大蛋白抗原

大蛋白抗原（精选7篇）

大蛋白抗原 篇1

HBeAg阴性乙型肝炎病毒感染者呈全球性分布, 而且在分子病毒学、流行病学、发病机制、自然进程和转归等方面都与HBeAg阳性乙肝感染者有着显著的不同[1]。HBeAg 阴性慢性乙型肝炎发展至肝硬化、肝癌等终末期肝病依然十分常见[2]。2005年北京全国肝病及传染病学术会将其列为慢性乙型肝炎的一个特殊类型, 但是临床上目前如何评价HBeAg阴性乙肝患者炎症活动以及肝炎病变程度尚缺乏可靠的血清学指标[3]。

HBV大蛋白 (Hepatitis B Virus Large Surface Protein, LHBs) 是HBV包膜蛋白组成成分之一, 由S、PreS2及PreS1基因编码, 在空间上具有两种不同的跨膜构象, 为389或400个氨基酸组成的具有复杂拓扑结构的构象型蛋白。LHBs作为HBV的包膜蛋白, 内侧可以和HBV核壳体膜结合, 外侧可与病毒受体结合, 是HBV颗粒成熟包装的关键[4]。近年来随着对LHBs在乙肝发病机制、感染与复制等方面研究的深入, 研究者们逐渐认识到LHBs具有越来越重要的临床意义[5]。

不同状态下HBV感染者血清中病毒颗粒LHBs含量不同, 非复制状态不含病毒DNA的小球形颗粒和管型颗粒中LHBs含量极低, 复制期管病毒DNA的Dane颗粒中LHBs的含量可达20%, 因而提示LHBs水平可能与HBV的载量密切相关。当病毒的优势抗原表位是具有立体空间的构象表位时, 以线性表位制备的单抗对该抗原进行检测存在灵敏度低的缺点。随着对PreS1抗原研究的深入, 发现以PreS1抗原线性表位制备的单抗在检测PreS1抗原时阳性率偏低, 因此PreS1抗原作为衡量HBV复制的指标依然存在一定的局限。而通过以LHBs立体构象表位制备的单抗检测HBV LHBs作为衡量HBV复制的指标是否更为优越呢?我们通过对批量标本PreS1抗原、HBV DNA以及HBV LHBs的比较, 试图阐明HBV LHBs在反映HBV复制中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 标本来源 120例血清标本为2010年7月—2011年6月我院基因扩增检验实验室收集的标本库中标本, 均经荧光定量PCR定量检测HBV DNA, 所有标本均为HBsAg阳性, HBeAg阴性, -70℃保存, 批量检测。

1.2 检测HBV-DNA 以罗氏公司的LightCycler荧光定量PCR仪定量检测血清标本的HBV DNA, 试剂为深圳匹基公司产品。

1.3 检测PreS1抗原 PreS1抗原试剂盒购于阿尔法公司, 为双抗体夹心ELISA法, 由TECAN全自动酶联免疫分析仪完成。

1.4 检测LHBs LHBs试剂盒由北京热景生物技术公司生产, 为双抗体夹心ELISA法, 由TECAN全自动酶联免疫分析仪完成。

1.5 统计学方法 应用SPSS 12.0统计学软件, 计量资料以 ($\overline{x}$±s) 表示, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV-DNA载量与LHBs含量的关系

120例HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染者血清中, 随着HBV DNA拷贝数的升高其LHBs的浓度呈上升趋势, 且两者之间有良好的相关性;不同HBV-DNA拷贝数组别间LHBs含量差异有统计学意义 (P<0.01, 见表1) 。

2.2 不同HBV DNA载量与LHBs阳性率和PreS1抗原阳性率的关系

HBV-DNA载量≤103copies/ml组, LHBs的阳性率为37.5%, PreS1抗原的阳性率为20.0%;HBV-DNA载量为103～105copies/ml组, LHBs的阳性率为72.5%, PreS1抗原的阳性率为42.5%;HBV-DNA载量≥106copies/ml组, LHBs的阳性率为95.0%, PreS1抗原的阳性率为80.0%。随着HBV DNA拷贝数的增加, LHBs的阳性率均逐步增加, 不同HBV DNA载量组间LHBs阳性率比较差异有统计学意义 (P<0.01) ;PreS1抗原的阳性率也随HBV DNA拷贝数的增加逐步增加, 不同HBV DNA拷贝数组别间PreS1抗原的阳性率比较差异有统计学意义 (P<0.01) ;另外, 同一HBV DNA载量组LHBs和PreS1抗原的阳性率比较差异有统计学意义 (P<0.01, 见表2) 。

3 讨论

乙型肝炎病毒标志物LHBs对HBV的感染、复制及其预后起着极其重要的作用, 是目前研究的热点之一。PreS1抗原作为HBV复制的指标, 在临床上具有一定的优越性, 尤其对传统的HBeAg阴性的患者, 检测PreS1抗原在一定程度上可以反映病毒的活动情况, 然而由于目前的PreS1抗原试剂盒采用线性的蛋白表位制备成单抗, 由于线性表位在形成高级结构时, 可被折叠、卷曲而失去暴露表位的机会, 可能导致检测灵敏度下降[6], 因此PreS1抗原作为血清学指标在反映部分处于不同复制状态的HBV感染者中, 依然存在一定的局限。

LHBs的双重拓扑构象不仅是病毒包装的关键, 而且对乙肝病毒感染肝细胞具有增强作用, 并可以反式激活细胞内HBV复制和基因表达[7]。采用立体构象表位的蛋白制备成单抗检测血清中LHBs时, 由于考虑了HBV病毒蛋白组分折叠、卷曲的结构, 因此具有更高的亲和力, 检测过程中也呈现更高的灵敏度。我们的结果显示, 所有PreS1抗原阳性的标本无一例外的LHBs都阳性;另外不同HBV DNA载量标本中, LHBs也具有更高阳性率和相关性, 随着HBV DNA拷贝数的升高, LHBs与HBV DNA的阳性符合率越高, 当HBV DNA载量大于106copies/ml时, LHBs的阳性率达到95.0% (38/40) , 而PreS1抗原阳性率仅为80.0%, 提示LHBs可能更能真实地反映了HBV的复制情况。

以往的研究结果大多认为HBeAg阳性是HBV在乙肝病毒感染者体内复制旺盛的一项重要指标, 而HBeAg由阳性转为阴性是部分病毒被清除以及肝病缓解。但实际上并非所有HBeAg阳性转为阴性的的HBV感染者病情都趋于好转。相反, 相当部分重型肝炎的发生与HBeAg阴转存在一定的关系。HBV基因组多个位置的碱基变异均可导致HBeAg阴转。其中较多见的有前C区1862位碱基由G变为T (T1862) 及1896位碱基由T变为A, 均可导致HBeAg阴转。我国慢性HBV感染患者, 尤其是肝硬化患者中HBeAg阴性者高达60%以上[8], HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染者中部分是HBV基因前C区或核心启动子发生变异, 导致HBeAg合成障碍[9], 因此这部分感染者体内病毒活动情况如何已经不能简单地靠HBeAg阴性或阳性来解释。而目前临床上主要利用直接检测HBV DNA来反映乙型肝炎病毒感染者体内HBV复制活跃程度。与ELISA检测血清HBV蛋白标志物相比, HBV DNA检测需要有严格的基因扩增检验实验室和昂贵的实时荧光定量PCR扩增仪。因此寻找一个可以普及各级医院使用的临床血清学指标显得很重要。研究发现, 在HBV形成包膜的过程中需要大蛋白 (即HBsAg、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白) 和中蛋白的参与[5], 即大蛋白和中蛋白是HBV复制必备的蛋白组分。本研究结果表明:血清中LHBs含量与HBV DNA载量变化一致, 具有良好的相关性, 尤其在HBeAg阴性乙型肝炎病毒感染者中LHBs含量与HBV DNA的符合率具有更重要的意义, 与其它病毒蛋白标志物比较, 定量检测LHBs能较好反映患者体内HBV复制程度。

与PreS1抗原比较, LHBS的测定结果与HBV DNA载量呈现良好的相关性, 更能准确地反映HBV感染者体内病毒的复制程度, 因此LHBS定量可能成为判断HBV活动的新的血清学指标。

摘要：目的 通过定量检测HBeAg阴性HBV感染者血清病毒大蛋白 (HBV-LHBS) 和前S1 (PreS1) 抗原, 探讨HBV-LHBS和PreS1在反映HBV复制中的作用。方法 收集经荧光定量PCR检测HBV-DNA的120份HBeAg阴性HBV病毒感染者血清, 将这些标本按DNA拷贝数分为3组 (≥106copies/ml、103～105copies/ml、≤103copies/ml) , 每组各40例, 以酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测HBV-LHBS和PreS1抗原。结果 ≥106copies/ml组, LHBS阳性率和定量检测结果分别为95.0%和 (92.12±29.38) ng/ml, 103～105copies/ml组, LHBS阳性率和定量检测结果为72.5%和 (33.26±19.44) ng/ml, ≤103copies/ml组, LHBS阳性率和定量检测结果为37.5%和 (15.02±11.10) ng/ml, 3组标本PreS1抗原阳性率依次为80.0%、42.5%、20.0%;LHBS总阳性率为61.6%, PreS1抗原阳性率为38.1%。结论 与PreS1抗原比较, LHBS的测定结果与HBVDNA载量呈现良好的相关性, 更能准确地反映HBV感染者体内病毒的复制程度, 因此LHBS定量可能成为判断HBV活动的新的血清学指标。

关键词：前S1抗原,乙型肝炎病毒,HBVDNA,乙肝病毒大蛋白

参考文献

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大蛋白抗原 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年3月至2015年3月我院收治的43例肺癌患者作为观察组, 所有肺癌患者均经组织病理学及细胞学检查确诊为肺癌, 排除合并其他癌症及严重心、脑、肝、肾疾病;选取同期收治的良性肺部疾病患者45例作为对照组;选取同期健康体检者47例作为健康组。观察组男23例, 女20例, 年龄42~83岁, 平均 (62±7) 岁;小细胞肺癌9例, 腺癌11例, 鳞癌23例;肿瘤分期:Ⅰ期14例, Ⅱ期9例, Ⅲ期13例, Ⅳ期7例。对照组中男24例, 女21例, 年龄41~83岁, 平均 (62±7) 岁;其中肺结核4例, 肺部感染3例, 慢性阻塞性肺炎16例, 支气管肺炎22例。健康组中男27例, 女20例, 年龄41~85岁, 平均 (61.5±6.9) 岁。所有研究对象均符合本院医学伦理委员会相关要求, 均签署了知情同意书。3组研究对象一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2检测方法

观察组及对照组患者均在入院24 h内, 于清晨空腹状态下抽取3 ml外周静脉血管, 置入试管内, 健康组则选择体检时抽取的外周静脉血进行检测, 将血液标本以每分钟2500 r离心10 ml, 离心半径5 cm, 选择上层血清进行检测。CA153、CA125、CEA均选用美国ARCHITECT i1000 sr型全自动发光免疫仪进行检测, 严格按照说明说操作, CA153正常值<31.3 U/ml, CA125正常值<35 U/ml, CEA正常值<10 ng/ml, 超过正常值, 可以判断为阳性。

1.3 观察指标

观察3组研究对象的CA153、CA125、CEA检测结果, CA153、CA125、CEA及CA153+CA125+CEA对肺癌诊断的准确性、特异性及敏感性, 准确性=a+d/ (a+b+c+d) ;特异性=d/ (b+d) ;敏感性=a/ (a+c) 。a:真阳性;b:假阳性;c:假阴性;d:真阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析, 计量资料±s表示, 组间比较采用F检验, 两两比较采用q检验, 计数资料以百分率表示, 组间比较采用Z检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CA153、CA125、CEA水平比较

观察组患者的CA153、CA125、CEA水平均明显高于对照组及健康组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) ;对照组患者的CA153、CA125、CEA水平与健康组比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) 。见表1。

2.2 CA153、CA125、CEA真阳性、假阳性、真阴性、假阴性情况比较

CA153、CA125、CEA的真阳性、假阴性情况比较, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) ;CA153、CA125、CEA的假阳性、真阴性情况比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) 。见表2。

2.3 CA153、CA125、CEA对肺癌诊断的准确性、特异性及敏感性比较

CA153+CA125+CEA的准确性及敏感性均明显高于CA153、CA125、CEA, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。CA153、CA125、CEA及CA153+CA125+CEA的特异性比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) 。见表3。

3 讨论

肺癌的病死率较高, 而目前临床上缺乏特异性诊断方法, 导致许多患者在早期发病时无法及时发现, 而中晚期肺癌治疗预后一般较差, 因此寻求有效的早期检测方法就显得尤为重要[3,4]。肿瘤标志物是检测肿瘤的一种较为有效的方式, 其一般是指在肿瘤发生和发展阶段产生的异常物质, 可作为肿瘤诊断的辅助手段。临床上常见肿瘤标志物较多, 其敏感性与特异性存在较大差距, 因此, 对现有肿瘤标志物进行探讨十分重要。

CEA是一种酸性蛋白, 具有人类胚胎抗原决定簇, 主要存在于胎儿和结肠癌组织中, 因此又称癌胚抗原。随着医学不断发展, 研究发现身体大多数器官均可产生CEA, 如胃肠道、泌尿系统以及呼吸道等[5,6]。正常人体内CEA会经胃肠道代谢而被排除, 因此血液中含量较低, 但在肿瘤发生和发展期间, 血清CEA水平显著升高, 因此其属于非特异性肿瘤相关抗原, 对临床诊断肿瘤具有辅助作用。在多种肿瘤患者中, 均可检测出CEA升高, 其中便包括肺癌[7,8]。CEA作用不仅如此, 其水平会随着肿瘤进展而呈动态变化, 因此对治疗效果具有观测作用, 可用于判断治疗效果。本研究结果显示, 观察组患者血清CEA含量明显高于对照组和健康组, 说明肿瘤患者中CEA水平会明显升高, 据此说明CEA具有辅助诊断肺癌的作用。而CA125和CA153属于糖类抗原, CA125是早期在卵巢癌中发现的一种物质, 而肺癌发生时, 由于肺癌细胞对支气管膜上皮以及间皮组织的破坏, 产生阻挡作用, 会导致血清CA125含量上升。而CA153也属于常见的肺癌肿瘤标志物[9,10]。同时, CA125以及CA153水平在肺癌患者中均高于对照组及健康组, 说明将其作为肿瘤标志物是确切有效的, 而对照组和健康组CA125以及CA153、CEA水平差异均无统计学意义, 提示一般肺部疾病并不会引起3种肿瘤标志物含量上升, 具有较高特异性。但本研究对3种肿瘤标志物检测肺癌的效果进行分析发现, 单独使用任何一种标志物进行检测均无法获得令人满意的敏感性与特异性, 并且准确性也较差, 因此临床价值仍然不高;采用联合检测3种肿瘤标志物虽然特异性并未上升, 但结果更加准确, 并且敏感性有所提升。提示联合检测可有效降低漏诊率, 帮助医师在疾病早期获得准确判断, 以便采取适当治疗, 改善预后。

综上所述, 肿瘤标志物检测是诊断肺癌较为有效的方式, 而临床存在的肿瘤标志物较多, 选择其中敏感性与特异性较高的标志物对检测有所帮助。联合检验CA153、CA125及CEA可有效提高肺癌诊断的敏感性与准确性, 临床应用价值较高。

摘要：目的 探讨联合检测糖蛋白类抗原153 (CA153) 与糖蛋白类抗原125 (CA125) 和癌胚抗原 (CEA) 在肺癌患者诊断中的应用价值。方法 选取2013年3月至2015年3月辽宁省庄河市中心医院收治的43例肺癌患者作为观察组, 取同期收治的良性肺部疾病患者45例作为对照组, 选取同期健康体检者47例作为健康组。检测3组研究对象血清CA153、CA125及CEA水平。结果 观察组患者的CA153、CA125、CEA水平均明显高于对照组及健康组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) ;CA153+CA125+CEA的准确性及敏感性均明显高于CA153、CA125、CEA, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。结论 联合检验CA153、CA125及CEA可有效提高肺癌诊断的敏感性与准确性, 临床应用价值较高。

关键词：糖蛋白类抗原153,糖蛋白类抗原125,癌胚抗原,肺癌,临床诊断

参考文献

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大蛋白抗原 篇3

关键词：血清甲胎蛋白,癌胚抗原,糖类抗原199,联合检测,原发性肝癌

原发性肝癌是临床较为常见的一种肿瘤疾病, 该病起病急且致死率高, 严重影响着患者的生活质量[1,2,3]。早发现、早诊断、早治疗是改善原发性肝癌患者预后的关键[4,5]。目前原发性肝癌的主要检测手段为血清甲胎蛋白 (AFP) 、癌胚抗原 (CEA) 、糖类抗原199 (CA199) 检测[6,7]。有研究表明, AFP、CEA、CA199联合检测可显著提高原发性肝癌的诊断准确率[8,9,10]。为了探讨AFP、CEA、CA199联合检测在原发性肝癌诊断中的应用价值, 我院选取2009年1月~2012年6月收治的原发性肝癌患者153例与健康体检人员70例进行血清AFP、CEA、CA199水平检测, 现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009年1月~2012年6月将我院收治的原发性肝癌患者153例作为观察组, 经临床病理诊断分为两组, 病理诊断为良性患者94例为观察Ⅰ组, 其中, 男60例, 女34例;年龄43~69岁, 平均 (61.2±9.7) 岁。病理诊断为恶性患者59例为观察Ⅱ组, 其中, 男38例, 女21例;年龄41~73岁, 平均 (63.0±12.4) 岁。患者均符合2001年中国抗癌协会专业委员会制订的肝癌诊断标准。排除患有心肺异常、血液病、复发肝癌的患者。观察Ⅱ组的患者参考美国癌症研究委员会与国际抗癌联盟联合制订的病理学分期标准分为:肿瘤Ⅰ期25例, 肿瘤Ⅱ期21例, 肿瘤Ⅲ期13例。癌细胞转移患者21例。同期健康体检人员70例作为对照组, 其中, 男45例, 女25例;年龄42~70岁, 平均 (62.8±10.3) 岁。各组人员间一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

所有研究对象均抽取空腹静脉血5 m L, 于3 000 r/min转速下离心3 min, 分离血清后于6 h内完成AFP、CEA、CA199检测。均采用Access型全自动化学发光免疫分析仪 (美国贝克曼公司生产) 进行检测, 试剂盒为该公司生产的专用试剂盒, 严格按照说明书进行操作。

1.3 评价标准

AFP正常范围:0~20μg/L。CEA正常范围:0~5μg/L。CA199正常范围:0~34 IU/m L。超出正常范围即为阳性, 否则为阴性。

1.4 统计学方法

所有数据资料均采用SPSS 16.0统计学软件进行处理, 计量资料数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 计量资料采用t检验和F检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组AFP、CEA、CA199检测结果分析

观察Ⅱ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组和观察Ⅰ组, 观察Ⅰ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。见表1。

注:与对照组比较, #P<0.05;与观察Ⅰ组比较, *P<0.05

2.2 观察Ⅱ组AFP、CEA、CA199与病理参数分析

肿瘤Ⅱ、Ⅲ期患者AFP、CEA、CA199均明显高于肿瘤Ⅰ期患者, 癌细胞转移患者AFP、CEA、CA199均明显高于未转移患者, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。见表2。

2.3 AFP、CEA、CA199的诊断性能分析

AFP、CEA、CA199的诊断性能分析结果显示见表3, 特异性由高到低依次为AFP、CEA、CA199、联合诊断, 敏感性由高到低依次为联合诊断、AFP、CA199、CEA, 准确性由高到低依次为联合诊断、AFP、CEA、CA199, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。

3 讨论

目前, AFP检测是世界公认的原发性肝癌诊断的有效指标之一, 其发生机制可能是由于患者体内的肝细胞大量受损后将会出现快速增生, 而新增生的肝细胞在尚未成熟的情况下容易合成AFP, 使得机体血清中的AFP含量快速升高。及时检测患者体内的AFP水平可以准确掌握患者肝脏的病情变化, 对早期发现和诊治肝癌具有显著的临床价值。

CEA是人体消化系统中的一种特异性抗原, 与机体肝硬化的发生机制密切相关, 肝硬化发展到后期极易发展成为肝癌, 因而CEA也可作为肿瘤标志物的一种检测手段。正常情况下, CEA的主要通过胃肠道实现代谢, 在血清水平显著降低时, 肿瘤状态下的CEA将会大量进入血液和淋巴的循环系统中, 使得血清中的CEA含量迅速升高。因而对CEA水平进行及时检测可以掌握患者的病情变化, 有利于患者后期的治疗。

CA199是人体消化道肿瘤细胞株分泌生成的一种低聚糖类抗原, 在消化道肿瘤患者中会呈现出显著的升高趋势。正常人体内的CA199会经肝脏代谢, 使血清中CA199的含量较低, 当肝癌发生后, 机体的肝功能代谢将会受到抑制和改变, 使CA199的代谢速度明显减慢, 大量的CA199滞留于体内血清中, 使得血清中CA199含量快速上升, 因而对CA199水平的有效监测可以了解患者肝癌发展的病情变化, 也可作为一种诊断原发性肝癌的有效指标。

本次研究表明, 观察Ⅱ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组和观察Ⅰ组, 恶性肝癌患者血清中3种肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平显著上升。观察Ⅰ组AFP、CEA、CA199均明显高于对照组, 说明良性肝癌患者血清中3种肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平较正常人有所上升, 以体现出病变趋势。肿瘤Ⅱ、Ⅲ期患者AFP、CEA、CA199均明显高于肿瘤Ⅰ期患者, 随着病情的发展, 发展越晚期患者肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平升高越明显。癌细胞转移患者AFP、CEA、CA199均明显高于未转移患者, 说明癌细胞转移后患者病情已发展到了晚期, 其体内的肿瘤标志物AFP、CEA、CA199水平将会显著上升。特异性由高到低依次为AFP、CEA、CA199、联合诊断, 敏感性由高到低依次为联合诊断、AFP、CA199、CEA, 准确性由高到低依次为联合诊断、AFP、CEA、CA199, 说明3种肿瘤标志物AFP、CEA、CA199联合检测可以显著提高诊断原发性肝癌的准确性, 为后期的临床治疗提供了有效的科学依据, 具有显著的临床应用价值。

综上所述, AFP、CEA和CA199联合检测可以显著提高原发性肝癌诊断的准确率, 具有较高的敏感度, 值得临床推广使用。

参考文献

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[9]马丽艳, 刘媛媛.血清AFP、CEA和CA199联合对原发性肝癌诊断价值[J].黑龙江医药科学, 2011, 34 (1) :80.

大蛋白抗原 篇4

另外，本文采用了聚乙二醇法、水稀释法和乙醇提取法三种方法提取蛋黄免疫球蛋白，并对水稀释法进行了改进，并对IgY在免疫鸡蛋中的含量变化进行了测定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

动物：成年健康母鸡;疫苗：重组乙型肝炎疫苗(酵母型);主要仪器：低速大容量离心机、紫外分光光度计、精密pH计、冰箱;药品：聚乙二醇、乙醇、硫酸铵、PBS缓冲液(pH7.2, 0.01mol/L)、硫酸钠、95%冰乙醇(-20℃，预冷)、0.028mol/LNa Cl溶液、HCl溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 母鸡免疫

对试验用母鸡进行免疫，每次注射0.5ml (含HBs Ag10ug)，每12d注射1次，共注射3次。

1.2.2 聚乙二醇法提取Ig Y

新鲜鸡蛋取出蛋黄，搅拌成液状，加入2倍体积的PBS缓冲液(p H7.2, 0.01mol/L)混合均匀后加入粉状聚乙二醇(PEG, MW6000)，使其浓度达到3.5% (W/V) ，充分混匀，静置15min，离心 (10000r/min, 20min) ，去上清液加PEG使其浓度达12%，4℃条件下静置30min, 离心，得沉淀溶于适量PBS中，即得粗提物IgY。之后用固体硫酸胺进行纯化[3]。

1.2.3 水稀释法提取IgY

新鲜鸡蛋取出蛋黄，搅拌成蛋黄液，蛋黄液与蒸馏水按1:7的比例稀释，调节稀释后的蛋黄液的pH为5.0，于4℃条件下静置5h，离心30min (4000r/min)，得上清液记录体积，加入固体硫酸铵使其浓度达到50%，静置30min，离心25min，沉淀溶于适量得蒸馏水中，加入硫酸钠使其浓度达到14%，静置30min，离心，最后得沉淀即为纯度较高得IgY[4]。

1.2.4 乙醇提取法

新鲜鸡蛋取出蛋黄。按照1:7的比例稀释蛋黄，搅拌10min，使水溶性IgY充分溶出。用HCl调节pH至5.0左右，稀释液在4℃静置2h，去沉淀。向上清液中加入95%冰乙醇至60% (V/V) ，4℃搅拌20min后离心 (4000r/min, 4℃, 40min) ，收集沉淀并向其中加入0.028mol/L的NaCl溶液，溶解后过滤除去脂蛋白沉淀，收集澄清的水溶性蛋白组分 (WSF) 。向WSF中加入95%冰乙醇使其最终浓度达到30% (V/V) ，也可将最终浓度调至25% (V/V) ，离心 (4000r/min, 4℃, 40min) ，沉淀即为纯化后得IgY[5]。

1.2.5 改良水稀释法的研究

在原有水稀释法的基础上对水稀释法的稀释倍数和pH调节分别进行评定，最终确立适宜的提取条件和最佳的提取方法。

1.2.6 蛋黄免疫球蛋白含量和纯度测定

采用双波长紫外分光光度法测定IgY含量，测定提取物中总蛋白含量，从而计算出蛋黄免疫球蛋白的纯度[6]。

1.2.7 免疫后蛋黄中IgY含量变化的测定

对母鸡从第1次免疫后开始对蛋黄免疫球蛋白进行测定，直到含量稳定。

2 结果与分析

2.1 免疫后蛋黄中IgY含量的变化

当机体受到外界特异性抗原 (尤其是灭活抗原) 的刺激后，诱发一系列的免疫应答反应, 激发B细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞，分泌大量的特异性抗体进入血液中。在产蛋禽体内，血液中的特异性抗体逐渐移行到卵巢，并在卵黄中蓄积[7]。因而对母鸡进行免疫，分3次进行，时间间隔12d，注射量0.5ml/次 (含HBs Ag 10µg) 。从而观察每次注射后蛋黄中免疫球蛋白含量的变化，进而得出IgY含量的变化趋势。

2.1.1 第一次免疫后蛋黄中IgY含量的变化

健康母鸡进行第1次注射重组乙型肝炎疫苗(酵母型)，从次日起检测蛋黄中的免疫球蛋白含量，结果如图1ㄢ

由图1可看出母鸡在第1次免疫后蛋黄中IgY的含量并没有很大的变化，基本保持在未注射疫苗的水平 (2.1mg/ml左右) 。这主要是因为机体初次接触抗原后，在一定时期内抗体产生很少，这一时期称为潜伏期，又称诱导期，潜伏期的长短视抗原的种类而异[8]。动物机体初次接触抗原，也就是某种抗原首次进入体内引起的抗体产生过程称为初次应答。抗原首次进入体内后，B细胞克隆被选择性活化，随之进行增殖与分化，大约经过10次分裂，形成一群浆细胞，导致特异性抗体的产生。因而在第1次免疫后蛋黄中的IgY未出现明显的变化。

2.1.2 第二次免疫后蛋黄中IgY含量的变化

在第1次免疫后12d再次对母鸡进行免疫，测定蛋黄中IgY含量的变化结果如图2ㄢ

在第2次免疫后从图2中可以看出，蛋黄中的IgY有了明显的变化，开始增加呈缓慢的增长趋势，在第12d时IgY含量达到3.11mg/ml，增加了50%左右，这个阶段称之为再次应答或者初级免疫，动物抗体第2次接触相同的抗原时，起初原有抗体水平略有下降，接着抗体水平很快上升。

在次级免疫反应中存在两种可能性：Patterson等[9]认为，鸡抗体的动力学和哺乳动物类似;而其他学者认为抗体浓度在初次免疫后会增加，而再次给予抗原时不会有明显的变化。本试验的结果显示，在初级免疫后蛋黄中的IgY没有很大的变化。

2.1.3 第3次免疫后蛋黄中IgY含量的变化

第2次免疫后12d对母鸡进行第3次免疫，在这一阶段蛋黄中IgY的含量迅速增加，增长趋势较大，最后达到稳定阶段。

由图3可以看出在第3次免疫后，蛋黄中IgY含量呈线性增长趋势，增长速度较快，在第10d时可以达到最大值10.0mg/ml，开始持续稳定期，IgY含量在10mg/ml左右上下波动。这一阶段称为回忆应答，因此抗原刺激机体产生的抗体经过一定时间后，在体内逐渐消失，此时若机体再次接触相同的抗原物质，可使已消失的抗体快速回升。

再次应答和回忆应答取决于体内记忆性细胞T细胞和B细胞的存在，记忆性T细胞保留了对抗原分子载体决定族的记忆，在再次应答中，记忆性T细胞可诱导很快增殖分化TH细胞，对B细胞的增殖和产生抗体起辅助作用[8]。2.1.4蛋黄中IgY含量变化的总趋势根据以上3个阶段IgY含量的变化来看，随着免疫次数增加，也就是免疫抗原量的增加，蛋黄中IgY的含量也随之变化。第1次免疫后含量没有明显的变化，第2次免疫后呈现出较小的增长趋势，第3次免疫后基本呈现线性增长趋势，最后达到稳定时期，其总的变化趋势如图4所示。

由图4可以看出对母鸡分别进行3次免疫后，蛋黄中的IgY开始缓慢增加，35d左右达到稳定，从而进入IgY持续稳定期，含量在10.0mg/ml左右。这一过程将会持续约5个月的时间，之后测定蛋黄中IgY的含量得知，此时蛋黄IgY的含量开始下降，直至恢复到未免疫的水平，免疫蛋白含量平均为2.1mg/ml。因此，可以得出对母鸡进行免疫后蛋黄中IgY在1个月左右达到最大值，约为平常蛋的5倍左右，并且稳定。持续稳定半年后蛋黄中IgY的含量开始下降。

2.2 三种提取方法的比较

分别用聚乙二醇法、水稀释法和乙醇提取法对同一批鸡蛋提取IgY，测其含量及纯度，结果如表1ㄢ

由表1可以看出水稀释法提取的蛋黄免疫球蛋白的含量和纯度较高，纯度可达92%，据此选用水稀释法进行研究。

2.3 稀释倍数的确定

鸡蛋黄主要由不溶于水的颗粒成分和水溶性的浆液成分两部分组成，前者主要含低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及卵黄高磷蛋白，后者主要由IgY和大量低密度脂蛋白组成，颗粒成分分散于浆液中[10]。因此，分离IgY的关键是将蛋黄中的颗粒成分与水溶性的浆液分开，并除去卵黄中脂蛋白类物质，把IgY留在水中。为了完成以上分离过程，用水稀释蛋黄，根据相似相溶原理，浆液成分可部分溶于水中，能初步将不溶于水的颗粒成分从浆液中分离出。分别将蛋黄稀释5、6、7、8倍，由于稀释倍数不同，IgY的提取率也不同，提取结果如表2ㄢ

从表2可以看出，在pH5.0时，随着稀释倍数的增加，IgY的含量和纯度都有不同程度的增加，尤其在稀释倍数为7时最为明显。这主要是因为当卵黄稀释后，浆液成分具有亲水作用能够溶于水中，不溶于水的颗粒成分析出，沉淀。随着稀释倍数的增加，溶于水的浆液成分增加，分散于浆液中的颗粒减少，从而使IgY的含量和纯度增加。但并不是稀释倍数越大，IgY的含量和纯度就越高，还要考虑蛋黄中的其他成分，因此稀释倍数不要过大，选择7倍为宜。

2.4 提取酸度的确定

对蛋黄进行前处理后，分别调节到pH至4.9、5.1、5.5、5.7，因为在酸性条件下颗粒成分和浆液成分彻底分离。不同的酸度条件下也会直接影响其含量，结果如表3ㄢ

由表3可以看出，在pH5.1时IgY的含量和纯度高，高于pH5.1时IgY的含量和纯度都较低，随着pH增加有降低的趋势，因此提取IgY时选用pH5.1做为最佳酸度。这一结果主要是因为酸度会影响卵黄浆液中的脂类含量，而卵黄中脂类主要以各种脂蛋白的形式存在，酸度影响的是浆液中的脂蛋白和分散于其中的颗粒成分的结合能力[11]。在pH5.1时水溶液中几乎没有脂类物质，因而提取效果最好。

3小结

通过对母鸡免疫后鸡蛋中免疫球蛋白含量变化的测定，不同提取方法的比较，以及改进水稀释法条件的研究，得出以下结论：

(1)母鸡进行第1次免疫后蛋黄中IgY含量无明显的变化，第2次免疫后IgY含量呈缓慢的增长趋势，第3次加强免疫后IgY含量增长迅速，并达到最大值 (10.0mg/ml左右) ，从而进入持续稳定期，保持在10.0mg/ml左右上下波动;持续稳定约5个月后蛋黄IgY含量开始下降，最终达到未免疫时的水平。

(2)在聚乙二醇法、水稀释法和乙醇提取法中，水稀释法的提取效果最好，且操作简单，试剂用量少。

(3)改良水稀释法的提取方法为：蛋黄稀释7倍后，调节pH为5.1，然后于4℃下放置6h，于4200r/min离心40min，用硫酸铵沉淀，透析提纯。

摘要：本文研究蛋鸡注射抗原后蛋黄免疫球蛋白含量的变化及提取方法。并以此为基础, 对免疫前后母鸡所产蛋中的IgY含量变化进行了分析, 结果表明, 在母鸡经免疫注射1个月后蛋黄中的IgY含量达到稳定, 半年后IgY含量降低, 并且缓慢降至免疫前的含量。本研究采用改进水稀释法提取蛋黄免疫球蛋白的工艺为:稀释倍数为7倍、pH调节至5.1。IgY含量可达10.02mg/ml, 为以后IgY的提取和应用打下基础。

大蛋白抗原 篇5

关键词：甲胎蛋白,癌胚抗原,溶血,化学发光法

血液标本溶血对生化检查结果有很大影响, 是临床生化检验中较常见的一种干扰和影响因素, 标本溶血后总胆红素、总蛋白、肌酐等都有明显的变化, 血液标本溶血的原因有抽血困难、操作不当、存放不当等[1]。为了观察不同程度的溶血对化学发光法检测甲胎蛋白 (AFP) 、癌胚抗原 (CEA) 结果的影响, 选取我院当天空腹静脉血标本30份, 使用人工方法造成中、重度溶血, 分别测定非溶血标本Ⅰ组、中度溶血标本Ⅱ组、重度溶血标本Ⅲ组的AFP和CEA值, 现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

取我院当天空腹静脉血标本30份, 4000r/min离心15min, ⅠAFP组和ⅠCEA组分别取0.2ml为非溶血组;取余下标本用玻璃棒搅拌后, ⅡAFP组和ⅡCEA组分别取0.2ml为中度溶血组;再将余下标本冷藏24h后, ⅢAFP组和ⅢCEA组分别取0.2ml为重度溶血组。

1.2 方法

分别测AFP、CEA的高、中、低值, 然后分别测ⅠAFP、ⅡAFP、ⅢAFP组的AFP值3次;ⅠCEA、ⅡCEA、ⅢCEA的CEA值3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0进行数据统计, Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅰ组与Ⅲ组之间分别作配对t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AFP值

ⅠAFP值为3.58±1.42, ⅡAFP值为3.04±1.33, ⅢAFP值为2.55±1.28, Ⅰ组与Ⅱ组和Ⅲ组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。

2.2 CEA值

ⅠCEA值为2.38±1.42ⅡCEA值为3.13±1.35, ⅢCEA值为4.27±1.23, Ⅰ组与Ⅱ组和Ⅲ组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。

3 讨论

化学发光免疫分析 (CLIA) 是结合了高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应, 应用在各种抗原、抗体、酶、脂肪酸、激素、维生素和药物的检测分析技术, 是继酶联免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项免疫测定技术, 具有特异性强、灵敏度高、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长、操作简单、方法稳定快速、检测范围宽、自动化程度高等优点。

CLIA包括了化学发光分析系统和免疫反应系统。前者主要是使用催化剂的催化和氧化剂的氧化化学发光物质, 形成一个中间体, 当这种中间体回到稳定的基态的过程中会发射出光子, 这样就可以利用发光信号测量仪器测量光量子产额;后者是将发光物质标记在抗原或者抗体上, 作用于发光底物[2]。

在实验室检测血液标本时, 往往会因为很多原因造成血液标本溶血, 从而导致对检测结果造成偏差[3], 进一步影响医师对疾病的诊断, 本次研究显示, Ⅰ组与Ⅱ组和Ⅲ组AFP值和CEA值比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。提示血液标本中度溶血对化学发光法检测AFP、CEA结果有影响, 而血液标本重度溶血对化学发光法检测AFP、CEA结果影响更明显。

总之, 不同程度溶血对化学发光法检测甲胎蛋白、癌胚抗原结果均有影响, 操作时须注意标本溶血而影响检查结果。

参考文献

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[2] 罗炜, 王慧.化学发光免疫法与放射免疫法检测血清AFP的比较[J].上海医学检验杂志, 2000, 15 (3) :149.

大蛋白抗原 篇6

Cap蛋白由PCV - 2 开放阅读框2( ORF2) 编码,是PCV - 2 唯一的结构蛋白,包含233 ~ 236 个氨基酸,具有良好的免疫原性和反应原性,且PCV - 1 和PCV - 2 的Cap蛋白没有免疫交叉反应[6]。有研究表明,在Cap蛋白N端核定位信号区( 41 个氨基酸)内存在抗原表位,精确定位显示该表位位于第26 ~36 位氨基酸[7]。为获得PCV - 2 Cap蛋白,本研究通过PCR方法扩增出Cap蛋白全长基因,并将其克隆至p ET - 30a原核表达载体,实现了对PCV - 2 Cap蛋白的体外诱导表达,并对影响重组蛋白表达如诱导温度、菌体浓度、IPTG浓度及诱导时间等因素进行优化,以期获得大量的重组Cap蛋白,用于后续检测PCV - 2 抗体的间接ELISA试剂盒的研制,同时为实现重组Cap蛋白的规模化生产提供理论依据。

1 材料

PCV - 2 毒株、PCV - 2 单克隆抗体、猪PCV - 2阴性血清、p ET - 30a( + ) 和E. coli BL21( DE3) 感受态细胞,均为兽医生物技术国家重点实验室保存。

Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶( 5 U / μL) ,购自Ta KaRa公司( 大连) ; 兔抗猪Ig G - HRP,购自Sigma公司; 山羊抗小鼠Ig G - HRP、His标签单克隆抗体和DAB显色试剂盒,购自中杉金桥( 北京) ; Easy Pure Viral DNA / RNA Kit,购自北京全式金生物公司;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒,购自OMEGA公司; 预染蛋白Marker( 170 ku) ,购自Thermo Scientific公司; 限制性内切酶Bam H Ⅰ - HF、Hind Ⅲ - HF,购自NEB公司; Ni - NTA His - Bind树脂,购自GE公司。

2 方法

2. 1 重组质粒的构建

比较Gen Bank中PCV - 2 Cap蛋白基因序列,应用Primer Premier 5. 0 软件设计1 对特异性引物,序列为: 上游引物PCV - 2 - U 5' - AAAAGGATCCATGACGTATCCAGGGAGGC - 3' ( 下画线部分为Bam HⅠ 酶切位点) ,下游引物PCV - 2 - L 5' - AATCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGGG - 3' ( 下画线部分为Hind Ⅲ酶切位点) 。参照Easy Pure Viral DNA/RNA Kit说明书,提取感染PCV - 2 的PK15 细胞的总DNA。以提取的DNA为模板,PCR扩增PCV - 2ORF2 基因。PCR扩增产物与表达载体p ET - 30a( + ) 分别用Bam HⅠ - HF和HindⅢ - HF双酶切,经胶回收后连接,转化于E. coli BL21( DE3) 感受态细胞,将鉴定正确的重组菌命名为E. coli BL21( p ET - 30a - Cap)

2. 2 重组菌表达条件的优化

用无菌接种环蘸取少量E. coli BL21 ( p ET -30a - Cap) 菌液,划线于含100 μg / m L卡那霉素抗性的LB固体平板,37 ℃ 培养12 ~ 14 h; 挑取单菌落转接至含100 μg /m L卡那霉素抗性的LB液体培养基中,于37 ℃恒温振荡摇床培养过夜。

2.2.1诱导温度的优化

将过夜培养的重组菌按1∶100接种于LB液体培养基,于37 ℃ 恒温摇床培养。当OD600值达到0. 4 ~ 0. 6 时,加入终浓度为1. 0 mmol / L的IPTG后,用吸管吸取菌液分装至4 支试管中,每支试管分装10 m L,分别转移至22 ℃、30 ℃ 和37 ℃ 恒温振荡摇床,175 r / min振荡培养6 h和16 ℃恒温振荡摇床,175 r/min振荡培养12 h; 取不同温度诱导后的菌液离心,弃上清液,菌体沉淀用1 m L PBS ( 0. 01 mol / L,p H值为7. 4) 悬浮,超声波破碎后,分别收取上清液和沉淀,沉淀用1 m L PBS悬浮,分别取50 μL超声上清液及悬浮后的沉淀与等体积2 × SDS - PAGE上样缓冲液混匀后,沸水煮5 min;冰上冷却至室温后,取10 μL样品,用分离胶浓度为12% 的SDS - PAGE进行检测,凝胶经考马斯亮蓝染色及脱色液脱色后,用DNR Bio - Imaging Systems Mini Lumi成像系统进行拍照,用Image J软件对目的蛋白带进行灰度分析,每个目的条带的Int Den灰度值取3 次,所有数据经Graphpad prism 5. 0 处理,从宏观及数值分析两方面确定诱导重组菌的最佳温度。

2.2.2菌体浓度(OD600值)的优化

重组菌按1∶100接入LB液体培养基,37℃恒温摇床培养,检测OD600值;用移液器取OD600值依次达到>0.4~≤0.6、>0.6~≤0.8、>0.8~≤1.0、>1.0~≤2.0和>2.0的10 m L菌液分装至试管中,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG后,于175 r/min最佳温度诱导培养6 h;各取1 m L不同OD600值诱导后的菌液,4℃、12 000 r/min离心2 min;弃去上清液,并用滤纸小心吸去残余上清液,加入60μL PBS及等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液,后续试验方法同2.2.1,从而确定诱导重组菌的最佳菌体浓度(OD600值)。

2.2.3 IPTG浓度的优化

重组菌按1 ∶100 接入LB液体培养基,37 ℃ 恒温摇床培养,当达到最佳诱导OD600值时,用移液器取10 m L菌液分装至6 支试管中,分别加入终浓度为0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 2 mmol / L的IPTG,于175 r / min最佳温度进行诱导培养6 h。样品处理及后续试验方法同2. 2. 2,从而确定诱导重组菌的最佳IPTG浓度。

2.2.4诱导时间的优化

重组菌按1 ∶ 100 接入LB液体培养基,37 ℃ 恒温摇床培养,当达到最佳诱导OD600值时,用移液器取10 m L菌液分装至7 支试管中,加入最佳诱导浓度的IPTG,175 r/min最佳温度进行诱导培养,分别于1,2,3,4,5,6,7 小时取样。样品处理及后续试验方法同2. 2. 2,从而确定重组菌的最佳诱导时长。

2. 3 重组Cap蛋白的纯化

按照探索的最佳表达条件,重组菌按1∶100 接入1 L LB液体培养基进行大量诱导表达,4 ℃ 、5 000 r / min离心20 min; 收集菌体沉淀,用平衡液( 20 mmol/L Tris,50 mmol/L Na Cl,p H值为8. 0) 洗涤3 次,用100 m L重悬菌体沉淀,于- 70 ℃ 冰箱反复冻融3 次后进行超声裂解; 离心,收集上清液,用0. 45 μm滤器过滤除去大分子杂质; 取少量上清液用于纯化条件的探索,其余上清液于4 ℃ 保存。用GE公司Ni - NTA His - Bind纯化系统进行纯化,对含不同咪唑浓度的洗脱液进行探索,收集洗脱样品进行SDS - PAGE分析,确定纯化条件。按照优化后的纯化程序对超声后的上清液进行大量纯化,取纯化后的样品进行SDS - PAGE,分析其纯度。

2. 4 重组Cap蛋白的Western - blot分析

重组蛋白进行SDS - PAGE电泳后,采用半干法转移至硝酸纤维素膜( NC膜) 上,用含5% 脱脂乳的封闭液( PBST稀释) 室温封闭2 h; 分别以PCV - 2 单克隆抗体、猪PCV - 2 阴性血清和His标签单克隆抗体为一抗,室温孵育1 h; 用PBST洗涤3 次后,以兔抗猪Ig G - HRP或山羊抗小鼠Ig G - HRP为二抗,室温孵育1 h; 用PBST洗涤3 次,用DAB显色试剂盒显色,进行Western - blot鉴定。

3 结果与分析

3. 1 重组质粒的构建

利用PCR方法成功克隆出基因片段,扩增片段长度为722 bp( 见图1A) ,经酶切后连接p ET - 30a载体,构建p ET - 30a - Cap重组质粒,经Bam H Ⅰ -HF和Hind Ⅲ - HF酶切( 见图1B) 及测序鉴定,目的基因被成功插入。

M1.DL-2 000 Marker;1.PCR结果;2.阴性对照;M2.DL-15 000 Marker;3.酶切结果。

3. 2 重组菌的最佳表达条件

3.2.1最佳诱导温度

诱导后菌体经超声离心处理后,取上清液及沉淀分别进行SDS - PAGE分析,结果表明: 不同诱导温度下,重组Cap蛋白存在于上清液中,表明该蛋白主要以可溶性形式表达; 不同诱导温度对重组Cap蛋白的表达量有较大影响,眼观凝胶,37 ℃诱导时的产量与30 ℃ 诱导时无明显差异,但产量明显高于22 ℃与16 ℃( 见图2A) 。Int Den值与目的蛋白产量呈正相关,通过软件分析发现,37 ℃诱导时的产量显著高于30 ℃ ( P = 0. 005 5) ( 见图2B) ,因此确定重组菌的最佳诱导温度为37 ℃ 。

3.2.2最佳诱导OD600值

在不同OD600值进行诱导试验中,重组菌菌液加入终浓度为1. 0 mmol/L的IPTG,于37 ℃ 恒温摇床175 r / min振荡培养6 h; 样品进行SDS - PAGE分析,眼观凝胶可以看到,当OD600值从0. 471 到1. 827 时,目的蛋白产量依次增加( 见图3A) 。软件分析发现,当OD600值为1. 274 开始诱导时,目的蛋白的Int Den值与OD600值为0. 940时相比差异显著( P < 0. 05) ,但与OD600值为1. 563,1. 827,2. 246 时相比,均无显著差异( 见图3B) 。此外,从凝胶还可以看到OD600值为1. 563,1. 827,2. 246 时,除目的蛋白产量增加外,杂蛋白表达量也增加。综合考虑确定,重组菌的诱导OD600值取为1. 0 ~ 1. 5。

3.2.3最佳诱导IPTG浓度

当OD600值达到1. 3时,重组菌菌液加入不同终浓度的IPTG,于37 ℃ 恒温摇床175 r/min振荡培养6 h; 样品进行SDS -PAGE分析,眼观凝胶,IPTG浓度从0. 2 mmol / L到1. 2 mmol / L时,目的蛋白表达量并没有很明显的差异; 当IPTG浓度为0. 2 mmol/L及0. 4 mmol/L诱导时,目的蛋白量稍高于其他IPTG浓度( 见图4A) 。用软件分析发现,仅当IPTG浓度为0. 2 mmol/L时,目的蛋白的Int Den值与IPTG浓度为0. 6 mmol/L时相比有显著差异( P = 0. 033 6) ,而与其他各IPTG浓度诱导相比时,目的蛋白表达量无显著差异( 见图4B) 。因此,确定重组菌的最佳诱导IPTG浓度为0. 2 mmol / L。

3.2.4最佳诱导时间

当OD600值达到1. 3 时,重组菌菌液加入终浓度为0. 2 mmol/L的IPTG,于37 ℃恒温摇床175 r/min振荡培养。分别于诱导后1 ~7 h取样,样品进行SDS - PAGE分析,眼观凝胶,诱导后4 小时目的蛋白表达量明显高于诱导后1,2,3 小时,但与诱导后5,6,7 小时相比无明显差异( 见图5A) 。软件分析发现,诱导后5 小时的目的蛋白的Int Den值显著高于诱导后4 小时( P = 0. 014 2) 及诱导后6 小时( P = 0. 000 7) 。因此,确定重组菌的最佳诱导时间为5 h( 见图5B) 。

3. 3 目的蛋白的纯化结果

按照优化后的纯化程序,用GE公司Ni - NTAHis - Bind纯化系统对处理后的样品进行纯化,纯化过程中均留取样品进行SDS - PAGE分析,结果见图6。

从图6 可以看出: 含100 mmol/L咪唑的洗涤液对杂蛋白有很好的洗涤效果,杂蛋白被全部洗脱而此时目的蛋白仍与His标签紧密结合; 当用含300 mmol / L咪唑的洗脱液洗脱时,仅在约35 ku处有单一条带,与预期结果相符。

M.蛋白Marker;1,2.超声上清液;3~5.100 mmol·L-1咪唑洗涤后留样;6.300 mmol·L-1咪唑洗脱液。

3. 4 重组蛋白的Western - blot检测结果

以PCV - 2 单克隆抗体及His标签单克隆抗体分别作为一抗时,重组菌诱导后超声上清液及纯化后的重组Cap蛋白,在约35 ku处均出现明显条带,而重组菌诱导前样品在相应位置没有条带出现; 此外,以猪PCV - 2 阴性血清为一抗时,相应位置也无条带出现( 见图7) 。Western - blot结果表明,重组Cap蛋白表达成功,能与PCV - 2 单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。

M.蛋白Marker;1.诱导前;2.超声上清液;3.超声沉淀;4.纯化后样品。

4 讨论

大肠杆菌表达系统是目前研究最为深入、发展最迅速的原核表达系统。E. coli因其遗传背景清楚、表达周期短、表达量大、操作简单、容易培养和进行基因组改造、大规模培养成本较低等优点,在外源基因的表达中应用最为广泛[8,9]。2001 年,Q. Liu等[10]利用p MAL - c2X表达载体实现了PCV - 2 ORF2 全长基因的外源表达,得到MBP - ORF2 融合蛋白,但其产量较低; 试验中曾尝试用30 ℃ 及37 ℃ 温度诱导,但用p ET - 15b为表达载体的重组菌均未得到目的蛋白; 以p GEX - 5X - 3 为表达载体时,在考马斯亮蓝染色过的蛋白胶中及以抗GST标签为一抗进行Western - blot检测,均在35 ku处观察到蛋白带,并被证实是预期52 ku的蛋白经水解酶消化后的片段。2004 年,P. Lekcharoensuk等[11]研究证实,在PCV -2 Cap蛋白N端47 个氨基酸处不存在构象表位。2005 年,J. Y. Zhou等[12]将不含信号肽序列( NLS)的截短ORF2 基因在p GEX - 4T - 1 表达载体中实现了高效表达,证实去掉NLS不影响Cap蛋白的抗原性,并再次指出以p BAD/His B及p GEX - 4T - 3 为表达载体时均未实现对PCV - 2 ORF2 全长基因的表达。目前,在进行PCV - 2 ORF2 基因外源表达时,常选择去掉NLS序列,获得截短Cap蛋白[13,14,15]。最新研究证实,PCV - 2 Cap蛋白N端NLS处存在抗原表位[7]。因此,本研究利用p ET - 30a原核表达载体对PCV - 2 ORF2 全长基因进行体外表达,获得了可溶性的重组Cap蛋白,经Western - blot鉴定,该蛋白具有良好的反应原性。PCV - 2 ORF2 全长基因能够在p ET - 30a表达载体中实现表达,可能是相对p ET -15b表达载体,优化后的p ET - 30a更适宜于Cap蛋白的外源表达。

重组Cap蛋白在初步表达时其表达量较低,为得到较多的目的蛋白,本研究针对影响原核表达量的诱导温度、诱导起始菌体浓度、IPTG浓度及诱导时间等重要因素进行了优化。温度是影响外源基因表达的重要因素。研究表明,低温诱导可提高表达蛋白的可溶性,一般多选择低温并延长诱导时间以获得较多的可溶性目的蛋白[16]; 因此,本研究选择在22 ℃、30 ℃ 及37 ℃ 温度下诱导6 h,而16 ℃ 诱导12 h进行探索,最终确定最佳诱导温度为37 ℃。重组菌诱导起始菌体浓度的不同,同样影响外源基因的表达。在原核表达中,常选择OD600值达到0. 4 ~ 0. 6 或OD600值达到0. 6 ~ 0. 8 时进行诱导。本研究选择的7 个起始诱导OD600值( 0. 471,0. 752,0. 940,1. 247,1. 563,1. 827,2. 246) 分别处于> 0. 4 ~ ≤0. 6, > 0. 6 ~ ≤0. 8, > 0. 8 ~ ≤1. 0, > 1. 0 ~ ≤2. 0 及> 2. 0 的范围内。在研究中发现OD600值小于1. 0 时,目的蛋白产量呈上升趋势; 因此,OD600值取值至大于2. 0。研究确定,在重组Cap蛋白进行表达时,起始诱导OD600值最佳范围是1. 0 ~ 1. 5; 因此,在选择起始OD600值时,为提高目的蛋白产量,有必要对其起始诱导OD600值进行探索。研究中发现,IPTG诱导浓度对蛋白表达影响不大。对诱导时间进行探索,能够了解目的蛋白的产生情况,并及时终止诱导的进行,收获大量目的蛋白。一般在诱导4 h后,目的蛋白的表达量接近最大,故本研究选择1 ~ 7 h来研究目的蛋白的最佳诱导时间。

目前,在表达条件优化方面,常通过SDS - PAGE分析,进行直观的蛋白凝胶观察,缺乏科学的客观数据。虽然,现有凝胶成像系统具备分析各样品中重组蛋白表达量占菌体总蛋白量的百分数的功能,但这样的凝胶成像系统还未普及应用。本研究在传统的SDS - PAGE分析的基础上,利用Image J软件对目的蛋白带进行灰度分析,将蛋白表达量用Int Den灰度值呈现出来,利用Graphpad prism 5. 0 软件对数值进行统计学分析,为表达条件的优化提供了科学客观的依据。

本研究成功构建了p ET - 30a - Cap表达载体,实现PCV - 2 ORF2 全长基因克隆表达,获得了重组Cap蛋白。经Western - blot鉴定,该蛋白具有良好的反应原性。通过对影响重组Cap蛋白表达的诱导温度、诱导起始OD600值、IPTG浓度及诱导时间等因素的优化,及其蛋白纯化条件的优化,旨在为PCV - 2诊断方法的建立及后续研究提供大量高纯度的重组Cap蛋白; 同时,也为实现重组Cap蛋白的规模化生产提供参考数据。

摘要：为了获取大量的有良好抗原性的猪圆环病毒2型(PCV-2)重组Cap蛋白,用于PCV-2抗体检测试剂盒的研制,试验对PCV-2 ORF2全长基因进行扩增,构建重组表达质粒p ET-30a-Cap,转化E.coli BL21(DE3),在SDS-PAGE分析基础上,结合Image J和Graphpad prism 5.0软件的分析,对重组菌E.coli BL21(p ET-30a-Cap)表达条件进行了优化,诱导产物纯化后,经SDS-PAGE分析及Western-blot鉴定其抗原性。结果表明:重组Cap蛋白的最佳表达条件是当菌体浓度(OD600值)达到1.0~1.5时,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG,37℃恒温摇床175 r/min振荡培养5 h;纯化获得高纯度的重组Cap蛋白,且该蛋白具有良好的反应原性。说明表达的重组Cap蛋白具有良好的抗原性,能为检测PCV-2抗体的间接ELISA试剂盒的研制提供诊断抗原。

大蛋白抗原 篇7

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2009 年1 月30 日-2012 年4 月1 日在遵义医学院附院妇科病房住院行手术治疗,并经病理确诊的宫颈鳞癌患者60 例为研究组,年龄32~65岁,平均(45.00±3.28)岁。按照2009 年国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Ob stetrics,FIGO)分期,其中ⅠA2期10 例,ⅠB1期13 例,ⅠB2期15 例,ⅡA期22 例。随机选取同期在本院妇科门诊和/ 或病房诊治后经病理确诊的宫颈上皮内瘤变(cervical intra-epithelial neoplasia,CIN)60 例为对照组1,慢性宫颈炎60 例为对照组2。所有入选患者均排除支气管囊肿、妊娠、牛皮癣、肺结核、湿疹及盆腔炎症。各组年龄比较差异无统计学意义(P =0.215)。

1.2 主要试剂与仪器

采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked im munosorbent assay,ELISA)检测SCCAg和Cath-D水平,试剂由上海信裕生物科技有限公司提供,检测仪器为荷兰Wellscan MK2 酶标仪;全自动化学发光免疫分析法检测CA125 水平,仪器为Immulite 2000,试剂由西门子公司提供。所有操作严格按照说明书进行。

1.3 结果判断标准

选择体检健康女性60 例(均行妇科检查及宫颈刮片检测),检测SCCAg、Cath-D和CA125 水平确定参考值。取95%可信区间(confidence interval,CI),SCCAg为0.1 ~0.7 ng/ml,≥0.7 ng/ml为阳性;Cath-D为4.3~7.5 ng/L,≥7.5 ng/L为阳性;CA125 为2.1~8.9 u/ml,≥8.9 u/ml为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,运用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较用LSD法,检验水准为0.05。检测结果以敏感性为纵轴,以误诊率为横轴,绘制工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC),计算曲线下面积(area under curve,AUC)和标准误,ROC曲线下面积<0.70 表示准确性较低,0.70~0.90 为中等,>0.90 为较高。其中联合检测结果变量即预测概率由Logistic回归产生,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1研究组与对照组的SCCAg、Cath-D和CA125 水平比较

宫颈鳞癌组SCCAg、Cath-D和CA125 水平升高。方差分析表明,各组间SCCAg、Cath-D和CA125水平比较,差异有统计学意义。见表1。

进一步两两比较结果表明,宫颈鳞癌组与CIN组和慢性宫颈炎组间差异有统计学意义(①SCCAg:宫颈鳞癌组vs CIN组,t =22.286,P =0.003;慢性宫颈炎组vs宫颈鳞癌组,t =20.333,P =0.005;②CathD:宫颈鳞癌组vs CIN组,t =17.385,P =0.000;慢性宫颈炎组vs宫颈鳞癌组,t =16.333,P =0.000;③CA125:宫颈鳞癌组vs CIN组t =16.887,P =0.000;慢性宫颈炎组vs宫颈鳞癌组,t =17.815,P =0.000);CIN组SCCAg、Cath-D、CA125 与慢性宫颈炎组比较,差异无统计学意义(t =1.952、1.052 和0.927,P =0.144、0.289 和0.493)。

2.2 SCCAg、Cath-D、CA125 与不同病理参数的相关性

宫颈鳞癌组血清SCCAg、Cath-D水平与临床分期、分化程度、间质浸润深度、肿瘤体积、阴道残端浸润、脉管癌栓、盆腔淋巴结转移有不同程度相关,差异有统计学意义(P <0.05),CA125 水平变化与宫颈癌间质浸润深度有关,差异有统计学意义(P <0.05)。见表2、3。

2.3 宫颈鳞癌诊断、预测转移的敏感性与特异性

应用ROC曲线,依据敏感性与特异性之和最大化原则,计算出血清SCCAg、Cath-D和CA125 诊断宫颈鳞癌的临界值分别为1.03 ng/ml、13.58 ng/L和8.16u/ml,预测转移临界值分别为3.21 ng/ml、21.20ng/L和12.45 u/ml。敏感性:Cath-D>SCCAg>CA125;特异性:SCCAg>Cath-D>CA125。3 项指标联合检测时敏感性(0.99)和特异性(0.98)均显著提高。见表4。

2.4 ROC曲线面积预测宫颈鳞癌转移

计算SCCAg、Cath-D和CA125 的ROC曲线下面积,分别为0.954、0.905 和0.718,从单项独立指标分析看出,预测宫颈鳞癌转移的准确性:SCCAg>Cath-D>CA125;联合检测的ROC曲线下面积增加到0.977,明显提高预测宫颈鳞癌转移的准确性。见表5。

(n=60,ng/ml,±s)

(±s)

(±s)

3 讨论

宫颈鳞癌的进展是一个从非典型增生到原位癌再到浸润癌的循序渐进过程[6],病因尚不完全明确[7],可能与多基因共同作用有关,系相关致癌因子激活原发基因使细胞增殖和凋亡紊乱所致。目前对宫颈鳞癌的早期诊断及预测转移尚无统一和规范的肿瘤标志物,韦羽梅等[8]研究显示,宫颈癌治疗效果与是否转移密切相关,因此寻找早期诊断和预测转移的指标是提高宫颈鳞癌诊疗效果的关键所在。SCCAg存在于鳞状细胞的胞浆内,是肿瘤相关抗原TA-4 的亚单位,作为一种肿瘤标志物与各种器官的鳞状细胞癌相关[9],当鳞状细胞异常增生时,就会被动表达SCCAg并释放到人体外周血中,诱导细胞毒性T细胞的免疫活性,激发机体对肿瘤的免疫应答[10];Cath-D是一种52 k D的含天冬氨酸的糖蛋白,属于木瓜蛋白酶家族,存在于细胞内溶酶体,有分解细胞内蛋白、激活细胞内酶原和激素的作用,当肿瘤组织细胞代谢加强时,随着肿瘤的发展,Cath-D也会明显升高[11]。有研究显示多种肿瘤患者体内均有Cath-D高表达[12];CA125 属于糖蛋白中的一种,在宫颈癌中的诊断价值曾有报道[13],但其敏感性和特异性均不高。

本文研究血清SCCAg、Cath-D和CA125 及联合检测对宫颈鳞癌诊断及预测转移的价值,结果显示,宫颈鳞癌组SCCAg、Cath-D和CA125 水平显著高于CIN组及慢性宫颈炎组,表明宫颈鳞癌与3 项指标密切相关,对宫颈鳞癌的诊断具有非常重要的价值,与赵倩颖[14]报道一致。血清SCCAg和Cath-D水平与宫颈鳞癌的临床分期、分化程度、瘤体大小、肿瘤浸润深度、脉管癌栓及盆腔淋巴结转移关系密切,可以作为独立预测转移的良好指标,与Gadducci等[15]报道一致。通过CA125 诊断宫颈鳞癌浸润有较好的临床意义。

通过研究结果分析SCCAg、Cath-D和CA125与宫颈鳞癌发病的原因,机制如下:①宫颈鳞癌侵犯鳞状细胞基底层,SCCAg通过血管、淋巴管进入外周血导致水平升高;②癌细胞通过抑制细胞凋亡途径,使机体相关细胞的自杀机制产生抵抗[16],肿瘤细胞恶性生长,鳞状细胞基因表达和调控失常,受到浸润生长及分化程度的影响,参与凋亡调控的细胞高表达SCCAg;③Cath-D水平升高,可能是宫颈鳞癌周围组织代谢加强,抑制自噬体的活性,使得Cath-D的表达随着肿瘤进展而不断增强[17],同时Cath-D刺激癌细胞的生长,降解基底膜和结缔组织[18],破坏宿主细胞外基质天然屏障,有利于肿瘤细胞侵袭[19];④Cath-D可诱导u PA介导肿瘤相关蛋白溶解的级联效应,促进肿瘤细胞增殖、局部扩散[20],特别是在肿瘤浸润和转移的过程中蛋白水解酶发挥重要的作用[6];⑤Cath-D纤溶酶原的水解片段还有抑制血管生成的作用,在缺氧条件下导致环氧化酶2 表达,血管密度增加[21],促使肿瘤的形成;⑥CA125 与宫颈鳞癌的间质浸润深度有直接关系,可能是因为肿瘤细胞的浸润,破坏正常组织细胞的基底膜,淋巴管侵袭导致CA125 水平升高。

应用ROC曲线计算SCCAg、Cath-D和CA125诊断宫颈鳞癌及预测其转移的临界值、敏感性、特异性和曲线下面积,结果显示SCCAg和Cath-D在宫颈鳞癌的发生、发展、分化、侵袭、转移等过程中具有相互调控、诱导或信息传递的协同作用,既可单独成为宫颈鳞癌诊断和预测转移的指标,也可以联合使用;SCCAg具有很高的特异性,而Cath-D有很好的敏感性。如将几项指标联合使用,可明显提高宫颈鳞癌的诊断和预测转移的敏感性和特异性,对宫颈鳞癌早期诊断、预测转移、治疗方案的制定有一定的临床价值。

摘要：目的 探讨血清鳞状细胞癌抗原(SCCAg)、组织蛋白酶D(Cath-D)、糖类抗原125(CA125)联合检测对宫颈鳞癌诊断及预测转移的临床应用价值。方法 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中SCCAg和CathD水平,全自动化学发光免疫分析法检测CA125。收集2009年1月30日-2012年4月1日宫颈鳞癌患者(ⅠA2~ⅡA期)60例为研究组;宫颈上皮内瘤变组(CIN组)60例为对照组1;慢性宫颈炎组60例为对照组2。研究组在术前检测血清SCCAg、Cath-D、CA125水平,分析血清SCCAg、Cath-D、CA125水平与宫颈鳞癌、临床病理特征、转移及复发之间的相关性。结果 宫颈鳞癌组手术前的SCCAg、Cath-D和CA125水平分别为(1.41±0.26)ng/ml、(19.14±1.52)ng/L和(17.42±0.90)u/ml,明显高于CIN组和慢性宫颈炎组,差异有统计学意义(P=0.003、0.005、0.000、0.000、0.000和0.000);SCCAg、Cath-D水平与宫颈鳞癌临床分期、肿瘤体积、分化程度、间质浸润深度、脉管癌栓、宫旁转移、盆腔淋巴结转移有不同程度相关,差异有统计学意义(P<0.05),CA125水平变化与宫颈癌间质浸润深度密切相关,差异有统计学意义(P=0.007)。应用工作特征曲线(ROC)分析SCCAg、Cath-D和CA125诊断宫颈鳞癌的临界值分别为1.03 ng/ml、13.58 ng/L和8.16 u/ml,预测转移临界值分别为3.21 ng/ml、21.20 ng/L和12.45 u/ml,曲线下面积(AUC)分别为0.954、0.905和0.718。结论 血清SCCAg和Cath-D水平对宫颈鳞癌的诊断、临床分期、预判复发具有很高的临床诊断价值;SCCAg、Cath-D和CA125 3项指标联合使用,可明显提高预测宫颈鳞癌转移的临床价值。