多重定量PCR（共7篇）
多重定量PCR 篇1
有研究表明,端粒长度是生物学老化的标志[1],端粒缩短被认为与多种心脑血管病的发生及进展有关[2,3,4,5]。端粒长度的测定方法最早由Harley等[6]在1990年提出,即通过Southern blot测定末端限制性片段(TRF)的长度,该方法虽然过程繁琐,所需DNA量大,但至今仍是端粒长度测量方法的“金标准”。随后人们提出了定量荧光原位杂交(Q-FISH)[7]和建立流式荧光原位杂交(Flow-FISH)[8](流式荧光原位杂交)。2002年,Cawthon[9]首创了荧光定量PCR测定端粒相对长度的方法,即通过计算端粒拷贝数(T)与单拷贝基因拷贝数(S)的比值T/S来反映平均端粒长度,但该方法中端粒DNA和单拷贝基因的扩增是在不同的反应管中进行,使得模板起始量的不同对结果的变异产生重要影响,为解决这一问题,2009年,Cawthon[9]还提出了单色多重定量PCR方法(MMQPCR)[10]。该方法对荧光定量PCR仪有一定要求,即能够在一个循环中两次收集SYBR Green荧光信号,而国内外实验室使用较多的ABI系列如7900HT、7700等无此功能。因此,目前研究者仍普遍采用Cawthon[11]于2002年提出的定量PCR方法测定端粒长度。罗氏480(Light Cycler480)荧光实时定量PCR仪被广泛应用于诊断和研究,但文献中较少见到其被用于测定端粒长度[11,12,13],本文参照Cawthon[9]2009提出的MMQPCR,优化实验中的参数,阐述在罗氏480实时定量PCR仪上建立MMQPCR的过程,并与传统的Southern blot方法测量平均TRF长度作相关性分析。
1 材料与方法
1.1 材料
实验标本选自2013年11月1~30日南京医科大学附属淮安第一医院(以下简称“我院”)检验科体检者的肘静脉新鲜EDTA抗凝血2 mL,共40例,其中男19例,女21例,年龄38~79岁,平均(61.46±11.58)岁。本研究获得我院医学伦理委员会审查通过,所有入选者均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度
使用富士核酸提取系统提取基因组DNA,操作严格按照说明书进行。微量紫外分光光度计测DNA的浓度与纯度,OD260/280为1.7~1.9为合格,记录DNA的浓度。使用TB缓冲液将待测样本DNA浓度稀释至7 ng/μL,任意选取一样本作为标准品,使用Milli-Q超纯水按1︰2.5的比例将标准品DNA浓度依次等比稀释为45、18、7.2、2.88、1.152 ng/μL,并放于-20℃冰箱保存备用。端粒长度的测定参照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反应使用的引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,序列如下:telg 5′-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3′;telc 5′-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3′;hbgu 5′-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3′;hbgd 5′-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3′。反应体系:SYBR GreenⅠMaster(罗氏公司)7.5μL,样本DNA 5μL(待测样本DNA含量为35 ng,标准品含量依次为225、90、36、14.4、5.76 ng),端粒引物telg、telc终浓度均为500 nmol/L;单拷贝基因引物HBGU、HBGD终浓度均为200 nmol/L。反应在同一块384孔板上进行,标准品和待测样本均设置3复孔,另外设置以相同体积的超纯水作为DNA的阴性对照,亦为3个复孔。使用仪器为Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)。反应条件为Ⅰ:95℃15 min;Ⅱ:94℃15 s,49℃15 s,2个循环;Ⅲ:94℃15 s,62℃10 s,74℃15 s,84℃10 s,85℃15 s,38个循环。反应结束后建立熔解曲线。从Light Cycler480v1.5拷出原始数据,使用软件“Conversion from Light Cycler480 to LinReg PCR”将其转换并导入Lin Reg PCR(v12.15)软件进行分析。
1.2.2 Southern blot测量平均TRF长度
实验前进行琼脂糖凝胶电泳检验待测DNA的完整性,使用罗氏试剂盒Telo TAGGG Telomere Length Assay(罗氏公司)完成平均TRF的测定,琼脂糖、尼龙膜亦购于该公司,实验参照试剂盒提供的步骤进行。具体为:限制性内切酶Hinf I和Rsa I酶切基因组DNA(1.2μg,包括试剂盒提供的对照DNA)2 h,将酶切DNA连同地高辛标记的marker放于0.8%琼脂糖凝胶中以5 V/cm的电压电泳10 cm,使用毛细管转移法将DNA转移至带正电荷尼龙膜上,120℃烘烤30 min,使用试剂盒提供的杂交液42℃预杂交1 h后,用地高辛标记的端粒探针42℃杂交3 h,洗膜后,加入显影底液,并将尼龙膜放入LAS-4000数字成像系统中进行连续曝光,曝光时间15~20 min,选择曝光强度最适宜的一张照片进行TRF长度测定。使用图像处理软件Image J(v1.44p),根据公式TRF=∑(ODi)/∑(ODi/Li)计算平均TRF长度。其中,ODi表示位置i的光密度值,Li表示位置i的marker长度,不同批次的结果根据control DNA进行校正。
1.3 观察指标
①观察PCR产物的熔解曲线、端粒与单拷贝基因的标准曲线;②观察T/S比值的重复性,计算批内变异系数及批间变异系数;③分析T/S比值与平均TRF长度的相关性。
2 结果
2.1 熔解曲线、标准曲线及相对T/S比值的计算
PCR产物的熔解曲线如图1所示,熔解曲线为两个完全分开的双峰,Tm值分别为78℃和91℃,分别为端粒扩增产物和单拷贝基因扩增产物。分别计算各个浓度标准品端粒和单拷贝基因的平均Ct值,并以DNA含量的对数值log[DNA]作横坐标,以Ct值作纵坐标,在Microsoft Excel中绘制端粒和单拷贝基因的标准曲线,得出R2值和公式(图2)。从图中可以看出,端粒和单拷贝基因的标准曲线R2均>0.99,且两条标准曲线几乎平行,说明端粒和单拷贝基因扩增效率相近,提示在225~5.76 ng范围内,使用该标准曲线计算待测样本的端粒长度可靠。将各个待测样本的原始Ct值代入公式,进行幂转换,得到每个待测样本相对于标准品的端粒的纳克数(T)和单拷贝基因的纳克数(S),最后计算3个复孔T/S比值的平均值,即得到每个待测样本相对于标准品的T/S比值。
2.2 T/S比值的重复性检验
计算每个待测样本3个复孔T/S比值的变异系数,然后计算39个样本变异系数的几何均数,得出批内变异系数为2.9%。为了检验该MMQPCR方法的批间重复性,同样的39个样本于第2天进行重复测量,仍为3个复孔,且保证每个样本在384孔板上的位置与前一次不同,以减少位置效应。两次独立实验各个样本T/S均值的相关性见图3,可以发现线性回归线的斜率接近于1,且在Y轴上的截距接近于零。计算两次实验每对样本T/S比值的变异系数,最后求得39对样本变异系数的几何均数,即批间变异系数为3.4%。
2.3 T/S比值与平均TRF长度的相关性分析
计算39个样本DNA的平均T/S比值为1.13±0.21,平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,从图4可以看出两种不同方法测得的结果存在明显相关性(R2=0.6706,P<0.001)。
3 讨论
MMQPCR将端粒和单拷贝基因置于同一个反应管中扩增,利用端粒和单拷贝基因丰度和产物Tm值的差异,使用SYBR Green染料在一个循环中顺序收集端粒荧光信号和单拷贝基因荧光信号。该方法与传统多重PCR不同的是两个目标基因的扩增并不是同时进行。端粒首先扩增并在74℃收集信号,由于端粒的丰度远比单拷贝基因高,此时单拷贝基因的Ct值仍在基线水平以下,因此74℃的Ct值仅代表端粒。温度继续升高到85℃,因为此时端粒产物已完全解链,释放DNA聚合酶用于单拷贝基因的扩增,由于单拷贝基因引物5′端被加了“GC钳”,提高了退火温度,使其在85℃仍能扩增,因此此时收集的荧光仅代表单拷贝基因产物。该方法与之前的PCR方法比较,试剂和模板用量以及时间均减少了一半,更为重要的是消除了模板起始量不同对结果产生的影响,减少了批内误差。
扩增效率是影响定量PCR可靠性的最重要因素[14],由于实时定量PCR通过Ct值来计算模板的起始量,因此所有样本的扩增效率一致显得很重要。端粒的定量PCR利用两个基因的扩增来计算端粒长度,其中任何一个都有可能存在效率误差,因而对效率误差尤为敏感。有文献报道了端粒定量PCR可接受的效率范围为95%~103%[16],但这个范围只是象征性的,如果所有的样本的扩增效率一致,具体的数值并不重要,80%和100%一样可靠,因为导致效率误差的是样本之间扩增效率的差别[15]。另一个与扩增效率有关的问题与标准品有关。端粒定量PCR通过外部标准曲线法计算端粒长度,一般来说应使用任一个待测样本,或多个样本的混合作为标准品。因为在血样本的保存及DNA的提取过程中有很多化学物质可抑制PCR反应,如乙醇、酚、EDTA等[17],而标准品与待测样本来源相同可以控制抑制因子对PCR的影响,从而减少标准品与待测样本之间的效率误差[15]。相反,使用购买的高度纯化的标准品[18]和来自细胞系的标准品[19,20]则不能消除抑制因子的影响。
本实验在罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪上进行端粒与单拷贝基因的扩增,利用LinRegPCR软件进行数据分析,解决了仪器自带软件无法分析数据的问题,从而拓宽了MMQPCR方法测定端粒长度的应用范围。与传统的Southern blot方法比较,MMQPCR方法具有省时、简便的特点,可高通量处理大量样品。
摘要：目的 在罗氏Light Cycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应(MMQPCR)方法测定端粒长度。方法 在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度(相对T/S比值),并与DNA印迹法(Southern blot)测得的平均末端限制性片段(TRF)长度作比较。结果 MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13±0.21,Southern blot方法测量平均TRF长度为(7.46±1.21)kb,两种方法测定结果的相关性分析R2=0.6706(P<0.001)。结论 本研究建立的MMQPCR方法测定端粒长度重复性好、省时、简便、可靠,可高通量处理大量样品。
关键词：端粒长度,多重定量PCR,T/S比值,末端限制性片段
多重定量PCR 篇2
1 反应体系及其优化
1.1 引物
在多重PCR反应中, 引物的设计至关重要, 它是影响多重PCR反应成败的关键[4]。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与灵敏度, 并且需要根据经验来调整多重PCR反应中各对引物之间的浓度差异。引物设计时需严格遵循引物设计原则进行, 通过微机帮助寻找有利于成功的设计引物, 合适的引物既能增加特异性又能增加敏感性。目前, 使用频率较高的引物设计软件主要是Oligo和Primer Premier, 前者已见有7.4版本, 后者已现6.0版本。软件在引物设计功能上首先体现在引物分析评价功能方面, 其中以Oligo 软件最优秀;其次是引物的自动搜索功能, 则以Primer Premier 为最强且方便易用。因此, 笔者认为以Primer Premier进行自动搜索, Oligo进行分析评价, 这样便可设计出成功率很高的引物。在多重PCR反应中, 引物设计应注意:1) 引物长度。单条引物的长度最好介于18~24 bp之间, 引物太长, 容易导致引物间的相互缠绕, 严重影响多重PCR反应结果。2) 引物同源性。为了避免引物的非特异性扩增, 引物必须高度特异, 引物之间彼此应无同源性[4]。3) 引物碱基。要充分考虑不同引物对之间互补的碱基序列, 特别是引物二聚体的形成, 这将严重影响到引物的有效性。所有的引物对最好有相近的退火温度, 引物的碱基构成最好是4种碱基的比例相当, G+C的含量应为40%~60%。引物的序列最好以1~2个GC开头或结尾, 避免3′端以A结尾。引物设计好后, 应将设计的引物序列与数据库中的核苷酸序列进行比对。此外, 如果扩增位点非常相似, 存在交叉反应, 那么在引物的3′末端至少有1~2个特异性的碱基用于目的基因的特异性扩增。4) 引物浓度。引物的浓度影响多重PCR反应的结果, 研究表明太高的引物浓度或太低的引物浓度在多重PCR反应中都应避免[6]。通常引物浓度为400 μmol/L, 浓度过高凝胶电泳时会出现引物条带[7]。
1.2 缓冲体系
研究表明, 96孔板的PCR反应塑料管对于小体积PCR反应是非常理想的。在反应中, 不论是100 μL、25 μL或是5 μL的反应体积, 均能使PCR得到有效的扩增, 所选体系要根据实际需要和经济实用而定。如果反应模板的浓度低, 小体积的PCR反应体系能够得到更好的反应结果。一般在标准25 μL体积的反应溶液中, 缓冲液的终浓度为1×Buffer时, 但有时为了能更好地扩增出目的片段, 特别是扩增片段的长度为100~1 000 bp时, 提高终浓度到 (1.4~2) ×Buffer, 或者提高KCl的浓度到 (70~100) μmol/L, 能够明显提高反应的扩增效率。一般说来, 为了扩增出长目的片段引物, 在高盐条件下扩增的效果会更好, 而扩增短目的片段引物则在低盐条件下效果更好。
1.3 模板和聚合酶浓度
1) 模板。
首先, 高质量的模板 (DNA或cDNA) 是PCR成功的保证, 原料中不能混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶的抑制剂和能结合DNA的蛋白质。Chamberlain J S等[1]研究表明, 在反应前使用多种限制性酶对样品中除模板以外的其他核酸进行消化, 能大大增加反应的特异性和产量。其次, 模板的量与循环数要匹配, 如果循环数一定, 模板的量太少, 会出现阴性结果或条带很弱;模板的量太多, 则会出现条带弥散, 模糊不清。第三, 在提取模板时, 细菌量不宜加入太多, 否则因为裂解不完全, 菌体蛋白会抑制DNA聚合酶活性, 造成假阴性结果[4]。理论上, PCR最基本的特征之一是对DNA模板的质和量要求都不太高。单、双链DNA或RNA, 一个细胞或简单地煮沸细胞得到的粗制溶解物, 或仅含几百个碱基的中等大小的DNA样品均可作为扩增模板, 并可以成功地扩增DNA片段 , 但研究发现模板DNA的质和量常是影响PCR扩增结果的重要因素[8]。研究表明, 当DNA模板浓度低于30 ng时, PCR扩增的数量将明显减少[6]。如果DNA模板浓度非常低 (达皮克级) , 可以通过调整退火温度和改变反应的其他条件也能让多重PCR有效进行。
2) 聚合酶浓度。
最有效的Taq DNA聚合酶浓度为每25 μL 0.4 U。如果聚合酶浓度过高, 将会导致不平衡的扩增及非特异性条带的扩增。
1.4 dNTP和Mg2+浓度
1) dNTP浓度。
在PCR反应中, dNTP的最佳浓度在 (200~400) μmol/L时特异性和灵敏度较好[9]。如果高于这个浓度, PCR的反应将会被迅速抑制。当dNTP的浓度低于50 μmol/L时, 扩增目的片段的产量将会大大降低。反复冻融对于dNTP是非常敏感的, 因此有必要将dNTP进行分装, 避免反复冻融。此外, 在使用之前将dNTP进行短暂离心以避免因冻存导致的反应浓度的改变。
2) Mg2+浓度。
在PCR反应中, Mg2+的浓度也决定着PCR反应的成功与否。反应中dNTP和MgCl2的浓度应该平衡, 除了DNA聚合酶需要自由的镁离子, 模板DNA也需要自由的镁离子。研究表明, 当Mg2+浓度在1.5~2 mmol/L时, dNTP的浓度在200 μmol/L时能够得到较好的反应[1,6]。Taq酶的活性表达与Mg2+浓度有极大的关系, 在低Mg2+浓度下使用低Taq酶量, 反应效果较差, 而在高Mg2+浓度下, 同样的低Taq酶量, 则可扩增出较好的谱带[10]。
2 反应条件及其优化
2.1 退火温度
在多重PCR反应中, 退火温度是另一个最重要的需要调整的因素。通常依据引物的解链温度选择退火温度, 但有的时候其结果和预期并不一致。最简单的方法就是使用54 ℃作为最初的退火温度, 如果多重PCR扩增产生非特异性条带, 就应该适当提高引物的退火温度, 反之则降低反应的退火温度。此外, 也可以通过改变多重PCR反应的其他成分使目的片段得到有效扩增。Henegariu O等[5]研究表明, 尽管单个目的片段能够在 56~60 ℃特异性地扩增, 但是在多重PCR反应中, 降低 4~6 ℃的退火温度能够更好地用于所有目的片段的扩增。
2.2 循环数量
一般说来, 对于普通的PCR反应, 30个循环就能够有效地扩增目的片段, 增加循环数并不能明显地改变扩增片段的产量。研究表明, PCR产物量增加最明显是在2个循环附近, 通常对于1个反应, 28~30个循环就足够了。循环参数:1) 变性。一般94 ℃ 30 s即可, 时间过长温度过高, 都会加速酶的失活。在第1个循环变性前, 维持 94 ℃ 1~3 min, 有利于打开模板的二级结构。2) 复性。复性温度影响PCR的特异性, 温度升高, 特异性增强, 但是温度过高, 引物与模板不易结合, PCR反应效率降低;温度过低, 非特异性结合增加。一般复性温度比引物-模板解链温度 (Tm) 低 5~10 ℃, 可用公式:Tm = 4 (G+C) +2 (T+A) 进行计算。降落PCR是增加PCR反应特异性的一个比较好的办法, 即随着循环数的增加, 复性温度逐渐降低;因此, 降落PCR既能增加反应特异性, 又能提高产量[11]。3) 延伸。延伸温度一般为72 ℃, 延伸时间长短取决于扩增片段的长短。一般来说, Taq酶在72 ℃左右, 每分钟可延伸1 000个碱基, 但是随着循环数的增加, 应逐渐增加延伸时间 (如每个循环增加3~5 s) 。随着反应进行, 各种试剂浓度降低, 特别是Taq酶的浓度和活性降低, 降低了反应效率;因此, 适当增加延伸时间可弥补这一不足。
2.3 辅助剂
使用一定浓度 (5%~10%) 的辅助剂能够改进多重PCR反应的有效性和特异性。在多重PCR反应中, 5%的二甲基亚砜或5%的甘油可改进某些目的片段的扩增效率, 但同时也会减少其他目的片段的扩增。因此, 是否使用辅助剂还取决于具体的反应。
综上所述, 进行多重PCR试验时不应墨守陈规, 而应该根据实际情况对试验条件进行优化, 尽可能避免某些因素影响PCR的试验结果, 从而使试验更加准确, 相信今后多重PCR会在疾病的临床诊断和流行病学方面发挥更大的作用。
参考文献
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多重定量PCR 篇3
目前PCV-2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸分子杂交技术等,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想,因此生产实践中需要一种快速、特异、敏感的PCV-2检测技术来准确检测圆环病毒病,并为该病的防治提供事实和理论依据。本试验旨在对比新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室建立的常规PCR和荧光定量PCR检测方法的优缺点,为实验室或者临床中PCV-2的准确、快速检测提供帮助。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
荧光定量PCR仪,购自Bio-Rad公司;普通PCR仪,购自Eppendorf公司;琼脂糖,购自Invitrogen公司;PCR试剂盒、DL-2 000 Marker等,购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 标准阳性模板
包含PCV-2-ORF2全基因的重组质粒p MD-PCV-2-ORF2,新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室构建保存。
1.3 标准阳性模板的制备
培养含p MD-PCV-2-ORF2的工程菌,提取质粒,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,并计算标准品的拷贝数。将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝数/μL后再倍比稀释成含质粒数量分别为109,108,107,106,105,104,103,102,101,100拷贝数的标准阳性模板,-80℃保存,备用。
1.4 引物设计与合成
1.4.1 荧光定量PCR引物和探针的设计
根据Gen Bank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物和Taq-Man探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成,探针的5'端用FAM标记,3'端用TAMRA标记,扩增目的片段长度为106 bp。具体序列如下。
引物F(上游):5'-CCCTATGTAAACTACTCCT C-3';引物R(下游):5'-GGAAGTAATCAATAGTG-GAAT C-3'。
探针序列:5'-(FAM)ACCATAACCCAGCCCT-TCTCC(TAMRA)-3'。
1.4.2 普通PCR引物和探针的设计
根据GenBank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物,扩增目的片段长度为494 bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列如下。
引物P1(上游):5'-CACGGATATTGTAGTCCT-GGT-3';引物P2(下游):5'-CGCACCTTCG-GATATACTGTC-3'。
1.5 反应条件
1.5.1 荧光定量PCR反应条件
经过反复试验确定出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中Premix Ex Taq 12.5μL,上、下游引物(终浓度为10μmol/L)各0.5μL,探针(终浓度为10μmol/L)0.25μL,模板DNA 2μL,去离子水9.25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,57.4℃退火延伸30 s,40个循环。
1.5.2 普通PCR反应条件
经过反复试验选出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中上游引物P1 1μL,下游引物P2 1μL,10×PCR Buffer(Mg Cl2Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,La Taq(2.5 U/μL)0.25μL,模板DNA 5μL,去离子水11.25μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,54℃退火40 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,置紫外灯下观察。
1.6 临床样品检测
临床送检的158份病料用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测。
2 结果
2.1 重组质粒浓度的测定
提取的p MD-PCV-2-ORF2质粒,经核酸蛋白分析仪测定其质量浓度为449.9 ng/μL,并计算其拷贝数为9.84×1010拷贝数/μL,OD260/OD280值为1.80,符合纯度要求。
2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立
根据重组质粒浓度测定结果,选择106,105,104,103,102,101拷贝数/μL 6个梯度浓度的质粒为模板,制作标准曲线(见图1)。标准曲线斜率为-3.354,轴截距为35.337,线性方程为Y=-3.354X+35.337,相关系数r为0.999,表明线性关系很好。
2.3 荧光定量PCR敏感性试验
以10倍系列稀释的p MD-PCV-2-ORF2标准质粒(1.0×106~1.0×101拷贝数/μL)为模板进行扩增,1.0×101拷贝数/μL仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为1.0×101拷贝数/μL。荧光曲线见图2。
2.4 普通PCR特异性与敏感性试验
选用101~1010拷贝数/μL 10个梯度浓度的质粒为模板进行扩增,凝胶电泳结果显示:当模板浓度≤1.0×104拷贝数/μL时,无法扩增出特异性目的条带。凝胶电泳检测结果见图3。
2.5 临床样品检测
对临床送检的158份病料用常规PCR法和荧光定量PCR法进行检测,结果见表1。荧光定量PCR法比常规PCR法的检出率高出8.86个百分点,表明荧光定量PCR法更加敏感。
-.PCR阴性对照;M.DL-2 000 Marker;1~10.101~1010拷贝数/μL。
3 讨论
断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年首次在加拿大的SPF猪群中被发现,随后在世界范围内广泛流行,自2001年起,我国的一些猪场也发现了PMWS[3]。PMWS主要侵害6~12周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及黄疸,造成病猪免疫机能下降、生产性能降低。现已证明PCV-2是导致PMWS的主要病原,特别是在有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)存在的情况下,该病的阳性率更高[4],是当前严重危害我国养猪业的重要疫病之一。
圆环病毒病的确诊需要进行病毒分离,PCV-2在细胞上不产生细胞病变,且需将PCV-2盲传多代后才能使病毒有效增值,有时连续传代会导致病毒抗原性的改变,因此病毒的分离费力耗时,不适合快速诊断。国内外已有多种诊断试剂盒,如ELISA、IFA等,但其非特异性较高,且价格昂贵。常规PCR方法可以快速、敏感、特异地定性检测PCV-2,具有简单、易操作、设备价格较低、人员素质要求不高的优点,但也存在非特异性扩增造成的假阳性结果需要PCR后处理的缺点。荧光定量PCR可以对样品中的病毒含量进行准确的定量检测,具有结果直观、灵敏度高、特异性强的优点[5],同时也存在设备及试剂价格较高、对人员的素质要求较高、在基层推广性低的缺点。
参考文献
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浅谈临床定量PCR实验室管理 篇4
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增105~107倍,将检测阈值降至1~10拷贝用于基因表达检测,使低拷贝临床标本的检测成为可能。荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。该技术使PCR实现了从定性到定量的革命性飞跃,具有特异性较强、灵敏度高,简便快速等优点。近年来,PCR技术在临床医学中得以快速应用,特别是在肝炎、结核、艾滋病、性病、SARS等病原微生物诊断以及部分遗传性疾病诊断和癌症的辅助诊断等方面的应用[1,2,3]。
2 临床定量PCR实验室管理
临床定量PCR实验室由卫生部管理,依据国家卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号)、《临床基因扩增检验实验室工作规范》(卫检字[2002]8号)、《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(2002-1-14)、《临床基因扩增实验室申请表》及《临床基因扩增实验室验收表》执行。实验室申办程序包括:(1)填写调查表,由省临检中心审核;(2)正式填写申请表,上报卫生部临检中心;(3)评审由卫生部、省专家参加,并报省卫生厅备案;(4)合格单位名单由卫生行政部门在媒体公示。临床定量PCR实验室应具备以下条件:标准的实验室设计设置、专业的技术人员、标准操作程序(SOP)和质量管理文件等。
2.1 实验室设置及人员管理
在实验室设计上,建立单流向、一体化的临床定量PCR实验室是安全准确进行基因扩增检验和保障生物安全的重要措施[4]。其具有理想的布局结构、标准的风向设置、严谨的防护措施、简明洁净的外观、合适的环境条件与参数等。它具体包括建设好“3个实验区”(试剂准备区、标本制备区和PCR扩增区及其各自缓冲区)和“3个系统”(单向气流控制系统、单向物品传送系统、生物安全控制系统)。对于人员管理,首先应制定一系列规章制度。检验人员要严格遵守操作规程,制定日常工作中的质量控制流程,严格执行查对制度和考核制度,具有实事求是的工作作风。检验人员必须满足以下条件:(1)经有资质的单位培训,考试合格取得上岗证后持证上岗。(2)专业主管为本科以上学历和中级以上职称3 a以上工作经历。(3)工作人员须有专业技术职称。(4)培训单位须由省卫生厅指定,经卫生部临检中心认可。
2.2 实验室操作规程的规范化
建立符合当今实验室的管理模式,形成管理文件,包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序(SOP)等。质量手册主要包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员管理、实验室设施环境、仪器设备、生物防护措施、标准操作程序、标本管理、记录、报告、应急处理及实验室的工作制度等。SOP文件是最具体、最具可操作性,也是使用频率最高的文件,其精髓就是使所有与实验室检验质量有关的环节都有章可循,要让每一个操作人员都了解并严格遵照执行管理制度和标准操作程序。此外,所有实验的原始资料均应存档;所有的记录均应规范登记在册;原始登记表应记录试剂来源、批号,质控血清的来源及测定值,并注明是否在控;检验者及审核者应签名。如果实验结果对临床诊断有决定意义,其样本应留存,至少要与病历的保存期一致。规范化的管理和操作保证了实验结果的准确性和可靠性,而且便于各项数据资料的核实。
3 临床定量PCR实验室的质量控制
PCR技术自Mullis创立以来广泛应用于多种疾病检测,但PCR测定不同于一般临床检测,由于其灵敏性很高,即使有极少量DNA污染也会造成假阳性,因此对实验条件要求非常严格。检验者在操作过程中必需牢固树立“无基因观念”,严格操作规程,防止一切可能的污染,包括以前的扩增产物、天然基因组DNA、试剂配置、气溶胶、实验所用的器具等。一旦发生污染,实验即不能进行,而且查找污染源非常困难,因此避免发生污染重在预防,并贯穿于PCR检测的全过程。因此质量控制在PCR检测过程中尤为重要。
3.1 室内质量控制
室内质量控制是指一个实验室内部对所有影响质量的各个环节进行系统控制。目的是控制本试验室常规工作的精密度,提高常规工作前后的一致性。临床PCR实验室应开展所有检验项目的室内质量控制,并做好记录和分析[5]。PCR检测包括标本采集、核酸提取、基因扩增、产物检测等步骤,每个步骤都应有相应的质控措施。其中最关键的是标本采集和核酸提取,按照卫生部临床检验中心《临床基因扩增实验室工作规范》严格执行。室内质控贵在坚持,重在不断总结提高。
3.2 室间质量评价
室间质量评价是实验室质量控制体系中的重要部分,是保证患者检验结果及其报告的准确性和可靠性,以及各实验室间结果可比性的重要手段。卫生部临床检验中心组织的全国性室间质量评价活动现已扩展到细菌、免疫、血液、体液、治疗药物监测、分子诊断等领域。临床PCR实验室应积极参加省、市及卫生部临床检验中心组织的各项活动,如实验室室间质量评价、质量评价总结会议、研讨会和学习班,各医院间相互学习、沟通和交流,不断改进和完善本实验室的质量管理。实事求是地汇报室间质评结果,认真地研究反馈的评价信息。接受卫生部或省临检中心的现场调查,如果1个质评项目连续2次成绩不合格,整改并停止项目收费3个月。及时发现问题,做好失控分析和记录,找出问题所在,采取相应措施,力求实验室结果准确、可靠、及时、可比,更好地服务于临床。
4 小结
随着PCR实验室管理方法的不断完善,新试剂盒的相继推出,实验室设备的改良及实验方法的不断改进,定量PCR技术已经发展成为日益强大和用途广泛的技术。此外,PCR技术不同于常规的检验技术,必须按照PCR实验室的一系列要求开展工作才能保证操作的安全性和结果的可靠性。可以预计,PCR技术将会给临床医学检验方法带来一场巨大的变革,并逐步进入我国卫生机构的各级实验室,更好地为临床某些疾病的早期诊断和治疗提供服务。
参考文献
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多重定量PCR 篇5
1多重PCR技术的基本原理
多重PCR技术是PCR技术的一种, 由Chamberian等在1988年率先报道。该技术具有高度特异性、敏感性、高效快捷、实验成本低、实验进程快等优点, 并迅速在人类、动物以及微生物研究方面得到广泛应用。其原理与PCR技术原理基本一致, 指在同一反应体系中加入两对或多对特异性引物, 同时扩增多个目的基因或DNA序列。在各种生物基因组中存在连续的20~30个相同或者互补碱基的概率几乎不存在, 并且DNA聚合酶具有非常高的复制准确活性。所以在多重PCR反应体系中, 由各引物交叉结合而造成的非特异性扩增的可能性十分小, 保证了多重PCR的特异性。多重PCR不但可同时扩增多条目的片段, 节省了试剂和时间, 而且减少了污染的机会。理论上只要条件允许, 引物对的数量可以不限, 目前有扩增9条目的片段的记录。但该技术需要对反应体系和反应条件进行多次优化。
2多重PCR技术在猪病检测中的应用
2.1多重PCR用于常规猪病诊断
2.1.1病毒常规检测焦洋等[1]根据猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) S基因序列、猪流行性腹泻病毒 (PEDV) M基因和猪博卡病毒 (PBo V) NP1基因序列, 设计合成3对特异性引物, 建立了检测TGEV、PEDV和PBo V的多重PCR方法, 用该方法检测60份临床样品, 得出TEGV阳性率为1.6%, PEDV阳性率为6.7%, PBo V阳性率为21.7%。Xu等[2]建立了检测圆环病毒2型 (PCV2) 、伪狂犬病毒 (PRV) 、猪细小病毒 (PPV) 、经典猪瘟病毒 (CSFV) 、蓝耳病病毒 (PRRSV) 、乙型脑炎病毒 (JEV) 的多重PCR, 该技术可同时鉴别诊断6种常见病毒病, 且对各类病毒的灵敏度均高于普通PCR, 各引物之间没有交叉反应, 特异性高。Ogawa等[3]建立了可检测盖塔病毒 (GETV) 、TGEV、猪轮状病毒A型 (GAR) 、PEDV、JEV、PRRSV、PPV、猪水泡病毒1型 (Su HV-1) 和PCV2的9重PCR检测方法, 使用该方法检测75份临床样本, 其检测结果与普通PCR的结果相一致, 表明该方法具有良好的灵敏性和特异性。
2.1.2细菌常规检测Rossi等[4]基于SCAR片段建立的三重PCR可准确鉴别诊断胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌以及多杀性巴氏杆菌, 该方法与普通PCR结果相一致, 对临床疾病的诊断和流行病学调查有重要意义。李伟杰等[5]分别针对志贺毒素Stx2e A亚基、大肠埃希菌16S r DNA和菌毛F18ab A亚基的保守序列设计合成3对特异性引物, 优化并建立了多重PCR, 结果与其他猪常见致病菌均无交叉反应。该方法对猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断及流行病学调查具有一定的应用价值。安俊卿等[6]根据沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌kmt1基因和大肠埃希菌23S r RNA基因设计并合成3对特异性引物, 通过优化反应条件建立了多重PCR方法, 结果对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×104CFU/m L、1.99×104CFU/m L、2.01×104CFU/m L。该方法特异性强、敏感度高、稳定性好, 能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。
2.2多重PCR用于猪病分型鉴别
2.2.1病毒的分型鉴定王晓波等[7]根据Gen Bank中公布的已知序列对CSFV、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 (HP-PRRSV) 及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒 (C-PRRSV) 分别设计特异性引物, 优化并建立了多重RT-PCR方法, 结果显示可用2对引物同时检测这3种病毒。徐磊等[8]根据猪圆环病毒1型 (PCV-1) 、圆环病毒2型a (PCV-2a) 以及圆环病毒2型b (PCV-2b) 序列的差异设计了3对特异性引物, 并通过优化反应条件建立了三重PCR方法, 结果表明该方法灵敏性高、引物特异性良好, 各引物之间没有出现交叉反应。用此方法对采集自陕西省的56份样品进行检测, 其检测结果与单重PCR检测结果的符合率达99%以上。
2.2.2细菌的分型检测Liu Z等[9]利用全基因组高通量测序设计特异性引物, 完成了多重PCR的建立, 用该方法对链球菌进行鉴别诊断, 结果显示:经过4次多重PCR, 成功鉴别出了33种血清型。张亮等[10]根据JEV基因I型和基因III型的保守序列设计特异性引物, 并对反应体系及条件进行优化, 建立了多重RT-PCR方法, 用该法检测27份临床样品, 结果灵敏且特异性地检测出了5份为基因I型, 2份为基因III型, 与核苷酸序列分析结果一致。
2.3多重PCR与其他技术的创新结合
2.3.1与荧光定量PCR技术结合王乃福等[11]根据口蹄疫病毒 (FMDV) 3D蛋白编码基因、水疱性口炎病毒 (VSV) N蛋白编码基因和猪水泡病病毒 (SVDV) VP1蛋白编码基因的高保守区设计了特异性引物和探针, 成功建立了可同时检测这三种病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。结果经扩增显示, 该方法灵敏度高, 特异性良好, 可实现对多种病毒混合感染的同时检测。Zhao等[12]结合荧光定量PCR技术与多重PCR技术成功地建立了一种快捷高效的荧光定量多重PCR检测方法, 用于鉴别猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 的经典株和变异株。该方法针对PEDV保守序列中的S基因设计两套引物, 可对不少于5×102DNA拷贝数进行检测。使用该方法检测42份临床腹泻病料, 其中36份为变异毒株, 3份为经典毒株。
2.3.2与不对称PCR和悬浮阵列技术结合Chen等[13]结合不对称PCR技术、悬浮微阵列技术以及多重PCR技术, 成功建立了一种可同时检测PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV的诊断方法。用该方法检测219份临床病料, 检测率均高于RT-PCR和不对称PCR, 且从提取病毒核酸到显示检测结果只需2 h。
2.3.3与LAMP技术结合Park等针对引起猪增生性肠病的胞内劳森氏菌的不同基因设计了4段引物, 将多重PCR与环介导等温扩增技术 (LAMP) 相结合, 所建立的新方法特异性强, 灵敏性是RT-PCR的10~100倍, 同时节约了试剂成本和检测时间。
2.3.4与基因芯片技术结合王小强等[14]针对PCV-2、PPV、PRV、SIV、CSFV、FMDV和PRRS建立的多重不对称PCR扩增方法与寡核苷酸基因芯片相结合, 杂交反应中使用胶体金进行标记, 最后用银染试剂进行显色, 建立了可同时检测7种常见猪病的可视化寡核苷酸基因芯片, 其检测结果与普通PCR检测结果的符合率为100%。基于多重PCR技术的寡核苷酸可视化基因芯片, 具有灵敏性高、节约费用和省时等优良特性。
3多重PCR技术的应用前景
多重PCR技术以其快速、高效、特异性好、灵敏度高的优点在病原检测方面与流行病学调查方面具有重要作用[15]。多重PCR在反应过程中可能存在多对引物之间的相互抑制, 引物与非靶序列结合可能产生非特异性扩增, 因此在确立多重PCR实验方案时, 首先应合理设计引物, 同时重视优化反应体系中的主要成分和反应条件, 以减少非特异性扩增和假阳性。除此之外, 多重PCR作为一种灵敏快速、高通量的特异性扩增技术常常与其他方法结合使用, 如在硅玻基片中完成系列核酸扩增反应的多重PCR基因芯片技术、LAMP技术、实时多重PCR技术、巢式多重PCR、荧光定量多重PCR等。但其在实际应用中也存在不少问题, 一旦有极少量外源性DNA污染, 就可能出现假阳性结果;且反应为多对引物同时扩增, 若各种实验条件控制不当, 很容易导致扩增失败或出现假阳性、假阴性等非理想结果。
多重定量PCR 篇6
关键词：实时荧光定量PCR技术,优点与缺陷,应用情况,研究探讨
实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈,与常规PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点,使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。
1 实时荧光定量PCR技术的原理
在实时荧光定量PCR技术中,它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是,当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线,所以,依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系,因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。
相比于常规PCR,实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环,模板的初始量可以定量分析。简言之,实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增,正比于产品的对数扩增样品的DNA含量,因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。
2 实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷
2.1 实时荧光定量PCR技术的优势
与传统的PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处,具体如下[2]:
(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究,极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用;
(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度:科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量,检测极限能够实现10 cells/样品[4];
(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量,简便快捷:对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线,通常可以超过7个数量级以上;
(4)实时荧光定量PCR技术安全性高:在样品的定量检测在PCR反应完成后,没有进一步的后续处理,减少了工作量,以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide,EB)等诱变风险的过程。
2.2 实时荧光定量PCR技术的缺陷
实时荧光定量PCR技术是一种高效,灵敏,安全的分子生物学手段,已经成为主流定量核酸的技术之一,但此技术还不是很成熟,在使用过程中还存在一些缺陷,具体如下[1,2,3]:
(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的,这会对实验结果的准确性有一定的影响;
(2)标准曲线制作过程是非常复杂的,目前还没有统一的标准方法,这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性;
(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确,目前的大多数研究是基于平均份数进行评估,其精度是可疑的;
(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术,目前在我国还没有广泛的应用基础;
(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。
2.3 实时荧光定量PCR技术的应用
实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示,荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S r DNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nir S)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)种类的丰度,说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量,表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量,发现分布相对均匀,泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospira spp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的总量进行了定量监测。
在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol,PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测,研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大,并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析,结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升,系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eae A和rfb E进行实时荧光定量PCR检测,表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数,表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级,腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcy A基因进行了定量的分析,实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。
3 结语
多重定量PCR 篇7
目前, 转基因产品检测方法分为DNA检测、蛋白质检测[4]。蛋白质检测方法有试纸条检测、ELISA, DNA检测方法有基因芯片、PCR、Southern杂交等[5,6,7]。多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入2对或2对以上引物, 同时扩增出多个核酸片段的PCR反应, 其反应原理、试剂、操作过程与一般PCR相同[8]。多重PCR技术应用十分广泛, 包括动物和植物生物学、人类生物医学、食品卫生等。多重PCR检测方法具有高效、快捷、准确和经济简便的特点。该研究拟通过对多重PCR检测方法进行优化并建立起包括Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3种外源基因的多重PCR检测技术体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验用材料。
所有转基因及非转基因材料均购自欧盟标准物质和计量研究所, 市售大米、玉米均购自康定县各大超市及农贸市场。
1.1.2 主要试剂。
植物基因组提取试剂盒、Master Mix购于成都博瑞克生物技术有限公司;引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成;标准分子量 (M) 大小依次为100 bp、250bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、1 200 bp;CTAB、SDS等生化试剂均为国产分析纯。
1.2 基因的确定与引物的设计
根据目前转基因商业化材料的分子特征选择出现几率较高的Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因作为检测基因, 引物分别参照国家相关标准中的特异性序列 (表1) 。
1.3 样品DNA提取
样品DNA提取按照转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化 (农业部1485号公告-4-2010) 之试剂盒方法进行[9], 测定提取DNA浓度和质量。
1.4 多重PCR方法的建立
1.4.1 多重PCR单基因特异性试验。
反应体系:2×Master Mix 12.5μL, F、R各1μL (10μmol/L) , 模板DNA 2μL (模板浓度为25 ng/μL) , 加dd H2O至25μL。
扩增程序:95℃5 min;94℃30 s, 58℃30 s, 72℃30 s, 35个循环;72℃5 min, 4℃保存。PCR反应结束后将反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
1.4.2 多重PCR检测方法的建立及条件优化。
(1) 多重PCR退火温度的优化。反应体系:2×Master Mix12.5μL, 3对引物中F、R各0.25μL (10μmol/L) , 模板DNA2μL (模板浓度为25 ng/μL) , 加dd H2O至25μL。
扩增程序:95℃预变性5 min;94℃30 s, 退火温度设置梯度50、54、56、58、60、64℃30 s, 72℃40 s, 30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析, 筛选出最佳退火温度。
(2) 多重PCR引物浓度的优化。反应体系:2×Master Mix12.5μL, 3对引物终浓度 (μmol/L) 按照0.2∶0.2∶0.2、0.1∶0.1∶0.1、0.2∶0.2∶0.1、0.1∶0.2∶0.1和0.1∶0.2∶0.1设置引物浓度梯度, 模板DNA 2μL (模板浓度为25 ng/μL) , 加dd H2O至25μL。扩增程序选择退火温度优化后确定的程序。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析, 筛选出最佳引物浓度配比。
1.5 多重PCR方法的实例应用
利用该研究建立的多重PCR检测体系, 对实验室保存的已知样品进行实例验证, 以期进一步检验建立的多重PCR检测体系的可靠性和准确性。
1.6 市售样品检测
利用该研究建立的准确、可靠的多重PCR检测体系, 对购自康定县各大超市及农贸市场的大米、玉米进行检测, 定期掌握康定县市场上是否存在非法存在的转基因作物及其产品。
2 结果与分析
2.1 提取样品DNA
采用试剂盒提取纯化后的样品总DNA通过超微量分光光度计测定浓度和质量, 经测定, 所有样品浓度都大于25ng/μL, 且OD260nm/OD280nm范围在1.8~2.0, OD260nm/OD230nm大于2.0, 说明提取的样品DNA能满足该研究的需要。将样品DNA浓度稀释至25 ng/μL待测。
2.2 多重PCR单基因特异性验证
试验建立的单基因PCR检测方法可将目的基因片段成功地扩增, 而其他不含此基因的样品中没有相应扩增 (图1) , 结果表明, 此多重PCR体系所用基因序列特异性好, 可以用于多重PCR检测体系。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2~3:水稻、玉米、大豆混合阴性对照;4:dd H2O对照。
2.3 多重PCR条件的优化
经过退火温度梯度试验, 试验结果 (图2) 表明, 退火温度太低容易产生非特异性条带, 而退火温度太高又不能使需要的目的条带得到理想扩增, 最终选择多重PCR反应的退火温度为60℃;在引物浓度梯度试验中, 结果 (图3) 表明, 只有各引物终浓度 (μmol/L) 在0.2∶0.2∶0.2和0.2∶0.2∶0.1 2种情况下, 产物条带清晰, 无非特异性条带, 而其他几种引物浓度梯度结果均不理想, 产物条带模糊、不清晰, 并有非特异性条带, 在考虑反应体系中引物浓度大可能会增加引物二聚体产生的情况下, 最终确定最优化的引物终浓度 (μmol/L) 配比为0.2∶0.2∶0.1。
注:M:标准分子量;1~6:退火温度50、54、56、58、60、64℃;7:dd H2O对照。
注:M:标准分子量;1-6:引物终浓度 (μmol/L) 0.2∶0.2∶0.2, 0.1∶0.1∶0.1, 0.2∶0.2∶0.1, 0.1∶0.2∶0.1, 0.1∶0.2∶0.1;7:dd H2O对照。
2.4 已知样品检测结果
采用此多重PCR体系检测已知样品的结果 (图4) 表明, 所有已知样品检测出现的条带与其分子特征显示的基因元件一一对应。此结果进一步验证了该试验建立的多重PCR检测方法的可靠性。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2:阴性对照;3:dd H2O对照;4:GTS-40-3-2;5:NK603;6:GA21;7:MON88017;8:T25。
2.5 市售样品检测结果
在对照设置正常的情况下, 结果显示:6个大米样品中均未检测出外源基因Ca MV 35S (195 bp) 、NOS (138 bp) 、CP4-epsps (498 bp) (图5) ;6个玉米样品也均未检测出外源基因Ca MV 35S (195 bp) 、NOS (138 bp) 、CP4-epsps (498 bp) (图6) 。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2:dd H2O对照;3~8:1~6号大米样品。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2:试剂空白对照;3~8:1~6号玉米样品。
3 结论与讨论
3.1 结论
(1) 该研究在一个反应体系中同时检测多个转基因成分, 很大程度上减少了操作步骤, 缩短了检测时间, 降低了成本, 同时提高了检测效率, 有效降低污染的机率, 避免了漏检现象, 从而为转基因的检测提供更有为效的检测手段。
(2) 建立了快速、准确的三重PCR检测转基因植物的方法。
3.2 讨论
多重PCR最早由Chamberlain J S等[13]提出, 目前广泛应用于生物、医学等领域, 包括基因敲除分析、突变、多态性分析、定量分析、RNA检测及微生物耐药检测等[8]。影响多重PCR的因素很多, 对多重PCR体系中各条件进行探索, 是建立起高效、准确的多重PCR检测体系的必然过程。
多重PCR由于涉及的引物较多, 因此比较容易造成引物二聚体、错配、非特异性带等现象, 从而降低扩增效率[14];在建立多重PCR反应体系时需要对引物的设计和反应条件的选择进行反复摸索。该试验就采用不同引物浓度梯度对引物配比进行摸索, 在考虑到易产生引物二聚体、非特异性条带等的情况下, 选择出没有非特异条带、引物二聚体少、各基因引物扩增效率大体一致的引物浓度配比进行多重PCR检测体系反应。
在多重PCR反应中, 常依据引物的解链温度选择退火温度, 但常常结果和预期不一致。一般最初退火温度可用54℃, 若多重PCR扩增产生非特异性条带, 应适当提高引物的退火温度, 反之退火温度要降低。Henegariu O等[15]认为, 尽管单个目的片段能够在56~60℃特异性地扩增, 但多重PCR反应中, 退火温度降低4~6℃, 能更好地用于所有目的片段的扩增。该试验就根据特异引物间退火温度比较分析, 选取50、54、56、58、60、64℃6个温度梯度, 最终根据3个目的基因的特异性条带亮度一致、无非特异性条带等, 选择60℃作为多重PCR检测体系的退火温度。
摘要：根据目前转基因作物常见的外源基因, 选择出现几率较高的Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因, 引物分别参照国家相关标准中的特异性序列, 建立可同时特异性地检测3种外源基因的多重PCR检测体系。同时, 对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。已知样品检测证明, 此多重PCR体系具有良好的可靠性。利用此体系在对康定县境内出售大米、玉米样品检测中未检测相关基因。