多重PCR方法（共9篇）
多重PCR方法 篇1
转基因作物 (GMP) 是指利用分子生物学手段, 将某些生物的基因转移到作物中去, 使其出现原物种不具有的性状或产物[1]。近年来, 随着转基因技术迅速发展, 转基因作物种植面积不断加大, 但其对自然环境安全、人体健康、生物多样性等可能造成的负面影响引起各国的关注。为此, 日本、欧盟等开始对转基因作物实行强制性标识制度[2], 同时转基因检测技术的需求大大增加, 且对准确性、特异性提出严格要求。我国施行《农业转基因生物标识管理办法》, 要求对5类转基因生物涉及的17种转基因产品标识[3]。为贯彻标识制度, 需要建立一套方便、实用的转基因产品检测技术。
目前, 转基因产品检测方法分为DNA检测、蛋白质检测[4]。蛋白质检测方法有试纸条检测、ELISA, DNA检测方法有基因芯片、PCR、Southern杂交等[5,6,7]。多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入2对或2对以上引物, 同时扩增出多个核酸片段的PCR反应, 其反应原理、试剂、操作过程与一般PCR相同[8]。多重PCR技术应用十分广泛, 包括动物和植物生物学、人类生物医学、食品卫生等。多重PCR检测方法具有高效、快捷、准确和经济简便的特点。该研究拟通过对多重PCR检测方法进行优化并建立起包括Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3种外源基因的多重PCR检测技术体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验用材料。
所有转基因及非转基因材料均购自欧盟标准物质和计量研究所, 市售大米、玉米均购自康定县各大超市及农贸市场。
1.1.2 主要试剂。
植物基因组提取试剂盒、Master Mix购于成都博瑞克生物技术有限公司;引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成;标准分子量 (M) 大小依次为100 bp、250bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、1 200 bp;CTAB、SDS等生化试剂均为国产分析纯。
1.2 基因的确定与引物的设计
根据目前转基因商业化材料的分子特征选择出现几率较高的Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因作为检测基因, 引物分别参照国家相关标准中的特异性序列 (表1) 。
1.3 样品DNA提取
样品DNA提取按照转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化 (农业部1485号公告-4-2010) 之试剂盒方法进行[9], 测定提取DNA浓度和质量。
1.4 多重PCR方法的建立
1.4.1 多重PCR单基因特异性试验。
反应体系:2×Master Mix 12.5μL, F、R各1μL (10μmol/L) , 模板DNA 2μL (模板浓度为25 ng/μL) , 加dd H2O至25μL。
扩增程序:95℃5 min;94℃30 s, 58℃30 s, 72℃30 s, 35个循环;72℃5 min, 4℃保存。PCR反应结束后将反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
1.4.2 多重PCR检测方法的建立及条件优化。
(1) 多重PCR退火温度的优化。反应体系:2×Master Mix12.5μL, 3对引物中F、R各0.25μL (10μmol/L) , 模板DNA2μL (模板浓度为25 ng/μL) , 加dd H2O至25μL。
扩增程序:95℃预变性5 min;94℃30 s, 退火温度设置梯度50、54、56、58、60、64℃30 s, 72℃40 s, 30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析, 筛选出最佳退火温度。
(2) 多重PCR引物浓度的优化。反应体系:2×Master Mix12.5μL, 3对引物终浓度 (μmol/L) 按照0.2∶0.2∶0.2、0.1∶0.1∶0.1、0.2∶0.2∶0.1、0.1∶0.2∶0.1和0.1∶0.2∶0.1设置引物浓度梯度, 模板DNA 2μL (模板浓度为25 ng/μL) , 加dd H2O至25μL。扩增程序选择退火温度优化后确定的程序。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳进行结果分析, 筛选出最佳引物浓度配比。
1.5 多重PCR方法的实例应用
利用该研究建立的多重PCR检测体系, 对实验室保存的已知样品进行实例验证, 以期进一步检验建立的多重PCR检测体系的可靠性和准确性。
1.6 市售样品检测
利用该研究建立的准确、可靠的多重PCR检测体系, 对购自康定县各大超市及农贸市场的大米、玉米进行检测, 定期掌握康定县市场上是否存在非法存在的转基因作物及其产品。
2 结果与分析
2.1 提取样品DNA
采用试剂盒提取纯化后的样品总DNA通过超微量分光光度计测定浓度和质量, 经测定, 所有样品浓度都大于25ng/μL, 且OD260nm/OD280nm范围在1.8~2.0, OD260nm/OD230nm大于2.0, 说明提取的样品DNA能满足该研究的需要。将样品DNA浓度稀释至25 ng/μL待测。
2.2 多重PCR单基因特异性验证
试验建立的单基因PCR检测方法可将目的基因片段成功地扩增, 而其他不含此基因的样品中没有相应扩增 (图1) , 结果表明, 此多重PCR体系所用基因序列特异性好, 可以用于多重PCR检测体系。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2~3:水稻、玉米、大豆混合阴性对照;4:dd H2O对照。
2.3 多重PCR条件的优化
经过退火温度梯度试验, 试验结果 (图2) 表明, 退火温度太低容易产生非特异性条带, 而退火温度太高又不能使需要的目的条带得到理想扩增, 最终选择多重PCR反应的退火温度为60℃;在引物浓度梯度试验中, 结果 (图3) 表明, 只有各引物终浓度 (μmol/L) 在0.2∶0.2∶0.2和0.2∶0.2∶0.1 2种情况下, 产物条带清晰, 无非特异性条带, 而其他几种引物浓度梯度结果均不理想, 产物条带模糊、不清晰, 并有非特异性条带, 在考虑反应体系中引物浓度大可能会增加引物二聚体产生的情况下, 最终确定最优化的引物终浓度 (μmol/L) 配比为0.2∶0.2∶0.1。
注:M:标准分子量;1~6:退火温度50、54、56、58、60、64℃;7:dd H2O对照。
注:M:标准分子量;1-6:引物终浓度 (μmol/L) 0.2∶0.2∶0.2, 0.1∶0.1∶0.1, 0.2∶0.2∶0.1, 0.1∶0.2∶0.1, 0.1∶0.2∶0.1;7:dd H2O对照。
2.4 已知样品检测结果
采用此多重PCR体系检测已知样品的结果 (图4) 表明, 所有已知样品检测出现的条带与其分子特征显示的基因元件一一对应。此结果进一步验证了该试验建立的多重PCR检测方法的可靠性。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2:阴性对照;3:dd H2O对照;4:GTS-40-3-2;5:NK603;6:GA21;7:MON88017;8:T25。
2.5 市售样品检测结果
在对照设置正常的情况下, 结果显示:6个大米样品中均未检测出外源基因Ca MV 35S (195 bp) 、NOS (138 bp) 、CP4-epsps (498 bp) (图5) ;6个玉米样品也均未检测出外源基因Ca MV 35S (195 bp) 、NOS (138 bp) 、CP4-epsps (498 bp) (图6) 。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2:dd H2O对照;3~8:1~6号大米样品。
注:M:标准分子量;1:阳性对照;2:试剂空白对照;3~8:1~6号玉米样品。
3 结论与讨论
3.1 结论
(1) 该研究在一个反应体系中同时检测多个转基因成分, 很大程度上减少了操作步骤, 缩短了检测时间, 降低了成本, 同时提高了检测效率, 有效降低污染的机率, 避免了漏检现象, 从而为转基因的检测提供更有为效的检测手段。
(2) 建立了快速、准确的三重PCR检测转基因植物的方法。
3.2 讨论
多重PCR最早由Chamberlain J S等[13]提出, 目前广泛应用于生物、医学等领域, 包括基因敲除分析、突变、多态性分析、定量分析、RNA检测及微生物耐药检测等[8]。影响多重PCR的因素很多, 对多重PCR体系中各条件进行探索, 是建立起高效、准确的多重PCR检测体系的必然过程。
多重PCR由于涉及的引物较多, 因此比较容易造成引物二聚体、错配、非特异性带等现象, 从而降低扩增效率[14];在建立多重PCR反应体系时需要对引物的设计和反应条件的选择进行反复摸索。该试验就采用不同引物浓度梯度对引物配比进行摸索, 在考虑到易产生引物二聚体、非特异性条带等的情况下, 选择出没有非特异条带、引物二聚体少、各基因引物扩增效率大体一致的引物浓度配比进行多重PCR检测体系反应。
在多重PCR反应中, 常依据引物的解链温度选择退火温度, 但常常结果和预期不一致。一般最初退火温度可用54℃, 若多重PCR扩增产生非特异性条带, 应适当提高引物的退火温度, 反之退火温度要降低。Henegariu O等[15]认为, 尽管单个目的片段能够在56~60℃特异性地扩增, 但多重PCR反应中, 退火温度降低4~6℃, 能更好地用于所有目的片段的扩增。该试验就根据特异引物间退火温度比较分析, 选取50、54、56、58、60、64℃6个温度梯度, 最终根据3个目的基因的特异性条带亮度一致、无非特异性条带等, 选择60℃作为多重PCR检测体系的退火温度。
摘要：根据目前转基因作物常见的外源基因, 选择出现几率较高的Ca MV 35S、NOS、CP4-epsps 3个基因, 引物分别参照国家相关标准中的特异性序列, 建立可同时特异性地检测3种外源基因的多重PCR检测体系。同时, 对反应条件进行优化并测试其特异性和灵敏度。已知样品检测证明, 此多重PCR体系具有良好的可靠性。利用此体系在对康定县境内出售大米、玉米样品检测中未检测相关基因。
关键词：CaMV 35S,NOS,CP4-epsps,多重PCR,检测
多重PCR方法 篇2
巢式-多重RT-Reahime PCR检测马铃薯黑环斑病毒的研究
马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)是马铃薯重要病毒病害之一.本研究根据PBRSV基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了两对巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了巢式-多重RT-Realtime PCR检测PBRSV的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM珊试剂盒快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR、多重PCR和探针检测技术.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达450fg/μL植物总RNA.利用4对引物和1条TaqMAN探针对PCR阳性产物进行确认,本方法检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高.
作 者：粟智平耿金培 鲁闽 张京萱 王颖 Su Zhiping Geng Jinpei Lu Ming Zhang Jingxuan Wan Ying 作者单位：烟台出入境检验检疫局,山东烟台,264000刊 名：检验检疫学刊英文刊名：INSPECTION AND QUARANTINE SCIENCE年，卷(期)：19(2)分类号：Q503 S435.32关键词：马铃薯黑环斑病毒(PBRSV) 巢式-多重RT-RealtimePCR 检测
多重PCR方法 篇3
动物线粒体基因具有种内高度保守性, 同时具有强的抗腐蚀性和耐高温性, 在国内外逐渐被应用于饲料、鲜肉及肉制品来源追踪和物种鉴定等研究。本研究根据线粒体基因组设计猪和牛线特异性的引物并对反应体系进行优化, 建立一种快速简便的鉴定牛肉和猪肉的多重聚合酶链反应 (PCR) 技术, 为杜绝贸易中的欺骗行为提供了快捷可靠的检验方法。
1 材料与方法
1.1 样品来源
本试验所用肉品均购于市场, 鼠肉来自本实验室, 腊牛肉及包装牛肉制品购于各大超市。
1.2 主要试剂
蛋白酶K、d NTP、10×PCR缓冲液 (含Mg2+) 、Taq DNA聚合酶、RNA酶、2 000bp DNA marker等购于北京天根生化科技有限公司。
1.3 引物的设计与合成
通过对Gen Bank TM上的牛、猪和多种其它哺乳动物的线粒体核苷酸序列进行比较, 在牛和猪线粒体核苷酸序列上种内同源性较高而种间又有一定差异的的位置设计牛和猪的特异引物, BPF:C G T G A A G A G G C G G G A A T G C A C A和BPR:TTTGGATCAATGAGCGATAGAGTG (序列登陆号:FJ997262) ;PPF:GAAACCAGACGAGCTACCYATGAG和PPR:CGTGTGCGAGGAGAAAGGC TTC (序列登陆号:GQ351599) ;引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.4 DNA模板的提取
按参照文献[5]提取DNA模版。
1.5 多重PCR的建立及反应条件优化
PCR反应 (引物对BP/PP) 以牛肉和猪肉阳性参照等量混合作为扩增模板, 扩增体系为25μL, 其中双蒸水19.75μL、10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs (2.5 m M) 0.5μL、引物 (50 pmol·L-1) 各0.5μL、Taq DNA聚合酶 (2.5 U·μL-1) 0.25μL、模板DNA 1μL。反应参数为:预变性94℃5min;变性94℃30s, 退火58~61℃30s, 延伸72℃30s, 循环30次;最后延伸72℃5min。
1.6 特异性试验
分别取1μL猪牛等动物基因组DNA作为扩增模板进行引物的特异性检测。同时设立以灭菌双蒸水代替模板的阴性对照。
1.7 敏感性试验
以牛肉和猪肉阳性参照等量混合作为标准模板DNA进行敏感性试验。将标准模板DNA分别按1∶10到1∶107稀释, 从每个稀释液各取1μL作为模板进行PCR扩增 (25μL反应体系) 。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8 市场样品的调查监测
市场买回的腊牛肉样品及包装牛肉制品切成片, 加入适量灭菌生理盐水, 放入50℃水浴锅中, 每隔十分钟换一次生理盐水, 共换3次, 按照1.4提取DNA模版, 然后按照1.5扩增体系和筛选的最佳退火温度进行多重PCR检测, 同时设计阳性和阴性对照。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 多重PCR的建立及最佳退火温度的确定
对牛肉和猪肉阳性参照模板等量混合进行温度梯度PCR扩增 (图1) 。从电泳检测结果可以看出, 当退火温度为59.0℃时, PCR扩增出二条明亮的条带, 选为最佳退火温度。
2.2 特异性试验
应用牛和猪线粒体序列特异性引物进行PCR扩增, 只有牛肉和猪肉基因组DNA样品能扩增出214bp和431bp的目的条带。上述其它肉品对照基因组DNA以及阴性对照均没有扩增产物出现 (图2) 。
2.3 敏感性试验
将阳性参照DNA连续稀释后, 进行多重PCR扩增, 结果表明, 多重PCR扩增引物可检测到最高达1×107倍稀释的阳性参照DNA (图3) , 即对模板最低可检测值为9.8×101fg/μL和6.7×101fg/μL。
2.4 市场样品的检测结果
对15份从市场购回的牛肉制品进行多重PCR检测, 其中包装牛肉制品8份, 5份检测结果为牛肉, 阳性率为62.5% (图4) ;熏腊牛肉制品7份, 3份检测结果为牛肉, 阳性率仅为42.9% (图5) 。
3 讨论
本研究对牛肉和猪肉和与其同源性较高的羊肉等线粒体基因序列进行分析比较, 设计了特异性引物BP和PP并优化了多重PCR反应体系, 使实验达到了最佳效果。用该特异性引物成功地建立了牛肉和猪肉多重PCR检测方法。特异性试验表明, 利用特异性引物对, 在牛肉和猪肉DNA模版同时存在的情况下, 能扩增出两条不同大小的目的片段, 而对其他对照基因组DNA则不能, 表明该特异性引物对具有很强的特异性, 在牛肉和猪肉的市场检测方面具有一定的实用价值。另外, 本研究采用多重PCR技术进行牛肉和猪肉检测, 其敏感性分别为9.8×101fg/μL和6.7×101fg/μL, 具有很高的敏感性。
本实验检测的15份样品中, 熏腊牛肉制品7份, 3份检测结果为牛肉, 阳性率仅为42.9%;包装牛肉制品8份, 5份检测结果为牛肉, 阳性率为62.5%。对熏腊牛肉制品, 参考其价格, 可以明显发现, 检测结果为牛肉的产品价格相对较高, 包装上产地厂家也较齐全, 而那些检测结果为猪肉的产品不仅价格低廉 (40~50元/kg) , 而且厂家信息也模糊不全。单从阳性率看, 熏腊牛肉制品惨假现象更严重, 阳性率仅为42.9%。但是由于经加工的包装牛肉制品是小块状, 很容易在其中掺入少量牛肉、牛筋和牛皮等含牛DNA的物质, 经过多重PCR扩增也能检测出阳性结果, 因此不能完全确定包装牛肉制品是100%的牛肉。另外, 检测的样品数量也有限, 不一定能完全代表市场现状。
另有2份检测出既不是牛肉又不是猪肉的样本, 电泳鉴定仅能观察到引物二聚体的条带, 可能是模板中含有强烈抑制Taq DNA聚合酶活性的物质, 也有可能是该制品使用的既不是牛肉也不是猪肉, 或加工过程中线粒体DNA被破坏了, 具体原因有待考察。对于其中一些知名厂家生产的腊牛肉, 检测结果虽为猪肉, 但未经场地调查之前尚不能确定是否为假冒该品牌的产品。
4 结论
本研究所建立的多重PCR检测方法具有很强的特异性和高度的敏感性, 对市场样品的检测具有较好的应用价值。
参考文献
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多重PCR方法 篇4
羊流产衣原体的PCR检测方法研究
根据羊流产衣原体16S rRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼农原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的`卵黄囊膜均未扩增出相应的片段.敏感性试验表明,该体系可检测到2 pg的衣原体DNA.
作 者：张莉 王英珍 鄢明华 李秀丽 ZHANG Li WANG Ying-zhen YAN Ming-hua LI Xiu-li 作者单位：天津市畜牧兽医研究所,天津,300112 刊 名：天津农业科学 英文刊名：TIANJIN AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)： 15(2) 分类号：S852.67 关键词：羊流产衣原体 PCR 检测多重PCR方法 篇5
由于PEDV、TGEV及RV有相似的临床表现和剖检变化,其鉴别诊断通常需要借助实验室诊断技术[4],如免疫荧光试验、病毒分离、PCR技术等[5]。传统的诊断技术,如免疫荧光试验、病毒分离等费力费时,不适合用于临床的快速诊断,也不适合用于大规模的流行病学调查;PCR技术具有很强的特异性,很高的敏感度;而多重PCR技术能够在一个扩增反应中同时检测多种病原体,在实验室诊断中具有较突出的优势。
本研究旨在建立一种能够快速检测PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR体系,并用于临床样本的检测,现将结果报道如下。
1 材料
1.1 疫苗、病毒
猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联弱毒疫苗,购自哈尔滨维科生物技术开发公司;猪瘟病毒(CSFV),购自广东永顺生物制药有限公司;猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、沙门氏菌、大肠杆菌,由天津市畜牧兽医研究所实验室提供;牛病毒性腹泻病毒(BVDV),由美国明尼苏达大学赠送;TGEV、PEDV、RV阳性质粒p MD-S、p MD-M和p MD-VP7,由天津市畜牧兽医研究所实验室制备;疑似病毒性腹泻粪样,采自天津、河北等地区发病猪场。
1.2 主要试剂
TRIzol试剂、反转录酶、RNA酶抑制剂、r Taq DNA聚合酶、d NTPs、100 bp DNA Marker、DL-2 000Marker,购自Ta KaRa公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.3 引物的设计与合成
根据Gen Bank登录的TGEV S基因、PEDV M基因及RV VP7基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增引物,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,多重RT-PCR引物设计见表1。
2 方法
2.1 病料处理
用p H值为7.4的PBS缓冲液将猪腹泻粪便样品稀释成浓度为100 g/L的悬液,4℃、3 000 r/min离心30 min;取上清液,于-70℃保存,备用。
2.2 RNA提取
采用TRIzol法提取RNA。取200μL待检样品分别加入TRIzol Reagent 600μL,振荡混匀,室温作用5 min;加入200μL氯仿,振荡混匀,室温作用5 min;4℃、12 000 r/min离心10 min;取上清液至新的1.5 m L离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温放置15 min;4℃、12 000 r/min离心10 min;弃上清液,用500μL 75%乙醇洗涤;4℃、12 000 r/min离心10 min;自然干燥,用20μL DEPC水溶解。
2.3 c DNA合成
反转录体系(总体积为20μL):50 pmol/μL RNA模板10μL,5×RT Buffer 4μL,随机引物1μL,d NTP Mix 2μL,Mg Cl22μL,40 U/μL RNA酶抑制剂0.5μL,5 U/μL反转录酶0.5μL。
反应程序:30℃10 min;42℃60 min,99℃5 min,4℃5 min;c DNA合成结束后,进行PCR扩增或-20℃保存,备用。
2.4 单项PCR最佳退火温度的确定
以PEDV、TGEV、RV的c DNA为模板,分别应用表1中的3对引物进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积为20μL):10×PCR Buffer 2μL,2.5 mmol/L d NTPs2μL,Mg Cl21μL,上、下游引物各1μL,5 U/μL r Taq DNA聚合酶0.5μL,c DNA模板5μL,用去离子水补至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃30 s,退火温度分别为54℃、56℃、58℃、60℃、64℃,72℃45 s,共30个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存,备用。
2.5 多重PCR引物浓度的优化
在单对引物扩增成功的基础上,将表1中的3对引物同时加到扩增体系中,建立多重PCR扩增反应体系,对多重PCR反应体系的引物浓度进行优化。PCR结束后,取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2.6 多重PCR特异性试验
以CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PPV、JEV、BVDV、大肠杆菌、沙门氏菌等病原体的核酸为模板,同时以TGEV、PEDV、RV为阳性对照,进行同等条件下的多重PCR扩增,反应结束后取5μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.7 多重PCR敏感性试验
将p MD-S、p MD-M和p MD-VP7阳性质粒稀释为1×101~1×105拷贝/μL,每种标准品取1.0μL,加到同一多重PCR反应体系中,验证所建立方法的敏感性。反应结束后取5μL反应液用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2.8 多重PCR的临床检测
采集天津、河北等地区的疑似病料样品78份,用已建立的多重PCR方法检测,并分析检测结果。
3 结果与分析
3.1 单项PCR最佳退火温度的确定
采用不同退火温度对PEDV、TGEV、RV进行PCR扩增,退火温度范围为54~64℃,结果5个温度都有目的条带,其中PEDV的最佳退火温度为60℃和64℃,5个退火温度均能扩增TGEV和RV,见图1~3,为防止非特异性扩增,本试验选定64℃作为退火温度。
M.DL-2 000 Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
M.100 bp DNA Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
M.100 bp DNA Marker;1~5.退火温度分别为54,56,58,60,64℃。
3.2 多重PCR引物浓度的确定
通过对引物浓度的摸索,结果表明:PEDV的上、下游引物浓度各为0.7μL,TGEV的上、下游引物浓度各为0.75μL,RV的上、下游引物浓度各为0.6μL,该条件下扩增效率最优,见图4。最终PCR反应体系(总体积为20μL):10×PCR Buffer 2μL,2.5 mmol/L d NTPs 2μL,Mg Cl21μL,3对引物(各单条引物终浓度均为10μmol/L)分别为PEDV引物0.7μL、TGEV引物0.75μL、RV引物0.6μL,5 U/μL r Taq DNA聚合酶0.5μL,c DNA模板2μL,用dd H2O补充至20μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸45 s,共30个循环;72℃再延伸10 min;4℃保存,备用。
M.DL-2 000 Marker;RV、PEDV和TGEV引物量分别为:1.1μL、1μL、1μL;2.0.6μL、0.7μL、0.75μL;3.0.5μL、0.6μL、0.6μL;4.0.3μL、0.4μL、0.3μL。
3.3 多重PCR特异性试验
对PEDV、TGEV和RV进行多重PCR扩增,同时对猪常见的病毒病病原进行PCR扩增,结果显示,多重PCR仅扩增出PEDV、TGEV和RV的目的条带,而未曾扩增出其他病毒,说明本试验建立的多重PCR具有很好的特异性,见图5。
M.100 bp DNA Marker;1.CSFV;2.PRRSV;3.PRV;4.PCV-2;5.PPV;6.JEV;7.BVDV;8.大肠杆菌;9.沙门氏菌;10.PEDV阳性对照;11.TGEV阳性对照;12.RV阳性对照;13.PEDV+TGEV+RV阳性对照;14.空白对照。
3.4 多重PCR敏感性试验
以已测得的含目的片段的阳性质粒作为模板,稀释成1×101~1×105拷贝/μL的5个不同浓度,进行PCR扩增反应,结果见图6。
由图6可知,最低检测浓度为1×102拷贝/μL。
3.5 多重PCR的临床检测
应用建立的多重PCR方法对天津和河北等地区的78份疑似腹泻粪样进行检测,结果在78份样品中检测到PEDV阳性37份,阳性率为47.44%;TGEV阳性10份,阳性率为12.82%;RV阳性4份,阳性率为5.13%;PEDV、TGEV和RV均为阳性2份,阳性率为2.56%。该试验结果表明,阳性样品的PCR检测结果出现3条特异性片段,可用于临床病例的检测与诊断。
M.DL-2 000 Marker;1.空白对照;2.1×105拷贝/μL;3.1×104拷贝/μL;4.1×103拷贝/μL;5.1×102拷贝/μL;6.1×101拷贝/μL。
4 讨论
1)本试验针对TGEV S基因、PEDV M基因及RV VP7基因保守序列设计引物,建立了检测3种病毒的多重PCR方法,扩增得到的特异性片段长度分别为299 bp、437 bp和639 bp,目的片段之间具有明显的长度差异,便于鉴别,而且单对引物的扩增特异性强,扩增效率高。
2)在多重PCR方法建立过程中,引物是最关键的因素。在引物设计时,除了考虑每对引物的特异性及扩增效率之外,还应尽量减少不同引物之间形成二聚体和交叉配错的可能。此外,还需要对各对引物浓度配比及退火温度等条件进行优化,以便确定最佳反应体系和最佳反应温度。
3)本试验所建立的TGEV-PEDV-RV多重PCR方法具有较高的敏感性,能检测出1×102拷贝/μL浓度的阳性质粒模板。该方法和传统PCR方法检测单一病原体相比具有较大优势,能同时检测3种病原,且具有方便、灵敏、快捷等优点,适于动物疫病的流行病学调查和临床病例的快速检测。
4)应用本试验所建立的TGEV-PEDV-RV多重PCR对78份疑似腹泻粪样进行检测,结果表明,多重PCR方法不仅省时、省力,而且具有敏感性高、特异性强等优点,具有较高的实用价值。
参考文献
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多重PCR方法 篇6
1 反应体系及其优化
1.1 引物
在多重PCR反应中, 引物的设计至关重要, 它是影响多重PCR反应成败的关键[4]。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与灵敏度, 并且需要根据经验来调整多重PCR反应中各对引物之间的浓度差异。引物设计时需严格遵循引物设计原则进行, 通过微机帮助寻找有利于成功的设计引物, 合适的引物既能增加特异性又能增加敏感性。目前, 使用频率较高的引物设计软件主要是Oligo和Primer Premier, 前者已见有7.4版本, 后者已现6.0版本。软件在引物设计功能上首先体现在引物分析评价功能方面, 其中以Oligo 软件最优秀;其次是引物的自动搜索功能, 则以Primer Premier 为最强且方便易用。因此, 笔者认为以Primer Premier进行自动搜索, Oligo进行分析评价, 这样便可设计出成功率很高的引物。在多重PCR反应中, 引物设计应注意:1) 引物长度。单条引物的长度最好介于18~24 bp之间, 引物太长, 容易导致引物间的相互缠绕, 严重影响多重PCR反应结果。2) 引物同源性。为了避免引物的非特异性扩增, 引物必须高度特异, 引物之间彼此应无同源性[4]。3) 引物碱基。要充分考虑不同引物对之间互补的碱基序列, 特别是引物二聚体的形成, 这将严重影响到引物的有效性。所有的引物对最好有相近的退火温度, 引物的碱基构成最好是4种碱基的比例相当, G+C的含量应为40%~60%。引物的序列最好以1~2个GC开头或结尾, 避免3′端以A结尾。引物设计好后, 应将设计的引物序列与数据库中的核苷酸序列进行比对。此外, 如果扩增位点非常相似, 存在交叉反应, 那么在引物的3′末端至少有1~2个特异性的碱基用于目的基因的特异性扩增。4) 引物浓度。引物的浓度影响多重PCR反应的结果, 研究表明太高的引物浓度或太低的引物浓度在多重PCR反应中都应避免[6]。通常引物浓度为400 μmol/L, 浓度过高凝胶电泳时会出现引物条带[7]。
1.2 缓冲体系
研究表明, 96孔板的PCR反应塑料管对于小体积PCR反应是非常理想的。在反应中, 不论是100 μL、25 μL或是5 μL的反应体积, 均能使PCR得到有效的扩增, 所选体系要根据实际需要和经济实用而定。如果反应模板的浓度低, 小体积的PCR反应体系能够得到更好的反应结果。一般在标准25 μL体积的反应溶液中, 缓冲液的终浓度为1×Buffer时, 但有时为了能更好地扩增出目的片段, 特别是扩增片段的长度为100~1 000 bp时, 提高终浓度到 (1.4~2) ×Buffer, 或者提高KCl的浓度到 (70~100) μmol/L, 能够明显提高反应的扩增效率。一般说来, 为了扩增出长目的片段引物, 在高盐条件下扩增的效果会更好, 而扩增短目的片段引物则在低盐条件下效果更好。
1.3 模板和聚合酶浓度
1) 模板。
首先, 高质量的模板 (DNA或cDNA) 是PCR成功的保证, 原料中不能混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶的抑制剂和能结合DNA的蛋白质。Chamberlain J S等[1]研究表明, 在反应前使用多种限制性酶对样品中除模板以外的其他核酸进行消化, 能大大增加反应的特异性和产量。其次, 模板的量与循环数要匹配, 如果循环数一定, 模板的量太少, 会出现阴性结果或条带很弱;模板的量太多, 则会出现条带弥散, 模糊不清。第三, 在提取模板时, 细菌量不宜加入太多, 否则因为裂解不完全, 菌体蛋白会抑制DNA聚合酶活性, 造成假阴性结果[4]。理论上, PCR最基本的特征之一是对DNA模板的质和量要求都不太高。单、双链DNA或RNA, 一个细胞或简单地煮沸细胞得到的粗制溶解物, 或仅含几百个碱基的中等大小的DNA样品均可作为扩增模板, 并可以成功地扩增DNA片段 , 但研究发现模板DNA的质和量常是影响PCR扩增结果的重要因素[8]。研究表明, 当DNA模板浓度低于30 ng时, PCR扩增的数量将明显减少[6]。如果DNA模板浓度非常低 (达皮克级) , 可以通过调整退火温度和改变反应的其他条件也能让多重PCR有效进行。
2) 聚合酶浓度。
最有效的Taq DNA聚合酶浓度为每25 μL 0.4 U。如果聚合酶浓度过高, 将会导致不平衡的扩增及非特异性条带的扩增。
1.4 dNTP和Mg2+浓度
1) dNTP浓度。
在PCR反应中, dNTP的最佳浓度在 (200~400) μmol/L时特异性和灵敏度较好[9]。如果高于这个浓度, PCR的反应将会被迅速抑制。当dNTP的浓度低于50 μmol/L时, 扩增目的片段的产量将会大大降低。反复冻融对于dNTP是非常敏感的, 因此有必要将dNTP进行分装, 避免反复冻融。此外, 在使用之前将dNTP进行短暂离心以避免因冻存导致的反应浓度的改变。
2) Mg2+浓度。
在PCR反应中, Mg2+的浓度也决定着PCR反应的成功与否。反应中dNTP和MgCl2的浓度应该平衡, 除了DNA聚合酶需要自由的镁离子, 模板DNA也需要自由的镁离子。研究表明, 当Mg2+浓度在1.5~2 mmol/L时, dNTP的浓度在200 μmol/L时能够得到较好的反应[1,6]。Taq酶的活性表达与Mg2+浓度有极大的关系, 在低Mg2+浓度下使用低Taq酶量, 反应效果较差, 而在高Mg2+浓度下, 同样的低Taq酶量, 则可扩增出较好的谱带[10]。
2 反应条件及其优化
2.1 退火温度
在多重PCR反应中, 退火温度是另一个最重要的需要调整的因素。通常依据引物的解链温度选择退火温度, 但有的时候其结果和预期并不一致。最简单的方法就是使用54 ℃作为最初的退火温度, 如果多重PCR扩增产生非特异性条带, 就应该适当提高引物的退火温度, 反之则降低反应的退火温度。此外, 也可以通过改变多重PCR反应的其他成分使目的片段得到有效扩增。Henegariu O等[5]研究表明, 尽管单个目的片段能够在 56~60 ℃特异性地扩增, 但是在多重PCR反应中, 降低 4~6 ℃的退火温度能够更好地用于所有目的片段的扩增。
2.2 循环数量
一般说来, 对于普通的PCR反应, 30个循环就能够有效地扩增目的片段, 增加循环数并不能明显地改变扩增片段的产量。研究表明, PCR产物量增加最明显是在2个循环附近, 通常对于1个反应, 28~30个循环就足够了。循环参数:1) 变性。一般94 ℃ 30 s即可, 时间过长温度过高, 都会加速酶的失活。在第1个循环变性前, 维持 94 ℃ 1~3 min, 有利于打开模板的二级结构。2) 复性。复性温度影响PCR的特异性, 温度升高, 特异性增强, 但是温度过高, 引物与模板不易结合, PCR反应效率降低;温度过低, 非特异性结合增加。一般复性温度比引物-模板解链温度 (Tm) 低 5~10 ℃, 可用公式:Tm = 4 (G+C) +2 (T+A) 进行计算。降落PCR是增加PCR反应特异性的一个比较好的办法, 即随着循环数的增加, 复性温度逐渐降低;因此, 降落PCR既能增加反应特异性, 又能提高产量[11]。3) 延伸。延伸温度一般为72 ℃, 延伸时间长短取决于扩增片段的长短。一般来说, Taq酶在72 ℃左右, 每分钟可延伸1 000个碱基, 但是随着循环数的增加, 应逐渐增加延伸时间 (如每个循环增加3~5 s) 。随着反应进行, 各种试剂浓度降低, 特别是Taq酶的浓度和活性降低, 降低了反应效率;因此, 适当增加延伸时间可弥补这一不足。
2.3 辅助剂
使用一定浓度 (5%~10%) 的辅助剂能够改进多重PCR反应的有效性和特异性。在多重PCR反应中, 5%的二甲基亚砜或5%的甘油可改进某些目的片段的扩增效率, 但同时也会减少其他目的片段的扩增。因此, 是否使用辅助剂还取决于具体的反应。
综上所述, 进行多重PCR试验时不应墨守陈规, 而应该根据实际情况对试验条件进行优化, 尽可能避免某些因素影响PCR的试验结果, 从而使试验更加准确, 相信今后多重PCR会在疾病的临床诊断和流行病学方面发挥更大的作用。
参考文献
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多重PCR方法 篇7
1 原理及技术特点
PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶莲式反应, 是1985年美国科学家Mullis发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。原理是首先将靶DNA双链加热变性为单链, 然后加入两段人工合成的与靶DNA两端正邻近序列互补的寡核苷酸片断作为引物 (Primer) , 即左端引物和右端引物;该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后, 在有DNA聚合酶和4种d NTPs底物存在的情况下, 引物沿模板DNA链按5’→3’方向延伸, 自动合成新的DNA双链。新合成的DNA双链又可作为扩增的模板, 继续重复以上的DNA多聚酶链反应。经过25~35次循环, 可将靶DNA序列扩增近百万倍。PCR技术最早应用于基因克隆和转基因检测, 但由于其准确、微量的特点, 已经广泛应用到其他领域。随着对一些主要食品微生物遗传性质了解的逐渐深入, 许多致病菌的遗传背景进一步明了, PCR技术在食品检测中也逐渐显示出其应用前景。利用PCR技术从食品中检测病原微生物近几年才得到比较广泛的应用。
多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的原理与常规PCR基本相同, 只是在同一反应体系中加入一对以上的特异性引物, 如果存在各对引物特异性互补的模板, 则可以同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段[1]多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术, 是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多功能条目的DNA片段的方法, 采用这一技术可同时检测多种病原微生物。该技术已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用[2]。
2 主要流程及影响因素
多重PCR的各反应条件均能不同程度的影响扩增反应的结果, 其中退火温度及各引物浓度配比为主要影响因素。各引物在反应中成竞争关系, 目的片段种类越多, 引物间竞争越激烈。在一定范围内, 该引物在体系中使用的量, 与电泳结果中其目的条带的明亮程度成正比关系, 然而使用过多会导致对其他引物的抑制。这是由于在反应中, 酶与d NTP的供应量是有限的。一只在前儿个循环中, 某一产物的量远远大丁另外的产物, 在之后的指数级扩增中, 其他的扩增产物的量就变得相对微弱了, 这是引起多重PCR假阴月性结果或灵敏度降低的重要原冈。所以, 扩增反应最后的成功, 需取决一定程度的经验积累和摸索。
2.1 引物设计
PCR引物对扩增的特异性起着关键的作用, 引物的优劣直接关系到PCR扩增的特异性和成功与否。引物位于待分析基因组中的高度保守区域, 长度为18~30个碱基为宜。多重PCR引物对的最适退火温度要尽可能的相同, 这样有助于多重PCR选择的退火温度保证每对引物都有相同的扩增效率。应尽量确保所有引物间没有任何形式的相互作用, 在引物设计时可通过分子生物学软件进行分析。扩增产物的大小要能通过电泳或其他方法区分开。
2.2模板提取
PCR检测方法的可靠性一部分依赖于目标模板的纯度和足够的目标分子数量, 模极量太少, 会出现阴性结果或条带很弱:模扳量太多则会出现条带弥散, 模糊不清;模扳纯度低或被降解会导致扩增的不整齐[3]。根据研究, 模板提取方法的差异与操作不当亦可以导致扩增失败。提取效率的差异, 直接影响着检测的灵敏度。据国内外学者研究chelex–100离子交换树脂提取细菌DNA的效果良好[4,5]。该法具有提取纯度高、速度快、操作简便、高度灵敏、低成本等优点, 弥补了传统方法提取效率低、长时间高温引起DNA降解、产物中杂质成为Taq E的抑制剂、抽提过程DNA损失较多等缺陷。多重PCR方法在大规模投入食品检测的应用之前, 尚需在这方面做进一步研究。
2.3 Taq DNA聚合酶
多重PCR反应体系中同时存在多个DNA扩增反应, 不同反应之间对Taq酶存在竞争, 这种反应之间的竞争会使效率相对较低的DNA扩增受到很大程度的抑制。在多重PCR体系中适当多加入一些Taq酶可减弱竞争产生的抑制作用, 但Taq酶过多则极易造成非特异性扩增。通常可根据不同产品的说明书为基础进行凋整优化。
3 多重PCR在食品安全检测中的应用
在同一PCR反应管中同时加入多种病原细菌的特异性引物进行多重PCR扩增, 可快速实现多种病原细菌的同时检测和分析。目前大多数病原菌对人感染剂量很低, 1~10CFU的菌体细胞就足以对人致病。vantarakis等人调查发现90%蚌类海产品都易同时污染沙门氏菌和志贺氏菌, 其采用多重PCR扩增, 增菌后可同时检测到10~100CFU/ml的沙门氏菌和志贺氏菌[6]。肉制品中常易同时污染金黄色葡萄球菌, 李博、陈福生等人建立了可同时检测食品中金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌的多重PCR方法[7]。
4 存在问题和技术展望
多重PCR在实际应用中一旦有极少量外源性DNA污染, 就可能出现假阳性结果;多对引物同时扩增, 各种试验条件控制不当, 很容易导致扩增失败或非特异性产物;引物的设计及靶序列的选抒不当等都可能降低其灵敏度和特异性。此外, 对食品样品进行检测时, 增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓慢或被抑制, 导致假阴性的结果。
今后的技术发展尚需延伸: (1) DNA模板的提取和纯化方法。 (2) 反应条什的优化。 (3) 增加反应引物对数, 真正实现高通量。 (4) 与其他分子生物学技术相结合。
参考文献
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多重PCR方法 篇8
1多重PCR技术的基本原理
多重PCR技术是PCR技术的一种, 由Chamberian等在1988年率先报道。该技术具有高度特异性、敏感性、高效快捷、实验成本低、实验进程快等优点, 并迅速在人类、动物以及微生物研究方面得到广泛应用。其原理与PCR技术原理基本一致, 指在同一反应体系中加入两对或多对特异性引物, 同时扩增多个目的基因或DNA序列。在各种生物基因组中存在连续的20~30个相同或者互补碱基的概率几乎不存在, 并且DNA聚合酶具有非常高的复制准确活性。所以在多重PCR反应体系中, 由各引物交叉结合而造成的非特异性扩增的可能性十分小, 保证了多重PCR的特异性。多重PCR不但可同时扩增多条目的片段, 节省了试剂和时间, 而且减少了污染的机会。理论上只要条件允许, 引物对的数量可以不限, 目前有扩增9条目的片段的记录。但该技术需要对反应体系和反应条件进行多次优化。
2多重PCR技术在猪病检测中的应用
2.1多重PCR用于常规猪病诊断
2.1.1病毒常规检测焦洋等[1]根据猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) S基因序列、猪流行性腹泻病毒 (PEDV) M基因和猪博卡病毒 (PBo V) NP1基因序列, 设计合成3对特异性引物, 建立了检测TGEV、PEDV和PBo V的多重PCR方法, 用该方法检测60份临床样品, 得出TEGV阳性率为1.6%, PEDV阳性率为6.7%, PBo V阳性率为21.7%。Xu等[2]建立了检测圆环病毒2型 (PCV2) 、伪狂犬病毒 (PRV) 、猪细小病毒 (PPV) 、经典猪瘟病毒 (CSFV) 、蓝耳病病毒 (PRRSV) 、乙型脑炎病毒 (JEV) 的多重PCR, 该技术可同时鉴别诊断6种常见病毒病, 且对各类病毒的灵敏度均高于普通PCR, 各引物之间没有交叉反应, 特异性高。Ogawa等[3]建立了可检测盖塔病毒 (GETV) 、TGEV、猪轮状病毒A型 (GAR) 、PEDV、JEV、PRRSV、PPV、猪水泡病毒1型 (Su HV-1) 和PCV2的9重PCR检测方法, 使用该方法检测75份临床样本, 其检测结果与普通PCR的结果相一致, 表明该方法具有良好的灵敏性和特异性。
2.1.2细菌常规检测Rossi等[4]基于SCAR片段建立的三重PCR可准确鉴别诊断胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌以及多杀性巴氏杆菌, 该方法与普通PCR结果相一致, 对临床疾病的诊断和流行病学调查有重要意义。李伟杰等[5]分别针对志贺毒素Stx2e A亚基、大肠埃希菌16S r DNA和菌毛F18ab A亚基的保守序列设计合成3对特异性引物, 优化并建立了多重PCR, 结果与其他猪常见致病菌均无交叉反应。该方法对猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断及流行病学调查具有一定的应用价值。安俊卿等[6]根据沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌kmt1基因和大肠埃希菌23S r RNA基因设计并合成3对特异性引物, 通过优化反应条件建立了多重PCR方法, 结果对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×104CFU/m L、1.99×104CFU/m L、2.01×104CFU/m L。该方法特异性强、敏感度高、稳定性好, 能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。
2.2多重PCR用于猪病分型鉴别
2.2.1病毒的分型鉴定王晓波等[7]根据Gen Bank中公布的已知序列对CSFV、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 (HP-PRRSV) 及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒 (C-PRRSV) 分别设计特异性引物, 优化并建立了多重RT-PCR方法, 结果显示可用2对引物同时检测这3种病毒。徐磊等[8]根据猪圆环病毒1型 (PCV-1) 、圆环病毒2型a (PCV-2a) 以及圆环病毒2型b (PCV-2b) 序列的差异设计了3对特异性引物, 并通过优化反应条件建立了三重PCR方法, 结果表明该方法灵敏性高、引物特异性良好, 各引物之间没有出现交叉反应。用此方法对采集自陕西省的56份样品进行检测, 其检测结果与单重PCR检测结果的符合率达99%以上。
2.2.2细菌的分型检测Liu Z等[9]利用全基因组高通量测序设计特异性引物, 完成了多重PCR的建立, 用该方法对链球菌进行鉴别诊断, 结果显示:经过4次多重PCR, 成功鉴别出了33种血清型。张亮等[10]根据JEV基因I型和基因III型的保守序列设计特异性引物, 并对反应体系及条件进行优化, 建立了多重RT-PCR方法, 用该法检测27份临床样品, 结果灵敏且特异性地检测出了5份为基因I型, 2份为基因III型, 与核苷酸序列分析结果一致。
2.3多重PCR与其他技术的创新结合
2.3.1与荧光定量PCR技术结合王乃福等[11]根据口蹄疫病毒 (FMDV) 3D蛋白编码基因、水疱性口炎病毒 (VSV) N蛋白编码基因和猪水泡病病毒 (SVDV) VP1蛋白编码基因的高保守区设计了特异性引物和探针, 成功建立了可同时检测这三种病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。结果经扩增显示, 该方法灵敏度高, 特异性良好, 可实现对多种病毒混合感染的同时检测。Zhao等[12]结合荧光定量PCR技术与多重PCR技术成功地建立了一种快捷高效的荧光定量多重PCR检测方法, 用于鉴别猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 的经典株和变异株。该方法针对PEDV保守序列中的S基因设计两套引物, 可对不少于5×102DNA拷贝数进行检测。使用该方法检测42份临床腹泻病料, 其中36份为变异毒株, 3份为经典毒株。
2.3.2与不对称PCR和悬浮阵列技术结合Chen等[13]结合不对称PCR技术、悬浮微阵列技术以及多重PCR技术, 成功建立了一种可同时检测PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV、PPV的诊断方法。用该方法检测219份临床病料, 检测率均高于RT-PCR和不对称PCR, 且从提取病毒核酸到显示检测结果只需2 h。
2.3.3与LAMP技术结合Park等针对引起猪增生性肠病的胞内劳森氏菌的不同基因设计了4段引物, 将多重PCR与环介导等温扩增技术 (LAMP) 相结合, 所建立的新方法特异性强, 灵敏性是RT-PCR的10~100倍, 同时节约了试剂成本和检测时间。
2.3.4与基因芯片技术结合王小强等[14]针对PCV-2、PPV、PRV、SIV、CSFV、FMDV和PRRS建立的多重不对称PCR扩增方法与寡核苷酸基因芯片相结合, 杂交反应中使用胶体金进行标记, 最后用银染试剂进行显色, 建立了可同时检测7种常见猪病的可视化寡核苷酸基因芯片, 其检测结果与普通PCR检测结果的符合率为100%。基于多重PCR技术的寡核苷酸可视化基因芯片, 具有灵敏性高、节约费用和省时等优良特性。
3多重PCR技术的应用前景
多重PCR技术以其快速、高效、特异性好、灵敏度高的优点在病原检测方面与流行病学调查方面具有重要作用[15]。多重PCR在反应过程中可能存在多对引物之间的相互抑制, 引物与非靶序列结合可能产生非特异性扩增, 因此在确立多重PCR实验方案时, 首先应合理设计引物, 同时重视优化反应体系中的主要成分和反应条件, 以减少非特异性扩增和假阳性。除此之外, 多重PCR作为一种灵敏快速、高通量的特异性扩增技术常常与其他方法结合使用, 如在硅玻基片中完成系列核酸扩增反应的多重PCR基因芯片技术、LAMP技术、实时多重PCR技术、巢式多重PCR、荧光定量多重PCR等。但其在实际应用中也存在不少问题, 一旦有极少量外源性DNA污染, 就可能出现假阳性结果;且反应为多对引物同时扩增, 若各种实验条件控制不当, 很容易导致扩增失败或出现假阳性、假阴性等非理想结果。
多重PCR方法 篇9
1 材料与方法
1.1 菌株来源
84株金葡菌均为我科2008年1月~2009年1月从临床标本中分离的菌株,分别来源于痰液、脓液、血液、分泌物、腹腔引流物、肾囊肿穿刺液、胸腔积液、脓疱液、疱液、导管下段及导管尖端,经美国DADE-BERING公司Walk Away-40全自动微生物分析仪鉴定核实为金葡菌。
1.2 细菌鉴定质控菌株
金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。
1.3 仪器与试剂
Walk Away-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。
1.4 引物设计
根据Gen Bank中已发布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[2]设计mec A基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。
mec A:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P25'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。
PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P25',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。
TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。
1.5 细菌DNA的提取
将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24 h培养的单个菌落,置于100μl裂解液(1 mol/L Na OH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷却后用等量的1 mol/L盐酸中和,离心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400μ无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30 min,13 000 r/min离心15 min,弃上清。加入70%乙醇200μl,静置5 min,13 000 r/min离心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。
1.6 多重PCR扩增体系及反应条件
把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20μl反应体系,模板1μl,起始引物和终末引物各1μl,d NTP 1.5μl,Taq酶0.2μl,10×Buffer 2μl,Mg2+2μl,双蒸水11.3μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。
1.7 序列测定
将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与Gen Bank中的核苷酸序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析
84株金葡菌中检出mec A基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。
(1~6、9~11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)
2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点
PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。
2.3 测序结果的分析
将测序结果与Gen Bank中的已有序列进行比较,同源性为100%。
3 讨论
最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mec A)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mec A基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。
PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。
TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。
摘要：目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。
关键词：金黄色葡萄球菌,中毒休克综合征毒素-1基因,杀白细胞毒素基因
参考文献
[1]Becker K,Friedrich AW,Lubritz G,et al.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J].J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.
[2]Yamasaki O,Kaneko J,Morizane S,et al.The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection[J].Clin In-fect Dis,2005,40(3):381-385.
[3]姚春艳,府伟灵.葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(1):104-106.
[4]马筱玲,孙光明,戴媛媛,等.金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].临床输血与检验杂志,2007,9(1):18-20.
[5]Lopez-Aguilar C,Perez-Roth E,Moreno A,et al.Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylo-coccal disease[J].J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.
[6]闫中强,沈定霞,罗燕萍,等.多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(4):255-259.