荧光定量（精选10篇）
荧光定量 篇1
0 引言
免疫荧光分析技术是新发展起来的精密的免疫标记检测技术, 与传统的酶联免疫法及金标法相比, 免疫荧光分析技术灵敏度高, 特异性强, 操作方便, 不用放射性物质作为标记物, 因此具有无放射性、标记物稳定、便于长期保存、试验重复性好、分析速度快、样品用量少及标准曲线量程宽等优点[1]。荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后, 物质本身所发射的光的强度。荧光的强度与物质数量之间存在正比关系, 可通过测定荧光的光谱和荧光强度, 对物质进行定性或定量的分析。免疫荧光分析技术是目前生物医学检验中常用的快速分析技术, 在微生物、病毒抗原或抗体检测、激素检测、肿瘤标志物检测、毒品海洛因、吗啡、摇头丸、氯胺酮等检测领域具有广阔的应用前景。
1 免疫荧光定量检测原理
将特异的荧光抗体先固体于硝酸纤维素膜的某一区带, 当该干燥的硝酸纤维素一端滴加样品后, 由于毛细管作用, 样品将沿着该膜向前移动, 当移动至固定有抗体的区域时, 样品中相应的抗原即与该荧光体发生特异性结合, 随着进一步的层析作用, 用此抗原的另一个抗体对此复合物进行捕捉, 多余的荧光抗体用其二抗进行捕捉, 两次捕捉的位置分别称为质控线 (C线) 和检测线 (T线) 。当光源照射到检测卡上时, 质控线和检测线分别激发出不同强度的荧光, 光电转换器接收不同强度的荧光产生不同大小的电信号, 电信号的强弱反映出待检测物的浓度, 从而实现特异性的免疫诊断。
2 免疫荧光定量分析仪系统设计
免疫荧光定量分析仪主要由光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分组成。光学部分是荧光定量分析仪的核心部分, 用来激发出荧光, 而硬件电路部分和系统软件部分则用来进行荧光信号的检测处理以及控制整个仪器的正常运行。
2.1 光学部分设计
光学部分设计如图1所示, 光学部分由光源发射光路和荧光检测光路两部分组成。
光源发射光路由LED光源、凸透镜1、滤光片1和凸透镜2组成。LED光源的光轴与凸透镜1、滤光片1以及凸透镜2的光轴在一条线上。光源为绿色 (中心波长为580 nm) 高亮度LED光源, LED位于发射光路凸透镜1的焦点, 这样光源发出的光经凸透镜1后变为平行光, 滤光片1采用中心波长580 nm带宽为30 nm的窄带干涉滤光片, 平行光经过滤光片1后, 入射光中565 nm~595 nm范围以外的光被滤除掉, 出射的光为窄带光 (565 nm~595 nm) , 其经过凸透镜2后, 被聚焦到样品上, 激发出荧光, 荧光波长为610 nm。
荧光检测光路由凸透镜3、滤光片2、凸透镜4和光电转换器组成。光电转换器与凸透镜3、滤光片2、凸透镜4的光轴在一条线上。荧光检测光路光轴和发射光路光轴成45°角, 最大程度地减少了激发光对荧光信号检测的影响。荧光检测光路光轴和发射光路光轴的交点在检测试纸上, 且交点为凸透镜2和凸透镜3的焦点。滤光片2采用中心波长610 nm, 带宽为15 nm的窄带干涉滤光片。激发出的荧光被凸透镜3收集后变为平行光, 平行光通过滤光片2后, 原来的少量激发光会被滤光片滤除掉, 仅剩激发出的610 nm左右的荧光信号通过[2,3]。通过滤光片后的光被凸透镜4收集聚焦到荧光检测模块上的光电转换器上, 实现光信号到电信号的转换。
2.2 系统硬件电路部分设计
系统硬件电路的结构框图如图2所示, 仪器的测量原理是:处理器控制步进电机带动待检测样本到达检测器的检测口上方, 通过发光控制模块控制LED的发光强度以符合测量的强度要求, 光电传感器检测荧光信号的强弱, 传感器输出信号经放大和滤波处理后进入ADS1252转化为数字信号交给处理器进行处理[4]。
图2中检测器框中所示的部分包括上文2.1所描述的光学部分以及部分硬件电路, 两部分共同封装在检测器内, 提高了检测信号的稳定性和抗干扰能力。检测器硬件电路部分由发光控制模块和荧光检测模块组成。
为了保证光源的稳定性, 发光控制模块采用了恒流源驱动方式, 这样可以有效保证光源发光强度的恒定。对于有的样品, 照射光源不宜太强, 因此, 恒流源采用的是程控调节的恒流源, 通过输入不同的数字值, 可以控制LED的发光强度。即LED驱动电流的大小可以通过程序进行控制。
光电转换器选用内置运放的光电转换芯片OPT101。荧光检测模块包含了光电转换、信号放大滤波、电压偏置、模/数转换等部分。其中, 信号放大采用程控放大, 模/数转换采用24位的A/D转换芯片ADS1252, 可保证足够的转换精度和大的动态检测范围。检测器传输给控制器的是数字电信号, 数字信号比模拟信号有更强的抗干扰能力和准确性, 这就大大提高了系统的检测精度。
2.3 系统软件部分设计
系统软件使用C语言进行编写, 软件流程图如图3所示。系统初始化主要完成系统各外围模块的配置以及历史设置的读取和配置。待系统初始化完成后, 控制电机带动样品卡卡槽出仓, 并在显示屏上提示用户插入检测样品卡。系统循环检测样品卡是否插入卡槽内, 当检测到样品卡插入后系统打开二维码扫描枪并控制电机带动样品卡移动至扫描枪处进行二维码的读取。二维码包含检测项目、产品批号、标准曲线等信息。系统判断二维码信息有效后打开LED并根据二维码相关信息调整LED亮度同时控制电机带动待检测样本移动至检测器上方进行检测。采集到的数据将以txt文件的形式保存在SD卡内, 经一定的算法计算出T线与C线对应波峰的面积比后代入二维码信息中的标准曲线内, 得出待检测样品的浓度并将最终的荧光强度曲线及样品的浓度检测结果显示到显示屏上并自动存储和打印检测信息[5]。
3 测试结果及分析
本文设计的免疫荧光定量分析仪可以测量血液和尿液中多种物质的浓度, 本文以NT-pro BNP (N末端脑钠肽前体) 的浓度测量为例对仪器的运行效果进行分析。NT-pro BNP是由心脏分泌的一种神经内分泌激素, 已被证明是临床上诊断、治疗及判断心力衰竭患者预后的重要指标[6]。
3.1 荧光信号的采集
将样品卡插到仪器的卡槽内进行检测得到荧光强度曲线如图4所示。图中横坐标代表数据个数, 纵坐标代表光电转换器输出的电压值, 单位为m V。
3.2 标准直线拟合
得到样品荧光强度的曲线后, 利用高斯拟合可以计算出T线和C线对应的曲线波峰的面积, 利用T线和C线对应波峰的面积可以计算出待检测样品的浓度。这就需要一组标准浓度校验品, 根据标准浓度校验品的测量结果, 建立一定的数学模型计算出T线和C线对应波峰的面积与样品浓度之间的数学关系。
根据标准浓度校验品得到样品浓度与T线对应波峰的面积 (用AT表示) 与C线对应波峰的面积 (用AC表示) 之比AT/AC的对应关系如表1所示。
由表1中的对应关系, 利用最小二乘法得到的样品浓度与AT/AC数学量化关系, 如图5所示。
由图5可以得出, 最小二乘法拟合直线的表达式如式1所示:
直线拟合相关系数R=0.999 92, 说明这6种标准浓度校验品的浓度与AT/AC之间存在良好的线性关系。
3.3 系统测量误差分析
选择一组同一批次不同浓度标准浓度样品, 依据式1对样品浓度进行测量, 分析系统的检测误差, 得到的测量结果如表2所示。
由表2的实测结果可以看出, 对于标准浓度样品的测量误差在±8%以内, 满足实际的使用要求。下面选取一组医院的病人血液样品, 以进口的锐普智能荧光干式定量分析仪作为标准仪器进行对比测量。每个病例取75μL病人血液样本加到样品缓冲液中, 将溶液充分混匀后取75μL混匀后的样本滴加到样品卡的加样孔内, 等待15 min后将样品卡插入到仪器的卡槽内得到的测量结果如表3所示。
由表3的对比测量结果可以看出, 本文设计的免疫荧光定量分析仪与现已商品化的免疫荧光检测仪相比, 测量误差在±8%以内, 能满足临床应用要求。
4 结论
本文设计了免疫荧光定量分析仪, 对仪器的光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分进行了详细介绍。从多个角度对仪器的运行结果进行了分析, 从测试结果可以看出, 仪器可以拟合出线性度良好的标准直线, 通过对标准校验品的测量试验和与标准仪器的对比试验表明仪器在小型化、快速性的基础上, 测量误差能够控制在±8%以内, 可以满足临床应用的要求。
摘要：设计了免疫荧光定量分析仪, 用以对人体血液和尿液中的各种分析物 (CRP、PCT、NTpro BNP、c Tn I等) 含量进行快速准确的定量分析。光源采用大功率LED灯珠, 采用窄带干涉滤光片对激发光和荧光进行滤光, 采用内置运放的光电转换芯片OPT101进行荧光强度的检测。采用步进电机驱动, 皮带传动方式带动双排滚珠宽体滑块在单根精密直线导轨上滑动, 实现对检测样品的扫描式检测。通过与标准仪器进行对比试验, 结果表明样机在小型化、快速性以及低成本的基础上, 测量结果准确, 测量精度高, 稳定性好, 能满足临床应用要求。
关键词：免疫荧光定量分析仪,干涉滤光片,OPT101
参考文献
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[3]张可可, 闫星魁, 陈世哲.荧光法海水叶绿素a传感器设计[J].山东科学, 2013, 26 (3) :37-40.
[4]王宜怀, 吴瑾, 蒋银珍.嵌入式系统原理与实践:ARM Cortex-M4 Kinetis微控制器[M].北京:电子工业出版社, 2012.
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[6]史晓敏, 林箐, 徐国宾.血清N末端B型钠尿肽原在心功能评价及慢性充血性心力衰竭诊断中的初步应用[J].中华检验医学杂志, 2005, 28 (1) :37-41.
荧光定量 篇2
尊敬的校领导：
自我校2012年提出“五大工程”以来，人才队伍实力与水平得到显著提升，同时我们也清醒地认识到现在高校所面临的生存危机，应对危机唯有发展壮大我校的软实力：大力发展特色学科、特色专业；大力开发研究秦巴山区优势生物资源，立足于秦巴山区，服务于全国。然而，我校在科研仪器设备配置方面还有待提高，我学科现需购置实时荧光定量PCR仪，申购理由如下：
高通量的检测和定量核酸序列的实时定量PCR系统，在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。广泛应用于肿瘤的分子诊断，新药筛选，基因表达研究，转基因研究，单核苷酸多态性（SNP）及突变分析，病原体的分子检测，遗传分析等。
关于实时荧光定量PCR仪功能介绍：我校位于秦巴山区，秦巴山区素有“天然药库”之称，有着丰富的生物资源。随着世界科研水平的发展，目前我校的仪器设备已不能满足科研工作的要求。在对秦巴山区优势中药材功能基因的研究中：（1）对功能基因的发育阶段表达、组织表达情况分析；（2）检测功能基因RNAi干扰效率：功能基因的作用研究中，要对功能基因沉默表达（RNAi）分析，检测RNAi的干扰效率要用到实时荧光定量。（3）对功能基因相关基因表达模式分析。
作为一所
院校，拥有一台性能良好的实时荧光定量PCR仪，是学校发展和从业教师的需求。可行新分析：
（1）研究功能基因，实时荧光定量PCR仪是必不可少的仪器设备；（2）实时荧光定量PCR仪操作简单，经过简单培训即可学会；（3）试剂耗材费
（4）应用广泛
科研领域都在用 主要技术指标：
热循环系统
新型半导体
96/384孔
可升级选配低密度芯片 光学系统
氩离子激光器 全波长光栅 冷CCD 扫描模式
全程扫描
软件系统
Primer Express 3.0探针引物设计软件 SDS 软件 绝对定量 相对定量 等位基因分析 阴阳性结果自动判断
反应系统
最低可在35分钟内完成PCR实验
5ul反应体积（选配低密度芯片可至1ul）
配套试剂盒
30万基因表达试剂盒 200万SNP试剂盒 可代客定做引物模板 专业转基因 致病菌筛选试剂盒 主要性能：
全波长光栅分光，添加新染料无需更换滤光片，同时检测8种以上荧光染料，最大限度实现多重定量，SNP分析等应用。
完备，多样，专用的软件，无需人工计算，完成定量实验
多组份荧光校正软件，一体化硬件设计，辅助ROX荧光，保证定量结果的准确性和高分辨率（装机指标，5000和10000达到2倍的拷贝数）
齐备的试剂盒 帮助客户完成高要求的实验
9、可为客户提供安装操作鉴定（IQ/OQ）验证文件服务，以符合GLP/GMP对生产设备的要求。
技术参数：
（1）色荧光，可用于多重PCR检测（2）激发光源寿命
（3）检测器：
成像系统，无时间差，保证结果的准确（4）温度控制系统：半导体控温（5）温度准确性≤±0.05℃（6）温度控制范围：
（7）动力学线性范围：
个数量级，区分
拷贝两倍差异浓度的样本，其致信度高达多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做参比荧光，同时，软件支持无参比染料设置（9）试剂开放，耗材开放，（10）仪器性能有原厂装机试剂盒验证（11）灵敏度：
（12）激发/发射滤光片：是否支持客户自行添加染料。（13）可检测450～750nm连续波长
（14）数据分析：可同时分析
色荧光PCR数据；有无绝对定量、相对定量功能；可否选择多个看家基因进行数据处理；可否自动根据扩增效率对数据进一步处理，得到更加准确可靠的结果；软件支持分析无限制数量的数据文件，增大反应通量；具有等位基因、熔解曲线分析功能；软件支持进行加样重复及生物学重复结果的统计。
荧光定量 篇3
摘 要：为了能够快速准确检测出市场中掺假牛肉制品，采用TaqMan探针法，建立一种用于快速有效检测牛肉制品中牛源性成分的荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法。选择GenBank中牛β-actin基因的保守序列，设计并合成特异性引物及TaqMan探针，以构建的pMD-18T-96-beef质粒为标准品，优化反应条件。结果表明：重组质粒标准品经PCR、测序和酶切鉴定正确，建立的标准曲线Ct值与模板拷贝数对数值之间呈良好的线性关系，相关系数为0.98，斜率为-3.345，敏感度为46.1 copies/?L。特异性实验表明，用该方法检测猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等非牛肉制品结果均为阴性。批内重复实验变异系数均小于0.98%，批间重复实验变异系数均小于0.33%，表明该方法重复性良好。用建立的荧光定量PCR方法与SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法》同时对市场上40 份牛肉加工品进行检测，结果显示，本方法检测有3 份样品为牛源成分阴性，与SN/T 2051—2008方法检测结果相同。可见，本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速的特点，适用于检测市场中肉类掺假的行为。
关键词：肉制品；牛源性成分；荧光定量PCR；肉类掺假
Abstract： A real-time fluorescence-based polymerase chain reaction （PCR） assay that enables rapid and accurate identification of adulterated beef products was developed using TaqMan probe for the rapid and effective detection of bovine-derived materials in meat products. A pair of specific primers and TaqMan probe was designed according to the conserved sequence of the bovine β-actin gene. PCR reaction conditions were optimized using pMD-18T-96-beef plasmid as standard. The results showed that the pMD-18T-96-beef plasmid was confirmed to be valid by PCR， sequencing and enzyme digestion and the developed standard curve produced a good linear relationship between Ct value and initial amounts of total DNA with correlation coefficient and slope of 0.98 and ?3.345， respectively. The sensitivity was 46.1 copies/?L. No cross-reactions were found in specimens containing pork， mutton， chicken， duck and goose. The intra- and inter-assay variable coefficients were less than 0.98% and 0.33%， respectively， suggesting good repeatability. A total of 40 beef product samples from the market were measured by this method and the routine real-time PCR method from the industry standard SN/T 2051—2008. Of the 40 samples， 3 were detected as positive as consistently indicated by the two assays. This real-time PCR method with strong specificity and high sensitivity could provide a useful approach for the identification of meat adulteration.
Key words： meat products； bovine-derived ingredients； fluorescence-based quantitative polymerase chain reaction； meat adulteration
中图分类号：TS207.3 文献标志码：A文章编号：1001-8123（2015）09-0030-04
随着市场上牛肉价格的不断上涨，使其价格远高于其他种属肉制品，部分不法企业及商贩在高成本的牛肉中掺入低廉的其他肉类品种，冒充牛肉进行销售来谋取利益，这种行为在损害消费者利益的同时，也干扰了正常市场竞争秩序的建立[1-3]，造成恶劣的社会影响[4-6]。因此，建立一种快速、准确检测肉制品中牛肉含量的方法，具有非常重要的意义。对于肉源成分的检测，检疫部门通常采用以线粒体单拷贝基因为基础的荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法。自Tartaglia等[7]首先报道了PCR方法检测饲料中的牛、羊源性成分至今，大量研究报道了应用PCR及多重PCR技术对食品中不同肉类种属的鉴别方法[8-14]。实时荧光PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点，将种属鉴定技术发展到了一个新的高度[15-18]，而探针法荧光定量PCR由于增加了探针结合反应，更进一步增加了该方法的特异性，在肉类掺假检测方面具有巨大的应用潜能。
与线粒体相比，一些管家基因的DNA为单拷贝基因，组织间差异不大[19]，有利于进行量化分析。因此，本研究选用牛β-actin基因组单拷贝基因种间保守片段，设计合成了一对特异性引物与TaqMan探针，构建牛源性成分标准质粒，绘制标准曲线，建立了检测肉制品中牛源性成分定量检测方法，为肉类掺假量化研究的进一步发展提供方法借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生鲜牛肉、酱牛肉、肥牛卷、牛肉干、牛肉松、牛排、牛肉馅饺子、猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉均购自郑州市某超市。
组织裂解液、氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）、3 mol/L
醋酸钠、TE缓冲液均为自配试剂；Tris平衡酚 北京
索莱宝生物科技有限公司；Premix Ex 2×Taq?（Probe qPCR）、pMD-18-T载体、工程菌DH5α感受态细胞 大连
宝生物公司；质粒小量制备试剂盒、琼脂糖凝胶快速回收DNA试剂盒 北京百泰生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
ABI 7500实时荧光定量PCR仪 美国应用生物系统（中国）公司；BioSpec-nano微量核酸蛋白仪 日本
岛津公司；Z36HK高速冷冻离心机 德国Hermle公司；NTS-4000AM恒温振荡水槽 日本Tokyo Rikakikai
公司。
1.3 方法
1.3.1 引物和TaqMan探针
查找Genebank中公布的牛肉单拷贝β-actin基因组的特异区域进行多序列的比对，针对其保守区域设计了牛肉的特异性引物bovine-F、bovine-R和探针bovine-P，并用FAM荧光染料基团标记探针的5端，非荧光淬灭基团BHQ1标记探针的3端，PCR扩增产物长度为96 bp。引物（上海）及探针均由生物工程（上海）技术有限公司合成。
1.3.2 样品DNA的提取
肉制品或生鲜样品，取100 mg充分研磨，置于1.5 mL EP管中，加入1 mL ddH2O，混匀后置-20 ℃反复冻融2 次，5 000 r/min离心3 min，取上清300 ?L用于酚-氯仿核酸提取，最后加入50 ?L 1×TE缓冲液溶解，作为PCR模板，贮存于-20 ℃备用。
1.3.3 标准质粒的构建
按照琼脂糖凝胶快速回收DNA试剂盒纯化PCR产物，并将其连接到pMD-18-T载体上，转入E.coli工程菌DH5α感受态细胞，并做酶切鉴定，由生物工程（上海）技术有限公司完成测序，并将其命名为pMD-18T-96-beef标准质粒。
1.3.4 牛源性成分荧光定量PCR检测方法反应条件的确定
在Premix Ex Taq?的基础上，选择20 μL的反应体系，对引物和探针浓度进行优化，以最小Ct值和最高荧光增量值为判定依据，从而确定引物和探针的最佳工作浓度。
1.3.5 牛源性成分荧光定量PCR标准曲线的绘制
利用核酸蛋白检测仪检测提取标准质粒的含量，取DNA纯度在1.8～2.0之间的质粒计算其浓度和起始拷贝数，起始模板量为3.32×106 copies/?L，10倍倍比稀释，共6 个梯度的标准质粒进行荧光定量PCR扩增，绘制荧光定量PCR标准曲线。
1.3.6 牛源性成分荧光定量PCR检测方法的评价
1.3.6.1 灵敏度
设置标准质粒梯度为3.32×106、4.76×105、3.50×104、3.47×103、5.13×102、4.16×101 copies/?L，荧光定量PCR能扩增的最低稀释度的拷贝数即为所建方法的灵敏度。
1.3.6.2 特异性
用建立的荧光定量PCR方法分别对猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉基因组进行荧光定量PCR扩增，评价该方法的特异性。
1.3.6.3 重复性
选取4.76×105、3.50×104、3.47×103 copies/?L稀释度的pMD-18T-96-beef标准质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，分别做3 次组内重复和组间重复，评价该方法的重复性。
1.3.7 市售牛肉加工品的检测
为验证所建方法在实际样品检测过程中的准确性，购买市售牛肉加工品（酱牛肉、肥牛卷、牛肉干、牛肉松、牛排、牛肉馅饺子等）40 份，按照1.3.2节方法提取DNA模板进行检测。同时用SN/T 2051—2008方法对此40 份样品进行检测，比较2 种方法的符合率。
2 结果与分析
2.1 标准质粒的鉴定
由图1可知，对标准质粒进行PCR鉴定，可扩增到1 条约96 bp的片段，与连接前的PCR产物大小一致。由图2可知，标准质粒酶切鉴定正确，测序结果与目的基因序列相符，表明pMD-18T-96-beef标准质粒构建成功。
2.2 荧光定量PCR反应条件的确定
经过对引物和探针浓度的摸索，确定反应体系为：2×Premix Ex Taq?（Probe qPCR）12.5 μL，bovine-F、bovine-R终浓度为0.5 ?mol/L，bovine-P终浓度为0.025 ?mol/L，DNA模板2 μL，用双蒸水补齐至20 μL。实时荧光PCR反应条件为：95 ℃/10 s、95 ℃/ 5 s、60 ℃/ 20 s，40 个循环；35 ℃/10 s。结果判定，
Ct值<30为阳性，Ct值>40为阴性，两者之间为可疑，重复检验，结果一致且呈明显的对数增长，判定为阳性，否则为阴性。
2.3 牛源性成分荧光定量PCR标准曲线的建立
按优化的反应条件，取6 个稀释度的标准质粒pMD-18T-96-beef作为模板进行荧光定量PCR扩增，从而可以得出拷贝数对数值（x）与循环数（Ct）值之间的线性关系表达式：Ct=-3.345x+36.48，相关系数R2=0.98。
2.4 牛源性成分荧光定量PCR检测方法的评价
2.4.1 牛源性成分荧光定量PCR检测方法的灵敏度
标准质粒梯度为3.32×106、4.76×105、3.50×104、3.47×103、5.13×102、4.16×101 copies/?L时，用荧光定量PCR方法对不同质粒量的模板进行扩增，当标准质粒在4.16×101 copies/?L模板浓度时，仍然可以检测到牛源性成分阳性，故本检测方法的灵敏度为4.16×101 copies/?L。
2.4.2 牛源性成分荧光定量PCR检测方法的特异性
以不同肉种基因组为模板进行荧光定量PCR扩增，由图3可知，只有牛肉有荧光信号，猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉均无有效扩增，说明所建方法有很好的特异性。
2.4.3 牛源性成分荧光定量PCR检测方法的重复性
由表2可知，4.76×105、3.50×104、3.47×103 copies/?L
标准质粒稀释度3 次扩增的变异系数均小于0.98%，由批间重复性实验可知，3 个标准质粒稀释度的变异系数均小于0.33%。可见，本实验建立的荧光定量PCR检测方法具有较高的可重复性，从而保证了样品检测结果的可靠性和稳定性。
2.5 市售样品的荧光定量PCR检测结果
使用本研究建立的方法对40 份市售样品中的牛源性成分进行定量检测，结果显示，有2 份肥牛卷和1 份牛肉干存在检不到荧光信号的现象，表明市场上确实存在假冒牛肉成分的商品。而且该结果与SN/T 2051—2008方法的检测结果符合率达100%。说明本实验建立的荧光定量PCR方法可以用于肉制品中牛源性成分的检测。
3 讨 论
肉类鉴别涉及畜牧业的健康发展，消费者权益的保障，进出口贸易等诸多领域。对肉类鉴别方法的研究十分必要，特别是近几年的核酸扩增技术更给肉类鉴别提供了有利平台。肉类鉴别的靶基因主要包括3 类：线粒体基因组DNA、细胞基因组中重复序列和单拷贝序列。物种基因的正确选择及基因片段长度的大小是动物源性成分检测的关键，本研究选择单拷贝β-actin基因设计特异性引物和探针，是因为其组织间差异不大，在定量检测时更能准确的计算其拷贝数，对其含量进行量化分析。因此单拷贝基因DNA序列已广泛应用于研究物种的遗传分化，物种进化食品及饲料中动物源性成分检测的靶基因[20]。
本研究基于牛单拷贝基因组序列设计特异性引物和荧光探针，建立了肉制品中牛源性成分检测的TaqMan荧光定量PCR方法。经验证，本研究建立的方法特异性良好，检测灵敏度达到41.6 copies/?L。应用本方法对市售40 份牛肉加工品进行检测，发现确实存在牛肉成分肉类掺假的行为，而且该结果与SN/T 2051—2008方法结果符合率达100%。本研究可以满足日常的检测工作需要，是防止商家掺假牟利的有效手段之一。
荧光定量PCR方法对样品中的牛源性成分进行了相对定量，这方便了食品检测部门对样品中牛源性成分的无意沾染和故意添加做出判定。该方法修补了行业标准的漏洞，是对行业标准的有益补充。应用荧光定量PCR方法检测食品中的牛源性成分是我国行业标准发展的必然趋势，以指导我国食品检验检疫部门对食品的安全进行把关。
应用分子技术来检测食品安全是未来发展的重要方向，肉源成分检测历经了普通PCR方法、实时荧光PCR方法、以及定量PCR方法，虽然各方法还存在着一定的技术性问题，比如目前还不能通过对样品中不同肉源性成分的DNA拷贝数比来计算出其组分的质量比，但是随着分子生物学技术的不断发展必将会日趋完善，在生命科学技术领域有很大的应用前景。
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实时荧光定量PCR应用技术综述 篇4
1 实时荧光定量PCR技术的基本原理
实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来, 其基本原理是相同的, 主要不同之处是其定量的体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出, 利用荧光信号积累, 实时监测整个PCR进程, 在PCR循环中, 测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值 (Threshold Cycle) 概念, Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数, 是PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号, 可以用于定义一个样本的C值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线, 然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率, 所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数 (R2>0.99) , 这样才能认为实验的过程和数据是可信的, 使用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量PCR仪都有软件, 可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类
目前, Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种, 也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测, 这些方法有着相近的灵敏感度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子, 如SYBR greenⅠ。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法, 在PCR反应体系中, 加入过量SYBR greenⅠ荧光染料, SYBR greenⅠ荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何ds DNA序列的扩增, 不需要探针的设计, 使检测方法变得简便, 同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何ds DNA结合, 因此它也能与非特异的ds DNA (如引物二聚体) 结合, 使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲 (Melting Curve) 分析的软件加以解决。由于SYBR GreenⅠ对PCR有一定的抑制性, 并且荧光强度较低, 稳定性差。近来试剂公司针对SYBR GreenⅠ存在的缺点开发了一些性能改进的染料, 如SYBR GreenⅠ、SYBR Green ER、Eva Green TM等。荧光定量PCR所用到的探针可分为以下几类:内掺式染料、序列特异性探针、特异性引物、阴阳探针。
2.1 SYBR GreenⅠ染料
反应体系中, 加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。其优点是对模板没有选择性, 使用方便, 非常方便, 但也易与容易与非特异性双链DNA结合, 产生假阳性, 可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件。
2.2 Taqman探针
目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TagMan系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶 (例如Taq酶) 的5'-3'活性所降解, 探针的5'端有一荧光报告基团, 3'端有一荧光淬灭基团, 当两个基团相互先靠近的时候, 由于发生能量传递作用, 报告基团不能发出荧光, 但随着扩增反应的进行, 5'端的报告基团随着探针的水解而脱落下来, 不再与淬灭发生能量传递作用, 从而能发出荧光, 被信号探测器所捕获。针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题, 2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3′端采用了非荧光性的淬灭基因, 吸收报告基团的能量后并不发光, 大大降低了本底信号的干扰。此外, MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽, 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好, 荧光背景更低, 使得信噪比更高。
2.3 Scorpions
它由两个寡核苷酸分子组成, 一个是引物, 另一个是带荧光分子的探针, 但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连, 在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 不发荧光。变性阶段, 探针的发夹结构会解开, 在退火时则与模板相结合, 形成线性分子, 报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上, 要求绝对保守, 长度为25~32bp, Tm在68~70度之间, 探针的5'端不能为G, 避免多个碱基同时出现, 尤其要避免4个G同时出现, 另外, 探针应靠近上游引物。
2.4 分子信标
分子倍标 (Molecular Beacon) 是一种单链DNA形成的发夹结构, 在其一端有一报告基团, 在另一端有一淬灭基团, 当它形成发夹结构时, 由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 两者之间发生荧光信号能量共振转移, 当热循环温度达到分子Beacon的解链温度时, 其构象改变, 与模板结合而完全伸展成线性分子, 使得FRET消失, 报告基团发出荧光信号。荧光基团被激发时, 淬灭作用被解除, 发出激发光子。
3 实时荧光定量PCR技术的实验方法
3.1 RT-PCR
以RNA为起始实验材料。分为两种: (1) 一步法, 反转录反应和PCR反应在同一反应管中进行。操作简单、反应连续、污染几率低, 适合于病原体的检测。 (2) 二步法, 反转录反应和PCR反应分两步进行, 反转录反应液 (cDNA) 作为PCR反应的模板, 适合于mRNA表达量的解析。
3.2 PCR
以DNA材料为起始实验。
4 实时荧光定量PCR技术存在的问题及应用前景
实时荧光定量PCR技术由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点, 是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法, 与传统的PCR技术相比, Real-time Q-PCR的不足之处是 (1) 由于运用了封闭的检测, 减少了扩增后电泳的检测步骤, 因此也就不能监测扩增产物的大小; (2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性, 从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式检测的应用能力; (3) 目前Real-time Q-PCR实验成本比较高, 从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展, 目前Real-time QPCR已成为科研的主要工具, 使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的研究手段, 该技术未来的应用前景是非常广阔的将成为生物定量分析的强有力段。
摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系, 经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度, 其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法, 而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比, 实时定量PCR能够更加快速、灵敏, 并有效地对核酸进行实时定量检测。
荧光定量 篇5
一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法
根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性,用4μmol/L YO-PRO-1(YP)和4μg/ml碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色96孔板中的.细胞样品.分别在485/538(Ex/Em,nm)和530/590(Ex/Em,nm)的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度.将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应,通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析(r=0.999,P＜0.01),得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程.该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞,具有灵敏度高和快速高效的特点.
作 者：叶玲玲 刘红 刘兴茂 李世崇 吴本传 王启伟 陈昭烈 YE Ling-ling LIU Hong LIU Xing-mao LI Shi-chong WU Ben-chuan WANG Qi-wei CHEN Zhao-lie 作者单位：军事医学科学院生物工程研究所细胞工程室,北京,100071 刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 26(6) 分类号：Q819 关键词：荧光强度 高通量 定量检测 细胞凋亡荧光定量 篇6
该病的主要临床症状是精神沉郁,食欲废绝;行为上无方向感的游泳,甚至停止游泳;皮肤上出现苍白的块斑和水泡;鳍、鳞片、口腔、腹部出血或充血;患病鱼出现症状后1~2 d内死亡。
该病毒适合培养温度为21℃,只对锦鲤鳍细胞系敏感,产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊断方法不多,主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。目前,很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧光定量PCR方法,该方法以其敏感性、特异性高,污染少,可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒VR52标准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法,利用一对特异性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法,以期为KHV感染提供快速、特异的诊断方法。
1 材料和方法
1.1 毒株
KHV标准毒株VR52购自ATCC R公司。鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠。
1.2 试剂和仪器
组织基因组DNA提取试剂盒(DV811A),Taq DNA聚合酶,PCR反应试剂盒,质粒提取试剂盒,PMD-18T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,Takara Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,DNA分子量Marker,DNAgreen,焦磷酸二乙酯(DEPC)均购自宝生物工程(大连)有限公司,其他试剂均为国产或进口分装。核酸蛋白分析仪Gene.specv为Hitachi Naka Instruments Co.Ltd公司产品。荧光PCR仪ABI7000 Sequence Detection Systems为ABI公司、普通PCR仪PTC-200 Peltien Thermal Cycler为MJ Research公司产品。凝胶成像仪Gel Doc TMXR为BIO-RED公司产品,高速冷冻离心机3K30为德国SIGMA公司。
1.3 FQ-PCR标准品的制备
1.3.1 引物的设计与合成
根据Gen Bank上公布的AB375391 KHV胸苷激酶(TK)基因的保守序列,利用Premier5.0引物设计软件设计两条引物,送上海生工合成。引物序列如下:
上游引物TK1为:5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′下游引物TK2为:5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′
1.3.2 TK基因的扩增
将KHV标准毒VR52接种KF细胞,待出现细胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸,做为扩增的模板。提取过程按照说明书进行操作。PCR扩增体系如下:25 L的体系,DNA模板3 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,引物TK11 L(10 p M),引物TK21 L(10 p M),Taq酶(5U/L)0.2 L,DEPC处理水补到25 L。反应条件为94℃5 min;95℃1 min,52℃1 min,72℃1 min,40个循环;72℃10 min;4℃保温。扩增片段大小为409 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。
1.3.3 TK基因的克隆与鉴定
利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将TK基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书),将回收的产物与PMD-18T Vector连接16 h。连接体系:PMD-18T Vector 1 L,PCR产物1 L,DEPC处理水3 L,连接液5 L。将连接产物转化到DH5感受态细胞,加入IPTG和X-Gal,涂在Amp+琼脂平板上,次日挑取4个白色单个菌落,分别进行PCR鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养基中,37℃摇床过夜,利用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3.4 质粒标准品浓度的计算
将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值,判断其纯度(OD260nm/OD280nm>1.8者为纯品),然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/L)×1 L]×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023个/mol),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;660是每个碱基的平均分子量;重组质粒的总长度为3101bp。标准品作10倍梯度稀释,–20℃保存备用。
1.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立
1.4.1 引物和Taq Man探针的设计与合成
以1.3中PCR扩增的片段为模板,利用Beacon Designer 5.0软件设计了1对特异引物和Taq Man探针,引物和探针均由大连宝生物有限公司合成,探针的5′端用荧光基团FAM标记,3′端用淬灭基团TAMRA标记。引物及其Taq Man探针序列见表1。扩增长度为116bp。
1.4.2 荧光定量PCR反应体系及条件
反应体系:25 L的总体系,DNA模板5 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,上游引物1 L(10 p M),下游引物1 L(10 p M),探针0.8 L(10 p M),Taq酶(5 U/L)1 L,DEPC处理水补到25 L。置荧光定量PCR仪中,反应条件为94℃3 min;94℃15 s,60℃30 s,72℃1 min,5个循环;94℃10 s,60℃40 s,40个循环,收集荧光信号。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。
1.4.3 标准曲线的制备
将KHV标准品质粒做10倍系列稀释,采用优化好的条件进行实时荧光定量PCR。根据质粒拷贝数和对应的Ct值,利用SDS1.2分析软件得到标准曲线。
1.4.4 FQ-PCR特异性试验
用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒,检测KHV引物和探针的特异性。
1.4.5 FQ-PCR重复性试验
对FQ-PCR模板进行10倍系列稀释,并做2组平行样,检测其重复性。
2 结果
2.1 KHV TK基因特异性片段的扩增
目的片段大小为409 bp,经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
2.2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定
将目的片段与PMD-18T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5,经过Amp+的琼脂平板的培养,挑取阳性克隆菌,提取质粒,并测序。经0.8%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小为3 101 bp,结果如图2所示。测序结果显示,质粒中含有目的片段。以质粒为模板,进行常规PCR鉴定,扩增出409 bp的目的片段,如图3所示,说明质粒构建成功,取2号管对应的质粒做标准品,用于荧光定量PCR方法的建立。
2.3 重组质粒浓度的测定
提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定,其质量浓度为32.85 g/m L,OD260nm/OD280nm比值为1.825,符合纯度要求。根据每个阳性质粒含3101bp,所提质粒DNA溶液浓度可换算为1.6×1010个拷贝/L。
2.4 引物和探针最佳使用浓度的确定
以相同浓度的阳性核酸为模板,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下,以循环阈值(Ct值)最小,荧光强度增加值(Rn)最大,若两者不一致,优先以Ct值为准,矩阵法优选后,引物和探针的最佳浓度分别为0.4 p M和0.32 p M。
2.5 FQ-PCR标准曲线的建立和回归方程的确定
对标准阳性质粒10倍系列稀释,以优化的条件进行Taq Man FQ-PCR扩增。利用SDS1.2分析软件,以Ct值为纵坐标,质粒DNA拷贝数的对数为横坐标,获得一条标准曲线,如图4所示。可见,在1.6×10~1.6×105拷贝之间,测得的数值基本在一条直线上,与Ct值有良好的相关性,相关系数R2=0.992,说明各个浓度组相关性非常好,可以对病毒进行可靠的定量检测,此阳性质粒可作为FQ-PCR的标准品。质粒在稀释到10-9仍能检测到荧光信号,对应16个拷贝数,该方法检测的灵敏度为16个病毒拷贝数,灵敏度较高。图中,标准曲线的斜率为-3.09,截距为20.96,可以得出拷贝数N与Ct值之间的线性关系表达式即回归方程:Ct=-3.09Ig N+20.96。待测样品的Ct值可直接从仪器中读取,通过回归方程,可确定样品中核酸的含量。
2.6 FQ-PCR重复性试验
将KHV核酸做梯度稀释,做两组重复样,结果如图5所示,重复样Ct值之间相差0.1左右,重复性较好。
2.7 FQ-PCR特异性实验
分别对IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒,用建立好的KHV FQ-PCR的反应体系,进行扩增。如图6所示,只有KHV有扩增曲线,呈现出良好的特异性。
3 讨论
目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soliman等[3]、Gunimaladevi等[4]报道采用LAMP法能高度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒;乌日琴等[5]、刘荭等[6]也初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定性分析的手段。而本文建立的FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的使用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测的特点;FQ-PCR克服了常规PCR的许多缺点,如普通PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果,费时费力,并且紫外线和溴化乙锭对人体又有害,这些复杂的过程增加了假阳性的机会,FQ-PCR具有扩增与自动分析一体化,缩短了检测时间。本文建立的FQ-PCR检测方法,具有高灵敏性、高特异性、操作时间短,可做为KHV检测首选的方法。
本文FQ-PCR标准品的构建是荧光定量PCR方法建立的基础,本文选用6个稀释度的标准阳性质粒模板,建立的标准曲线,相关系数为0.992,表明拷贝数与Ct值相关性良好,本试验最低可检出16个病毒拷贝,说明灵敏度较高。因此本研究构建的检测KHV的标准品可用于FQ-PCR检测。
由于FQ-PCR可定量检测病毒数量的特点,可做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有力的参考,有很好的应用前景和研究价值。
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荧光定量 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
实验标本选自2013年11月1~30日南京医科大学附属淮安第一医院(以下简称“我院”)检验科体检者的肘静脉新鲜EDTA抗凝血2 mL,共40例,其中男19例,女21例,年龄38~79岁,平均(61.46±11.58)岁。本研究获得我院医学伦理委员会审查通过,所有入选者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度
使用富士核酸提取系统提取基因组DNA,操作严格按照说明书进行。微量紫外分光光度计测DNA的浓度与纯度,OD260/280为1.7~1.9为合格,记录DNA的浓度。使用TB缓冲液将待测样本DNA浓度稀释至7 ng/μL,任意选取一样本作为标准品,使用Milli-Q超纯水按1︰2.5的比例将标准品DNA浓度依次等比稀释为45、18、7.2、2.88、1.152 ng/μL,并放于-20℃冰箱保存备用。端粒长度的测定参照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反应使用的引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,序列如下:telg 5′-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3′;telc 5′-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3′;hbgu 5′-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3′;hbgd 5′-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3′。反应体系:SYBR GreenⅠMaster(罗氏公司)7.5μL,样本DNA 5μL(待测样本DNA含量为35 ng,标准品含量依次为225、90、36、14.4、5.76 ng),端粒引物telg、telc终浓度均为500 nmol/L;单拷贝基因引物HBGU、HBGD终浓度均为200 nmol/L。反应在同一块384孔板上进行,标准品和待测样本均设置3复孔,另外设置以相同体积的超纯水作为DNA的阴性对照,亦为3个复孔。使用仪器为Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)。反应条件为Ⅰ:95℃15 min;Ⅱ:94℃15 s,49℃15 s,2个循环;Ⅲ:94℃15 s,62℃10 s,74℃15 s,84℃10 s,85℃15 s,38个循环。反应结束后建立熔解曲线。从Light Cycler480v1.5拷出原始数据,使用软件“Conversion from Light Cycler480 to LinReg PCR”将其转换并导入Lin Reg PCR(v12.15)软件进行分析。
1.2.2 Southern blot测量平均TRF长度
实验前进行琼脂糖凝胶电泳检验待测DNA的完整性,使用罗氏试剂盒Telo TAGGG Telomere Length Assay(罗氏公司)完成平均TRF的测定,琼脂糖、尼龙膜亦购于该公司,实验参照试剂盒提供的步骤进行。具体为:限制性内切酶Hinf I和Rsa I酶切基因组DNA(1.2μg,包括试剂盒提供的对照DNA)2 h,将酶切DNA连同地高辛标记的marker放于0.8%琼脂糖凝胶中以5 V/cm的电压电泳10 cm,使用毛细管转移法将DNA转移至带正电荷尼龙膜上,120℃烘烤30 min,使用试剂盒提供的杂交液42℃预杂交1 h后,用地高辛标记的端粒探针42℃杂交3 h,洗膜后,加入显影底液,并将尼龙膜放入LAS-4000数字成像系统中进行连续曝光,曝光时间15~20 min,选择曝光强度最适宜的一张照片进行TRF长度测定。使用图像处理软件Image J(v1.44p),根据公式TRF=∑(ODi)/∑(ODi/Li)计算平均TRF长度。其中,ODi表示位置i的光密度值,Li表示位置i的marker长度,不同批次的结果根据control DNA进行校正。
1.3 观察指标
①观察PCR产物的熔解曲线、端粒与单拷贝基因的标准曲线;②观察T/S比值的重复性,计算批内变异系数及批间变异系数;③分析T/S比值与平均TRF长度的相关性。
2 结果
2.1 熔解曲线、标准曲线及相对T/S比值的计算
PCR产物的熔解曲线如图1所示,熔解曲线为两个完全分开的双峰,Tm值分别为78℃和91℃,分别为端粒扩增产物和单拷贝基因扩增产物。分别计算各个浓度标准品端粒和单拷贝基因的平均Ct值,并以DNA含量的对数值log[DNA]作横坐标,以Ct值作纵坐标,在Microsoft Excel中绘制端粒和单拷贝基因的标准曲线,得出R2值和公式(图2)。从图中可以看出,端粒和单拷贝基因的标准曲线R2均>0.99,且两条标准曲线几乎平行,说明端粒和单拷贝基因扩增效率相近,提示在225~5.76 ng范围内,使用该标准曲线计算待测样本的端粒长度可靠。将各个待测样本的原始Ct值代入公式,进行幂转换,得到每个待测样本相对于标准品的端粒的纳克数(T)和单拷贝基因的纳克数(S),最后计算3个复孔T/S比值的平均值,即得到每个待测样本相对于标准品的T/S比值。
2.2 T/S比值的重复性检验
计算每个待测样本3个复孔T/S比值的变异系数,然后计算39个样本变异系数的几何均数,得出批内变异系数为2.9%。为了检验该MMQPCR方法的批间重复性,同样的39个样本于第2天进行重复测量,仍为3个复孔,且保证每个样本在384孔板上的位置与前一次不同,以减少位置效应。两次独立实验各个样本T/S均值的相关性见图3,可以发现线性回归线的斜率接近于1,且在Y轴上的截距接近于零。计算两次实验每对样本T/S比值的变异系数,最后求得39对样本变异系数的几何均数,即批间变异系数为3.4%。
2.3 T/S比值与平均TRF长度的相关性分析
计算39个样本DNA的平均T/S比值为1.13±0.21,平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,从图4可以看出两种不同方法测得的结果存在明显相关性(R2=0.6706,P<0.001)。
3 讨论
MMQPCR将端粒和单拷贝基因置于同一个反应管中扩增,利用端粒和单拷贝基因丰度和产物Tm值的差异,使用SYBR Green染料在一个循环中顺序收集端粒荧光信号和单拷贝基因荧光信号。该方法与传统多重PCR不同的是两个目标基因的扩增并不是同时进行。端粒首先扩增并在74℃收集信号,由于端粒的丰度远比单拷贝基因高,此时单拷贝基因的Ct值仍在基线水平以下,因此74℃的Ct值仅代表端粒。温度继续升高到85℃,因为此时端粒产物已完全解链,释放DNA聚合酶用于单拷贝基因的扩增,由于单拷贝基因引物5′端被加了“GC钳”,提高了退火温度,使其在85℃仍能扩增,因此此时收集的荧光仅代表单拷贝基因产物。该方法与之前的PCR方法比较,试剂和模板用量以及时间均减少了一半,更为重要的是消除了模板起始量不同对结果产生的影响,减少了批内误差。
扩增效率是影响定量PCR可靠性的最重要因素[14],由于实时定量PCR通过Ct值来计算模板的起始量,因此所有样本的扩增效率一致显得很重要。端粒的定量PCR利用两个基因的扩增来计算端粒长度,其中任何一个都有可能存在效率误差,因而对效率误差尤为敏感。有文献报道了端粒定量PCR可接受的效率范围为95%~103%[16],但这个范围只是象征性的,如果所有的样本的扩增效率一致,具体的数值并不重要,80%和100%一样可靠,因为导致效率误差的是样本之间扩增效率的差别[15]。另一个与扩增效率有关的问题与标准品有关。端粒定量PCR通过外部标准曲线法计算端粒长度,一般来说应使用任一个待测样本,或多个样本的混合作为标准品。因为在血样本的保存及DNA的提取过程中有很多化学物质可抑制PCR反应,如乙醇、酚、EDTA等[17],而标准品与待测样本来源相同可以控制抑制因子对PCR的影响,从而减少标准品与待测样本之间的效率误差[15]。相反,使用购买的高度纯化的标准品[18]和来自细胞系的标准品[19,20]则不能消除抑制因子的影响。
本实验在罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪上进行端粒与单拷贝基因的扩增,利用LinRegPCR软件进行数据分析,解决了仪器自带软件无法分析数据的问题,从而拓宽了MMQPCR方法测定端粒长度的应用范围。与传统的Southern blot方法比较,MMQPCR方法具有省时、简便的特点,可高通量处理大量样品。
摘要：目的 在罗氏Light Cycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应(MMQPCR)方法测定端粒长度。方法 在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度(相对T/S比值),并与DNA印迹法(Southern blot)测得的平均末端限制性片段(TRF)长度作比较。结果 MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13±0.21,Southern blot方法测量平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,两种方法测定结果的相关性分析R2=0.6706(P<0.001)。结论 本研究建立的MMQPCR方法测定端粒长度重复性好、省时、简便、可靠,可高通量处理大量样品。
荧光定量 篇8
1 实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR技术, 是指在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。在荧光定量PCR中, 对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号, 随着反应时间的延续, 监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线。在PCR 反应早期, 产生荧光的水平不能与背景明显区别, 而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期, 在PCR反应处于指数期的某一点检测PCR产物的量, 并由此可以推断模板最初的含量[2]。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数, 荧光定量PCR采用参数“Ct”值, Ct值 (cycle threshold) 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明, 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 起始拷贝数越多, Ct值越小[3]。利用已知起始拷贝数的标准品可以绘制出标准曲线;因此, 只要获得未知样品的Ct值, 即可从标准曲线上推算出该样品的起始拷贝数[4]。
2 实时荧光定量PCR的检测方法
随着分子生物学技术的不断发展, 迄今已建立了一系列的实时定量PCR技术检测方法。具体包括2大类, 即探针类和染料类。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;染料类如SYBR Green Ⅰ则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。
2.1 Taqman 探针
该探针是长度为20~24 bp的寡核苷酸, 在其5′末端标记1个荧光报告基团, 3′末端标记1个荧光淬灭基团, 其序列与2个引物包含序列内的1段DNA 模板完全互补。该方法是当探针保持完整时利用Taq 酶 (5′→3′外切酶) 的活性淬灭基团吸收发射的荧光。当有特异的而不是非特异的PCR 发生时, Taq酶同时发挥其5′→3′外切酶活性, 将与模板杂交的探针切碎, 报告基团与淬灭基团分离, 淬灭作用被解除, 荧光信号释放, 通过检测系统就可以观察到信号的变化, 荧光信号的累积与PCR 产物形成呈正相关。每扩增1条DNA 链, 就有1个游离的荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与PCR 产物的形成完全同步。利用标准模板系列绘制出标准曲线, 结合各样品的Ct值, 可以确定样品的起初模板量[5]。由于探针与目标片段之间的特异杂交产生荧光信号, 因而此方法可通过探针增强检测的特异性, 且能够提供多重检测功能。但Taqman探针检测法也存在一定的不足, 如淬灭难以彻底、本底较高、定量时容易受酶活性的影响、探针成本较高等使其无法普及应用。
2.2 TaqmanMGB 探针
TaqmanMGB 探针是在Taqman 探针的基础上改进的, 在探针的3′端增加了小槽黏结剂 (MGB) 分子, 这种物质能够结合在双链DNA小沟部位。MGB 可将探针的TM值提高10 ℃左右, 从而使其能够分辨1个碱基的差别, 如完全配对则有荧光信号, 若有1个碱基不匹配则没有信号, 而且连在MGB分子后面的是非荧光物质的淬灭基团, 从而使这种探针具备更好的淬灭效果, 且无背景荧光、荧光标记灵活、荧光信号的信噪比高、退火温度高、探针短、核酸多态性 (SNP) 识别率高, 从而使TaqmanMGB 探针具备了更加广泛的应用前景。
2.3 分子信标
分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针, 环部大小为15~35 bp, 能与靶DNA序列互补, 茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成, 探针的5′端与3′端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由状态时, 发夹结构的2个末端靠近, 使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近, 产生荧光共振能量转移 (FRET) 效应, 荧光信号被淬灭;因此, 检测不到荧光信号[6]。当有靶序列存在时, 分子信标与靶序列结合, 使分子信标的发夹结构打开呈线型, 荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离, 此时荧光报告基团不能被淬灭, 荧光检测仪器可检测到荧光。随着每次扩增产物的积累, 荧光强度增加, 可反映出每次扩增末扩增产物积累的量。分子信标法的特点是探针可循环利用, 适用于检测点突变, 特异性更明显。但探针标记较复杂, 并且要求其游离在溶液中时探针能无选择性折叠, 当茎结构的热力学温度过高时还会影响探针与靶序列杂交。
2.4 双杂交探针
双杂交探针技术是Roche公司开发的一种PCR定量技术, 使用2个杂交探针, 能提高特异性[7]。该技术是将2条探针中的1条在5′端标记荧光, 1条在3′端标记荧光, 其中一个为受体荧光基团, 另一个为供体荧光基团, 2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。在自由状态时, 供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱;因此, 只能检测到供体荧光基团发出的荧光。在PCR退火阶段中2条探针与目的基因特异性结合, 首尾连接, 使供体和受体荧光距离非常接近, 两者产生荧光共振能量转移, 使受体荧光基团发出荧光。由于荧光共振能量转移探针是靠近发光, 所以检测信号是实时信号, 而非累积信号[8]。该方法的特点是淬灭效率高, 但由于2个探针结合于模板上;因此, 会影响扩增效率, 而且需要合成2个较长的探针, 合成成本相对较高。
2.5 复合探针
复合探针结合了分子信标和杂交探针的优点, 由荧光探针和淬灭探针组成, 荧光探针长25个碱基左右, 5′端标记荧光基团, 3′端磷酸化防止被延伸, 淬灭探针长15个碱基左右, 3′端标记淬灭基团。当没有模板存在时, 2个探针结合形成复合探针, 荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收, 无荧光产生;当有模板存在时, 由于荧光探针与模板完全互补, 荧光探针优先与模板结合, 2个探针分离, 产生较强荧光。荧光强度与PCR体系中模板数量成正比, 可进行PCR定量。该方法的优点是使用非荧光淬灭剂, 本底低, 对扩增效率影响小, 探针设计、合成、标记、纯化方便, 而且探针特异性较强、灵敏度较高, 可以用来鉴别单碱基变异。
2.6 荧光标记引物
荧光标记引物是根据分子信标的原理变化而来的一种联合分子探针系统。该方法是把荧光基团标记的发夹结构序列直接与PCR引物结合, 从而使荧光标记基团直接进入PCR扩增产物。在没有单链模板的情况下, 该引物自身配对形成发夹结构使荧光淬灭;在模板存在的情况下, 引物与模板配对, 发夹结构打开, 产生荧光信号。荧光标记引物通过二级结构实现淬灭, 不需要荧光淬灭基团, 也不需要设计特异的探针序列, 能更快地发射荧光, 而且信号更为强烈。由于没有探针控制特异性;因此, 特异性要弱于探针技术。目前, 荧光标记引物主要有3种:发卡式引物、蝎子引物和LUX引物。
2.6.1 发卡式引物
发卡式引物是在分子信标的基础上发展起来的[9] , 在PCR延伸阶段整合进它们的特异性扩增子, 产生荧光信号, 其特异性依赖于引物序列。此方法能将所有的扩增产物标记上荧光分子;因此, 荧光信号响应快, 但无法区分特异性和非特异性扩增。
2.6.2 蝎状引物
蝎状引物是对发卡式引物的改进。该技术在引物与分子灯标探针之间连接1个间隔臂, 使PCR延伸反应时不能延伸至分子信标。这样非特异性扩增产物便不能产生荧光信号, 当有特异性扩增产物时, 即可与分子信标杂交, 产生荧光信号。既解决了非特异性问题, 又保留了响应快的特点, 但仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配及探针合成复杂等问题。
2.6.3 LUX引物
LUX引物法是运用高灵敏度的荧光检测系统实时监控每个循环, 并利用累积荧光强度, 通过确立Ct值的方法推测样品起始模板数从而实现定量分析。此方法的特点是仅需要设计LUX引物而不需要专门设计探针, 既节省了成本又给引物设计提供了宽松的空间[10]。由于没有探针控制特异性, 它的特异性要弱于探针技术, 但并不受引物二聚体影响, 所以特异性和灵敏度比常规PCR方法高。
2.7 SYBR Green Ⅰ荧光染料
SYBR Green Ⅰ是一种非饱和菁类荧光素, 可以嵌合于DNA双链结构的小沟中, 非特异地与dsDNA分子结合, 是应用最广泛的非探针类化学检测物[11]。在PCR反应体系中, 加入过量的SYBR Green Ⅰ荧光染料, 使其特异地与dsDNA 分子结合后, 发射荧光信号, 荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加;因此, 可被荧光探测系统检测到, 荧光强度的增加与初始模板量相关, 可以进行定量DNA分析。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA 序列的扩增, 不需要探针的设计, 检测方法简便, 降低了检测成本。 然而, 由于荧光染料能与任何dsDNA分子结合, 也能与非特异性的dsDNA分子 (如引物二聚体) 结合, 产生荧光干扰, 使试验产生假阳性结果。目前, 可以用带有熔解曲线分析的软件解决这个问题。
2.8 LC Green TM Ⅰ荧光染料
LC Green TM Ⅰ荧光染料是新出现的一种dsDNA结合染料, 能够与dsDNA分子完全结合直接加入PCR反应体系中, 高浓度的LC Green TM Ⅰ不会抑制PCR反应[12];因此, 可得到更强的荧光信号。该染料抗水解、抗热解、抗光解能力均强于SYBR GreenⅠ染料。LC Green TM Ⅰ染料法简便、快速、准确性高、成本低, 但其反应的特异性依赖于高特异性的引物。
3 实时荧光定量PCR的定量方法
实时荧光定量PCR的定量方法有2种, 即绝对定量法和相对定量法[13]。绝对定量法是用已知的标准曲线来推算未知的样本量;相对定量法是在一定样品中靶序列相对于另一参照序列量的变化, 由于每个模板Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 利用已知起始DNA浓度的标准品即可绘制出标准曲线。
3.1 绝对定量法
绝对定量法指的是用已知的标准曲线来推算未知样本的量, 此方法要预先知道标准品的浓度。将标准品稀释成不同浓度并作为模板进行PCR反应, 以标准品拷贝数的对数值为横坐标, 以测得的Ct值为纵坐标绘制出标准曲线。对未知样品进行定量时根据未知样品的Ct值, 即可从标准曲线中推出样品的起始拷贝数。
3.2 相对定量法
3.2.1 比较标准曲线的相对定量法
相对定量法指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本量的变化。由于该方法中量的表达是相对于某个参照物而言的;因此, 相对定量法的标准曲线比较容易制备, 对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中, 待测样本靶序列的量来自标准曲线, 最后必须除以参照物的量, 其他的样本为参照物量的n倍。在试验中为了准确加入反应体系的RNA或DNA, 通常在反应中扩增1个内源管家基因作为参照基因, 由于管家基因在各种组织中的恒定表达, 所以可用来作为标准, 比较来源不同的样本目的基因表达量的差异。管理基因是用于比较目的基因拷贝数, 根据内参照补偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失, 反应体系内是否存在扩增抑制因素及参照物标准化等[14]。
3.2.2 比较Ct值的相对定量法
该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段。这2个扩增反应可以在2个反应管中分别进行, 也可以在同1个反应管中进行, 测得两者的Ct值之差即ΔCt。该方法不需要标准曲线, 与标准曲线法不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量, 前提是假设每个循环增加1倍的产物, 以PCR反应的指数期得到Ct值来估算起始模板的量, 一个循环 (Ct=1) 相当于起始模板数的2倍。此方法节省试剂, 操作简便, 但由于是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的, 效率的偏移会影响对实际拷贝数的估计[8];因此, 如何优化反应体系, 使得目的基因和内参基因的扩增效率相等是该方法的难点。
4 实时荧光定量PCR的应用
实时荧光定量PCR的应用范围很广, 目前主要用于肿瘤的诊断、细胞因子表达的分析、病原体的分子检测、基因工程的研究等方面。
4.1 肿瘤的诊断
肿瘤基因遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现。实时荧光定量PCR技术不但能够有效地检测基因的突变, 而且还能准确地测定表达量, 进行肿瘤的早期诊断和治疗效果及预后的判断。该技术的应用已成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。曹恒斌等应用实时荧光定量PCR方法成功证实肌细胞增强因子2与肝癌之间有密切关系。陈公琰等[15]利用实时荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达, 证实端粒酶参与了人肺腺癌Anip973/NVB细胞的MDR, 并可将端粒酶作为逆转耐药的新靶点。
4.2 细胞因子的表达分析
细胞因子在体内作为一种调节蛋白, 其表达和分泌都受到严格的调控。在某些病理情况下, 细胞因子的表达会出现异常, 通过实时荧光定量PCR技术可以对细胞因子的mRNA进行定量, 来估算其蛋白表达量, 从而可以对某些疾病进行诊断和研究。另外, 细胞因子通过调节免疫反应在机体的免疫系统中起着核心作用。为了阐明在许多炎症反应、自身免疫性疾病、器官移植排异中的免疫致病机制, 细胞因子mRNA表达谱的可靠定量就显得十分重要。实时荧光定量PCR允许被检样品中细胞因子含量极低, 同时又具有高敏感性和准确性。温立斌等利用构建的重组质粒, 成功建立了检测猪Th1、Th2型细胞因子基因的实时荧光定量PCR标准曲线和直线回归方程。
4.3 病原体的分子检测
该技术不仅能对病原体定性, 而且还能对病原体DNA或RNA序列准确定量, 同时对整个病程中潜在病原体的复活等进行动态研究, 从而对疾病进行早期诊断、药物疗效观察、病情判断及预后观察等。实时定量PCR技术的定量范围很宽, 可以快速、准确定量出高至1010, 低至101个拷贝数的病原体。目前, 该技术已应用于细菌、病毒、衣原体、支原体、寄生虫等许多病原体的检测研究。张志东等应用该技术快速检测出有口蹄疫病毒 (FMDV) 持续感染的带毒动物, 比以往的诊断方法更加快速、准确、客观。Stram Y等采用TaqmanMGB 探针方法可在10~100个病毒基因组分子范围内对病毒RNA进行定量检测牛流行热病毒。
4.4 基因工程研究
实时荧光定量PCR技术的出现不仅加强了对基因量的研究方法, 也加强了对基因质的变化研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性, 并已经被广泛应用于遗传分析[8]。
4.4.1 基因表达的研究
实时荧光定量PCR能对低丰度mRNA进行定量, 并且可在体外对细胞活性进行评估。细胞因子是一种调节蛋白, 对免疫反应和炎症反应都具有重要的调节作用, 其量的改变常与某些疾病, 如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥等有密切关系。由于得到的组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平上的检测, 所以应用实时定量PCR技术检测细胞因子mRNA表达水平显得更有意义。
4.4.2 基因突变及多态性研究
实时荧光定量PCR技术可用于检测特异性突变基因, 因为扩增DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆和宿主细胞内的生长准备, 即可在媒介生物分子纯化过程中直接测得。利用实时荧光定量PCR和间接测序方法, 可对已知DNA序列进行基因突变及多态性分析。Espasa M等[16]利用荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌靶基因单点突变, 其敏感性和特异性均获得满意的结果。
4.4.3 转基因安全检测
实时荧光定量PCR技术可用于对转基因产品的检测和定量。目前, 该技术在生物安全检测中的应用主要有:动物中基因治疗载体生物分布的确定、生物疗法中残留DNA 的定量、污染细胞库和终产物中病毒和细菌核酸的检测、病毒研究中病毒清除水平的定量、疫苗中逆转录病毒活性的特异性检测及遗传稳定性监控中转基因拷贝数的确定等。实时荧光定量PCR技术可达到简便、快速、准确地检测转基因产品的目的。
5 实时荧光定量PCR技术的展望
荧光定量 篇9
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验稻谷是由中国科学院亚热带农业生态研究所开发的转Bar基因抗除草剂水稻 (Bar68-1) , 基因转入方法为基因枪法, 外源基因拷贝数为2[6]。
1.2 含不同比例转Bar基因稻谷样品
将转Bar基因稻谷 (Bar68-1) 和非转基因稻谷 (Xiang125S) 在同等条件下 (相同的粉碎机、相同的粉碎时间) 粉碎后, 全部通过100目筛, 用分析天平分别称取不同重量粉碎产物按照重量比配制成含30%, 20%, 10%, 5%, 0.9%, 0.5%的转Bar基因稻谷的样品, 混合均匀。用于转Bar基因水稻的RT-PCR定量检测准确性的验证。
1.3 仪器设备与试剂
仪器:Roter-Gene-3000型实时荧光定量PCR仪, Gorbett research公司, 澳大利亚;
试剂:SYBR Premix Ex TaqR Ta Ka Ra (日本宝生物) , 中国大连。
1.4 样品DNA的提取
本研究采用改进的CTAB法提取DNA分子, 样品为稻谷粉碎产物, 每组样品分别做三个重复以提取DNA分子, 改进的CTAB法试剂配制及操作步骤参照许文涛等[7]方法。
1.5 荧光定量PCR引物及扩增条件
本研究选择两个水稻基因, 蔗糖磷酸合成酶基因 (sucrose phosphate synthase, SPS, 基因Bank号:U33175) 和水稻特有的淀粉分支酶基因 (rice starch branchingenzyme 4, RBE4, 基因Bank号:AB023498) 作为内参基因, 这两个基因在水稻基因组中均为单拷贝基因, SPS基因引物参照杨立桃等设计[8], RBE4引物序列参照Soon-Chun Jeong等[9]设计。根据转Bar基因水稻中转入的外源基因盒, 分别选择Bar基因和Ca MV35s启动子作为目的基因。基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的要求设计引物进行PCR扩增, 引物设计采用Primer Premier5.0软件设计, 引物序列及扩增片断长度如表1。引物由Ta Ka Ra (日本宝生物, 大连) 公司合成。
荧光定量PCR为20μL反应体系, 10μL SYBR Green I荧光结合染料的混合液, 引物浓度分别为1.0μmol/L, 一定量的模板DNA, 最后用灭菌超纯水补齐至20μL。空白对照以超纯水代替模板DNA。
定量PCR反应在Roter-Gene-3000型实时荧光定量PCR仪上进行, 采用两步法进行PCR反应, PCR反应条件:60℃保温15 s, 预变性为95℃, 60s, 变性94℃20s, 退火20s, 延伸72℃20s, 其中Bar、Ca MV35s、SPS、RBE4基因的退火温度分别是59℃、60℃、60℃、60℃, 循环次数均为40, 熔解曲线的温度范围设置为65℃到95.0℃。每个DNA样品对应的每个基因分别做两个重复。
1.6 荧光定量PCR反应标准曲线的制作
荧光定量PCR的标准曲线用100%含量的转Bar基因稻谷 (Bar68-1) 基因组DNA制作, 本研究将纯化的转Bar基因稻谷DNA模板用灭菌蒸馏水按5倍逐级稀释成5个浓度梯度, 然后把每一个梯度的DNA模板做两个平行进行荧光定量PCR扩增, 分别作出Bar, Ca MV35s, SPS, RBE4四个基因的标准曲线, 扩增体系与条件同1.5。
2 数据统计与分析
荧光定量PCR定量检测试验结束后, 分别将样品中各基因的CT值带入标准曲线公式中算出该基因在样品中的初始拷贝数, 然后将计算所得内参基因 (RBE4, SPS) 和外源目标基因 (Bar, Ca MV35s) 的初始拷贝数应用公式:
计算样品转Bar基因水稻的混入率, 其中, 重组基因拷贝数和内源基因拷贝数之比是指样品中初始重组基因拷贝数与内源基因初始拷贝数之比。内标比是基因组中内源基因拷贝数与外源基因拷贝数的比值, 本试验所用的转Bar基因水稻Bar68-1中转入的外源重组基因 (Bar, Ca MV35s) 的拷贝数为2, 而内源基因 (SPS, REB4) 拷贝数为1, 但由于水稻内参基因SPS和RBE4是纯合二倍体, 而转基因当代的外源基因一般不是纯合的, 因此内标比为1。所得结果用Excel软件整理分析。
3 试验结果
3.1 四种基因RT-PCR荧光定量标准曲线分析
注:其中SPS0, REB40, Bar0, Ca MV35s0分别表示各基因的初始拷贝数
本研究分别选取了两个水稻自身基因 (SPS基因, RBE4基因) 和两个外源基因 (Bar, Ca MV35s) 作为转基因作物荧光定量检测的内参基因和外源基因。采用经纯化的Bar68-1稻谷基因组DNA为模板制作各基因的标准曲线。应用5倍稀释制作荧光定量PCR标准曲线结果如表2所示, 各标准曲线的相关系数均达到0.99以上, 说明四个基因的标准曲线已经满足了荧光定量的标准曲线的精度要求。四种基因扩增曲线如图1。四种基因的熔解曲线如图2所示, 熔解曲线是RT-PCR扩增特异性的反映, 这四个基因的熔解曲线均呈单峰型, 说明在PCR扩增过程中, 没有出现非特异性扩增, 由此推断设计的四对定量PCR引物均具有较好的特异性。
3.2 不同比例转Bar基因稻谷的结果
表3列出了四种不同内参和外源基因组合条件下, RT-PCR法对于转Bar基因稻谷定量检测的结果。从结果可见, RT-PCR法可以实现对于高含量 (大于5%) 的转Bar基因水稻组的准确定量检测, 所有基因组合的检测结果误差范围大多处于20%以内。而定量检测结果误差主要以5%, 0.9%, 0.5%转Bar基因稻谷含量组误差最大, 且含量越小误差越大, 四种基因组合对于0.5%含量组的检测结果误差范围均大于25%。综合四种不同的内参和外源基因的组合的定量检测误差分析, 表明SPS/Ca MV35s两个基因组合的误差范围相对小于其它三组。
4 讨论
4.1 荧光定量PCR法的内参基因和外源基因的选择
本研究中, 转基因作物定量检测的内参基因分别选择了水稻蔗糖磷酸合成酶基因和水稻淀粉分支酶基因, 这两个基因在水稻基因组中均为单拷贝基因, SPS基因在检测水稻某些特异基因的表达量及转基因水稻检测等方面获得了广泛应用[8,10]。淀粉分支酶基因是一种水稻特异性基因, Soon-Chun Jeong等将其应用于转基因水稻的实时PCR定量检测获得了较高准确性[9]。本研究通过对转Bar基因水稻两种内参基因, 两种外源基因的定量检测, 分别进行相对比较, 选择出一对相对准确的检测转Bar基因水稻的内参和外源基因的组合。
4.2 荧光定量PCR法的定量检测结果
目前, 欧盟对食品和饲料中转基因成分的含量规定了严格的标准, 要求食品和饲料中的转基因成分不能超过0.9%, 超过了这个界限就需要进行标识[11]。因此, 本研究按照欧盟的标准, 设计了最低含量为0.5%转Bar基因稻谷的混合稻谷, 用实时PCR法检测转基因水稻的含量, 以验证该法的准确性。
研究结果认为基于RT-PCR法能较准确的检测转Bar基因水稻的含量, 可以作为转Bar基因水稻定量检测的可信方法之一, 本研究中的试验样品采集过程一致, 并且在同等条件下粉碎后严格按照比例进行混合, 因此所用的样品具有较好的均一性。但在实际生产条件下, 由于试验样品采集的误差, 或不同品种的作物混合后, 由于两者物理性质的不同而引起粉碎粒度的差异, 从而导致DNA抽提的不均一, 都将造成转基因作物检测结果的巨大误差[12]。Knut等使用某种转基因大豆进行转基因大豆定量检测, 其转基因含量按重量算是10%, 如果按照DNA比例来计算, 转基因含量约为12%, 二者略有差异[13]。这种差异可能是由于食品中转基因和非转基因组分单位重量材料里面含有不同量的DNA所致。一般认为最佳的定量PCR方法通常被认为存在25%的不确定性。因此, 韩国对转基因作物定量检测误差的可接受范围为20%[14]。可见, 本研究结果所表明的以SPS为内参基因, Ca MV35s为外源基因的组合对转Bar基因水稻Bar68-1的定量检测结果可信度较高, 除0.5%组以外, 各组误差均在20%以内, 符合对转基因作物定量检测的误差要求。
研究发现, RT-PCR法对于转Bar基因稻谷定量检测的结果的准确性随着转基因稻谷含量的降低而降低, 其原因可能与采样时样品的混合均匀度有关, 对于含转基因稻谷越低的混合稻谷样品, 其混匀的程度会给采样的准确性带来较大的误差, 特别是对于检测目标在样品中含量较低的待检样品, 采样的误差会给检测结果造成较大的影响[15]。此外, 基因组DNA抽提的过程中也可能会给定量检测的结果带来较大的误差, 因为转基因稻谷含量低组中外源基因的含量较低, 抽提过程中较小的降解都会给定量检测结果带来巨大误差[16,17]。
4.3 荧光定量PCR法的定量检测的局限
RT-PCR法是目前常用的转基因作物定量检测的方法之一, 许多转基因作物的实时PCR定量检测方法都被建立了起来[4,14,18]。但是, 实时PCR方法准确定量检测食品或饲料中转基因成分的前提条件是明确该作物转入基因片段在基因组中的拷贝数。然而, 在实际情况下, 食品或饲料中可能含有多种不同的转基因作物, 而这些转基因作物的外源基因片段资料又很难明确, 因此实时PCR法定量检测转基因成分的技术应用还有很大的局限性, 仅限于单一作物品种, 且所含的转基因成分背景明确的前提之下。此外, RT-PCR法是针对转基因作物的外源基因和内源基因片段进行检测的方法, 准确定量的前提是存在完整的重组和内源基因片段, 因此, 对于经过高温高压或其它特殊手段加工的含转基因作物的样品可能发生基因片段的降解而影响定量的准确性, 甚至无法进行RT-PCR的定量检测。
5 结论
5.1 RT-PCR法可作为稻谷中转Bar基因水稻定量检测的可信方法, 以SPS/Ca MV35s组合可获得相对较准确的检测结果。
5.2 RT-PCR法定量检测的准确性随混合稻谷中转Bar基因水稻含量的提高而提高。
荧光定量 篇10
三维定量荧光录井作为新型的录井技术, 从2011年底在珠江口盆地探区进行录井作业, 通过对12口井的数据进行分析, 综合其它的录井技术建立一套符合珠江口盆地探区的油气层解释和评价标准, 为生产、科研及下一步勘探开发决策提供翔实的资料。
一、三维定量荧光技术分析方法
三维定量荧光录井技术所检测物质的荧光强度 (INT) 与激发波长 (EX) 和接收、发射波长 (EM) 有关, 由三者可以组成三维定量荧光分析的立体谱图, 也可以演变成等值线谱图。不同烃类物质在萃取的条件下有不同的三维荧光谱图特征, 也就是说不同烃类物质在最佳的激发波长 (EX) 激发下, 会产生最佳的接收波长 (EM) 和最高的荧光强度 (INT) 。这种分析方法也是三维定量荧光录井技术判断流体性质的重要依据。
二、三维定量荧光技术与常规荧光录井的对比
常规荧光录井广泛用的是地质荧光灯, 它采用365nm的紫外线灯管产生的紫外线进行照射样品, 采用系列对比的方法进行判断岩屑有无荧光显示。主要应用于中、重质油的发现, 对于轻质
油的发现存在不足;目前海上钻井平台使用的二维定量荧光仪 (英文简称:QFT) 采用254nm紫外线激发荧光, 只适用于对油质的发现, 即用于简单定性, 不容易区别相应的流体性质, 也不能准确的定量。三维定量荧光录井是通过连续激发波长 (200-800nm) 和连续发射波长 (200-800nm) 范围内的荧光强度的变化来反映三者的关系, 从而得到三维荧光发射谱图[2]。
三、储集层原油性质的定性分析方法
分析方法解释 (如图1) :对角线A为萃取试剂正已烷出峰位置;平行于萃取试剂的线B为三维荧光原油图谱出峰位置及变化方向;差距C为相同激发波长EX下A线和B线接收波长EM之间的距离, 是判断油质谱的重要参考。油质荧光波长 (差距C) 都至少大于20nm, 小于50nm;红圈D为油质三维等值图信息, 像人的指纹图;黑圈E为泥浆添加剂荧光出峰位置;
备注:D中荧光主峰位置EM359nm与EX310nm相差49nm, 符合油质判断方法, 三维油质信息明显。此岩屑中有钻井液的影响。
四、三维定量荧光录井技术在海上油气发现中的应用
通过对海上某盆地探区12口井的岩屑进行三维荧光分析, 累计共发现荧光并解释747m, 远远大于常规的岩屑荧光录井285m, 与测井解释对比, 符合率达90%以上, 为该探区的油气发现与识别发挥了重要作用, 解决了凝析油、轻质油油气显示很难发现的难题。
1. 海上某盆地作业区域油气层谱图划分标准 (如图2所示)
(1) 凝析气峰:EX::227700~~229900, , EEM::331155~~332255;
(2) 轻质油峰 (凝析油峰) :EX:290~300, EM:300~350;
(3) 中质油峰:EX:300~330, EM:350~400。
2. 应用分析
三维定量荧光解释与电测解释结论符合性较好。下面以两口井为例来进行分析。
HZ-1井电测解释成果如表3所示:4号层 (2631.70~2637.00m) 解释为气层, 8号层 (2673.60~2677.00m) 解释为油层;现场三维定量荧光解释成果如表4所示:录井井段3号层 (2627.00m~2648.00m, 浅灰色泥质细砂岩) 定量荧光数据结果为相当含油量4.7~10.2mg/L, 荧光测级别为4.0~5.1, 油性指数为0.9~1.1, 三维定量荧光综合分析解释评价:原油性质为凝析油, 解释结论为油气层;录井井段4号层 (2674.00m~2680.00m, 浅灰色荧光细砂岩) 定量荧光数据结果为相当含油量22.5~35.4mg/L, 荧光测级别为6.2~6.9, 油性指数为1.0, 三维定量荧光综合分析解释评价:原油性质为凝析油, 解释结论为油气层。
LW-1井电测解释成果如表6所示:1号层 (3308.30~3314.10m) 解释为气层, 2号层 (3316.90~3317.60m) 解释为差气层, 3号层 (3319.20~3346.10m) 解释为气层;现场三维定量荧光解释成果如表5所示:录井井段1号层 (3309.00m~3314.00m, 浅灰色细砂岩) 定量荧光数据结果为相当含油量2.69~5.62mg/L, 荧光测级别为3.1~4.2, 油性指数为0.7, 三维定量荧光等值图出峰位EX为270nm、EM为320nm (图3) , 综合分析解释评价:原油性质为凝析气, 解释结论为气层;录井井段2号层 (3317.00m~3318.00m, 浅灰色细砂岩) 定量荧光数据结果为相当含油量4.82mg/L, 荧光测级别为4, 油性指数为0.7, 三维定量荧光等值图出峰位EX为270nm、EM为320nm (图4) , 综合分析解释评价:原油性质为凝析气, 解释结论为气层。录井井段3号层 (3320.00m~3347.00m, 浅灰色细砂岩) 定量荧光数据结果为相当含油量4.5~154.09mg/L, 荧光测级别为3.9~9, 油性指数为0.6~0.7, 综合分析解释评价:原油性质为凝析气, 解释结论为油气层。
结束语
1.三维定量荧光分析技术, 能够快速、直接区分钻井液对地层岩屑的影响;分析谱图直观, 主次分明, 在油气显示发现达到100%发现率, 在深圳探区均发现油气层显示。
2.三维定量荧光技术从定性和定量的角度进行流体性质的判别, 通过三维荧光技术的应用, 建立了油气层的三维定量荧光划分标准及相应区块的解释图版。
3. 仪器的高灵敏度检测, 解决了微弱油气显示不容易发现的难题, 三维荧光录井可靠的解释评价方法, 使三维荧光录井成为一种全新的录井手段。
摘要：三维定量荧光录井技术能够快速、直接区分钻井液对地层岩屑的影响, 分析谱图直观, 主次分明;可以从定性和定量的角度进行流体性质的判别;建立相应区块的原油图谱库和钻井液体系及泥浆添加剂的图谱库, 同时依据试油结果数据和测井数据, 建立相应区块的解释图版, 为相应区块三维荧光录井提供可靠的评价依据, 实现一种可靠的录井手段。
关键词：分析方法,油质定性,解释图版,评价标准
参考文献
[1]陈俊男.三维定量荧光录井技术探讨.录井工程, 2005, 16 (2) :5-9.