肝炎核心抗原（精选8篇）
肝炎核心抗原 篇1
丙型肝炎疗程长、疗效欠佳、费用高，选择理想方法及早检出HCV非常重要[1]，目前诊断主要指标为抗HCV和HCV-RNA,HCV核心抗原(HCV-Ag)检测作为抗-HCV检验的补充试验，对HCV感染的诊断有重要意义。我们采用ELISA法检测HCV-Ag，效果较好，报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
抽取疑为HCV感染的门诊及住院患者血清标本77份，男34份，女33份，年龄15～63岁，平均40.5岁;纳入标准:(1)经临床检查确诊;(2)实验室检查丙型肝炎病毒抗-HCV阳性的患者。排除标准:(1)甲、丁、戊型肝炎病毒混合感染;(2)其他疾病引起的肝脏损害。采血半小时内分离出血浆，一部分当日进行HCV-RNA和HCV-Ab检测，其余于-20℃冰箱保存用于HCVc Ag检测。
1.2 试剂和方法
HCV-Ag检测采用景达基因有限公司的HCV-Ag试剂盒;HCV-RNA检测采用匹基生物工程股份有限公司的HCV-RNA荧光定量检测试剂盒;抗-HCV检测采用英科新创科技有限公司的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒;HCV质控血清由卫生部临床检验中心提供。使用BAY-ER1650全自动生化分析仪，Opticon Monitocr2TM荧光定量PCR扩增仪，酶标仪Dragen MK3。HCV-Ab和HCV-cAg检测采用ELISA法，HCV-Ag检测设空白对照一孔，阴性对照、阳性对照各两孔，样本稀释液100μl/孔，待测标本100μl,37℃孵育90 min，洗板6次;加酶结合物200μl,37℃孵育30 min;再洗板6次，加显色剂200L，室温闭光30 min，终止;492 nm(参考波长630 nm)读板，Cut oof=NCx+01040。HCV-RNA采用RT-PCR法、检测严格按说明书要求进行。结果判断:≥1.0×106IU/L为阳性，<1.0×106IU/L为阴性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 10.0分析软件对收集到的数据进行处理，观察和统计数据用均值±标准差表示，用t和χ2检验进行组间显著性分析P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1
HCV-RNA、HCV-Ag、抗HCV检测结果见表1。
2.2
三法阳性率(含假阴性)占总样本的比率，HCV-RNA PCR、HCV-Ag、抗-HCV阳性率分别为42.86%、44.16%、38.96%;同HCV-RNA检测结果比较，HCV-Ag及抗-HCV检测的符合率。HCV-Ag检测符合率90.91%(70/77)、假阳性率3.90%(3/77)、假阴性率5.19%(4/77);抗-HCV检测符合率84.42%(65/77)、假阳性率6.49%(5/77)、假阴性率9.09%(7/77)。
3 讨论
丙肝与肝硬化、肝癌等发生、发展显著相关，HCV在体内复制活跃，传染性强，临床症状不典型，缺乏特异性的治疗方法，尽早开始治疗有可能中止或延缓病变发展，改善患者预后，早期诊断、及时阻断HCV传播非常重要[2]。HCV-Ag、抗-HCV和HCV-RNA联合检测为HCV感染诊断的主要指标，HCV-Ag为丙型肝炎早期感染的标志，患者外周血中HCV-Ag与HCVRNA水平具有良好的相关性[3]，可作为丙型肝炎病毒复制的标志，具有高度敏感性及特异性，早期检测HCV-Ag可克服抗-HCV筛选的局限性，适用血清抗体阳转前的抗原检查，也可明显缩短HCV感染的检测窗口期[3]，利于丙型肝炎的早期诊断，减少因输血传播丙肝的发生率，同时总HCV-Ag检测可用于监控慢性丙肝患者体内病毒载量，评价抗HCV治疗效果。
ELISA法检测HCV抗体为临床最常用手段，部分患者HCVAb检测阴性而HCV-Ag阳性，经PCR检测HCV-RNA阳性，可能与患者免疫功能抑制、处于抗体检测窗口期或尚未产生HCV-Ab等有关。HCV-Ag测定和HCV-RNA PCR都能将HCV窗口期平均缩短至36 d[4],HCV-RNA PCR检测对操作要求、设备条件、工作环境要求较高，易交叉污染导致假阳性偏高;ELISA法检测HCV-Ag简捷、价廉，设备简单，适合大规模筛查和多数基层医院，与HCV-RNA PCR检测相比具有优越性。HCV-Ag检测假阴性可能与检测抗原反应系统不稳定、抽样误差、抗原出现较早与抗体结合而检测不出、恢复期患者抗原消失而抗体仍存在等因素有关。
参考文献
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肝炎核心抗原 篇2
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.09.242
传统乙肝血清标志物是目前我国用于乙肝检测与筛查的普及指标，但其在检测病毒复制等方面尚有不足。文章分析前S1抗原(PreS1)和乙型肝炎病毒(HBV)血清标志物之间的关系，探讨乙型肝炎病毒前S1蛋白在临床上的应用价值。关于PreS1、抗PreS1与HBV免疫标志物的相关性。采用ELISA对306例HBsAg阳性标本进行PreS1、抗PreS1与HBV血清标志物相关性的研究证实，前S1抗原(Pre-S1Ag)检测是对乙肝“两对半”，尤其是e抗原和HBV-DNA测定的重要补充和加强。前S1蛋白与HBV-DNA的一致性较好，在反映乙型肝炎病毒复制情况方面比很敏感，可作为临床上乙型肝炎病毒感染的诊断的一项理想的检测指标。
资料与方法
标本：临床收集HBsAg阳性标本306份。
试剂：HBV血清标志物检测试剂由上海科华生物技术有限公司生产(批号201105022)，前S试剂由上海复星长征医学科学有限公司生产(批号2011062111)。
方法：严格按试剂盒说明书进行操作。
结果
HBeAg阳性共146例，其中前S1阳性127例，阳性率为87.0%；HBeAg阴性共160例，其中前S1阳性72例，阳性率为45%；HBeAg阴性血清160例，前S大多数存在于抗HBe阳性血清中，阳性率为40.6%。见表1。
前S1阳性127例，HBeAg(-)其中前S1阳性72例，阳性率为45%，HBeAg阴性血清160例前S大多数存在于抗HBe阳性血清中，阳性率为40.6%。见表2。
讨论
乙肝病毒前S抗原是乙肝表面抗原的组成成分。有研究报道，PreS1蛋白作为HBV的外壳蛋白成分，在HBV感染宿主的过程中起着关键作用。一方面，PreS1蛋白21～47段可与肝细胞膜上的相应受体直接结合；另一方面，PreS1蛋白21～47段可与宿主细胞膜上的IL-6含有的识别位点结合，均可介导HBV侵入宿主细胞。HBV PreS1抗原检测是对HBV标志有益的必要的补充，对乙型肝炎病况的判别有重要参考意义。
HBeAg是HBV核心内部成分，是临床上判断病毒在宿主体内复制并具有传染性的重要血清学指标，其出现常提示HBV复制活跃和传染性强。但目前HBeAg阴性的乙型肝炎患者逐年增多，其中一部分患者仍存在病毒复制，如何识别这些HBeAg阴性的患者有无病毒复制，PreS1抗原作为一种新的血清学指标，体现出其独特的优势。
临床306例HBsAg阳性病例，以两对半指标的不同组合模式，分析与PreS1间的关系，证明PreS1与HBeAg具有一致性。146例HBeAg阳性率为88.1%，说明前S1在HBV感染的早期就可检出。因此，前S1阳性是有助于乙型肝炎的诊断并可作为HBV复制的指标。多数研究报道急性HBV感染时抗PreS1是最早出现的免疫反应，本组数据研究与多数报道一致在急性肝炎早期多数患者血清中就出现了抗PreS1，因此，它的前S1和HBeAg指标一样，也是乙肝感染的早期指标，且与阴转时间呈正相关。这样，前S1抗原可作为病毒清除与病毒转阴的指标。前S1抗原阳性的乙肝患者传播乙型肝炎病毒比前S1抗原阴性和无症状HBsAg携带者的危险性更大，因而说明前S1抗原可反映乙型肝炎病毒复制的传染性的指标，如果前S1抗原持续阳性，指示HBV向慢性转变，比较急性乙型肝炎，慢性乙型肝炎和HBsAg阳性的患者血清中前S1蛋白，前S1抗原状阴转愈早，HBV患者的疗程愈短，预后也愈好，说明前S1抗原及其抗体的检测是急性乙型肝炎的临床论断，疗效观察和判断数据预后的良好指标。
参考文献
1 吕军,董黎,高远.乙型肝炎病毒前S1蛋白的檢测与临床应用价值［J］.实用诊断与治疗杂志,2007,21(10):767-768.
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肝炎核心抗原 篇3
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 HCV-Ab阳性标本
采自笔者所在医院2009年8月~2010年8月经HCV-Ab检测阳性的血液标本80例, 分离血清并置-20℃冰箱保存。
1.1.2 HCV-Ab阴性标本
采自笔者所在医院2009年8月~2010年8月住院输血前及门诊检查的血液标本, 随机抽取260例, 这部分患者采用双盲法同时检测HCV-Ab和HCV-c Ag。
1.2 方法与试剂
1.2.1 HCV-Ab检测
应用的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司生产, 严格按照说明书上的方法操作, 阳性结果经二次复检。
1.2.2 HCV-c Ag检测
应用的HCV-c Ag ELISA试剂盒由湖南景达基因公司生产, 严格按说明书上的方法操作, 阳性结果经二次复检。
1.2.3 HCV-RNA检测
应用的丙型肝炎病毒PCR检测试剂盒由深圳匹基生物工程有限公司生产, 严格按说明书上的方法操作。
2 结果
260例未知标本的检测HCV-Ab均为阴性, HCV-c Ag阳性5例, 阳性率1.9%, 其中HCV-RNA 4例;80例HCV-Ab阳性的样本检出HCV-c Ag阳性33例, 阳性率为41.25%;HCV-RNA 47例, HCV-c Ag与HCV-RNA符合率为70.21% (33/47) , 见表1。
3 讨论
称为“沉默杀手”的传染性疾病——丙型肝炎越来越受到医学界的重视。该病目前尚无特殊疗法, 主要采取保肝治疗, 因此, 及时准确地检测出体内感染丙型肝炎病毒, 就能在很大程度上减轻肝脏的损害。然而, HCV感染者的血液中病毒含量极低, 还没有适当的方法可以直接检测病毒。同时, 由于丙型肝炎病毒在机体复制增殖时, 存在HCV-Ab和HCV-c Ag浓度相互主导转换的一个过程。感染初期, 机体内存在一定浓度的HCV-c Ag, 刺激机体产生HCV-A b, 几乎所有的游离H C V-A b与结合成免疫复合物, 此时抗原过量, 而酶联免疫法只能检测游离状态的HCV-Ab或HCV-c Ag, 因此HCV-Ab检测为阴性, HCV-c Ag为阳性[3]。随着病程的进展, HCV-Ab的浓度升高, 游离的HCV-c Ag浓度下降, 抗体与抗原结合后, 机体内仍存在一定浓度游离的HCV-Ab, 可被酶联法检测出来, 此时HCV-Ab和HCV-c Ag的检测均为弱阳性。
病程的进一步发展, HCV-Ab继续升高, 体内绝大部分的HCV-c Ag与HCV-Ab结合形成免疫复合物, 游离的HCV-c Ag低于检测下限转为阴性, 而HCV-Ab的浓度进一步升高, 检测才为阳性。因此, 在感染早期仅仅单纯依靠HCV-Ab的检测进行筛查及早期诊断丙型肝炎感染就有很大局限性。本文260例HCV-Ab阴性的临床样本中, 检出HCV-c Ag阳性5例。表明有1.9%的患者因在“窗口期”测不出HCV-Ab而被漏诊。本实验应用的湖南景达基因公司生产的ELISA试剂, 是采用单克隆抗体制备的, 加之其已对样本稀释液进行了改进, 使待测血清中丙型肝炎病毒的外壳破坏较完全, 核心抗原暴露, 保证抗原抗体能充分接触, 从而提高了检测的敏感性, 并且ELISA法简便、快速, 几乎所有的实验室无需再增加特殊设备即可进行检测。
260例HCV-Ab阴性中, 检出HCV-c Ag阳性5例, 其中HCV-PCR 4例。反转录多聚酶链反应 (RT-PCR) 是一个非常敏感的方法, HCV-RNA暴露后的1~2周就可被检出[4]。在某些HCV感染恢复期的患者或免疫功能低下的HCV感染者中, HCV-Ab可能会逐渐下降到检测限以下[5]或持续阴性, 这时, HCV-RNA的检测是感染HCV的惟一证据。在被测的80例丙型肝炎样本中HCV-c Ag阳性33例, HCV-RNA阳性47例, 符合率为70.21% (33/47) 。由于RT-PCR技术较复杂, 对试验环境和条件的要求较高, 还有较多实验室不能接受和推广, 而HCV-c Ag也是HCV感染者体内出现较早的感染标志, 几乎与HCV-RNA同时出现, 因此丙型肝炎抗原不失为早期检测是否感染丙型肝炎的最佳手段之一。
综上所述, HCV-c Ag检测可作为HCV-Ab检测的补充试剂, 联合应用可大大提高丙型肝炎的诊断率, 还可应用于输血筛查, 降低检测成本, 但其敏感性和特异性有待提高。
参考文献
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肝炎核心抗原 篇4
HCV基因组为单股正链RNA,约9.4 kb,编码一个3010～3033氨基酸的多聚蛋白,排列顺序为5’UTR-C-E1-E2-NS2-NS3-NS4-NS5-3’U TR。由于血清中HCV抗原量很少,很难直接对其进行检测,只能通过免疫学方法检测抗体和用PCR技术检测病毒RNA的存在。检测抗体存在的ELISA试剂盒由于使用方便,已经得到广泛应用。1989年的第一代试剂盒采用重组抗原C100-3[1],第二代试剂盒则加入C22、C33c、5-1-1,第三代试剂盒又加入了NS5区域的抗原[2]。这些抗原分别位于相对保守的C区、NS3区、NS4区和NS5区。利用基因工程技术,将多个优势表面抗原肽基因融合表达,则可以省去分别表达、纯化单个抗原的烦琐操作,而且可以达到诊断试剂盒所要求的等摩尔比混合[3]。例如,CHIEN等表达了融合抗原C25[4],沈小川等表达了3价抗原[5],都表现了良好的抗原性和特异性。
本研究首先通过重叠延伸PCR技术(overlap extension PCR,OE PCR),把含HCV截短C基因、NS3基因、NS4基因和NS5基因的优势表位基因串联,组成HCV复合多表位融合基因,构建入原核表达载体pBVIL-1,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化,初步分析其抗原性和免疫原性,为HCV临床检测提供理想的诊断抗原奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
HCV抗原阳性血清由湖南景达生物工程有限公司君山浆站提供;表达载体pBVIL-2为军事医学科学院张贺秋教授惠赠;PrimeSTARTM HS DNA polymerase、p MD18-T Vector、限制性内切酶Xba I和Xho I、T4 DNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;羊抗人IgG购自Sigma公司;菌株JM109为本实验室保存。HCV抗体检测试剂盒购自上海科华生物技术公司,HCV抗原检测试剂盒购自北京万泰公司,其余化学试剂为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 OE-PCR法拼接和扩增HCV嵌合基因片段
采用Bio Sun3.0生物软件分析HCV(AB492206.1)氨基酸序列的抗原表位,选取带有优势抗原表位区域的4段HCV多肽(包括核心区、NS3区、NS4区和NS5区),找出对应碱基序列,设计引物8条,分别为HCV-core-F:TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C;HCV-core-R:GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG;HCV-NS3-F:CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC;HCV-NS3-R:GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC;HCV-NS4-F:GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC;HCV-NS4-R:GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC;HCV-NS5-F:GCG CGT GTTACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC;HCV-NS5-R:CAC TCG GGC ACA GGG AAGTTT GGC CTT GAC。引物由上海生工合成。然后用逆转录PCR的方法从HCV阳性血清中扩增出HCV-core、HCV-NS3、HCV-NS4、HCV-NS5 4段目的基因。将PCR产物用DNA产物纯化试剂盒纯化,然后取等量的各种DNA加入PrimeSTARTM HSDNA polymerase的PCR反应体系中,在不加任何其他引物的情况下反应5-7个循环(98℃10s,68℃1.2 min);然后向该PCR体系中加入设计有酶切位点的引物HCV-core-F和HCV-NS5-R,继续反应30个循环,取产物5μL进行1.7%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.2 原核表达载体的构建与鉴定
将拼接扩增好的HCV嵌合基因加A尾,然后克隆到pMD18-T载体上,克隆入pMD18-T载体。用限制性内切酶Xhol、XbaⅠ同时双酶切带有融合基因片段的pMD18-T质粒和表达载体pBVIL-1,用DNA电泳凝胶回收试剂盒回收融合基因片段和pBVIL-1载体片段。载体片段与插入的核心片段连接后,转化大肠杆菌JM109,进行蓝白筛选。阳性克隆经限制性内切酶分析正确后,送上海生工测序以确保阅读框的正确。
1.2.3 HCV嵌合抗原的诱导表达
将筛选到的阳性克隆菌株接种于LB培养基中(含氨苄青霉素50μg/m L),37℃振荡培养过夜。然后按照1∶50的比例接种到100 m L LB培养基中(含氨苄青霉素50μg/m L),37℃振荡培养3～4 h;再按照1∶20的比例接种到1 000 m L LB培养基中(含氨苄青霉素50μg/m L),37℃振荡培养到A600值为0.6时,转入42℃水浴箱振荡诱导目的蛋白表达3h后,收集1m L菌液,12 000 r/min离心2 min。沉淀重悬于400μL的1×SDS上样缓冲液中,沸水浴5 min,取20μL进行15%SDS-PAGE胶电泳。
1.2.4 HCV嵌合抗原的诱导表达时间选择和纯化诱导表达时间选择
分别取诱导表达前和诱导表达2 h、4 h、6 h菌液各1 m L,12 000转离心2 min。沉淀重悬于400μL的1×SDS上样缓冲液中,煮沸5min,取20μL进行15%SDS-PAGE胶电泳,确定HCV嵌合抗原表达的最佳诱导时间点。HCV嵌合抗原的纯化:将500 m L的表达菌,5 000 r/min离心10min,收集菌体。将菌体悬浮于100 m L缓冲液bufferⅠ(50 m M Tris,100 m M Na Cl,2 m M EDTA,pH7.2),加溶菌酶100 mg/100 m L,充分混匀,搅拌30min,溶液变得粘稠,加入脱氧胆酸钠,搅拌30 min,加入DNA酶至终浓度为5μg/m L,搅拌60 min,400W超声波破碎菌体15 min,然后5 000 r/min,4℃离心10 min收集沉淀,于沉淀中加入bufferⅡ(2.5M Urea,2%(V/V)Triton X-100,10 m M Tris,pH7.2),充分洗涤3次,5 000 r/min,4℃离心15 min收集沉淀并溶于8 M脲/25 m M TE(pH7.2)溶液中。然后将该包涵体进行DEAE离子交换柱分离,用洗脱缓冲液:(8M Urea,20 m M Tris-HCl,0.05-1 M NaCl,p H 7.2)洗脱目的蛋白,再用分子筛凝胶柱(Sephacryl S-300)纯化,并将纯化产物超滤离心透析到1×PBS复性蛋白。最后,用15%SDS-PAGE胶鉴定。
1.2.5 Western blot检测表达蛋白
将纯化蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,然后将蛋白质进行电转移至NC膜上(转移条件为恒流100 V,1 h)。用丙型肝炎阳性患者血清作为一抗,HRP-羊抗人IgG作为二抗,DAB(0.6 g/L)显色,至目的条带染色清晰时终止反应。
1.2.6 融合蛋白的抗原性的初步鉴定
把纯化的HCV融合抗原作适当稀释包被酶标板,用牛血清白蛋白封闭,分别加入10μL人丙肝阳性血清或阴性血清和90μL PBS,37℃接触反应30 min,洗涤后再加入稀释的过氧化物酶标记的羊抗人IgG反应(40℃,20 min),用TMB显色,用DG3022A型酶标仪用610μm波长滤光片测定OD值。
2 结果
2.1 HCV嵌合基因的拼接和扩增
如图1A所示,重叠延伸PCR拼接和扩增的嵌合基因大小为747 bp,符合HCV嵌合基因的预期结果。阳性克隆经Xba I和Xho I双酶切鉴定结果表明(图1B),嵌合基因大小正确,测序结果表明,所插入的目的基因片段的阅读框正确,阳性克隆命名为pBVIL-1/c-ns5。
2.2 HCV嵌合抗原的诱导表达
原核表达载体pBVIL1是一种温度诱导型原核表达载体,它包含质粒pBV220的大部分序列和经改造的IL-1β基因,含有起始密码子ATG、终止密码子TAA和内切酶点Xho I和Xba I,具有高效表达目的蛋白和抗原佐剂(经改造的IL-1β部分)的作用[6]。我们构建的原核表达载体表达的HCV嵌合抗原理论分子量大约为27.5KD。根据图2所示,诱导表达后较诱导表达前在约43KD处有一明显的蛋白成分(图2),与预期分子量一致(27.5 kb+16 kb的IL-1β部分),表达产物主要以包涵体的形式存在。蛋白印迹分析表明,表达产物与抗HCV抗体有特异反应(图3)。
2.3 HCV嵌合抗原的诱导表达时间选择和纯化
为了确定HCV嵌合抗原的最佳表达时间点。我们分别取诱导2、4和6 h三个时间点诱导表达的细菌培养液,SDS-PAGE结果表明(结果未显示):HCV嵌合抗原表达量无明显差异,我们选择诱导表达3h为大量诱导表达的时间点,因为此时菌体浓度较高,蛋白的降解较少。500 m L表达菌,经超声波破菌后,收集包涵体。将包涵体溶于结合缓冲液中,过045μm微孔滤膜后,依次进行DEAE柱和分子筛凝胶柱(Sephacryl S-300)纯化,经过BCA试剂盒分析蛋白含量约为886μg/m L。
2.4 表达产物的抗原性的初步鉴定
将p BVIL-1/c-ns5的表达全菌液及纯化的表达产物,经蛋白印迹分析,发现它们均可以和抗HCV阳性血清发生明显的特异反应(图3)。说明重组的嵌合抗原具有良好抗原性。
2.5 抗原活性分析
用纯化的目的蛋白包板,间接ELISA检测HCV内质控阳性血清。结果表明,在10份已知慢性HCV患者血清中检出阳性10份,A值均数为2.0028,阳性率100%;作为对照的5份HBs Ag阳性血清、5份正常人HCV阴性血清与嵌合蛋白进行的ELISA结果均呈阴性反应,A值均数为0.0677。上述结果说明,表达的嵌合抗原具有良好的免疫原性和特异性。
附表纯化嵌合蛋白的ELISA检测结果
3 讨论
目前,市售的HCV ELISA检测试剂盒所用抗原主要是基因表达和多肽合成,有单独使用,也有混合使用,主要包括了核心及NS3、NS4、NS5抗原。由于4种抗原按不同比例混合,有时因比例匹配不合适而影响检测的灵敏度和特异性,出现漏检,因此,多个抗原表位的融合表达,是提高抗原的覆盖面,增加检测灵敏度的有效方法。以前报道嵌合基因的连接多是采用人工合成的短接头,或在拼接基因相连引物中设计一个相同的酶切位点进行连接,该方法操作复杂,且要求连接的各种成分能够形成各自正常的空间结构,以保持天然活性。因而连接肽的长度、所选氨基酸的组分及其伸展性或活性基团能否充分暴露等都是关键。本文采用重叠延伸PCR技术(OEPCR)拼接嵌合基因,在连接肽中不必因设计限制性酶切位点,而引入不必要的氨基酸残基,快速构建了含有核心及NS3、NS4、NS5片段的嵌合基因。由于此技术是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组,因此不需要内切酶消化和连接酶处理,是一种高效快速获得融合基因的好方法。通过Bio Sun3.0生物软件分析HCV氨基酸序列的优势抗原表位,我们选取HCV-core(60-100aa)、HCV-NS3(1000-1105aa)、HCV-NS4(1917-1947aa)、HCV-NS5(2383-2502aa)共4段多肽进行嵌合。本文构建了含有区、NS3区、NS4区和NS5区的表面优势抗原基因的融合表达质粒pBVIL-1/c-ns5。在不降低其免疫活性的基础上,尽量减少其蛋白分子量,可使得其在大肠杆菌中易于表达,并增加蛋白稳定性。
目前,用于第3代EIA和RIBA HCV诊断试剂盒主要包含C区、NS3区、NS4区的抗原,有的也包含NS5区的抗原。Core、C33抗原在抗原反应性上有很好的互补性。其联合检出率平均值可在99%左右,是研究HCV诊断试剂的重点区段。此外,抗Core、C33c抗原的抗体发现得较早,而NS4区抗原的抗体出现较晚,抗-NS5抗体的检出率仅为59.3%,明显低于核心(92.1%)、NS3(88.1%)和NS4(83.6%),同时假阳性率较高[7,8]。因此,我们采用了石理兰等[9]人的方法,用小分子多肽((2383～2502aa)替代大分子的NS5蛋白抗原。对10分HCV阳性血清的ELISA结果表明其特异性很好。
本研究采用的表达系统为pBVIL-1融合表达系。为pBV220表达载体融合了IL-1β基因后构建而成。含有pBV220表达载体PRPL热诱导启动子,可以进行热诱导表达。同时由于IL-1β具有免疫增强活性,IL-1β分子中具有一极短肽能增强免疫,可起免疫佐剂的作用。本文用IL-1β进行融合表达,也希望能发挥其免疫增强作用,为实现抗原抗体的联合检测奠定了基础。
摘要：目的表达HCV核心蛋白Core、非结构区NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的融合基因,为丙型肝炎病毒的检测提供合适抗原。方法通过RT-PCR从HCV全长基因组中分别克隆Core、NS3、NS4和NS5区的部分优势表面抗原的基因片段,运用重叠延伸PCR技术将它们拼接成融合基因,将融合基因再克隆到表达载体pBVIL-2中,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆经42℃热诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。重组蛋白经阳离子交换和分子筛纯化。结果42℃诱导可高表达分子量约为43kD的融合抗原,重组蛋白主要以包涵体形式存在。经过纯化目的蛋白纯度达90%以上的,表达量约为886μg/mL。ELISA结果表明纯化蛋白具有良好的抗原性。结论HCV复合多表位抗原融合蛋白可作为HCV诊断抗原提供了靶抗原。
关键词：丙型肝炎病毒,蛋白表达,抗原检测
参考文献
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肝炎核心抗原 篇5
1.1 对象
1999~2008年新生体检者共31875人, 其中男生18967人, 女生12908人。
1.2 方法
用酶联免疫吸附法检测HBs Ag, 试剂由北京科卫临床诊断试剂有限公司提供, 对于检出阳性者, 用艾康生物技术杭州有限公司提供的乙肝表面抗原胶体金诊断试纸复检, 两次结果均为阳性者方可发出阳性报告。
1.3 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件进行分析, 采用χ2检验进行显著性检验。
2 结果
不同年度HBs Ag阳性率:10年来新生阳性率为4.5%, 且呈逐年递减趋势, 其中2008年阳性率为3.3%, 与1999年阳性率6.2%相比, 差异有显著意义 (P<0.01) 。
不同性别HBs Ag阳性率:男生阳性率为4.9%。女生阳性率为3.9%。男生乙肝表面抗原的阳性率普遍高于女生, 且二者阳性率存在显著差异 (P<0.01) 。
3 讨论
由于HBs Ag病毒广泛存在于携带者的血液、唾液、乳汁、泪液、汗腺、鼻咽分泌物、阴道分泌物及精液中, 因此乙肝病毒携带者是乙型肝炎的重要传染源。鉴于此, 自1999~2008年, 我们对大连大学新生进行了HBs Ag检测, 结果显示, 10年来, 阳性者占总人数的4.5%, 低于全国平均感染率9.75%, 而且阳性率呈逐年递减的趋势。这是由于, 随着社会的进步, 在中、小学中注射乙肝疫苗已经普及, 多数人因此而产生抗体, 感染乙肝病毒的几率自然就下降了。另外, 从性别上看, 男性HBs Ag阳性率高于女性 (P<0.01) , 可能是由于男性社交活动较高, 感染机会较大所致[2]。也有学者推测, 可能与性激素的作用有关, 并认为女性激素有促进机体对乙肝病毒的免疫作用, 有利于机体消除带毒状态[3]。
学校是人群密集的地方, 学生入学后要集体生活, 所以作为学校医务工作者, 除了严格做好乙型肝炎的检测工作之外, 还要通过宣传教育的方式将乙肝的相关知识提供给学生, 宣传的内容包括乙肝的传播途径及预防: (1) HBs Ag阳性者的牙具、刮面刀应严格分开, 防止唾液、血液及其他分泌物污染环境, 感染他人; (2) 双阳性 (HBs Ag、HBe Ag) 的女性要注意经期卫生, 严防月经血迹污染手和日常生活用品; (3) 单纯HBs Ag阳性或兼有抗-HBe阳性者, 可正常学习、工作, 但不能承担献血义务。乙肝患者日常生活应注意: (1) 戒烟、酒; (2) 养成良好的生活习惯, 避免过劳和超负荷工作; (3) 预防再次感染, 定期复查肝功; (4) 饮食多以低蛋白、少脂肪、易消化、富含维生素为主, 注意补充水分。
参考文献
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[2]许雅.伍碧雯.汪保国, 等.6671例HBV感染者五种标记物分析[J].中国卫生检验杂志, 2000, 10 (6) :737～739.
肝炎核心抗原 篇6
1 材料与方法
1.1 观察对象
1178例HBs Ag (-) 、HBV-M (+) 的人员分别来自本院2000年3月至2008年1月门诊、住院肝炎患者和查体人员。
1.2 治疗方法
观察组服Lamivudine 0.1 qd, 对照组服用益肝灵77mg tid。服药后6个月分别检查观察指标, 停药。12月复查。
1.3 试剂和设备
乙型肝炎病毒 (HBV) 核酸扩增 (PCR) 荧光检测试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心提供。应用美国Perkin Elmer公司生产PE5700型全自动荧光定量PCR仪检测;乙型肝炎RIA试剂盒由北京北方免疫所提供, 应用FM--2000免疫计数器检测;血生化试剂盒由北京中生公司提供, 应用OLMPUS AU560生化分析仪检测。
1.4 观察项目
(1) HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe、抗-HBc;HBV-DNA定量PCR;ALT、AST、r-GT、TBIL;HA、C-IV等项目。 (2) 结果判断:HBV-DNA≥1×103copy/m L为阳性, ALT、AST正常两倍为异常、其它指标>正常上限为异常。HBVDNA短期内复查两次或以上, 仍为阳性者方定为HBs Ag (-) 的HBV感染。 (3) HBVDNA阳性的肝炎患者排除甲、乙、丙、丁、戊、柯萨奇、埃柯等病毒性肝炎和其它肝脏疾病。 (4) 肝炎的诊断标准按2000年西安会议制定的《病毒性肝炎防治方案》 (试行) 标准执行。
P<0.05
1.5 统计学处理
计数资料用χ2检验, 计量资料用t检验。
2 结果
1178例共检出65例HBV-DNA (+) 者, HBV-DNA总体阳性率5.52%。年龄4~71岁, 平均年龄 (31.29±15.63) 岁。男22例, 女43例, 男女比例1∶1.95, 与HBs Ag (+) 乙型肝炎病毒携带者和乙型肝炎患者的男女比例 (综合资料:男女比例2.62∶1) 相反。慢性肝炎24例, 肝硬化3例、肝癌术后1例。HBV-DNA定量检查结果1.00×103~6.70×105copy/m L;肝功ALT 19~391IU/L, 平均 (88.68±134.54) IU/L, AST 17~122 IU/L, 平均 (37.36±32.51) IU/L;r-GT15~103 IU/L, 平均 (28.38±29.54) IU/L;TBIL5~113mol/L, 平均 (15.01±24.29) μmol/L。65例患者肝功能总体异常率43.08%。
本实验观察到HBs Ag阴性HBV-M阳性的血清学模式有: (1) 抗-HBs (+) 、抗-HBe (+) 、抗-HBc (+) , (2) 抗-HBc (+) , (3) 抗-HBe (+) 、抗-HBc (+) , (4) 抗-HBs (+) 、抗-HBe (+) , (5) 抗-HBe (+) , (6) 抗-HBs (+) 、抗-HBc (+) 。各种模式所占比例分别是16.92%、43.08%、24.62%、6.15%、7.69%和1.54%。65例患者分为两组, 35例为观察组, 两例由于年龄较小未坚持服药, 实际结果观察组为33例;对照组30例。
6个月复查, 治疗组HBV-DNA转阴率96.97% (32/33) , 对照组HBV-DNA转阴率26.67% (8/30) 。肝功能治疗前后对照见表1。
1年复查, 治疗组HBV-DNA阴转的患者中2例HBV-DNA转阳, 1例HBs Ag低滴度转阳, 1例时阴时阳;对照组HBV-DNA阴转的患者中2例HBV-DNA复转阳。Lamivudine可以降低治疗组HA、C-IV, 结果差异有显著性。检查结果见表2。
P<0.05
3 讨论
乙型肝炎五项是检查HBV感染的常见和有效的指标, 在临床上广泛使用。包括献血和器官供应人员的筛选, 亦应用较为广泛。但临床上发现有些受血和器官接受患者, 在输血和器官移植后有乙型肝炎发生的可能性。考虑是由于“沉默”乙型肝炎病毒引起的。
血清中未检测出的HBs Ag并不能排除乙型肝炎病毒感染。早就认识到仅单一抗HBc标志物的血液有时亦可传播乙型肝炎。应用分子杂交技术检查血清、肝组织以及外周血单个核细胞, 已经确定HBV感染可能出现HBs Ag (-) 。近年来, 由于聚合酶链反应技术广泛应用, 籍其高度的灵敏性, HBs Ag (-) 的HBV感染, 已得到更多的证实我国是HBV感染的高流行区, HBs Ag (-) 的HBV感染也不少见, 许多血清HBs Ag (-) 的慢性肝炎患者, 也可在肝组织中检出HBV-DNA或HBs Ag。临床上诊断的非甲~戊型肝炎, 在我国可能更多的是血清学阴性的HBV感染。
世界许多地区都报道过HBs Ag (-) 的HBV感染, 流行率较难估计。骆抗先等报告, 单-抗HBc阳性者中HBV-DNA检出率28.6%~35.6%。吕矫健等报道抗-HBs (+) , 肝功能反复异常者, 经肝活检免疫组化和血清HBV-DNA检测证实39.7%患者系HBV感染。说明我国存在HBs Ag (-) HBV感染的高流行率。我国的肝患者群基数较大, HBs Ag (-) HBV感染可能占相当部分。在武汉地区HBs Ag (-) 的各类慢性肝炎中, 25%的肝炎患者可检出血清HBV-DNA。在广东临床诊断的急性非甲非乙型肝炎, 近半数是这种HBs Ag (-) HBV感染;慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌中, 仅约10%不能检出HBs Ag, 但其大部分仍是HBV感染。尽管供血员筛选非常严格, 但在HBs Ag (-) 的输血后肝炎中仍有少数是乙型肝炎., HBs Ag (-) HBV感染者可以通过器官移植传播病毒。也可以导致肝移植失败。
不能表达HBs Ag的HBV毒株可能的分子特点有: (1) HBV整合分子中S基因启动子缺失。 (2) S基因122、125、127、131、134、143、159和161密码子可发生转变, 使得氨基酸发生了改变。表面基因的突变可以导致表面抗原的产生大大降低或完全停止。 (3) 前S2蛋白的AA9-12缺失。 (4) 共同a决定簇必须的最小序列 (AA139-147) 中氨基酸发生了替代。 (5) 共同a决定簇前插入。 (6) 外膜珠蛋白序列中散在错义突变。 (7) P基因变异, 降低HBV的复制水平, 低滴度HBV感染HBs Ag难检出。HBs Ag (-) HBV感染水平多数较低, 但却是稳定的, 大多数病例从开始既是HBs Ag (-) , 似不是在HBV感染恢复期中HBs Ag才消失的。约半数患者可持续检出乙型肝炎病毒, 1/3可间歇检出、表明HBV可以长期持续低水平复制。而且, 应用更灵敏的方法检测, 有些病例HBs Ag是阳性的。本组有的病例HBs Ag在血清中时隐时现亦与表面抗原持续低滴度复制有关。
本组病例43.08%的患者肝功能异常;33.33% (21/63) 的患者HA或C-IV异常。表面抗原阴性的HCC患者亦可发现HBV-DNA的存在。因此, HBs Ag (-) HBV感染可以引起肝脏的炎症, 甚至引起肝脏纤维化、肝硬化和肝癌。
本研究发现HBs Ag (-) HBV感染者以女性多见。男女比例1∶1.95, 与乙型肝炎病毒携带者和乙性肝炎患者的性别比例相反, 与HBs Ag (-) HBV-DNA (-) HBV-M (+) 的查体人员 (男女比例1.67∶1) 亦相反。说明女性患者更易表现为HBs Ag (-) HBV感染状态。HBV总感染率男女间相近, 只是性别间某些因素的差异能够影响HBV感染后的转归, 使男性感染后易形成ASC, 易形成肝炎, 发生肝炎后易于发展成慢性肝病。
Lamivudine可以迅速降低血清中的HBVDNA拷贝, 治疗1个月96.97% (32/33) 的患者HBV-DNA拷贝数即降到103以下。应用Lamivudine 6个月即可达到较长时间的HBV-DNA (-) 结果。而且, 能较长时间内保持HBV-DNA阴性。可能与乙型肝炎病毒的低复制能力低有关。患者的肝功和纤维化指标也相应好转。
因此, HBs Ag (-) HBV感染是乙型肝炎中不可忽视的特殊群体, 患者以女性居多, Lamivudine可以迅速降低HBs Ag (-) 乙型肝炎患者HBVDNA的滴度, 并较长时间保持稳定。由于HBs Ag (-) HBV感染者可以成为乙型肝炎病毒的传染源。因此, 应提倡改善献血员乙型肝炎的检查项目, 应用更灵敏的方法 (例如用PCR) 筛选, 以避免HBV的输血传播。
参考文献
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肝炎核心抗原 篇7
1 临床资料
1.1 一般资料
56例中男43例, 女13例;年龄15～70岁, 平均35岁。所有病例无其他继发性肾炎, 如狼疮性肾炎、过敏性紫癜性肾炎等。肾组织HBV抗原阳性25例 (44.6%) , 其中男21例, 女4例, 平均年龄34岁;设为阳性组。肾组织HBV抗原阴性31例 (55.4%) , 其中男22例, 女9例, 平均年龄36岁;设为阴性组。本文中肾组织H B V抗原阳性指肾组织中乙肝表面抗原 (H B s A g) 、e抗原 (H B e A g) 、核心抗原 (H B c A g) 之一阳性。
1.2 两组疾病进程及肝肾功能情况 (表1)
由表1可见, 两组单纯血尿、慢性肾炎、肾病综合征, 肝、肾功能异常的发生率差别不明显, 差异均无统计学意义。
1.3 两组病理类型比较 (表2)
由表2可见, 阳性组的病理类型以膜性肾病和IgA肾病为主, 阴性组的病理类型以IgA肾病为主。两组的IgA肾病构成比和膜性肾病构成比, 差异有统计学意义。
1.4 两组免疫荧光检测结果比较 (表3)
由表3可见, 阳性组肾组织中以C3沉积阳性率最高, 其次为IgM、IgG、I g A, 阴性组中以I g M沉积阳性率最高, 其次为C3、I g A。两组中以C3、I g G及C 1 q的沉积阳性率组间差别较大, 差异有统计学意义。
1.5 两组血清乙肝病毒标志物阳性情况 (表4)
由表4可见, 阳性组血清H B e A g阳性率明显高于阴性组, 而HBeAb阳性率则明显低于阴性组;两组间比较, 差异有统计学意义。
1.6 两组肾组织病变程度比较 (表5)
由表5可见, 阳性组的肾小球与肾小管间质的病变程度均高于阴性组, 两组间比较差异均有统计学意义 (χ2=1 3.30、16.26, P<0.01) 。
1.7 阳性组H B s A g与H B c A g在肾组织不同部位的沉积情况 (表6)
阳性组25例肾组织中HBsAg全部阳性, H B c A g阳性16例 (6 4.0%) 。
由表6可见, HBsAg在肾小球沉积共22例 (88.0%, 22/25) , 在肾小管及间质沉积仅3例;而HBcAg在肾小管及间质沉积12例, 在肾小球沉积仅4例。两者主要沉积部位差异有统计学意义 (χ2=16.69, P<0.01) 。
2 讨论
本组资料显示, 乙肝肾炎的主要病理类型为膜性肾病、IgA肾病、膜增殖性肾炎, 与文献报道一致[1]。肾组织IgG、C3的沉积阳性率明显高于阴性组, 而阴性组的主要病理类型为IgA肾病。这说明, 同为血清HBV阳性的肾炎, 两者的发病机制是不同的。目前乙肝肾炎的主要发病机制有3种假说: (1) H B V抗原抗体复合物致病; (2) H B V直接感染肾脏细胞致病; (3) H B V感染引起自身免疫反应致病。根据本组免疫荧光结果推测, 免疫复合物沉积后补体的激活可能是乙肝肾炎的主要发病机制。本组肾脏组织内存在H B c A g, 而通常H B c A g不存在于血液循环中, 提示H B V在肾脏组织内原位复制, 亦支持HBV直接感染肾脏细胞致病的假说。
在生化检查方面, 两组患者肝、肾功能的差异没有统计学意义。因此笔者认为, 肝、肾功能的检查不能用于区分血清HBV阳性患者是否属于乙肝肾炎。我们同时发现, 阳性组血清HBeAg的阳性率明显高于阴性组患者, 而H B e A b的阳性率却远低于阴性组患者。笔者推测, HBV活跃复制是导致乙肝肾炎的重要环节。
H B V感染与I g A肾病发病的关系目前尚有争论, 然而不少学者对此持肯定态度。Lai等发现在HBV流行率高的地区, I g A肾病的发病率也高, 而且H B V抗原血症发生率IgA肾病患者高于普通人群;免疫组化技术检测肾组织HBsAg的阳性率可高达40%, 且沉积部位与IgA一致。本组IgA肾病占了所有病理类型的46.4% (26/56) , 提示H B V感染可能与I g A肾病的发病关系密切。
卫建平等[2]发现, HBcAg在肾小管沉积的阳性率较肾小球更高, 表明病毒可以直接感染肾小管上皮细胞而致病, 循环携带不是唯一途径, 本组结果支持这一观点。本组资料显示, 肾组织HBV阳性组在肾小管、间质病变方面均比阴性组严重。笔者分析, 这可能与H B c A g更易在肾小管间质沉积从而直接感染肾小管上皮细胞致病等有关。
已有研究证实[3], HBV感染参与了多种原发、继发性肾小球肾炎的发病, 如膜性肾病、膜增生性肾炎、IgA肾病, 以及狼疮性肾炎等。因此, 临床上乙肝肾炎的诊断有一定困难。而且临床上, 并不是每个肾小球肾炎患者都进行肾活检并作肾组织的H B V检测, 尤其是外周血H B V阴性者。
参考文献
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肝炎核心抗原 篇8
1 对象和方法
1.1 对象
女性婚前检查对象均为2012年在玉林市7县市区进行婚前医学检查者, 包括北流市、容县、博白县、兴业县、陆川县、玉州区、福绵区。
1.2 方法
对2012年玉林市女性婚前乙型肝炎病毒表面抗原检测分区域进行统计分析, 资料由玉林市妇幼保健院信息科提供。
2 结果
2012年玉林市7县市区55 070例女性婚前检测乙肝表面抗原, 阳性6 709例, 检测阳性率为12.18%。见表1。
3 讨论
玉林市女性婚前检测乙肝表面抗原检测阳性率为12.18%, 阳性率最高为博白县15.25%, 最低为玉州区8.73%。女性婚前检测乙肝表面抗原可为母婴传播阻断措施提供有价值的医学信息, 加强孕前、孕期、分娩时及新生儿期母婴传播的预防措施, 以降低下一代乙型肝炎病毒感染, 提高人口素质。玉林市女性婚前检测乙肝表面抗原阳性检测率, 高于孙君香等[1]报道的威海市环翠区女性婚前乙肝病毒携带者检出率4.95% (163/3 294) , 与彭桂玲[2]报道的湘乡市女性婚前HBsAg阳性率9.27% (2 447/26 397) 接近, 玉林市女性婚前检测乙肝表面抗原阳性率相对较高。
乙型肝炎病毒感染可通过母婴传播, 女性承担着孕育下一代的重要任务, 优生优育应从婚前开始, 为孕期、分娩期及新生儿期阻断母婴传播提供有价值的信息, 对乙肝感染孕产妇所分娩的新生儿出生后及时注射乙肝免疫球蛋白、接种乙肝疫苗, 能有效地阻断乙肝的母婴垂直传播[3]。乙型肝炎病毒感染母亲能否母乳喂养存在争议, 倡导母乳喂养的学者认为能通过母乳喂养母婴传播的机会少, 母乳又是婴儿期最佳食品, 完全可以满足4个月~6个月婴儿的生长需要, 不能因噎废食。不支持母乳喂养的学者认为乙型肝炎病毒可以通过母乳传播, 新生儿的免疫功能又差。还有学者认为要检查母亲血液及母乳, 当乳汁不含乙型肝炎病毒才能母乳喂养。根据马庆海等[4]报道, HBsAg阳性产妇血液HBV-DNA阳性率为62.3% (135/220) , HBV-DNA阴性率为38.64% (85/220) ;血液HBV-DNA阴性产妇的初乳、半月乳及满月乳HBV-DNA均阴性, HBV-DNA阳性产妇初乳HBV-DNA检测阳性率为19.3% (26/135) , 提示HBsAg阳性产妇乳汁中可检测到HBV-DNA者仅为少数。
参考文献
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