乳铁蛋白

乳铁蛋白（精选6篇）

乳铁蛋白 篇1

乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是一种相对分子质量约为80k D的铁结合糖蛋白,广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。Groves于1960年首先从牛乳中分离获得这种蛋白,由于乳铁蛋白与铁结合形成红色的复合物,故始称红蛋白。1961年Blanc和Isliker将他们从人乳中分离出来的此种蛋白命名为乳铁蛋白。乳铁蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质,既可作为人体营养来源,补充铁和氨基酸,又具有抗微生物、免疫调节、抗氧化、抗癌等功效,被认为是一种新型的抗菌抗癌药物和极具开发潜力的食品添加剂。目前,乳铁蛋白已经成为蛋白质药物开发的热点之一。本文对乳铁蛋白的理化性质、生理功能及近年来研究进展进行了综述。

1 乳铁蛋白的来源及结构

乳铁蛋白因其最先在乳汁中被发现而得名,主要存在于人和哺乳动物的乳汁中,其含量随动物种类、泌乳时间、胎次、个体等而有所不同,除乳汁外,它也广泛存在于动物体的泪液、唾液、汗液、胰液等内、外分泌液中,只是含量甚微[1]。乳汁中的乳铁蛋白由乳腺合成,而血液中的LF则来自嗜中性粒白细胞。人乳中乳铁蛋白含量特别丰富,是母乳中含量位于第2的蛋白质,占普通母乳蛋白质的10%。人初乳中含LF质量浓度为1~5 g·L-1,常乳中1~3 g·L-1,牛初乳中0.8g·L-1左右,牛常乳中0.1~0.4 g·L-1,含量较母乳低[2]。

目前乳铁蛋白的结构与特性的研究已经相当深入。乳铁蛋白呈单一多肽链,两端各折成环状,铁离子伴随着2个碳酸氢根离子(HCO3-)结合于该区。1个铁离子(Fe3+)与乳铁蛋白每一端的4个残基相连:2个酪氨酸、1个天冬氨酸、1个组氨酸。乳铁蛋白与铁离子结合后,铁离子进入每叶缝隙内部,此区域闭合,使乳铁蛋白分子结构更加紧密。

乳铁蛋白的二级结构以α螺旋和β结构为主,二者沿蛋白质的氨基酸顺序交替排列,而且α螺旋多于β结构。乳铁蛋白的立体结构是在二级结构的基础上折叠形成两个相似的结构域(N-叶和C-叶)。呈2枚“无柄银杏叶并列状”(如图1)[3]。此二叶具有较高的重叠性,同源性高达40%,每叶可与一个Fe3+结合,结合点位于一个裂口内。每叶还包含4个氨基酸残基协调铁离子。每个铁结合位置还固定有重碳酸盐阴离子,以保持电荷平衡[4]。

随着研究的深入,人们发现水解后的乳铁蛋白会产生一些具有特殊生理功能的小肽。乳铁蛋白活性多肽(Lfcin B),它是牛乳铁蛋白在消化道正常生理条件下释放出的一种含25个氨基酸残基的抗菌肽。Lfcin B来源于牛乳铁蛋白的第17~41位氨基酸,由25个氨基酸残基组成,氨基酸顺序为:Phe-Lys-CysArg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe[5],包括5个Trp、3个Lys和多个芳香族氨基酸残基,具有强碱性,p I>8.15,相对分子质量3.1KDa。研究表明其水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构,具有耐热、在消化道中不易降解、免疫调节作用、广谱抑菌和对肠道有益菌无害等特性。

2 乳铁蛋白的生物学功能

2.1 提高机体对铁离子的吸收

动物体内的运铁蛋白在胃内极酸性条件下不具有运送铁的作用,这时只有乳铁蛋白能在动物肠道中运载铁离子。研究发现多种动物肠细胞上有乳铁蛋白的专一性受体,经此种受体的基因转染过的Caco-2细胞能对乳铁蛋白结合的铁表现出更强的摄取活性[6]。也有研究发现,当机体细胞缺铁时,细胞会合成较多的转铁蛋白和乳铁蛋白,表明乳铁蛋白和转铁蛋白具有相类似的转运铁的功能。Kawakami[7]证实,给贫血的小鼠进食铁结合的乳铁蛋白和普通的硫酸亚铁,要得到同样治疗效果,后者的摄入量需是前者的4倍。机体对铁的吸收有负反馈调节机制,当细胞缺铁时会在其表面合成特异的铁受体,如血液中的转铁蛋白和肠道中的乳铁蛋白。在摄入铁时,若结合乳铁蛋白则可明显减缓铁对肠道的刺激作用,减少无机铁离子摄入。

2.2 抑菌和杀菌

乳铁蛋白是一种广谱抑菌剂,早期研究表明既可抑制需铁的革兰氏阴性菌,如大肠菌群,E.Coli、沙门氏菌等;也可抑制革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特菌等。但对乳酸菌一类生理需铁较低的微生物,乳铁蛋白基本上不表现抑菌活性。Terrguchi等研究了牛乳铁蛋白对鼠肠内细菌的影响,结果发现用含乳铁蛋白的牛乳喂饲小鼠时,其肠道内肠球菌受到抑制,抑制效果与乳铁蛋白的浓度和喂食时间相关,而与乳铁蛋白的铁结合能力无关。同时,乳铁蛋白降解产生的乳铁多肽素表现出强杀菌活性,他能够破坏细胞膜,使细胞膜去极化,p H梯度消失,或在膜上形成孔洞,杀死细菌。所以,乳铁蛋白对微生物的抑制作用不仅依赖铁结合活性,还可达到抑菌杀菌效果[8]。

2.3 免疫调节

乳铁蛋白能够发挥其特异的调节功能,主要是与其靶细胞及靶细胞表面的特异性受体有关,不同的细胞其乳铁蛋白受体的特性也不相同。巨噬细胞和淋巴细胞的各种免疫细胞都有乳铁蛋白受体存在,乳铁蛋白具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力[9],还能促进多形核白血球巨噬细胞对细菌的吞噬,促进自然杀伤细胞的活化及淋巴球的增生,抑制颗粒球巨噬细胞菌落刺激因子的产生和释放。乳铁蛋白能够抑制由于脂多糖所诱导的TNF-a的释放,并诱导白介素6的表达,从而阻止由于败血症所诱发的机体死亡。乳铁蛋白可以通过诱导体液免疫反应,对免疫系统各方面产生影响:影响T细胞和B细胞成熟、影响淋巴细胞增生、调节单核细胞和巨噬细胞系统中铁水平以及其他免疫功能[10]。乳铁蛋白还可作为机体非抗体免疫的主要力量对抗病原菌的入侵。同时进食乳铁蛋白能刺激肠道免疫球蛋白的分泌,Debbabi等[11]认为,乳铁蛋白是免疫系统的激发因子,并且只有黏附在细胞上才能发挥激发作用。

2.4 抗病毒

乳铁蛋白能抵抗许多病毒的感染,如可抑制人体免疫缺陷性病毒、细胞巨化病毒、疱疹病毒、丙型肝炎病毒、流感病毒等。乳铁蛋白对宿主体内抗病毒作用很大。乳铁蛋白抑制HIV-1机理为:HIV-1生命周期中具有极其重要三种酶(逆转录酶、蛋白酶和整合酶),乳铁蛋白略微抑制HIV-1蛋白酶和整合酶,但强烈抑制HIV-1逆转录酶,从而能抑制HIV体外复制[12]。

抗HCV试验指出,其抗病毒的作用可能是干扰HCV和靶细胞的作用。因为如果在接种病毒的同时或之前使用乳铁蛋白最为有效。减少乳铁蛋白和HCV接触的时间就会增加感染病毒的机会。乳铁蛋白结合到HCV E1和E2的核衣壳上可以阻止病毒对靶细胞的吸附[13]。

Beljaars等[14]研究了乳铁蛋白对巨化病毒的抑制作用后指出,乳铁蛋白对病毒的作用主要是阻碍病毒入侵通道,而非通过调节免疫系统。但Waarts等[15]认为,乳铁蛋白抑制病毒主要是通过干预病毒与受体的结合,并非影响其入侵通道或者影响其复制过程。

此外,还能具有抑制流感病毒的活性,主要是因为其碳水化合物残基上含唾液酸,它干扰病毒对靶细胞的结合、感染[16]。可见,乳铁蛋白具有潜在的抗病毒效应和高选择性,在抑制病毒与细胞的早期相互作用中起着十分重要的作用。

2.5 乳铁蛋白的其他生理功能

乳铁蛋白除了具有以上功能,还有抑制肿瘤生长和转移、调控基因表达、抗寄生虫活性、抗氧化及抑制胆固醇积累等作用。

3 问题与展望

综上所述,乳铁蛋白作为一种多功能的蛋白质,有着独特作用机理,它广泛存在于动物多种组织及黏膜层,参与机体的非特异性体液免疫反应。近年来对乳铁蛋白进行了大量的研究工作,使得人们对乳铁蛋白的结构、生物学功能及其分子机制有了一定的认识,但还有很多问题不是完全清楚。随着乳铁蛋白生理功能研究的不断深入,其应用前景将越来越广阔。

乳铁蛋白对胃癌细胞增殖的影响 篇2

1 材料与方法

1.1 主要材料

胃癌细胞系MGC-803为本室保存。Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。qRT-PCR miRNA Detection Kit购自广州天根生物公司。miR-218 mimics为Ambion公司产品。DMEM培养基购自Hyclone公司, 胎牛血清来自杭州四季青。MTS细胞增殖/毒性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养

胃癌细胞系MGC-803培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中, 在95%的湿度、5%的CO2、37℃条件下培养。用不同浓度重组人乳铁蛋白干预MGC-803细胞。

1.3 MTS法检测细胞增殖活性

取对数生长期的MGC-803细胞, 胰蛋白酶消化后接种于96孔板中, 每组设6个复孔, 处理组细胞加入不同浓度重组人乳铁蛋白的培养基, 对照组加入相同体积的不含重组人乳铁蛋白的培养基放37℃、5% CO2培养箱中培养。在未接种细胞的孔中加入DMEM培养基中作为调零孔。接种后24、48、72和96h各检测1次。检测时每孔加20μL MTS检测试剂, 37℃孵育2h, 在酶标仪上测定570nm波长处吸光度值 (A570) 。细胞增殖抑制率= (1-实验A值/对照组A值) ×100%。

2 结果

采用0 (对照组) 、0.1、1、10、100μg/L重组人乳铁蛋白处理MGC-803细胞24、48、72h, 分别取细胞进行MTS检测, 结果发现乳铁蛋白能明显抑制MGC-803细胞的增殖 (P<0.05) , 其抑制作用呈现出剂量-时间依赖性 (见图1、表1) 。

3 讨论

乳铁蛋白属于转铁蛋白家族, 是一种非血红素铁结合蛋白。因与铁结合后形成的复合物呈红色, 故早前又称为“红色蛋白”[1]。它广泛分布于哺乳动物 (人、牛、羊、马、狗、猪和一些啮齿类) 乳汁、唾液、精液、泪液、气管和鼻腔分泌物、胰液等外分泌液, 以及血浆、中性粒细胞次级颗粒中[1]。它在人类初乳中含量最高, 可达6～8mg/mL, 成熟乳汁中含量在1g/L左右。乳铁蛋白具有广泛的生物学功能, 除参与铁代谢外, 具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能[1]。乳铁蛋白的多种重要生物学功能使其在畜牧、食品营养品、医药界受到广泛关注。乳铁蛋白在多种肿瘤中下调或缺失, 它能抑制宫颈癌细胞、头颈部肿瘤细胞等肿瘤细胞的增殖, 并且发现乳铁蛋白能阻止细胞周期G1/S进程[4,5]。研究也显示, 乳铁蛋白能调控细胞周期调控蛋白如p21、p27和Rb的表达和活性, 从而调控细胞周期影响肿瘤细胞生长增殖[4]。

本研究通过采用重组人乳铁蛋白处理胃癌细胞MGC-803, 结果发现乳铁蛋白能明显抑制MGC-803细胞的增殖 (P<0.05) , 其抑制作用呈现出剂量-时间依赖性。乳铁蛋白产品在畜牧业、食品行业已经开始使用, 安全性很好。因此, 本研究对于乳铁蛋白应用于胃癌的预防和治疗将具有十分重要的意义。

参考文献

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乳铁蛋白 篇3

1 材料与方法

1.1 实验菌株

实验采用的P.g ATCC33277由中国医科大学附属口腔医院牙周病科提供。将-80 ℃保存的P.g ATCC33277复苏、传代和增菌培养,经形态学检查确定其为纯培养后,采用麦氏比浊法用磷酸盐缓冲(PBS,pH 7.2)配制成P.g混悬液(108 CFU/ml)备用。

1.2 主要试剂

牛心脑浸液培养基(BHI培养基)。10 mmol/L二硫基苏糖醇(Dithiothreitol,简称DTT,Sevra)。0.2 mmol/L苯甲酸- L- 精氨酸对硝基苯胺(Na- benzoyl- l- arginine- p- nitroanizide,简称BAPNA,Sigma)。50 mmol/L Tris- HCl(pH 7.5)。0.1% TritonX- 100 (Por- analysi,Merck)。标准胰蛋白酶(trypsin, 2 500 U/mg,北京格源天润生物技术有限公司)。标准牛血清白蛋白(电泳单点纯,广州蕊特生物科技公司)。PBS缓冲液(pH 7.2)。0.01%G- 250考马斯亮蓝染色液(上海雅吉生物科技有限公司)。将天然牛乳铁蛋白(WAKO公司)配制成5 mg/ml,因之前通过实验得出牛乳铁蛋白对P.g的MIC为5 mg/ml,本实验要测牛乳铁蛋白对P.g TLP活性的影响,故选择低于MIC的乳铁蛋白浓度值,应用对倍稀释法将牛乳铁蛋白配制成2.5、 1.25、 0.625 mg/ml。

1.3 细菌培养

取2 ml EP管25 个,分为5 组,每组设5 个平行管,其中3 组作为实验组,1 组作阴性对照,1 组作阳性对照。在上述5 组EP管中分别加入BHI培养基,乳铁蛋白系列稀释液、P.g菌悬液和PBS缓冲液(表 1)。

实验组1、 2、 3及阴性对照组加入乳铁蛋白体积均为0.5 ml。将上述EP管在厌氧袋中37 ℃培养48 h。

1.4 细菌培养物处理

肉眼见细菌生长,并在镜下经形态学鉴定为纯P.g培养物后,将EP管置于低温冷冻高速离心机中离心(13 000 r/min,4 ℃)6 min,收集上清液(培养物上清液) 备用。收集离心后剩余的菌细胞,经PBS洗涤3 次,用PBS配成P.g菌悬液,进行超声破碎(10 Hz,冰浴0～4 ℃,破碎5 s,休息10 s,重复6 次),直到镜下见菌细胞完全破碎为止,将上述破碎后的菌悬液置于低温冷冻高速离心机中再次离心(13 000 r/min,4 ℃)6 min,收集上清液 (菌细胞破碎后上清液) 备用。

1.5 胰酶样蛋白酶活性的测定

取96孔反应板(每孔容积350 μl)一块,选其中14 孔作为标准孔,分为7 组,每组2 孔, 2 孔为空白孔。实验孔按乳铁蛋白浓度不同分5 组,其中包括阴性对照组和阳性对照组,每组2 孔。分别在标准孔、空白孔、实验孔中加入140 μl Tris- HCl,100 μl BAPNA, 10 μl DTT,10 μl TritonX- 100后,将反应板放入THZ- C型恒温振荡器中振荡10 min,温度为37 ℃,使混合液充分混匀。然后取出反应板,在空白孔中加入30 μl Tris- HCl(即标准胰蛋白酶浓度为0 U/ml),在实验孔中按乳铁蛋白浓度不同分别加入30 μl培养物上清液和30 μl菌细胞破碎后上清液,再将反应板放入THZ- C型恒温振荡器中振荡15 min,温度为37 ℃,使其充分反应,然后取出反应板在紫外光分光光度计下测定每孔液体的吸光度A值(λ=405 nm),空白孔用于调零。用同样方法制备胰蛋白酶标准曲线,只是在标准孔中加入30 μl经系列稀释的标准胰蛋白酶(浓度从0～8 000 U/ml),以标准孔中胰酶活性单位为横坐标,其A值为纵坐标,做出胰酶样蛋白酶的标准曲线,以实验孔中2 种上清液的A值在标准曲线上的投射点算出其横坐标值即TLP活性值。

1.6 上清液蛋白含量的测定

取96孔反应板(每孔容积350 μl)一块。选其中7孔为标准孔,1孔为空白孔、实验孔则按乳铁蛋白浓度不同分5 组,其中包括阴性对照组和阳性对照组,每组为2 孔。在空白孔中加入10 μl PBS缓冲液(即牛血清白蛋白浓度为0 mg/ml)、实验孔中分别加入10 μl培养基上清夜和菌细胞上清液。然后再于每个反应孔中分别加入280 μl考马斯亮蓝G- 250染色液,室温反应2 min并震荡10 s,之后用在紫外光分光光度计下采取比浊法测定蛋白浓度A值(λ=405 mn),空白孔用于调零。用同样方法制备牛血清白蛋白标准曲线。只是在标准孔中分别加入10 μl牛血清白蛋白溶液(对倍稀释7 个浓度梯度,0～6.25 mg/ml)。以标准孔中牛血清白蛋白的浓度为横坐标,其A值为纵坐标,作标准曲线。以实验孔中2 种上清液的A值在标准曲线上的投射点,算出其横坐标值即蛋白浓度。

1.7 胰酶样蛋白酶比活的测定

以实验孔中TLP的活性单位除以其所含的蛋白浓度就得出每克蛋白所含的TLP的活性单位,即比活。

1.8 统计分析

牛乳铁蛋白对P.g TLP比活抑制作用的研究数据采用SPSS 11.5统计软件分析,选用单因素方差分析各实验组之间有无统计学差别。

2 结果

2.1 牛乳铁蛋白对细菌培养上清液TLP的影响

见图 1。

2.2 牛乳铁蛋白对菌细胞裂解上清液TLP的影响

见图 2。

2.3 实验组TLP活性,蛋白含量及比活

见表 2。

注: ①与实验组2比,P=0.003; ②与阳性对照组比,P=0.002; ③与阳性对照组比,P=0.005; ④与实验组3比,P=0.002; ⑤与阳性对照组比,P=0.10; ⑥与细菌培养上清液实验组1比,P=0.005; ⑦与细菌培养上清液实验组2比,P=0.006; ⑧与细菌培养上清液实验组3比,P=0.002

3 讨论

P.g是牙周病的主要致病菌之一[4],它分泌产生的TLP是其重要的毒力因子之一[5]。TLP对牙周组织的破坏主要包括以下几个方面:(1)能够降解I型、IV型胶原,并可使胶原变性[6], 破坏牙周结缔组织和细胞外基质,从而破坏牙龈上皮和基底膜的完整性;(2)TLP能刺激成纤维细胞产生胶原酶,激活牙周组织中的胶原酶原或破坏血清中的胶原酶抑制剂,从而激活胶原酶,使牙周组织中胶原被溶解破坏;(3)TLP能激活补体系统,刺激前列腺素介导的破骨细胞骨吸收,从而破坏牙周组织的正常结构,诱发炎症反应,引起龈沟液分泌量增加,为龈下菌斑中致病微生物的过度生长提供条件,使龈下菌斑微生态失调;(4)TLP还能降解免疫球蛋白SIgA、IgA和IgG, 降低抗体的调理作用,抑制免疫反应,并可以导致牙周炎炎症过程中龈沟液的渗出,降低牙周组织局部的免疫功能[7]。此外,有学者发现具有较高TLP活性的P.g菌株对人上皮细胞的黏附强于TLP活性低的P.g菌株,而且TLP还能钝化人血清的抗菌活性[8,9],使人血清的免疫功能降低。还有学者研究发现TLP活性与P.g抗体水平呈正相关[10],TLP活性越高,P.g抗体水平越高。说明P.g能够产生TLP,这一特性增强了其毒力。

乳铁蛋白(lactoferrin,Lf)是一个大约有700 个氨基酸残基构成的、相对分子质量约为80 000 Da的单体糖蛋白,属于转铁蛋白家族。主要存在于乳汁、眼泪、唾液、精液、鼻腔分泌物等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。目前研究表明乳铁蛋白具有以下生物学功能[1]:①促进肠道细胞对铁离子的吸收; ②抗菌作用; ③抗病毒作用; ④免疫调节活性; ⑤抗感染活性; ⑥抗氧化; ⑦同药物的协同作用 (抗生素和抗病毒药物); ⑧基因调节作用; ⑨刺激成骨细胞增殖分化,促进骨生长,抑制骨吸收等。它已经被应用于营养补充以及食品等方面,其抗菌作用受到了广泛的关注。研究表明,乳铁蛋白属于广谱抑菌剂,既抑制需铁的革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等),也抑制革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单细胞李斯特菌等),但对需铁不高的微生物(如乳酸菌)则基本不抑制。Arslan[11]的研究表明乳铁蛋白对牙龈卟啉单胞菌等口腔致病菌的初期黏附定植有明显的抑制作用,但并未提及乳铁蛋白对牙周致病菌的生长是否有抑制作用。因此,本实验研究天然牛乳铁蛋白对P.g的抑制作用,为在临床应用天然牛乳铁蛋白治疗牙周病提供理论依据。

本实验结果显示P.g产生的TLP存在2 种形式,在细菌培养上清液中检测到了TLP活性,说明它可从菌细胞释放到培养基中呈游离状态;同时在菌细胞破碎后上清液中也检测到了TLP,表明它也可与菌细胞结合,处于结合状态。P.g在未加乳铁蛋白的培养物上清液中结合状态TLP活性比游离态高,说明TLP主要结合于P.g细胞膜表面;结合状态的TLP比活比游离态高,提示结合态TLP水解蛋白的能力比游离态强。

将游离状态的酶比活进行统计学分析,结果显示实验组1和实验组2之间差别有显著性(P<0.05),1 组、2 组和阳性对照组之间有差别(P<0.05),说明当乳铁蛋白浓度为2.5、1.25 mg/ml时,游离状态的TLP酶活性降低,乳铁蛋白对其酶活性及蛋白水解作用有明显的抑制作用。2 组和3 组间以及3 组和阳性对照组之间无差别(P>0.05),说明当乳铁蛋白浓度为0.625 mg/ml时对游离状态的酶比活没有明显影响。将结合态的TLP酶比活进行统计学分析,结果显示实验组1、 2、 3与阳性对照组比较差别有意义(P<0.05),说明当乳铁蛋白浓度为2.5、 1.25、 0.625 mg/ml时对结合态的TLP活性及蛋白水解能力有抑制作用;实验组1、2、3之间组间差别有显著性(P<0.05),说明乳铁蛋白浓度从2.5～0.625 mg/ml时,结合态TLP酶活性随乳铁蛋白浓度的降低而升高,乳铁蛋白浓度越高,其酶活性越低,具有浓度依赖性。

本实验结果显示细菌培养上清液中TLP活性较低,酶比活较低,而菌细胞裂解上清液的酶比活较高,通过计算乳铁蛋白对两种状态TLP酶比活的的抑制率得出,在同一牛乳铁蛋白浓度下,乳铁蛋白对结合态TLP活性的抑制作用较游离态强。

牛乳铁蛋白作为一种天然的蛋白质,除具有与抗生素相同的抗菌、抗病毒、抗肿瘤及促生长等功能外,还具促进骨形成及抑制骨吸收的作用,能够促进牙周骨组织缺损的恢复,而且安全无毒副作用,将它应用于口腔牙周疾病的治疗可以消除患者因使用抗生素而引起的副作用,减轻患者痛苦;并且不会产生耐药性,从而提高抗菌效能,缩短治疗的时间。牛乳铁蛋白来源广泛,提取工艺简单,与人乳铁蛋白相比不存在道德伦理问题,更具有临床应用意义。虽然乳铁蛋白的抗菌作用受很多条件的影响,但随着其作用、功能、机制的不断阐明和开发应用范围的不断扩大,相信乳铁蛋白在口腔牙周病治疗方面有着广阔而美好的前景。

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乳铁蛋白 篇4

关键词：乳铁蛋白(LF),人牙周膜细胞(HPDLCs),成骨分化

牙周炎是最常见的口腔疾病之一,促进牙周炎患者牙周支持组织重建,从而恢复患牙功能是牙周疾病治疗中的关键和热点[1,2]。乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是Sorensen等[3]于1939年从牛乳中分离纯化出一种蛋白质与铁结合形成的复合物,具有多种生物学作用[4]。国内外研究认为其具有抗菌[5]、抗病毒[6]、调节免疫[7]、抑制肿瘤细胞[8]等多种功能。近年来研究认为乳铁蛋白对骨的生长代谢也起着重要作用[9],能够诱导骨髓间充质干细胞中成骨标记物的表达[10],抑制感染相关破骨细胞的形成[11],促进成骨细胞的增殖和分化[12]。牙周炎治疗的理想药物应具备调节炎症和促进成骨两方面作用。本课题组在早期的研究中已发现LF可以下调脂多糖激发的HPDLCs Toll样受体4的表达[13],表明LF在牙周炎的免疫治疗方面有着积极意义。人牙周膜细胞(HPDLCs)有多向分化的潜能,在牙周支持组织重建过程中起着关键作用,以各种形式被应用于牙周组织再生的研究[14]。因此本研究的目的在于观察LF对HPDLCs增殖、迁移以及成骨分化的影响,探讨其促进牙周支持组织再生的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM细胞培养基、胎牛血清(Hyclone,美国),人乳铁蛋白、四甲基偶氮唑盐、地塞米松、茜素红染液(Sigma,美国),SP免疫组化检测试剂盒、小鼠抗人波形丝蛋白、角蛋白单抗(Dako,丹麦),CD29、CD44、CD90、CD105抗体(e Bioscience,美国),总RNA提取试剂、RT-PCR试剂盒(Takara,日本),罗氏Light Cycler480实时荧光定量PCR系统(Roche,美国)。

1.2 HPDLCs培养与鉴定

1.2.1 细胞获取与培养

选取10~22岁因正畸需要拔除的健康恒牙。无菌条件下冲洗干净表面血污后用刀片刮取根中1/3牙周膜,用组织块酶消化法培养原代细胞。首次传代按1∶1接种,待细胞达到80%~90%融合时,按照1∶2进行传代,每3 d换液1次,选取生长状态良好的第3代细胞进行实验。

1.2.2 HPDLCs鉴定

制作细胞爬片并固定,用免疫组化SP(streptavidin-perosidase)法进行抗波形丝蛋白和角蛋白染色。流式细胞仪检测表面标记物CD29,CD44,CD90,CD105的表达。

1.3 不同浓度LF对HPDLCs增殖的影响

将第3代HPDLCs按3×103/孔的密度接种至96孔板,待细胞单层贴壁后,将培养基更换为含有0、10、20μg/ml LF的完全培养基,每组6个复孔,分别在加入刺激后的第1、3、5、7天进行MTT检测,检测时每孔加入MTT溶液20μl,孵育4 h后吸出孔内液体,每孔加入150μl DMSO,微震荡10 min,分光光度计检测490波长处的A值,绘制生长曲线。

1.4 不同浓度LF对HPDLCs迁移的影响

1.4.1 划痕试验

将第3代HPDLCs按2×104/孔的密度接种至6孔板,待细胞单层贴壁后,用200μl规格枪头沿尺子在6孔板底部划出1 mm宽划痕,并标记观测点。PBS溶液冲洗掉脱落细胞后,更换含有0、10、20μg/ml LF的无血清培养基,每组3个复孔,在加入刺激后选择0、24、48 h对观测点拍照。

1.4.2 Transwell实验

将第3代HPDLCs按2×104/孔的密度接种至Transwell上室,用不含血清的培养基将体积调至200μl,下室分别加入含0、10、20μg/ml LF的完全培养基500μl,每组3个复孔,孵育24 h后弃去上、下室液体,用棉签擦去上室未迁移细胞,4%多聚甲醛固定10 min,1%结晶紫染色15 min,PBS溶液冲洗,200倍视野下随机选取5处,读取细胞个数。

1.5 茜素红染色观察矿化结节形成

将第3代HPDLCs按2×104/孔的密度接种于6孔板,待细胞单层贴壁后,更换完全培养基为含有0、10、20μg/ml乳铁蛋白的成骨诱导液,每组3个复孔,每3 d换液1次,矿化21 d后弃去培养液,4%多聚甲醛固定10 min,1%茜素红染色30 min,拍照并计算矿化结节面积。

1.6 实时荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达

分组及处理同实验1.5,矿化21 d后Trizol裂解细胞后提取总RNA,逆转录为c DNA,反应条件为37℃、15 min,85℃、5 s,4℃。取c DNA按说明书配制PCR反应液(配制过程在冰上进行)进行扩增,经过预变性、PCR反应、融解曲线分析完成扩增。引物序列见表1。

1.7 统计学分析

实验数据采用SPSS 19.0统计软件包,在验证方差齐性后选择合适的统计方法进行分析,数据均用±s表示,P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 HPDLCs的培养与鉴定

2.1.1 HPDLCs的培养

培养5~7 d后可见细胞从组织块中爬出,呈梭形,体积较大,10 d后组织块周围细胞可呈放射状或旋涡状生长。传至第3代后细胞形态稳定,生长状态良好。

2.1.2 HPDLCs的鉴定

SP法抗波形丝蛋白、角蛋白染色结果显示,胞质中波形丝蛋白深染且均匀分布,呈阳性(图1A),抗角蛋白染色阴性(图1B),与波形丝蛋白染色相比胞质明显浅染;流式细胞仪检测细胞表面标记物阳性率分别为CD29:98.17%,CD44:99.13%,CD90:100%,CD105:78.21%(图2)。证明细胞为间充质来源。

2.2 不同浓度LF对HPDLCs增殖的影响

MTT法结果显示(图3)3组细胞生长曲线均呈“S”形,且在第3天进入对数生长期,第5天进入平台期,其中10μg/ml和20μg/ml LF组在各时间点增殖能力均高于0μg/ml LF组(P<0.05)。

A:波形丝蛋白表达;B:角蛋白表达A:Vimentin expression;B:Cytokeratin expression

2.3 不同浓度LF对HPDLCs迁移的影响

2.3.1 划痕试验

经过24 h培养,各组细胞均向空白划痕处迁移,但0μg/ml LF组迁移速度较慢,迁移48 h后,10、20μg/ml LF组几乎可将原有划痕覆盖,而0μg/ml LF组仍能观察到清晰的划痕(图4)。

2.3.2 Transwell实验

24 h后10、20μg/ml LF组的迁移细胞数量均高于0μg/ml LF组(P<0.05,图5)。

2.4 茜素红染色

结果显示各组均有矿化结节形成,但0μg/ml LF组矿化结节数量明显较另2组少(P<0.05,图6)。

2.5 成骨相关基因的表达

实时荧光定量PCR结果显示,在LF刺激下成骨相关基因ALP、OCN、OPN的表达均增高(P<0.05)(图7)。

3 讨论

HPDLCs作为牙周膜中的主要细胞成分,已被证实具有干细胞定向分化的功能,在牙周组织再生中起到了重要的作用[15]。对于牙周组织再生,为其创造能够促进相关细胞增殖、分化的有利环境是十分重要的。LF作为正常存在于人体内的糖蛋白,不仅参与口腔唾液的免疫防御,亦具有促进成骨的作用:Zhang等[16]研究发现LF可通过激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)来调节核心结合因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达,从而上调骨钙素(osteocalcin,OCN),骨桥蛋白(osteopontin,OPN),骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和Ⅰ型胶原等成骨相关基因的转录和表达。并且低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)与LF结合后可激活胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2),引起细胞增殖的变化。

增殖、迁移是细胞自我修复能力的指标,本实验分别用MTT法、划痕试验和transwell试验来检测HP-DLCs增殖和迁移的能力。结果表明,LF组与对照组比较细胞增殖、迁移水平增高,并且在4个监测点细胞增殖水平均高于对照组,证实LF能够促进细胞增殖和迁移。矿化能力是细胞成骨分化的重要指标,其中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)被认为是成骨细胞分化和矿化的早期标志物,OCN是成骨细胞分化的晚期标志物,标志着细胞外基质的沉积,而OPN在骨重建和骨吸收中均起着重要的作用。本实验通过矿化结节染色和实时荧光定量PCR技术发现乳铁蛋白能够促进矿化结节形成以及ALP、OCN、OPN表达,证明LF具有促进HPDLCs成骨分化的能力。

乳铁蛋白 篇5

实验将母牛初乳通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-100葡聚糖凝胶过柱纯化以及聚乙二醇浓缩提取了LF;并利用它的抗微生物作用, 对猪源致病性大肠埃希氏杆菌 (E.coli.) 和猪传染性接触性胸膜肺炎放线菌 (APP) 进行了抑菌试验。实验结果表明, LF对E.coli.和APP的生长均有较明显的抑制作用, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂。

新鲜母牛初乳; (NH4) 2SO4、HCl、NaOH、聚乙二醇 (PEG6000) 、SephadexG-100 (均为国产分析纯试剂) ;pH试纸、透析膜UC20-32-100、直径0.22μm微孔滤膜 (均为进口实验耗材) ;普通营养肉汤培养基、PPLO琼脂培养基均按参考文献[1]介绍的方法配制。

1.1.2 实验用菌种。

E.coli, 编号:JXAV0703, 源自江西农业大学预防兽医学教研组分离保存;APP, 编号CVCC261, 源自中国兽医药品监察所菌种室。

1.2 实验方法

1.2.1 牛初乳中乳铁蛋白分离纯化

1.2.1. 1 饱和硫酸铵盐析沉淀, 参照文献[2]方法, 稍有改进。

取新鲜的牛初乳, 置于冰箱过夜, 再在室温下3 000 r/min离心30 min, 去除表层乳脂。用10%HCl调至pH=4.5, 置室温放置30 min, 然后4℃8 000 r/min离心30 min。去除沉淀物质 (除去酪蛋白) 取上清液 (酸乳清) , 在磁力搅拌器下边滴加饱和硫酸铵边搅拌, 配成50%饱和硫酸铵溶液, 室温沉淀20min, 然后4℃8 000 r/min离心30 min。再去除沉淀 (除去球蛋白) 取上清液, 用10%NaOH调至pH=8.5, 在磁力搅拌器下边滴加饱和硫酸铵边搅拌, 配成80%饱和硫酸铵, 室温沉淀20 min, 再4℃8 000r/min离心30 min, 收集沉淀用双蒸水溶解得到乳铁蛋白粗提物, 置冰箱备用。

1.2.1. 2 SephadexG-100葡聚糖凝胶过柱层析及浓缩, 参照文献[2]方法, 稍有改进。

将层析柱用双蒸水洗涤干净, 加预处理好的SephadexG-100葡聚糖凝胶装柱, 用蒸馏水平衡过夜。第2d, 将饱和硫酸铵盐析法分离的乳铁蛋白粗提物上样, 以0.2 mL/min速度双蒸水洗脱, 用紫外分析仪检测其蛋白的吸光率, 并通过便携式记录仪记录其动态的吸光率曲线, 同时用部分收集器收集各管洗脱液。实验结束时, 根据吸光率曲线将吸收峰各管合并得到乳铁蛋白纯化样品, 置冰箱备用。

将乳铁蛋白纯化样品置预处理好的透析膜中, 扎口置40%的PEG6000溶液中, 浓缩至所需浓度, 置冰箱备用。

1.2.2 LF的抗菌试验

1.2.2. 1 菌液培养。

E.coli、APP菌种分别接种于普通肉汤培养基和PPLO液体培养基中, 37℃振荡培养16 h, 使菌液达到一定浓度备用。

1.2.2. 2 LF预处理。

取分离纯化LF, 用针头式细菌滤器经0.22μm微孔滤膜除菌置冰箱备用。

1.2.2. 3 LF抗菌试验步骤。

取4支无菌试管 (见表1) , 第1支加入5 mL普通肉汤+1 mL LF溶液+0.2 mLE.coli.菌液;第2支加入5 mL普通肉汤+1 mL无菌生理盐水+0.2 mL E.coli.菌液。第3支加入5 mLPPLO液体培养基+1mLLF溶液+0.2 mLAPP菌液;第4支加入5 m L PP-LO液体培养基+1 mL无菌生理盐水+0.2 mLAPP菌液。混匀, 用无菌微量移液器分别取样, 在酶标仪上, 以各自无菌培养基做对照调零, 测量各自的OD630, 取样后迅速置37℃振荡培养箱中振荡培养, 并记录相应结果。

每隔2 h取样一次, 重复上述试验, 检测OD630, 至第8h结束, 并用红白细胞记数板计算各试管的细菌总数, 算出LF对2种细菌的抑菌率, 记录结果。

抑菌率的计算公式如下:

抑菌率= (t小时后对照组菌数-t小时后实验组菌数) /t小时后对照组菌数×100%

mL

2 结果

2.1 牛初乳中LF分离结果

从牛初乳中成功分离纯化LF, 经过Sephadex G-100葡聚糖凝胶过柱的洗脱效果见图1。

2.2 LF抗菌试验结果

LF抗菌试验结果见表2, LF对E.coli.的抑菌效果 (见图2) , LF对APP的抑菌效果 (见图3) , 其抑菌率分别为33.68%、13.41%。

3 小结与讨论

3.1 本试验采用饱和硫酸铵盐析法成功地从新鲜的牛初乳中分离到乳铁蛋白, 经过SephadexG-100葡聚糖凝胶过柱层析纯化的乳铁蛋白经透析膜浓缩后, 仍表现出较好的抑菌效果, 对猪源致病性大肠埃希氏杆菌和猪传染性胸膜肺炎放线菌的抑菌率分别为33.68%和13.41%。

3.2 目前国内对LF的研究已经不少, 但其分离过程均采用了比较繁杂方法, 对于工业化生产不利。本试验采用的饱和硫酸铵盐析法, 方法简便实用。经过2次50%饱和度、80%饱和度硫酸铵沉淀后, 得到LF的粗提物。再经过SephadexG-100葡聚糖凝胶过柱层析纯化样品, 该方法是根据分子大小的不同进行分离, 设备简单, 操作方便, 不需要有机溶剂, 这样在分离过程中不容易使LF失活。最后采用PEG6000浓缩法分离纯化LF, 该方法是利用蛋白分子对半透膜的不可透性而使其与其他小分子分开的方法, 动力是扩散压, 由横跨膜两边的浓度梯度形成, 通常在4℃下进行, 设备简单, 操作方便, 不需要有机溶剂, 这样在浓缩过程中不容易使LF失活。最终, 经抑菌试验证实, 分离所得LF活性保持较好。

3.3由图2可见, 在长达8 h的E.coli抑菌实验中, 添加了LF的E.coli.生长一直处于较缓但数量依然增加的趋势, 而未添加LF的对照管中E.coli生长始终保持较快的增长趋势, 这可能是在这8 h内E.coli的生长一直处在对数期, 而少量LF对E.coli较强的抑菌作用, 能在很长的时间内一直保持对E.coli的生长起减缓作用, 最后根据平板计数法也测得其抑菌率为33.68%, 抑菌作用较强。

3.4 由图3可见, 在APP抑菌实验中, 添加了LF的APP在0～2 h内生长呈下降趋势, 而未添加LF的APP则呈缓慢的增长趋势, 这可能是在这段时间APP生长处在延迟期, 因为LF的抑菌作用导致其生长呈下降趋势;而在2～8 h内, 添加了LF的APP生长则先呈较慢的增长趋势后也逐渐转变成较快的增长趋势, 未添加LF的APP则一直呈较快的增长趋势, 这可能是在这段时间内APP的生长处在对数期, 少量LF对APP的较弱抑菌作用, 无法阻止量逐渐增多, 生长速度很快的APP数量的不断增长趋势, 但因LF具有抑菌作用依然可以在短时间内对其生长速度起减缓作用。最后根据平板计数法也测得其抑菌率为仅为13.41%, 抑菌作用较弱。

3.5 LF来源广泛, 如经过广泛和深入的研究, 实现乳铁蛋白的工业化生产, 牛初乳中乳铁蛋白的开发利用具有广阔的前景。

参考文献

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乳铁蛋白 篇6

1 实验动物与方法

成年雄性体质量230～250 g的SD 大鼠80只,分笼饲养,动物房内温度恒定(22±1)℃,明暗光照每12 h交替,饲料和水可随时摄取。

1.1 研究对象

选取鞘内置管成功的体重250～300 g雄性SD大鼠80只,随机分为生理盐水组(NS组)和福尔马林组(F组);实验组分为乳铁蛋白1 ug -福尔马林组(F-R1组),乳铁蛋白10 ug -福尔马林组(F-R10组)和乳铁蛋白100 ug -福尔马林组(F-R100组)。五组鞘内分别给予NS 20 ul,NS 20 ul, 乳铁蛋白1 ug, 乳铁蛋白10 ug, 乳铁蛋白100 ug; 10 min后,除NS组大鼠足底注射NS 100 ul外,其余各组均给予5%福尔马林100 ul.经以上处理8只动物在福尔马林处理后30 min取脊髓,另8只动物在福尔马林处理后0～1 h观察行为学变化。

1.2 鞘内置管

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg,待麻醉满意后,采用Yaksh和Rudy法[3],在枕骨大孔上方纵向切开约1. 5～2. 0 cm的切口,钝性分离皮下组织和颈部肌肉,暴露出寰枕膜,用针尖挑破寰枕膜可见清澈脑脊液涌出并随呼吸波动,将已经消毒、一端封闭的充满生理盐水的PE210导管向尾端插入7. 0～7. 5 cm,至脊髓腰骶段,然后固定导管并逐层缝合伤口。大鼠清醒24 h后观察其活动情况,剔除出现运动功能障碍的大鼠。用2%利多卡因10 μl经导管注射来判断导管的位置,如注射后30 s内大鼠出现双后肢麻痹现象说明导管位置正确。术后常规使用抗生素,分笼单独饲养,室温维持20℃～25℃,自然照明,自由饮水和摄食, 5 d后即可用于实验。实验时每次给药后用10 μl生理盐水冲洗PE管。

1.3 福尔马林致痛模型

将大鼠置于观察台的3 000 ml烧杯,台下斜放一镜子(与平台成30°角)以便观察大鼠行为变化,待大鼠适应30 min后,经导管给予实验药物或生理盐水20 ul,随后生理盐水10 ul冲洗导管,10 min后,用100 ul微量进样器在大鼠足底部注射5%福尔马林100 ul。

1.4 行为学反应

采用缩腿及舔爪时间之和作为行为学反应指标, 在大鼠足底部注射5%福尔马林后立即用跑表记录大鼠1 h内每5 min的缩腿舔爪的时间。

1.5 NOS免疫组织化学染色

动物在戊巴比妥钠(60 mg/kg,i.p)麻醉下,经升主动脉依次灌注4℃生理盐水(100 ml)、4%多聚甲醛(400 ml,0.1 mol/L pH 7.4).取L4-5脊髓节段,并用刀片在非手术侧划一缺口作为标记,置于多聚甲醛后固定3 h,移至30%蔗糖脱水至组织沉底。冰冻横断切片,片厚40 um,收集在0.01M PBS(0.01 mol/L)中。切片经0.01M的PBS冲洗后,依次加入3%H2O2,30%封闭血清封闭10 min后加入一抗(兔抗NOS抗体,1:200),4℃孵育48 h。PBS冲洗3次后,滴加生物素标记的第二抗体,37℃孵育2 h,PBS冲洗,滴加辣根酶标记链霉卵白素,37℃孵育2 h,PBS冲洗,DAB显色,贴片,酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片光镜观察,棕色染色为阳性细胞。阴性对照实验中,用PBS代替一抗或二抗。

1.6 图像分析

选用Nikon E 600研究显微镜,STOP CCD计算机图像处理系统采集数码图像,应用软件进行图像分析,每只大鼠脊髓背角任选5个视野测定NOS阳性产物的IOD值,取平均值代表大鼠的NOS表达强度。IOD值为阳性产物面积与染色深度之积。IOD值越大表示阳性产物表达越强。

1.7 统计学方法

各组数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,采用SPSS10. 0统计软件进行数据分析,多组均数间的比较采用两因素方差分析。P< 0. 05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组行为学比较

各组缩腿舔爪时间的比较见图1。由图1可见大鼠足底注射福尔马林后,其注射足缩腿舔爪反应表现明显有2期,第1期注射后立即开始,持续5 min,经过约10 min 的间歇期,开始第2期,持续约40 min,非注射足活动自如,无缩腿舔爪反应

2.2 各组第1、2期行为学的比较

结果见表1及图1,第1、2期均无缩腿舔爪反应,F组的缩腿舔爪时间显著长于NS组;在第1期内,F-R1组、F-R10组、F-R100组与F组无显著性差异; 而在第2期内F-R1组,F-R10组,F-R100组的缩腿舔爪时间显著低于F组,且其降低呈剂量依赖性

2.3 脊髓背角NOS表达

见表2及图2,F组于注射福尔马林后30 min阳性神经元的 IOD值显著高与NS组;F-R1组、F-R10组、F-R100组阳性神经元的 IOD值显著地低于F组,阳性神经元的 IOD值降低呈剂量依赖性。

注:与NS组比,*P<0.01.与F 组比较, #P<0.01

注:与NS组比,*P<0.01.与F组比较,#P<0.01

3 讨论

福尔马林致痛模型所致的持续性紧张痛 (tonic pain) 是目前国内外已经公认的能模拟临床上常见的慢性痛( chronic pain) ,和热刺激与短期机械刺激相比较为可靠 ,被广泛地应用于痛觉生理学和药理学的研究 ,用于检测和筛选药物的镇痛效应 。福尔马林致痛模型的痛反应表现为双相伤害性行为反应 ,Ⅰ时相反应一般认为是直接刺激神经末梢,主要由A纤维介导信息传入而引起; Ⅱ时相反应则多认为是主要通过 C纤维介导刺激传递的继发炎性疼痛[4] ,在两个时相反应之间存在静息期[7]。应用电生理学方法记录大鼠脊髓背角神经元放电也发现 ,皮下注射福尔马林均可引起两个时相的放电变化 ,其变化规律与大鼠行为学表现相似。

在痛觉调制过程中 ,NO作为一种气体分子信使 ,参与外周神经信息传递 ,脊髓及脊髓以上不同水平的痛觉调制 。当大鼠足底伤害性感受器受到福尔马林刺激后 ,C纤维的高频、持续性传入造成脊髓神经元长时间去极化 ,Mg2+对NMDA受体的阻滞被解除 ,NMDA受体活化, Ca2+进入细胞内[5],Ca2+依赖性NOS被激活 ,催化 NO 生成 。在细胞内 ,NO 的弥散激活可溶性鸟苷酸环化酶增加环鸟苷酸 cGMP 产生 ,导致胞内第二信使PKC活化;在细胞外,NO 的弥散能增加神经末梢兴奋性氨基酸、P物质等释放[7];NO还可弥散至邻近神经元或胶质细胞[5] ,其神经毒性作用可能协同谷氨酸破坏胶状质抑制性中间神经元 ,使伤害性神经元的抑制被解除,表现为自发痛行为反应、痛觉过敏、痛感受野扩大等。由于 NO 的弥散使 Ca2+内流增加 ,核内第三信使 C - fos表达增加[8],并由此调节阿片肽等与伤害性刺激有关的基因表达。研究表明增加 NO的合成可诱发痛觉过敏 ,而抑制 NO的生成则可以阻断痛觉过敏的形成 。本实验显示福尔马林组大鼠注射侧L4～L5 节段脊髓背角浅层手术侧的 NOS免疫活性增高,提示福尔马林致痛模型中 ,脊髓背角 NO释放可能是福尔马林致痛的机制之一。福尔马林刺激可能通过兴奋 C 类传入纤维 ,激活 NOS,使 NO 合成增加 ,增强痛觉信息传递。

本实验通过行为观察 ,发现乳铁蛋白可以显著抑制疼痛的Ⅱ时相反应 ,说明乳铁蛋白可能影响了脊髓神经元放电 ,参与脊髓水平的调制过程 ,引起抗伤害性效应。且其抗伤害性和抑制NOS的表达呈剂量依赖性,提示抑制NOS的表达可能是乳铁蛋白抗伤害性机制之一。

本实验证明了乳铁蛋白对福尔马林致痛大鼠抗伤害性效应,仅从影响NOS的表达的角度来探讨其可能机制。至于是否通过调节受体,离子通道以及其他的信号通路还有待于实验进一步证实。自然条件下,外源性乳铁蛋白通常来源于哺乳动物,其本身具有显著的抗伤害作用且不产生耐受, 提示乳铁蛋白对于临床疼痛患者来说, 是一种可以安全使用的天然药物。

摘要：目的通过观察鞘内注射乳铁蛋白对福尔马林致痛大鼠行为学及一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,探讨乳铁蛋白可能的抗伤害机制。方法雄性SD大鼠80只,随机分为生理盐水组(NS组)和福尔马林组(F组);实验组分为乳铁蛋白1 ug-福尔马林组(F-R1组),乳铁蛋白10 ug-福尔马林组(F-R10组)和乳铁蛋白100 ug-福尔马林组(F-R100组)。五组鞘内分别给予NS20 ul,NS20 ul,乳铁蛋白1 ug,乳铁蛋白10 ug,乳铁蛋白100 ug;10 min后,除NS组大鼠组底注射NS 100 ul外,其余各组均给予5%福尔马林100 ul。经以上处理8只动物在福尔马林处理后30 min取脊髓观察NOS的表达,另8只动物在福尔马林处理后01 h观察行为学。结果F组的缩腿舔爪的时间和脊髓NOS表达显著长于,强于NS组;预先给予乳铁蛋白能抑制以上的作用,且呈剂量依赖性。结论乳铁蛋白明显抑制福尔马林致痛大鼠痛行为及NOS表达,可能是其产生抗伤害作用机制之一。

关键词：疼痛,乳铁蛋白,一氧化氮合酶,福尔马林

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