤进行治疗,或者将来若使用合成的反义核苷酸与作为癌基因的mi RNA互补,如抗mi RNA的寡核苷酸,可靶向性抑制mi RNA的功能,减慢肿瘤生长。这种更稳定及低毒性的特点很有可能在肿瘤的基因治疗中发挥巨大作用。因此,mi RNA有望成为一些肿瘤早期诊断、恶性分级的重要指标[10]。
参考文献
[1]Llave C,Xie Z,Kasschau KD,et al.Cleavage of Scarecrow-like m RNA targets directed by a class of Arabidopsis mi RNA[J].Science,2002,297(5589):2053-2056.
[2]Lewis BP,Burge CB,Bartel DP,Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are micro RNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.
[3]Abrahante JE,Daul AL,Li M,et al.The Caenorhabditis elegansn hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmentalntime and is regulated by micro RNAs[J].Dev Cell,2003,4(5):625-637.
[4]Bartel DP.Micro RNAs:genomics,biogenesis,mechanism and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.
[5]Hornstein E,Mansfield JH,Yekta S,et al.The micro RNA miR-196 acts upstream of Hoxb8and Shh in limb development[J].Nature,2005,438(7068):671-674.
[6]Wightman B,Ha I,Ruvkun G.Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4mediates temporal pattern formation in C.elegans[J].Cell,1993,75(5):855-862.
[7]Tavazoie SF,Alarcon C,Oskarsson T,et al.Endogenous human micro RNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature,2008,451(7175):147-152.
[8]Schmittgen TD,Lee EJ,Jiang J,et al.Real-time PCR quantification of precursor and mature micro RNA[J].Methods,2008,44(1):31-38.
[9]Mattie MD,Benz CC,Bow ers J,et al.Optimized high 2th roughput micro RNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical p ro state and breast cancer biop sies[J].Mo l Cancer,2006,5(1):24.
竞争定量RT-PCR 篇7
实时荧光定量PCR技术是一种新的DNA/RNA定量检测技术,具有操作简便、结果直观、特异性强、敏感性高、重复性好、稳定性好等优点,克服了以往PCR技术中存在假阳性和不能准确定量的缺点,已被越来越多地应用于病毒的定量分析、病原体的分型鉴定和基因的快速诊断分析方面[1]。
试验应用荧光定量RT-PCR方法定量检测PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫仔猪攻毒前后病毒在体内各组织中的动态分布规律,揭示HuN4活疫苗和JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后病毒在体内的复制情况,以期为PRRSV变异株疫苗免疫机理的研究和更好地预防PRRS提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 疫苗和毒株
PRRSV变异株(HuN4)活疫苗由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蓝耳病课题组提供,10头份/瓶,用PBS稀释至10 mL,病毒含量为1×105.0TCID50/mL;PRRSV变异株(JXA1)灭活苗由某公司生产;强毒为PRRSV变异株HuN4-F5,也由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所蓝耳病课题组提供,病毒含量为3×105.0TCID50/mL。
1.1.2 试剂和仪器
总RNA抽提试剂盒,购自上海生工生物工程技术服务有限公司;CIVTEST SUIS PRRS抗体检测试剂盒,购自LSI公司;禽原反转录酶(AMV)、RNA酶抑制剂、rTaq DNA 聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶(Hot Start Version),TaKaRa公司产品;RotorGene3000荧光定量PCR仪,Corbett 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 试验动物及设计
取25头约35日龄的健康断奶仔猪,经RT-PCR和ELISA血清学检测PRRSV抗原和抗体均为阴性,隔离饲养1周后随机分为3组(见表1)。免疫后第21天3个组仔猪均用PRRSV变异株HuN4-F5强毒攻毒, HuN4活疫苗组和JXA1灭活苗组仔猪在免疫后7,14,21天剖杀,每次每组1头;3个组仔猪于攻毒后1,5,9,14,21天剖杀,每次每组1头;剩余仔猪在攻毒后21天全部剖杀;无菌取脑、扁桃体、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肺门淋巴结、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃等组织器官,备用。
1.2.2 病毒RNA的提取和cDNA的合成
无菌取各脏器任意部位,重量在0.01～0.1 g之间;用1 mL预冷PBS研磨成匀浆,反复冻融3次;3 000 r/min离心5 min,取300 μL上清液,提取总RNA;溶于30 μL DEPC处理水中,进行反转录PCR,合成cDNA。反转录PCR体系(10 μL):总RNA模板 5.25 μL、5×AMV Buffer 2 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、随机引物(50 mmol/L) 0.5 μL、AMV(5 U/μL)1 μL、RNA酶抑制剂(40 U/μL)0.25 μL。反转录PCR程序:25 ℃ 10 min,42 ℃ 1 h,0 ℃ 2 min。
1.2.3 荧光定量RT-PCR检测组织中的病毒含量
采用韦天超等[2]的猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法检测血清中的病毒含量,并对其取以10为底的对数值作图。
2 结果与分析
2.1 HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在各组织中的动态分布
HuN4活疫苗免疫仔猪后,免疫期间病毒在颌下淋巴结、肺门淋巴结、肺脏和肾脏中持续存在,病毒载量较低,而在肝脏和脾脏中始终检测不到;免疫后第7天仅在颌下淋巴结、肺门淋巴结和肺脏中检测到,肺脏中病毒载量最高,达4.9×105copies/g;脑、扁桃体、腹股沟淋巴结、心脏和胃仅在免疫后14天检测到,免疫后14天病毒在各组织分布最广,病毒载量最高,达1.7×106copies/g;免疫后21天病毒载量呈下降趋势(见图1)。攻毒后病毒在淋巴结、脾脏和肺脏中持续存在,胃中没有检测到病毒;脑仅在攻毒后9天检测到,病毒载量较低,达1.5×104copies/g;心脏、肝脏和肾脏仅在攻毒后9,14天检测到;攻毒后1天仅在扁桃体、颌下淋巴结和肺门淋巴结中检测到,病毒载量较低,最高达6.4×105copies/g;攻毒后5天仅在肺门淋巴结检测到,病毒载量为1.83×104copies/g;攻毒后9天病毒遍布除胃以外的所有组织,病毒载量达到高峰,最高达1.0×108copies/g;攻毒后14天各组织中的病毒载量开始呈下降趋势;攻毒后21天仅在淋巴结、脾脏和肺脏中检测到,但淋巴结中病毒载量较高,达2.4×107copies/g(见图2)。
2.2 JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在各组织中的动态分布
JXA1灭活苗组免疫期间各组织中没有检测到病毒。攻毒后病毒在免疫器官、心脏、肺脏和肾脏中持续存在,脑和胃中很少检测到,且病毒载量较低,最高达3.2×105copies/g;攻毒后1天仅在扁桃体、淋巴结和肝脏中检测到,腹股沟淋巴结中病毒载量最高,达2.7×108copies/g;攻毒后5天病毒遍布除脑和胃以外的其他组织,但扁桃体和淋巴结中病毒载量降低;攻毒后9天病毒遍布所有组织,免疫器官、心脏和肺脏中病毒载量较高,最高达5.9×107copies/g;攻毒后14天病毒载量开始呈下降趋势;攻毒后21天病毒仍存在于除脑、肝脏和胃以外的其他器官中(见图3)。
2.3 对照组攻毒后PRRSV在各组织中的动态分布
对照组攻毒后病毒在免疫器官和心脏中持续存在,攻毒后1天病毒遍布除胃以外的所有器官,免疫器官扁桃体和淋巴结中病毒载量达到高峰,腹股沟淋巴结中病毒载量最高,达2.4×109copies/g;攻毒后5天扁桃体和淋巴结中病毒载量降低,其他组织中病毒载量升高,胃中病毒载量最高,达4.1×109copies/g;攻毒后9,14天除脾脏和胃中病毒载量降低外,其他各组织中病毒载量均明显升高;攻毒后21天病毒载量呈下降趋势(见图4)。
3 讨论与小结
目前,用于预防PRRS的疫苗主要是常规疫苗,即灭活苗和弱毒苗,其在控制PRRS传播和蔓延方面发挥了巨大作用,灭活苗的优点是安全性好,缺点是免疫剂量大、免疫次数多、免疫产生期较长,因而不适合仔猪免疫[3]。弱毒苗虽然具有免疫产生期快等优点,但存在着安全性和毒力返强问题。
试验结果表明,HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒后PRRSV在体内各组织的分布、持续时间及载量明显较对照组和JXA1灭活苗组低,表明HuN4活疫苗能够明显抑制病毒在体内的复制,攻毒后1天仅在扁桃体和淋巴结两个免疫器官中检测到病毒且含量较低,表明免疫产生期较快,攻毒前后病毒均主要分布在免疫器官扁桃体、淋巴结和肺脏中,表明扁桃体和淋巴结是产生免疫反应的主要器官。 JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后病毒在各组织中的分布和复制情况与对照组相似,但较对照组病毒载量降低,表明JXA1灭活苗也对病毒复制具有一定的抑制作用,而且JXA1灭活苗组于攻毒前期病毒在各组织的分布和载量一直居高不下,直到攻毒后14天才有降低趋势,表明JXA1灭活苗的免疫产生期较长,但是攻毒前没有检测到病毒,表明JXA1灭活苗安全性好。对照组攻毒后病毒遍布所有组织,且在各组织中持续时间较长,而HuN4活疫苗和JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后脑和胃中没有检测到病毒或持续时间明显减短,表明疫苗免疫后能明显抑制病毒在脑和胃中的复制,各组攻毒后在扁桃体和淋巴结中病毒载量较高,而且病毒在淋巴结中持续存在,表明淋巴结是PRRSV持续性感染的主要位置。
Nilubol D等[4]报道,灭活苗免疫后攻毒不能保护仔猪对PRRSV的感染。 本试验结果表明:HuN4活疫苗免疫仔猪后能够快速激发免疫反应,攻毒后明显抑制病毒在体内的复制;而JXA1灭活苗免疫仔猪攻毒后病毒在体内的复制情况与对照组相似,但较对照组轻,对病毒的复制也具有一定的抑制作用。
摘要：为了更好地了解高致病性PRRSV疫苗的免疫机理,试验应用荧光定量RT-PCR方法比较了PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在体内动态分布的差异。结果表明:HuN4活疫苗组攻毒后,病毒在各组织中的含量明显低于JXA1灭活苗组和对照组;JXA1灭活苗组攻毒后,病毒在各组织中的分布、载量与对照组相似,但较对照组轻。说明HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒后,能明显抑制病毒在各组织中的复制,其免疫效果明显优于JXA1灭活苗。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒,荧光定量RT-PCR,抗原的动态分布
参考文献
[1]SIRINARUMITT,SORDEN S D,MOROZOV I,et al.Double in situ hybridization for simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)and porcine circovirus(PCV)[J].J Vet Diagn Invest,2001,13(1):68-71.
[2]韦天超,田志军,安同庆,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J].中国预防兽医学报,2008,30(12):944-948.
[3]蔡雪辉,李艳华,刘永刚.PRRS疫苗研究进展及PRRS的综合防制[J].畜牧兽医科技信息,2004(4):49-51.