铁蛋白定量（精选4篇）
铁蛋白定量 篇1
测定蛋白质含量的方法有多种, 从古老经典的凯氏定氮法发展至今, 已经发展了几十种蛋白含量测定方法。每种方法都具有一些独特而有用的特性, 但在应用方面也有一定局限性。本文主要对凯氏定氮法、吸光光度法、荧光光度法、共振光散射法、和近红外光谱技术进行蛋白质定量分析的现状及发展前景做如下综述。
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法, 是一种经典的测定蛋白质含量的方法。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化, 含氮有机物分解产生氨, 氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收, 再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
凯氏定氮法的优点是适用范围广泛, 测定结果准确, 重现性好。它是目前分析有机化合物含氮量常用的方法, 是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一, 被国际国内作为法定的标准检验方法。其缺点是操作复杂费时, 试剂消耗量大。
宋鹏等[1]对凯氏定氮法中消化这一过程进行了改进, 用高温持续消化的方法代替国标的小火碳化消化法。大大缩短了工作时间, 提高了工作的效率, 适于广泛推广。但高温消化方法并不适用于免疫球蛋白含量较高的样品的蛋白含量检测, 其原因有待于进一步探索。
自奶粉的“三聚氰胺”事件发生以来, 凯氏定氮法在氮含量检测方法中的标准地位再一次被确定。凯氏定氮法应用于食品粗蛋白含量测定时, 其测定结果所反映的含氮物质中包括无机含氮化合物。这类非蛋白无机氮易溶于水, 而蛋白质在一定碱性条件下与重金属盐类发生盐析作用而产生沉淀, 此沉淀不溶于热水。用热水洗涤, 将水溶性含氮物洗去, 剩下的沉淀物用凯氏定氮法测定, 便可得到真实的蛋白质含量[2]。由此可见, 凯氏定氮法在食品质检部门发挥了巨大的作用。
2 吸光光度法
吸光光度法是基于物质对不同波长光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法[3]。常用的波长范围为: (1) 200-400nm的紫外光区, (2) 400-760nm的可见光区, (3) 2.5-25μm (按波长计数为4000cm<-1>-400cm<-1>) 的红外光区。蛋白质光度定量分析方法便是应用紫外、可见光谱快速测定蛋白质浓度的一种方法[4]。以下便对这两种方法进行简要介绍:
2.1 紫外吸光光度法
蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键, 使蛋白质具有吸收紫外光的性质, 吸收峰在280nm处, 其吸光度与蛋白质含量成正比。此外, 蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系, 可以进行蛋白质含量的测定。在280nm波长下的蛋白检测范围为20μg-3000μg。
2.2 可见吸光光度法
2.2.1 双缩脉 (Biuret) 法[5], 双缩脲 (NH
3CONHCONH 3) 是两个分子脲经180℃左右加热, 放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中, 双缩脲与CuSO 4形成紫色络合物, 称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键, 或能够以1个中间碳原子相连的肽键, 这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比, 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关, 故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg。
2.2.2 Lowry法 (又名Folin-酚试剂法) [6], Folin-
酚试剂法是由LOWRY在双缩脲法的基础上发展起来的一种方法。他在双缩脲试剂的基础上又增加了一种增强显色的试剂-磷钼酸和磷钨酸的混合液, 它们被蛋白质中酪氨酸残基的酚羟基还原, 产生深蓝色 (钼蓝和钨蓝的混合物) , 在一定的条件下, 蓝色混合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比, 故可用来测定蛋白质含量。
该测定方法的优点是灵敏度高, 比双缩脲法灵敏得多, 此法可检测的最低蛋白质量达5μg, 通常测定范围是5-100μg;缺点是费时较长, 要精确控制操作时间, 干扰物质多, 通常只适合于测定蛋白质的相对浓度[7]。
2.2.3 二甲酸喹啉 (BCA) 法, BCA法是近年来广为应用的
蛋白定量方法。其原理与Lowry法相似, 即在碱性溶液中, 蛋白质将Cu2+还原成Cu+, BCA与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物, 在562nm处具有最大吸收峰, 在一定条件下, 此复合物的吸光度与蛋白质浓度成正比。
此法的优点是试剂单一, 终产物稳定, 与Lowry法相比, 此法所用试剂及生成的呈色物质都更稳定, 除对还原性糖类的干扰敏感外, 对其他物质包括常用蛋白质增溶的表面活性物质如SDS等均无影响, 是更优越的用于检测总蛋白质含量的产品。与Bradford法相比, BCA法的显著优点是受杂质影响较小[8]。此法测定不同蛋白质时, 测值变化差别小。对含有0.2-50μg/mL的蛋白质液可精确测定, 是目前已知的最灵敏的蛋白质检测试剂之一。但是该方法的反应时间长, 蛋白质也会发生不可逆的变性。
2.2.4 Bradford法又称考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G 250是一种有机染料, 在游离状态下呈红色。该染料多以阴离子形式与蛋白质结合且结合后显蓝色, 在595nm处具有最大吸收峰, 蛋白质在此处的吸光度与蛋白质含量成正比[9]。它是目前灵敏度较高的蛋白质测定方法, 通常测定范围为1-50μg。
3 荧光光度法
荧光法是定量测定蛋白质的另一种方法, 通常比分光光度法更灵敏。用于蛋白质定量分析的荧光法分为两大类:内源荧光法和外源荧光法 (即荧光探针法) 。
3.1 内源荧光法
由于蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸, 故蛋白质本身能吸收270-300nm的紫外光而发生紫外荧光。有文献报道, 用紫外光照射动物蛋白质中性萃取液, 然后于340-350nm处测量其荧光强度, 可用于牛乳中蛋白质的测定。在测定条件下核酸、嘌呤和嘧啶都不发生荧光, 不干扰蛋白质测定。
3.2 外源荧光法 (荧光探针法)
与光度法类似, 蛋白质在和某些具有荧光特性的染料结合后, 能引起荧光强度的变化, 并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度呈正比, 因此可用于蛋白质含量的测定。已见报道的荧光染料探针有藻红B、血管黄素、曙红Y、TPCC、铬天青S等。
荧光法测定蛋白质含量最大的优点是灵敏度高, 但是仅适用于具有荧光的体系, 使方法的使用范围受到限制。
目前, 在一种新型的荧光探针-寡核苷酸探针[10]的基础上, 我们开发出了一种低触发的荧光探针-RETF探针。它在作用于富含精氨酸的蛋白质时, 在450mn处的荧光强度会增加。因此, 主要用于富含精氨酸蛋白质的检测。其优点是可产生永久的荧光信号, 但还存在适用范围小的不足。
4 共振光散射法
蛋白质多肤链上各部分的非极性侧链在酸性条件下带正电荷, 强烈吸附带负电荷的小分子探针试剂, 因此在蛋白质的表面形成一个试剂分子的覆盖层, 这种以蛋白质为支撑中心的大的探针分子聚集体远大于探针分子自身聚集体的体积, 因此二者结合后, 光散射强度急剧增加。在一定条件下, 光散射增强的程度与加人的蛋白质浓度成正比[11]。共振瑞利散射技术用于蛋白质的测定主要基于染料阴离子在蛋白质等电点前与肽链上带正电荷的基团的结合作用。此时生色团聚集于蛋白质分子上引起共振散射光增强, 它与核酸不同的是生色团必须是带负电荷的阴离子。目前测定蛋白质的共振光散射法所使用的试剂主要有偶氮胂M、氯酚磺S、苋菜红、磷锑钼蓝等。
5 近红外光谱技术
近红外光是 (NearInfrared, NIR) 介于可见光 (VIS) 和中红外光 (MIR或IR) 之间的电磁波, 美国材料检测协会 (ASTM) 将近红外光谱区定义为波长780~2526nm的光谱区[12]。习惯上又将近红外光划分为近红外短波 (780-1100nm) 和长波 (1100-2526nm) 两个区域。
选用连续改变频率的近红外光照射某样品时, 由于试样对不同频率近红外光的选择性吸收, 通过试样后的近红外光线在某些波长范围内会变弱, 透射出来的红外光线就携带有机物组分和结构的信息。通过检测器分析透射或反射光线的光密度, 就可以确定该组分的含量。
近红外光谱技术在建立可靠的校正模型的基础上, 可直接对样品进行无损检测, 具有分析速度快、效率高、成本低和多组分同时测定等优点。近年来已经非常广泛地应用于谷物、乳类、肉类、烘焙类、豆类蛋白质的分析测定中。
综上所述, 除上述方法外, 蛋白质的测定还有其他的方法, 各具有其优缺点, 在分析检测时, 应了解各种方法的优缺点, 结合具体情况来选择更适合的检测方法, 才能获得更好的检测结果。随着蛋白含量测定技术的不断发展, 其在生产和科研众多领域的应用都将步上一个新的台阶。但建立新的具有高选择性、高灵敏度、高重现性的蛋白质测定技术或方法仍在不断的探索中。将各种方法仪器一体化, 实现快速、精确、批量测量也是一个很好的发展方向。
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铁蛋白定量 篇2
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;T2DM:2型糖尿病;SBP:收缩压;BMI:体重指数;WHR:腰臀比;TG:三酰甘油;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;FPG:空腹血糖;FINS:空腹胰岛素;HOMA-IR:胰岛素抵抗指数;HOMAβ-cell:胰岛β细胞功能;1 mm Hg=0.133 kPa
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2011年1月~2012年12月山西医科大学第一医院T2DM患者60例为T2DM组(DM病史≤5年),患者均符合1999年WHO的诊断标准,其中男28例,女32例,平均年龄(50.31±8.47)岁。选择同期门诊健康体检者56例为对照组,其中男27例,女29例,平均年龄(47.82±7.63)岁。对照组患者经75 g口服葡萄糖耐量试验,排除DM及糖调节受损。入选对象均排除急慢性感染、血液系统疾病、肿瘤、妊娠及心、肝、肾脏功能不全及其他内分泌疾疾病。所有患者近1年未服用任何铁剂。两组性别、年龄一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经山西医科大学第一医院伦理委员会通过,所有患者均知情同意,并签署知情同意书。
1.2 方法
采集空腹静脉血10mL,分离血清,放射免疫法测定空腹胰岛素(FINS)、Roche p800生化仪测定空腹血糖(FPG)、血脂及尿酸(UA)。酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清SF、TRF。测量身高、体重、腰围、臀围,并计算体重指数(BMI)=体重(kg)/身高的平方(m2),腰臀比(WHR)=腰围/臀围,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5,胰岛β细胞功能(HOMAβ-cell)=20×FINS/(FPG-3.5)。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 16.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差表示,两独立样本的计量资料采用t检验;计数资料以率表示,采用χ2检验。SF、TRF与其他临床资料的相关性采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组临床及生化指标比较
两组舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)、UA水平差异无统计学意义(P>0.05);T2DM组收缩压(SBP)、BMI、WHR、三酰甘油(TG)、FPG、FINS、HOMA-IR等指标高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);T2DM组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、HOMAβ-cell低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。
2.2 两组血清铁蛋白、转铁蛋白结果比较
T2DM组血清SF、TRF高于对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01)。见表2。
2.3 T2DM组血清SF、TRF与临床资料的相关性分析
T2DM组血清SF水平分别与FINS、Hb A1c、HOMA-IR、BMI、WHR及SBP呈正相关,与HOMAβ-cell呈负相关(P<0.01);血清TRF水平分别与FINS、HOMA-IR、TG及WHR呈正相关(P<0.01)。见表3。
注:与对照组比较,**P<0.01;SF:铁蛋白;TRF:转铁蛋白;T2DM:2型糖尿病
注:“-”表示无数据;SBP:收缩压;BMI:体重指数;WHR:腰臀比;TG:三酰甘油;FINS:空腹胰岛素;HOMA-IR:胰岛素抵抗指数;HOMAβ-cell:胰岛β细胞功能;Hb A1c:糖化血红蛋白
3 讨论
研究显示,T2DM是一种常见的内分泌及代谢紊乱疾病,人体必需微量元素直接影响细胞代谢和胰岛素的水平[1]。铁作为一种极强的促氧化剂,其含量的升高可使氧化压力增强,进而加大罹患T2DM的风险[2]。铁过量可对多器官产生损害,如心血管系统、神经系统、肾脏及肝脏系统以及内分泌系统,导致多种疾病或加重疾病。近期的对照研究显示,铁超负荷可以影响到T2DM中胰岛素的作用[3]。铁超负荷可致多种胰岛素抵抗相关疾病,如地中海贫血中等。Cario等[4]研究发现,患者FPG和2 h血糖均比正常值高。又如在遗传性血色病中,Hramiak等[5]对血色病患者研究发现,铁超负荷早期就有胰岛素分泌及糖耐量受损。Jiang等[6]研究也发现,高铁负荷是健康女性T2DM发病的一个独立危险因素。T2DM患者体内存在铁负荷和铁代谢紊乱,体内铁负荷可能是导致T2DM患者铁代谢紊乱的原因之一[7]。即铁过量必然影响到体内的糖代谢。在人体中,铁的储存形式是SF,铁的转运形式是TRF,两者均是机体铁储备的敏感指标。其中,血清SF能反映体内铁存储量及机体的营养状态,是判定体内铁缺乏及铁负荷过大的有效指标。实验室和临床研究提示[8,9,10,11],血清SF与T2DM及其慢性并发症的发生、发展密切相关。所以,临床上测定SF和TRF,对于T2DM的发生和发展具有一定的意义。本研究结果也显示,血清SF和TRF水平在T2DM组明显升高,并且与HOMA-IR呈显著正相关。
有动物实验发现,铁超载和氧化应激可以导致血色病大鼠动物模型的胰岛β细胞凋亡,从而引起胰岛素分泌功能降低、糖耐量减低和糖尿病[9]。有学者通过研究发现,T2DM患者体内铁贮备量较正常组明显升高,且与IR水平呈正相关[12,13]。老年T2DM患者易发生脂肪代谢紊乱,与IR呈正相关[14,15]。本研究结果显示,T2DM组血清SF水平分别与FINS、Hb A1c、HOMA-IR、BMI、WHR及SBP呈正相关,与HOMAβ-cell呈负相关(P<0.01);血清TRF水平分别与FINS、HOMA-IR、TG及WHR呈正相关(P<0.01),提示铁代谢异常与IR的发生密切相关,铁超负荷可以损伤HOMAβ-cell,对T2DM的发生起到推波助澜的作用。
综上所述,本研究提示SF和TRF参与了T2DM的发生发展,并和IR、HOMAβ-cell存在着相关关系。在今后的工作中,对于存在代谢紊乱的高危人群,可以监测铁代谢指标以评估病变的严重程度及预后。
摘要：目的 分析2型糖尿病(T2DM)患者血清铁蛋白(SF)、转铁蛋白(TRF)水平及与胰岛素抵抗的相关性。方法 选择山西医科大学第一医院T2DM患者60例为T2DM组,选择同期健康体检者56例为对照组,比较两组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、体重指数(BMI)、总胆固醇(TC)、尿酸(UA)、腰臀比(WHR)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、胰岛β细胞功能(HOMAβ-cell)、血清铁蛋白(SF)、转铁蛋白(TRF);分析SF、TRF的相关影响因素。结果 ①两组DBP、TC、UA水平差异无统计学意义(P>0.05);T2DM组SBP[(133.95±17.64)mm Hg]、BMI[(24.57±3.04)kg/m2]、WHR(0.91±0.04)、TG[(2.09±0.87)mmol/L]、FPG[(7.90±3.04)mmol/L]、FINS[(13.38±6.27)mU/L]、HOMA-IR[(4.64±2.02)]等指标高于对照组[(125.02±12.56)mm Hg、(23.02±2.93)kg/m2、(0.86±0.05)、(1.55±0.67)mmol/L、(4.83±0.53)mmol/L、(9.84±4.72)mU/L、(2.06±1.03)],差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);T2DM组HDL-C[(1.17±0.49)mmol/L]、HOMAβ-cell(55.81±25.84)低于对照组[(1.51±0.38)mmol/L、(76.79±51.56)],差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。②T2DM组血清SF[(5.84±0.69)ng/mL]、TRF[(13.32±5.88)ng/mL]高于对照组[(4.14±0.79)ng/mL、(9.14±2.93)ng/mL],差异有高度统计学意义(P<0.01)。③2DM组血清SF水平分别与FINS、糖化血红蛋白(HbA1c)、HOMA-IR、BMI、WHR及SBP呈正相关,与HOMAβ-cell呈负相关(P<0.01);血清TRF水平分别与FINS、HOMA-IR、TG及WHR呈正相关(P<0.01)。结论 铁参与了T2DM发生、发展,SF、TRF可能是预测T2DM的因子。
转铁蛋白受体的结构及功能 篇3
关键词：转铁蛋白受体,结构,功能
0前言
铁是人体细胞进行代谢不可缺少的重要元素, 在运送氧、传递电子、DNA合成等过程中起着非常重要的作用。细胞内铁的转运主要通过转铁蛋白 (Tf) 和转铁蛋白受体 (Tf R) 来进行调控。由于转铁蛋白受体在所有细胞都呈低表达, 而在增殖活跃的细胞如肿瘤细胞高表达, 使得转铁蛋白受体在临床和药物转运上得到越来越广泛的研究。本文主要对转铁蛋白受体的结构及功能进行综述。
1 转铁蛋白受体的结构
转铁蛋白受体是由两个大小约为90KDa的亚单位通过两条二硫键交联而成的一种II型跨膜糖蛋白[1]。每个亚单位包括一个胞外C端区域, 一个单跨膜区域和一个N端区域。C端区域也称外功能区, 又分为蛋白酶样区、顶区和螺旋区[2], 其中包含Tf的结合位点。Tf R对不同的Tf均有较高的亲和力。科学家通过X线晶体衍射发现Tf通过其C片段和N片段与Tf R的螺旋区和蛋白酶样区相互作用从而导致Tf和Tf R的结合。此外, Tf与铁结合的饱和度对Tf识别Tf R也有明显影响[3]。Tf R共有两个家族成员, 分别是Tf R1和Tf R2。与Tf R1不同, Tf R2没有铁反应元件, 其表达不受胞内铁水平的调节, 而且对Tf的亲和力很低, 起作用还不是很清楚, 可能与调节和维持铁在内环境的稳定有关[4]。
2 转铁蛋白受体的表达
Tf R在机体的所有细胞中低表达, 在增殖活跃的细胞高表达。尤其是肿瘤细胞, 由于肿瘤细胞中铁代谢发生了很多改变, 导致Tf R表达显著增高, 尤其是Tf R1的表达增高。肿瘤细胞为更加快速的摄取铁因此高表达Tf R1, 其高表达与肿瘤细胞快速增殖相关。体外实验研究发现使用抗Tf R1单克隆抗体可有效抑制血液系统恶性肿瘤细胞增殖[5]。研究证实在人类B淋巴细胞中Tf R1是可诱导的癌基因c-myc位于下游区的重要靶位。Lepelletier等人研究发现, 非霍奇金淋巴瘤中5例弥漫性大B细胞淋巴瘤全部高度表达Tf R1, 而滤泡性淋巴瘤和小淋巴细胞性淋巴瘤则低表达Tf R1。在对脑肿瘤及正常脑组织Tf R1表达研究中发现, Tf R1m RNA在海马和延髓中表达最高, 在丘脑、皮质及和小脑中的表达明显降低。Tf R1在脑肿瘤组织中表达显著增高, 其增高程度与肿瘤的恶性程度呈正相关[6]。此外, Tf R1在前体红细胞, 胎盘和肝脏中高表达[7]。值得注意的是Tf R在脑的毛细血管[8], 小肠的上皮细胞, 肺泡Ⅱ型上皮细胞和肿瘤组织可检测到。由于Tf R在大量肿瘤组织中高表达, 因此Tf R成为肿瘤靶向治疗的研究热点。
Tf R2在正常细胞不表达, 但某些肿瘤细胞中有表达, 例如结肠癌、卵巢癌、恶性胶质瘤细胞株中等;而在白血病及黑色素瘤细胞株中的少见表达则。大量研究结果显示, 在不同的肿瘤组织中Tf R2表达存在差异, 这些分子机制有待进一步研究。
3 转铁蛋白受体的功能
转铁蛋白受体的功能是通过与转铁蛋白的相互作用介导铁的吸收。生理p H下, 转铁蛋白受体与带两个铁离子的转铁蛋白亲和力最高, 与带一个铁离子的亲和力次之, 与不带铁离子的亲和力最小[9]。
Tf R除了参与铁的吸收外, 还在细胞生长和增殖中发挥作用。最新研究证实Tf R还具有免疫调节的功能。研究显示Tf R高表达于Ig A肾病的患者肾小球系膜细胞和系膜细胞, 提示Tf R在该疾病的发病机制中起到重要作用[10]。此外, Tf R参与了T细胞的激活过程, 为T细胞的激活提供了必需的第二刺激信号。实验数据显示, 鼠单克隆Tf RIg G抗体C2F2可选择性抑制IL-1依赖的T细胞激活, 但是不能阻断IL-2诱导的T细胞激活作用。研究报道一种鼠抗人单克隆Tf RIg G1抗体在蛋白激酶C激活剂存在的情况下可以诱导T细胞的增殖。综上所述, Tf R具有选择性活化T细胞的作用, 但是其具体机制不详。
目前关于Tf R功能研究较多的是其可作为药物运输工具用于靶向治疗。Tf R能作为一种有效的靶向运输工具, 将具有治疗作用的因子靶向所选择的组织。Tf R药物靶向策略主要是将一种抗肿瘤的物质和Tf R识别的抗体 (或Tf) 偶联, 使药物能靶向进入到高表达Tf R的肿瘤组织[11]。由于Tf R高表达于许多肿瘤细胞, 且其表达量较正常组织高出许多倍。通过这种受体介导的内吞作用使Tf R成为肿瘤治疗的新靶点。很多抗肿瘤药物可以利用各种方式与之发生偶联, 例如处于研究中的顺铂、甲氨蝶呤、蓖麻毒素A、阿霉素、正定霉素等, 都显示出较好的效果。通过这种方法, 既可以减少抗肿瘤药物对正常组织的毒副作用, 同时还可以使药物靶向作用于肿瘤组织。
乳铁蛋白的生物学活性 篇4
1 乳铁蛋白的来源及结构
乳铁蛋白因其最先在乳汁中被发现而得名,主要存在于人和哺乳动物的乳汁中,其含量随动物种类、泌乳时间、胎次、个体等而有所不同,除乳汁外,它也广泛存在于动物体的泪液、唾液、汗液、胰液等内、外分泌液中,只是含量甚微[1]。乳汁中的乳铁蛋白由乳腺合成,而血液中的LF则来自嗜中性粒白细胞。人乳中乳铁蛋白含量特别丰富,是母乳中含量位于第2的蛋白质,占普通母乳蛋白质的10%。人初乳中含LF质量浓度为1~5 g·L-1,常乳中1~3 g·L-1,牛初乳中0.8g·L-1左右,牛常乳中0.1~0.4 g·L-1,含量较母乳低[2]。
目前乳铁蛋白的结构与特性的研究已经相当深入。乳铁蛋白呈单一多肽链,两端各折成环状,铁离子伴随着2个碳酸氢根离子(HCO3-)结合于该区。1个铁离子(Fe3+)与乳铁蛋白每一端的4个残基相连:2个酪氨酸、1个天冬氨酸、1个组氨酸。乳铁蛋白与铁离子结合后,铁离子进入每叶缝隙内部,此区域闭合,使乳铁蛋白分子结构更加紧密。
乳铁蛋白的二级结构以α螺旋和β结构为主,二者沿蛋白质的氨基酸顺序交替排列,而且α螺旋多于β结构。乳铁蛋白的立体结构是在二级结构的基础上折叠形成两个相似的结构域(N-叶和C-叶)。呈2枚“无柄银杏叶并列状”(如图1)[3]。此二叶具有较高的重叠性,同源性高达40%,每叶可与一个Fe3+结合,结合点位于一个裂口内。每叶还包含4个氨基酸残基协调铁离子。每个铁结合位置还固定有重碳酸盐阴离子,以保持电荷平衡[4]。
随着研究的深入,人们发现水解后的乳铁蛋白会产生一些具有特殊生理功能的小肽。乳铁蛋白活性多肽(Lfcin B),它是牛乳铁蛋白在消化道正常生理条件下释放出的一种含25个氨基酸残基的抗菌肽。Lfcin B来源于牛乳铁蛋白的第17~41位氨基酸,由25个氨基酸残基组成,氨基酸顺序为:Phe-Lys-CysArg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe[5],包括5个Trp、3个Lys和多个芳香族氨基酸残基,具有强碱性,p I>8.15,相对分子质量3.1KDa。研究表明其水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构,具有耐热、在消化道中不易降解、免疫调节作用、广谱抑菌和对肠道有益菌无害等特性。
2 乳铁蛋白的生物学功能
2.1 提高机体对铁离子的吸收
动物体内的运铁蛋白在胃内极酸性条件下不具有运送铁的作用,这时只有乳铁蛋白能在动物肠道中运载铁离子。研究发现多种动物肠细胞上有乳铁蛋白的专一性受体,经此种受体的基因转染过的Caco-2细胞能对乳铁蛋白结合的铁表现出更强的摄取活性[6]。也有研究发现,当机体细胞缺铁时,细胞会合成较多的转铁蛋白和乳铁蛋白,表明乳铁蛋白和转铁蛋白具有相类似的转运铁的功能。Kawakami[7]证实,给贫血的小鼠进食铁结合的乳铁蛋白和普通的硫酸亚铁,要得到同样治疗效果,后者的摄入量需是前者的4倍。机体对铁的吸收有负反馈调节机制,当细胞缺铁时会在其表面合成特异的铁受体,如血液中的转铁蛋白和肠道中的乳铁蛋白。在摄入铁时,若结合乳铁蛋白则可明显减缓铁对肠道的刺激作用,减少无机铁离子摄入。
2.2 抑菌和杀菌
乳铁蛋白是一种广谱抑菌剂,早期研究表明既可抑制需铁的革兰氏阴性菌,如大肠菌群,E.Coli、沙门氏菌等;也可抑制革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特菌等。但对乳酸菌一类生理需铁较低的微生物,乳铁蛋白基本上不表现抑菌活性。Terrguchi等研究了牛乳铁蛋白对鼠肠内细菌的影响,结果发现用含乳铁蛋白的牛乳喂饲小鼠时,其肠道内肠球菌受到抑制,抑制效果与乳铁蛋白的浓度和喂食时间相关,而与乳铁蛋白的铁结合能力无关。同时,乳铁蛋白降解产生的乳铁多肽素表现出强杀菌活性,他能够破坏细胞膜,使细胞膜去极化,p H梯度消失,或在膜上形成孔洞,杀死细菌。所以,乳铁蛋白对微生物的抑制作用不仅依赖铁结合活性,还可达到抑菌杀菌效果[8]。
2.3 免疫调节
乳铁蛋白能够发挥其特异的调节功能,主要是与其靶细胞及靶细胞表面的特异性受体有关,不同的细胞其乳铁蛋白受体的特性也不相同。巨噬细胞和淋巴细胞的各种免疫细胞都有乳铁蛋白受体存在,乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力[9],还能促进多形核白血球巨噬细胞对细菌的吞噬,促进自然杀伤细胞的活化及淋巴球的增生,抑制颗粒球巨噬细胞菌落刺激因子的产生和释放。乳铁蛋白能够抑制由于脂多糖所诱导的TNF-a的释放,并诱导白介素6的表达,从而阻止由于败血症所诱发的机体死亡。乳铁蛋白可以通过诱导体液免疫反应,对免疫系统各方面产生影响:影响T细胞和B细胞成熟、影响淋巴细胞增生、调节单核细胞和巨噬细胞系统中铁水平以及其他免疫功能[10]。乳铁蛋白还可作为机体非抗体免疫的主要力量对抗病原菌的入侵。同时进食乳铁蛋白能刺激肠道免疫球蛋白的分泌,Debbabi等[11]认为,乳铁蛋白是免疫系统的激发因子,并且只有黏附在细胞上才能发挥激发作用。
2.4 抗病毒
乳铁蛋白能抵抗许多病毒的感染,如可抑制人体免疫缺陷性病毒、细胞巨化病毒、疱疹病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒等。乳铁蛋白对宿主体内抗病毒作用很大。乳铁蛋白抑制HIV-1机理为:HIV-1生命周期中具有极其重要三种酶(逆转录酶、蛋白酶和整合酶),乳铁蛋白略微抑制HIV-1蛋白酶和整合酶,但强烈抑制HIV-1逆转录酶,从而能抑制HIV体外复制[12]。
抗HCV试验指出,其抗病毒的作用可能是干扰HCV和靶细胞的作用。因为如果在接种病毒的同时或之前使用乳铁蛋白最为有效。减少乳铁蛋白和HCV接触的时间就会增加感染病毒的机会。乳铁蛋白结合到HCV E1和E2的核衣壳上可以阻止病毒对靶细胞的吸附[13]。
Beljaars等[14]研究了乳铁蛋白对巨化病毒的抑制作用后指出,乳铁蛋白对病毒的作用主要是阻碍病毒入侵通道,而非通过调节免疫系统。但Waarts等[15]认为,乳铁蛋白抑制病毒主要是通过干预病毒与受体的结合,并非影响其入侵通道或者影响其复制过程。
此外,还能具有抑制流感病毒的活性,主要是因为其碳水化合物残基上含唾液酸,它干扰病毒对靶细胞的结合、感染[16]。可见,乳铁蛋白具有潜在的抗病毒效应和高选择性,在抑制病毒与细胞的早期相互作用中起着十分重要的作用。
2.5 乳铁蛋白的其他生理功能
乳铁蛋白除了具有以上功能,还有抑制肿瘤生长和转移、调控基因表达、抗寄生虫活性、抗氧化及抑制胆固醇积累等作用。
3 问题与展望