实时荧光PCR技术（精选8篇）
实时荧光PCR技术 篇1
聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。该技术被广泛应用于基础研究, 成为分子生物学、鉴别遗传疾病和快速检测病毒和病菌感染必不可少的研究工具。由于传统的PCR技术存在, 不能准确定量, 且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点, 使其应用受到局限。对PCR产物进行准确定量成为PCR技术发展的重要方向。定量PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) 先后出现了多种方法, 目前为止, 其中结果最为可靠的就是实时荧光定量PCR (Rea1 Time Fluorescent Quantitative PCR, Real-time QPCR) 。1996年, 美国Applied Biosystems公司首先推出实时荧光定量PCR技术。该项技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 利用荧光信号来实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板浓度进定量分析。其特点有: (1) 用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量, 进行实时动态连续的荧光监测, 避免终点定量的不准确, 并且消除了标本和产物的污染, 且无复杂的产物后续处理过程。 (2) 荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA, 或荧光探针特异结合目的检测物等方法获得, 大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确。Realtim Q-PCR可以应用于m RNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
1 实时荧光定量PCR技术的基本原理
实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来, 其基本原理是相同的, 主要不同之处是其定量的体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出, 利用荧光信号积累, 实时监测整个PCR进程, 在PCR循环中, 测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值 (Threshold Cycle) 概念, Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数, 是PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号, 可以用于定义一个样本的C值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线, 然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率, 所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数 (R2>0.99) , 这样才能认为实验的过程和数据是可信的, 使用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量PCR仪都有软件, 可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类
目前, Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种, 也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测, 这些方法有着相近的灵敏感度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子, 如SYBR greenⅠ。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法, 在PCR反应体系中, 加入过量SYBR greenⅠ荧光染料, SYBR greenⅠ荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何ds DNA序列的扩增, 不需要探针的设计, 使检测方法变得简便, 同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何ds DNA结合, 因此它也能与非特异的ds DNA (如引物二聚体) 结合, 使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲 (Melting Curve) 分析的软件加以解决。由于SYBR GreenⅠ对PCR有一定的抑制性, 并且荧光强度较低, 稳定性差。近来试剂公司针对SYBR GreenⅠ存在的缺点开发了一些性能改进的染料, 如SYBR GreenⅠ、SYBR Green ER、Eva Green TM等。荧光定量PCR所用到的探针可分为以下几类:内掺式染料、序列特异性探针、特异性引物、阴阳探针。
2.1 SYBR GreenⅠ染料
反应体系中, 加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。其优点是对模板没有选择性, 使用方便, 非常方便, 但也易与容易与非特异性双链DNA结合, 产生假阳性, 可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件。
2.2 Taqman探针
目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TagMan系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶 (例如Taq酶) 的5'-3'活性所降解, 探针的5'端有一荧光报告基团, 3'端有一荧光淬灭基团, 当两个基团相互先靠近的时候, 由于发生能量传递作用, 报告基团不能发出荧光, 但随着扩增反应的进行, 5'端的报告基团随着探针的水解而脱落下来, 不再与淬灭发生能量传递作用, 从而能发出荧光, 被信号探测器所捕获。针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题, 2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3′端采用了非荧光性的淬灭基因, 吸收报告基团的能量后并不发光, 大大降低了本底信号的干扰。此外, MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽, 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好, 荧光背景更低, 使得信噪比更高。
2.3 Scorpions
它由两个寡核苷酸分子组成, 一个是引物, 另一个是带荧光分子的探针, 但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连, 在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 不发荧光。变性阶段, 探针的发夹结构会解开, 在退火时则与模板相结合, 形成线性分子, 报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上, 要求绝对保守, 长度为25~32bp, Tm在68~70度之间, 探针的5'端不能为G, 避免多个碱基同时出现, 尤其要避免4个G同时出现, 另外, 探针应靠近上游引物。
2.4 分子信标
分子倍标 (Molecular Beacon) 是一种单链DNA形成的发夹结构, 在其一端有一报告基团, 在另一端有一淬灭基团, 当它形成发夹结构时, 由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 两者之间发生荧光信号能量共振转移, 当热循环温度达到分子Beacon的解链温度时, 其构象改变, 与模板结合而完全伸展成线性分子, 使得FRET消失, 报告基团发出荧光信号。荧光基团被激发时, 淬灭作用被解除, 发出激发光子。
3 实时荧光定量PCR技术的实验方法
3.1 RT-PCR
以RNA为起始实验材料。分为两种: (1) 一步法, 反转录反应和PCR反应在同一反应管中进行。操作简单、反应连续、污染几率低, 适合于病原体的检测。 (2) 二步法, 反转录反应和PCR反应分两步进行, 反转录反应液 (cDNA) 作为PCR反应的模板, 适合于mRNA表达量的解析。
3.2 PCR
以DNA材料为起始实验。
4 实时荧光定量PCR技术存在的问题及应用前景
实时荧光定量PCR技术由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点, 是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法, 与传统的PCR技术相比, Real-time Q-PCR的不足之处是 (1) 由于运用了封闭的检测, 减少了扩增后电泳的检测步骤, 因此也就不能监测扩增产物的大小; (2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性, 从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式检测的应用能力; (3) 目前Real-time Q-PCR实验成本比较高, 从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展, 目前Real-time QPCR已成为科研的主要工具, 使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的研究手段, 该技术未来的应用前景是非常广阔的将成为生物定量分析的强有力段。
摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系, 经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度, 其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法, 而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比, 实时定量PCR能够更加快速、灵敏, 并有效地对核酸进行实时定量检测。
关键词：实时荧光定量PCR,荧光染料
实时荧光PCR技术 篇2
工作原理：
荧光定量PCR仪，是采用一种新的核酸定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的仪器。其主要部件包括产生温度梯度的热力学结构、进行荧光激发的激发光源、对发射光进行检测的检测系统以及数据获取分析软件工作站
用途：
实时荧光PCR技术 篇3
关键词：实时荧光定量PCR技术,优点与缺陷,应用情况,研究探讨
实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈,与常规PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点,使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。
1 实时荧光定量PCR技术的原理
在实时荧光定量PCR技术中,它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是,当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线,所以,依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系,因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。
相比于常规PCR,实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环,模板的初始量可以定量分析。简言之,实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增,正比于产品的对数扩增样品的DNA含量,因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。
2 实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷
2.1 实时荧光定量PCR技术的优势
与传统的PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处,具体如下[2]:
(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究,极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用;
(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度:科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量,检测极限能够实现10 cells/样品[4];
(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量,简便快捷:对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线,通常可以超过7个数量级以上;
(4)实时荧光定量PCR技术安全性高:在样品的定量检测在PCR反应完成后,没有进一步的后续处理,减少了工作量,以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide,EB)等诱变风险的过程。
2.2 实时荧光定量PCR技术的缺陷
实时荧光定量PCR技术是一种高效,灵敏,安全的分子生物学手段,已经成为主流定量核酸的技术之一,但此技术还不是很成熟,在使用过程中还存在一些缺陷,具体如下[1,2,3]:
(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的,这会对实验结果的准确性有一定的影响;
(2)标准曲线制作过程是非常复杂的,目前还没有统一的标准方法,这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性;
(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确,目前的大多数研究是基于平均份数进行评估,其精度是可疑的;
(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术,目前在我国还没有广泛的应用基础;
(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。
2.3 实时荧光定量PCR技术的应用
实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示,荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S r DNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nir S)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)种类的丰度,说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量,表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量,发现分布相对均匀,泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospira spp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的总量进行了定量监测。
在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol,PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测,研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大,并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析,结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升,系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eae A和rfb E进行实时荧光定量PCR检测,表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数,表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级,腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcy A基因进行了定量的分析,实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。
3 结语
实时荧光PCR技术 篇4
在真菌感染性疾病中,曲霉菌所引起的感染是仅次于念珠菌的重要致病真菌之一。据统计,侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)在白血病和造血干细胞移植患者中病死率达70%~90%[2],有研究表明肺部感染IA的病死率为40%,泛发性IA的病死率为90%,特别是中枢神经系统的泛发性IA病死率可达100%[3]。其中烟曲霉是引起患者严重深部曲霉感染的最常见病原菌,其次还有黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等[5]。由于真菌感染的诊断方法相对落后,真菌感染实验室诊断长期所沿用的血培养和组织活检这一金标准,因其培养时间长、阳性率低导致很多患者得不到正确及时的诊断而丧失了治疗机会[4]。因此,发展新技术对真菌病能够快速准确的诊断,并能有效地对病原真菌进行鉴定具有临床治疗和流行病学研究的双重意义。
分子生物学技术的发展为真菌病的快速诊断及感染菌种的确立提供了可能。目前许多病原真菌的全基因组序列已完成测序。可以根据这些已知序列选择合适的区域设计具有种、属特异性的引物建立PCR方法用于医学真菌的检测。本文基于烟曲霉的Mto1基因序列,建立了特异、快速检测烟曲霉的Real-time PCR方法,并对该方法的敏感性及特异性进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
供试菌株主要购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)及中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。部分菌株为本实验室从临床送检样品中分离保藏菌株,其中黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16404、ATCC16888购自上海汉尼公司。
1.1.2 试剂
DNA提取试剂盒(AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit,AXYGEN公司),引物及Taqman探针合成于宝生物工程(大连)有限公司。Real-time PCR扩增试剂盒(JumpStartTM Taq Ready MixTM For Quantitative PCR,Sigma公司)
1.1.3 仪器设备
高速冷冻离心机(SIGMA 3K30,德国西格马公司);ABI Prism 7000 Sequence Detection System(美国ABI公司);微量移液器(0.1~1 000 μl BIOHIT芬兰);霉菌培养箱(MJ-180BS-Ⅱ型,上海新苗医疗器械制造有限公司);核酸蛋白分析仪(Gene SpecV, Hitachi NaKa instruments Co.Ltd.日本日立公司)。
1.1.4 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:购于北京路桥技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
所有试验菌株均在PDA培养基上28℃培养72h,用于DNA提取。在无菌条件下用接种环刮取少量菌丝体于预先加入提取液的1.5ml离心管中,用试剂盒附带的研磨杵将菌丝体捣散,然后按试剂盒说明进行DNA提取。
1.2.2 引物及Taqman探针
应用Primer express 2.0软件根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计实时荧光PCR特异引物及探针。上游引物序列:Mto1-F:ttt ctc cac cca gga acg tt,下游引物序列:Mto1-R:cga atc cgg aga ggt gat acc,Taqman探针序列:FAM-cag ttg tga tga cga cac gcc cag t-TAMRA,配制成100μmol/L储藏液备用。
1.2.3 实时荧光 PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系:2×JumpStart Taq Ready Mix(20mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 100mmol/L KCl, 3mmol/L MgCl2, 0.002% gelatin, 0.4mmol/L of each dNTP, stabilizers, 0.06 unit/μl Taq DNA Polymerase, JumpStart Taq antibody)10μl,引物Mto1-F (10μmol/L)1μl,引物Mto1-R(10μmol/L)1μl,探针(10μmol/L)1μl, 模板DNA 2μl,ddH2O补足体积到20μl。实时荧光PCR采用二步法,反应条件:94℃ 2min;95 ℃ 10s,60℃ 1min,40个循环。在ABI Prism 7000 Seqence Detection System仪器上进行扩增反应。反应结束后,仪器自动给出荧光信号增长曲线,可以根据荧光信号是否成指数增长及其Ct值来判断扩增结果。
1.2.4 实时荧光PCR的敏感性分析
为了确定Real-time PCR检测烟曲霉的敏感性,对烟曲霉基因组DNA进行一系列10倍比稀释,分别做模板DNA进行扩增,判断其检测Mto1基因的敏感性。
1.2.5 实时荧光PCR的特异性分析
为了验证引物及探针的特异性,选择了26株曲霉属及6株致病性真菌的DNA作模板(见表1),进行特异性验证。
注:表中+表示阳性结果,-表示阴性结果。
2 结果与分析
2.1 引物及Taqman探针的设计
以烟曲霉Af293的线粒体翻译优化蛋白基因(mitochondrial translation optimization protein,Mto1)为参考基本序列(GenBank accession No.XM-742541)通过与其他主要病原曲霉黑曲霉(Aspergillus.niger)、杂色曲霉(Aspergillus.versicolor)、构巢曲霉(Aspergillus.nidulans)、土曲霉(Aspergillus.terrus)及黄曲霉(Aspergillus. flavus)Mto1基因序列应用lasergene7.1软件对其进行比对分析,选择特异位点来进行引物及Taqman探针。序列比对结果如图1所示。
从图1可见,烟曲霉与黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉在Mto1基因这部分序列差异较大,适合设计特异引物及探针,我们据此设计了针对烟曲霉的特异引物及探针。
2.2 实时荧光PCR的敏感性分析
通过对烟曲霉标准菌株提取出的基因组DNA用核酸蛋白分析仪测量DNA含量后(含量107.40μg/ml),进行10倍比稀释后进行Real-time PCR扩增,分析结果显示,最低1.08×10-6μg/ml DNA能够被扩增,如图2中扩增曲线4所示,而其他更低的稀释度没有信号增长(图中未显示)。
2.3 实时荧光PCR的特异性分析
实验对曲霉属及其他一些属的菌株做了特异性验证,结果如表1所示,可见该引物和探针只对烟曲霉产生扩增,而其他致病性曲霉如黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉等均未有扩增,白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、茄病镰刀菌、裴氏着色菌及甄氏外瓶霉等病原真菌也见交叉反应。此外,本实验还对毛霉属、假丝酵母属、青霉属的一些真菌也做了特异性验证实验,均未发现交叉反应(数据未列出)。
3 讨论
由于曲霉感染发病隐匿,早期诊断十分困难,传统的真菌培养和组织病理方法因培养所需时间长、阳性率低及活检有创性,已不能满足临床早期诊断的要求。因此能够在发病早期、快速和特异地对病原曲霉进行检测显得十分必要,目前新发展的方法主要基于血清学方法和分子生物学方法。目前研究较多的曲霉血清抗原检测是检测曲霉的半乳甘露聚糖(GM)和(1→3)-β-葡聚糖(BG)。GM和BG均为是曲霉菌细胞壁的成分,可以采用ELISA方法检测GM抗原及BG抗原[6,7],由于抗原血症是短暂的,抗原的浓度受机体清除和抗真菌治疗的影响较大,此外假阳性也是GM检测的主要障碍之一。
PCR技术因具有高特异性,强敏感性及快速、便捷的特点,是目前最常用的分子生物学手段检测病原菌。目前已有应用PCR技术检测曲霉菌的报道[8,9],应用实时PCR技术用于临床病原真菌的诊断研究[10,11]。
以上应用分子生物学方法用于真菌的鉴定主要通过对18S、28S rDNA、ITS区、细胞色素b等目的序列进行分析,人们分别设计出白念珠菌、烟曲霉、孢子丝菌、皮炎外瓶霉、茄病镰刀菌的ITS区种特异性引物用于诊断。我们选择Mto1基因作为靶序列,通过序列分析表明该序列在不同病原曲霉的种间具有较大的变异性,以此设计的特异引物及探针建立了实时荧光PCR,采用两步法(退火与延伸在同一温度下进行)进行扩增,大大缩短了检验时间,特异性实验也证明了该方法能够区分烟曲霉与其他常见的病原曲霉如黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、杂色曲霉等,此外该引物探针还能区别念珠菌属、镰刀菌属、假丝酵母属、着色真菌属、外瓶霉属、毛霉属及青霉属的病原真菌。我们建立的real-time PCR可以检测到1.08×10-6μg/ml的烟曲霉DNA,非常适合于烟曲霉感染的早期诊断,从而为真菌感染的早发现早治疗提供了有效手段。应用实时荧光PCR可以定量检测病原菌数量,即能够监测患者真菌负荷量(fungal load)的变化,及时检查治疗效果, 是否具有抗药性以利于临床用药指导。为临床早期诊断治疗侵袭性曲霉感染建立一种有效方法。
摘要：目的:根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法。方法:通过对多种病原曲霉Mto1基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证。结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08×10-6μg/ml的模板DNA。结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题。
关键词：烟曲霉,实时荧光PCR,检测
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实时荧光PCR技术 篇5
一、FQ-PCR技术的原理
FQ-PCR技术是一种在PCR体系中加入荧光基团, 利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR反应中加入非特异性的荧光染料或特异性荧光探针, 根据荧光信号的增加和PCR产物的增加完全同步的原理, 实现对目标物质量变的实时监测。
1. FQ-PCR技术的反应原理
FQ-PCR所使用的荧光物质主要有两种:荧光染料和荧光探针。
(1) 荧光染料 (SYBR GreenⅠ) 1992年Higuch等在PCR反应管中加入EB, 反应进行过程中, PCR产物增加, EB与DNA双链结合发出荧光强度也逐渐增加。他们通过连续照相动态观察荧光强度的变化, 并以此定量PCR产物的多少, 成为最早的实时定量PCR。SYBR GreenⅠ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后, 其荧光增强为原来的1 000倍, 利用该染料的理化特征来指示扩增产物的增加, 在PCR反应体系中, 加入过量的SYBR荧光染料, 该染料与双链DNA结合, 发出荧光信号。而不掺入链中的染料仅有微弱的荧光信号背景, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加是同步的。此方法有许多优点:它可以与所有DNA双链结合, 不必因为模板的不同而特别制定, 设计的通用性好, 且价格较低, 但是, 由于SYBR GreenⅠ能与所有的双链DNA相结合, 因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增物引起的假阳性会影响定量的精确性。引物二聚体、单链二级结构的片段一般很小, 其 (Tm) 通常都比目标PCR产物的Tm低, 因此可以调节读板温度, 即引物二聚体Tm<读板Tm<特异产物Tm, 这时引物二聚体已变性, 与之结合的SYBR GreenⅠ都脱离下来, 可以消除引物二聚体的影响。此外, 在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况也不能用此方法。
(2) 探针1991年Holland等首次运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合, 然后利用DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性将探针切断, 使探针的能量传递结构被破坏发出荧光来定量PCR产物。探针类是利用靶细胞序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加, 常见的几种探针:Taqman探针, 分子信标, LUX Primer。现在我们分别介绍以下几种方法。
Taqman探针:该方法在一条20多bp的寡核苷酸探针的5′端标记上荧光发射基团FAM (6-羧基荧光素) 和3′端标记淬灭基团TAMRA (6-羧基四甲基丹诺明) , 根据FRET原理, 探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;当PCR扩增时Taq酶的5′→3′外切酶活性会从5′端将探针水解为单核苷酸, 使荧光发射基团和荧光淬灭基团脱离, 从而发出荧光信号, 即每扩增一条DNA链, 就形成一个游离的荧光分子, 使荧光信号累积与PCR产物形成完全同步。
分子信标:分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针。对探针的要求是, (1) 探针一个臂的末端即5′端有荧光标记物, 另一个末端即3′端有淬灭基团; (2) 在没有模板时, 两端的核酸序列自身互补配对; (3) 当有特异性的单链DNA存在时, 探针也与其配对。在FQ-PCR反应体系中, 模板与探针配对, 使发夹结构变成一个开放的线性结构, 5′端荧光基团和3′端淬灭基团彼此在空间上产生足够的分离, 从而产生的荧光可被检测到。
LUX Primer:该方法是利用荧光标记引物来实现定量的一种技术。使引物同时起到探针的作用, LUX引物一般为20～30个碱基, 具有类似与分子信标的发夹结构。引物对中的一个引物5′端或3′端用荧光基团标记, 在没有单链存在的情况下引物与模板自身配对, 成发夹结构, 有模板存在的情况下, 引物与模板配对, 发夹结构打开, 发出特异的荧光信号。
2. FQ-PCR技术的定量原理
(1) 两个重要的概念 (1) 荧光域值 (Threshold) :以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号, 一般荧光域值定义为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 (2) Ct值:C代表Cycle, t代表threshold。其含义是:在PCR循环过程中, 荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数, 也称循环阈值。
(2) FQ-PCR定量的基本原理荧光染料不掺入DNA双链或探针的荧光基团和淬灭基团的距离足够近时, 也会有微弱的荧光信号。在FQ-PCR反应中, 对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号, 随着反应时间的进行, 监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条荧光扩增曲线。此曲线分为三段, (1) 背景信号阶段。扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖, 无法判定扩增产物的变化; (2) 扩增阶段。PCR终产物的对数值与起始模板拷贝数之间存在线性关系, 可以选择此期进行模板定量分析; (3) 平台期。在此期荧光信号不再呈指数增加, PCR产物的与起始模板拷贝数之间没有线性关系。为了便于定量和比较, 在荧光扩增阶段, 设定两个概念:Ct, 荧光域值。经数学证明, Ct值与模板DNA的起始拷贝数 (dRn) 存在严格的负线性关系, 起始拷贝数越多, Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线, 因此只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
(3) FQ-PCR定量的方法在实时荧光定量FQ-PCR中, 模板定量有两种策略, 即相对定量和绝对定量。
绝对定量:是用外标准品定量的制备来实现绝对定量, 可以通过化学合成的目的基因;或是将PCR的扩增产物直接梯度稀释;或是将PCR产物克隆到载体上, 然后抽提质粒, 经过测量浓度和拷贝数可准确定量。它的优点是稳定、准确。缺点是标准品不容易稳定保存。
(2) 相对定量:用一系列已知外参物做标准曲线, 根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量, 再将目的基因同管家基因的比值作为定量的结果。管家基因作用是用于核苷酸拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素, 常用的看家基因有GAPDH, β-actin, β2微球蛋白和rRNA。该方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。
二、FQ-PCR在动物遗传育种中的应用
1. mRNA表达的研究
在动物遗传育种中, mRNA表达谱的可靠定量是很重要的, 实时荧光定量PCR以其高敏感性和准确性在m RNA定量中越来越受到青睐。
实时荧光定量PCR准确检测样品的前提条件是构建重组标准品质粒和制定标准曲线。韩彩霞、赵德明等人采用绵羊组织的m RNA经荧光定量PCR扩增后, 将扩增产物回收纯化后, 用连接酶与p GEM-T载体连接, 将连接产物转化到感受态大肠杆菌, 然后提取质粒DNA, 经质粒PCR扩增、酶切和测序鉴定证实重组质粒构建成功。成功构建的标准品质粒和标准曲线是m RNA表达水平定量的基础, 对绵羊的各组织器官中的PrP进行定量, 进而确定PrPmRNA表达的水平。
刘国庆、黄志国等对羔羊IGF-I和IGF-IR基因表达的发育性变化进行研究, 通过FQ-PCR分析发现羔羊肝脏组织中IGF-I和IGF-IR基因表达量有特定的模式, IGF-IR的基因表达水平的变化不依赖于IGF-I的基因表达水平。为羔羊的生长发育规律提供了理论依据。
张永宏、孙玉成等为阐明代谢产物非酯化脂肪酸 (NE-FA) 、β-羟丁酸 (BHBA) 和葡萄糖 (GLU) 在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用, 运用实时荧光定PCR法观察了NEFA, BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体 (GLNR) mRNA丰度的影响。结果表明:随着培养液中m RNA浓度的升高, GLNRmRNA的表达量逐渐增加, 代谢产物NEFA, BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体m RNA的表达。
孙培明、鲍恩东等对适应性饲养到30日龄时的肉鸡进行热应激处理, 通过热休克蛋白70 (heat shock protein70, HSP70) m RNA荧光定量PCR方法检测热应激处理肉鸡组织中HSP70m RNA含量。实验选用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 (GAPDH) 作为内参照, 体外转录的RNA和阳性质粒作为两种标准品。结果显示, 实验所建立和优化的FQ-PCR反应体系是理想的。
李玉保、鲍恩东等根据HSP90, HSP70, GAPDHmRNA序列, 设计合成引物, 将FQ-PCR扩增的基因片断克隆到载体, 重组质粒经筛选、鉴定体外转录出RNA, 梯度稀释作为阳性模板, 用标准曲线制定和样品检测, 结果标明:运输应激可以影响HSPm RNA转录水平的变化, 并且对不同家族的HSPm RNA转录水平的影响不同, HSP70mRNA的转录水平有望成为猪运输应激的判定指标之一。
2. 转基因动物的检测
薛利军、王永智等运用实时荧光定量PCR对20余种细菌进行多序列比对与进化分析, 结果表明:设计的FQ-PCR引物的靶向序列, 仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA, 其灵敏度达36pgμL的基因组DNA或 (2.1×103±3.1×102) 拷贝/μL的16Sr DNA基因, 并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测, 可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言, 以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA具有很好的研究价值与应用前景。
三、小结与展望
实时荧光PCR技术 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
2010年1月1日-2010年8月1日本市各大医院传染科住院的433名手足口病患者的咽拭子标本。仪器:高速微型离心机 (杭州汇尔仪器设备有限公司) 、小型漩涡振荡器 (北京华尔博科技有限公司) 、全自动荧光定量PCR检测仪 (广州市炳阳生物科技有限公司-美国) , ClassⅡTypeA2生物安全柜 (北京东联哈尔仪器制造有限公司) 。试剂:北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 ( 硅胶膜吸附法) 。
1.2 方法
标本保存:取患者的咽拭子标本和大便标本立即放-20℃保存。RNA提取:采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法) 。反应体系:RT-PCR反应液 19 μl、聚合酶1 μl、 逆转录酶0.35 μl、 标本RNA 5 μl。设置循环条件:逆转录及变性50℃ 30 min;95℃ 3 min;预扩增95℃ 15 s, 50℃ 30 s;72℃ 1 min。扩增及荧光收集95℃ 10 s, 55℃ 40 s。
1.3 结果判断
阴性质控品:扩增曲线无对数增长期或无Ct值显示;阳性质控品:扩增曲线有明显对数增长期, 且Ct<30;表示实验有效。如果检测样品的扩增曲线无对数增长期或Ct>37, 判断样品为阴性;如果检测样品Ct≤37, 且曲线有明显的对数增长期, 判断样品为阳性。
2 结果与讨论
用荧光PCR法对433份咽拭子标本进行肠道病毒核酸检测, 结果有253例呈肠道病毒核酸阳性, 阳性率为58.4% (253/433) 。在253肠道病毒核酸阳性病例中经分型检测, EV71型为146例, Cox.A16型为107例, 未见有混合感染。手足口病是以手掌、脚掌、口腔黏膜上发生疱疹和溃疡为特征的一种病毒感染性疾病, 但有些患者没有典型病症, 病情发展很快。因此及时检出和发现患者是否感染EV71和Cox.A16, 可为临床提供实验诊断依据。而常规诊断方法存在一些弊端, 如病毒分离培养对技术要求较高, 费用较昂贵, 耗时需要4~15 d, 而且各实验室分离的阳性率各不相同, 无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要;中和抗体检测常需比较患者急性期血清与恢复期血清的中和抗体滴度, 有时仅靠检测单份血清的中和抗体滴度很难做出诊断;RT-PCR技术虽然克服了以上缺点[2], 已成为快速诊断的重要手段, 但PCR后需要进行凝胶电泳分析, 操作也较繁琐。今年年初本市手足口病又有抬头趋势, 为了及时控制疫情笔者采用实时荧光定量PCR法对433例可疑患者做了EV71和CA16检测, 为及时控制疫情发挥了作用。本文使用的实时荧光定量PCR法操作简单快速, 整个操作只需两步, 不到3 h, 即可获得高质量的数据;具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点, 该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
关键词：荧光PCR,手足口病,肠道病毒
参考文献
[1]金奇.医学分子病毒学〔M〕.北京:科学出版社, 2000:606-613.
实时荧光PCR技术 篇7
一、材料与方法
1. 标本来源。
WHO B19标准品购自英国国家生物制品检定所 (NIBSC) 。单纯疱疹病毒样本、巨细胞病毒样本、带状疱疹病毒样本、T细胞白血病病毒样本、腺病毒样本、呼吸道合胞病毒样本、流感病毒样本和副流感病毒样本来自上海地区医院。89份临床样本为血液中心献血员血浆留样中筛检到的B19阳性样本。
2. 试剂和仪器。
DNA提取采用上海浩源磁珠提取试剂盒, d NTP (d ATP、d CTP、d GTP、d UTP、d TTP) 和Tris为宏锦公司采购, 尿嘧啶糖基化酶 (UNG) 为roche公司产品、热启动Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司。p MD18-T试剂盒试剂盒购自Takara。DNA1000微流芯片试剂盒购自Agilent。artus®Parvo B19 RG PCR Kit购自QIAGEN公司。实验仪器为TBG Ezbeads-system32核酸提取仪、Agilent Stratagene安捷伦Mx3000P荧光定量PCR仪和Agilent Caliper 2100微流芯片仪。
3. 引物探针的设计及合成。
从NCBI上下载B19核苷酸序列, 运用计算机DNAMAN、Oligo、Primer 5软件自行设计引物和探针。B19引物在结构蛋白VP1、VP2均有保守序列, 但是VP1较好, 选取PA57634BR/1995上VP1保守序列为检测片段, 设计引物和探针:上游引物5’-GGGCCAAT TGGAGGTATTAAATC-3’, 下游引物5’-CCACCGTCCTGTAGCTTTACG-3’, 探针5’-FamTA CT A CCTTAGTTCAGTATGCTGTG-BHQ1-3’。扩增片段长度为117bp。
4. 样本B19 DNA的提取。
采用上海浩源磁珠提取试剂盒提取纯化样本中的B19 DNA, 样本用量200 u L, 提取过程在TBG Ezbeads-system 32核酸提取仪上自动化进行。操作严格按照说明书进行。
5. 实时荧光PCR扩增检测。
实时荧光PCR扩增总反应体积为60μL, 其中模板为20μL, 热启动Taq酶为2U, 尿DNA糖基化酶 (UNG) 0.2U, 1×PCR缓冲液, 引物各为30 pmol, 探针为15pmol, 200μmol/Ld NTP, 5.0 mmol/L Mg Cl2。反应条件为:37℃UNG酶反应2 min;50℃UNG酶灭活5 min;94℃预变性10 min; (94℃变性10 s;55℃退火35 s;65℃延伸35 s) ×45个循环;荧光信号层设定为FAM荧光素, 荧光信号采集设定在最后一步的65℃。PCR过程在Agilent Stratagene安捷伦Mx3000P荧光定量PCR仪上进行。
6. PCR产物的鉴定。
将PCR产物用Agilent Caliper 2100微流芯片仪进行检测, 分析产物片段的大小。然后再将PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳, 然后将包含目的核酸片段大小的琼脂糖切胶后用磁珠法进行纯化, 将纯化后的扩增产物测定浓度后, 用Takara的p MD18-T试剂盒将其与载体p MD18-T物质的量之比3:1的比例在T4连接酶的作用下进行连接反应, 构建重组质粒p MD18-T-VP1。用Ca Cl2化学转化p MD18-T-VP1至大肠杆菌JM109感受态细胞中, 用蓝白斑筛选阳性转化菌, 提取重组质粒, 酶切, 选择阳性克隆菌进行测序。
7. 定量标准曲线的建立。
将提取的阳性重组质粒用Qiagen公司的B19核酸定量检测试剂盒进行标定。将B19 WHO标准品 (5×105IU) 加水500 u L溶解, 得到1×106IU/m L, 然后用PBS稀释成1×106IU/m L、1×105IU/m L、1×104IU/m L、1×103IU/m L共4个梯度, 用WHO标准品用Qiagen公司的B19核酸定量检测试剂盒共同检测稀释好的B19标准品和B19阳性质粒, 以WHO标准品作为标准曲线标定得到B19阳性质粒的浓度。标定好的质粒用PBS稀释到1×107IU/m L、1×106IU/m L、1×105IU/m L、1×104IU/m L、1×103IU/m L共5个梯度, 用建立的检测体系进行提取扩增作为标准曲线。
8. 特异性检测。
采用磁珠提取试剂盒提取单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、带状疱疹病毒、T细胞白血病病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒样本中的病毒核酸, 用建立的PCR系统进行扩增检测。
9. 灵敏度检测。
将B19病毒的WHO标准品用用正常人血清稀释到250 IU/m L、100 IU/m L、50 IU/m L、25 IU/m L、10 IU/m L, 然后用建立的荧光PCR病毒核酸检测系统对每个浓度梯度分别检测30次, 检测结果用PROBIT进行统计分析, 确定检测体系的分析灵敏度。
1 0. 临床样本的检测。
将研制的B19核酸定量检测系统与美国QIAGEN公司的artus®Parvo B19 RG PCR Kit共同对89份临床标本进行检测, 通过数据分析, 比较两个检测系统的相关性。
二、结果
1. PCR扩增产物微流芯片结果。
B19感染血液样本DNA经核酸提取和PCR扩增后, 采用Agilent Caliper 2100微流芯片仪进行检测, 结果显示扩增片段大小约为117bp, 与设计的目的片段大小一致, 检测结果如图1所示。
2. 重组质粒p MD18-T-VP1测序结果。
将扩增得到的PCR产物克隆测序后, blast分析显示序列和GENEBANK的同源性达93%~100%。
3. 定量标准曲线的建立。
用B19WHO标准品标定好的质粒用PBS稀释到1×107IU/m L、1×106IU/m L、1×105IU/m L、1×104IU/m L、1×103IU/m L、用建立的检测体系进行提取扩增, 在结果分析中把对应的孔类型设定为standard, 然后把对应的核酸含量填写进去, 分析后软件自动生成标准曲线, 标准曲线方程为Y=-3.161*LOG (X) +40.60, 相关系数RSq=1.000, 扩增效率Eff.=107.2%, 如图2所示。
4. 特异性检测。
用磁珠提取试剂提取疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒样本的核酸, PCR系统扩增模板, 结果只有B19样本样本有扩增曲线, 其他样本均为产生扩增曲线。
5. 灵敏度检测。
将B19病毒的WHO标准品用正常人血清稀释到250 IU/m L、100 IU/m L、50 IU/m L、25 IU/m L、10 IU/m L, 每份样本取200 u L, 用磁珠提取试剂盒进行核酸提取, 取提取的模板40 u L, 采用PCR系统进行扩增, 结果显示系统灵敏度可以到49.16 IU/m L。见表1。
6. 临床样本的检测。
将研制的B19核酸定量检测系统与美国QIAGEN公司的artus®Parvo B19 RG PCR Kit共同对89份临床标本进行检测, 通过数据分析, 得出两个检测系统所得数值具有显著相关性。相关方程为FQ=1.0285×QIAGEN+0.42 (n=89) , r=0.9785, P〈0.001, 结果如图3所示。
三、讨论
B19病毒为单链DNA病毒。目前, 多采用血清学B19抗体和抗原的检测, 但是检测B19病毒抗体起初是采用血源抗原, 但该抗原来源困难, 难于普及和推广。荧光定量PCR, 因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物, 进一步提高了检测的敏感性和特异性。
由于B19具有高度保守性, 本文, 笔者选择其基因组高度保守区域为扩增靶区域, 设计特异性引物和荧光探针, 对提取后获得的模板进行B19 DNA扩增。扩增过程中Taq DNA聚合酶5’-3’外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的Taq Man探针, 随着PCR反应的进行, 荧光信号不断积累。实时荧光定量PCR仪通过检测达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。由图2可以看出, 不同梯度定量模板数的对数值与CT值之间具有很好的相关性, 其相关系数为1。同时, 建立的检测方法采用了含有UNG-d UTP抗污染系统, UNG酶特异识别扩增产物中U-DNA片段中的UTP的位点并进行切割, 从而有效防止了PCR扩增产物的污染。
对于B19核酸的提取纯化笔者采用了近年迅速发展且被广泛应用的磁珠法核酸提取。磁珠是以纳米级磁性材料 (如三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等) 为载体, 外面包裹高分子骨架材料并经各种不同的物理化学方法处理后制备成磁性微球, 该磁性微球可以在高盐环境下实现对核酸分子的吸附, 而在低盐环境下又可以方便地把吸附的核酸释放到缓冲液中。
实时荧光PCR技术 篇8
1 材料与方法
1.1 毒株
鹅细小病毒病毒GPVS1株、鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒, 均为华南农业大学禽病实验室保存。
1.2 主要试剂
SYBR Green Realtime PCR Master MixPlus, 购于广州美津生物技术有限公司;PCR试剂、RNA抽提试剂盒, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.3 GPV-VP基因的扩增和克隆
参考GenBank中鹅细小病毒B株VP基因的核苷酸序列, 根据其保守区域的序列设计特异性引物扩增GPV-VP基因。引物序列:上游引物GPV-VP-PCR-F 5′-TGATTCTGCCCTCCCTTCCA-3′;下游引物GPV-VP-PCR-R 5′-TGATGAACACCGAGTCTTCCTTAC-3′。引物由上海基康生物技术有限公司合成。
1.4 PCR反应
取含GPVS1株的番鸭胚尿囊液经100 ℃水浴10 min, 然后冰浴5 min, 15 000 r/min离心10 min;取上清液作模板进行PCR。反应体系:模板DNA 3 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, GPV-VP-PCR-F (25 pmol/μL) 0.5 μL, GPV-VP-PCR-R (25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 16 μL, 总体积为25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 54 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。按广州瑞真生物技术有限公司的Gel Extraction Kit说明书纯化目的片段, 将该目的片段连接到pMD18-T载体, 重组质粒pMD18-T-VP经PCR与双酶切鉴定后进行测序。RNA病毒 (尿囊液) 的提取按照产品说明书操作。反转录采用20 μL体系:RNA 9.5 μL, 随机引物1 μL, 10×RT Buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, RNA酶抑制剂0.5 μL, AMV反转录酶1 μL, 加灭菌去离子水至20 μL。混匀, 室温下作用10 min, 接着42 ℃水浴1 h, 即为cDNA。
1.5 实时荧光定量PCR试验
1.5.1 引物及PCR条件
以上述重组质粒为模板, 选择保守序列设计荧光定量PCR 特异性引物, 序列为GPV-VPRT-PCR-F 5′-TTCTCCTACCACTCCCGCTACTT-3′;GPV-VPRT-PCR-R 5′- TGGTCTACATTTCCAGCA2GTTTGT-3′。扩增的目的片段是VP基因序列中3 011～3 144 bp的134 bp片段。pMD18-T-VP稀释10倍测定其在波长280 nm的吸光度值, 计算DNA的浓度和拷贝数。然后以标准质粒10倍梯度稀释溶液为模板, 根据SYBR GreenⅠReal-time PCR试剂盒说明, PCR反应中各组分如下:2×SYBRmixL 10 μL, GPV-VPRT-PCR-F (10 μmol/L) 0.4 μL, GPV-VPRT-PCR-R (10 μmol/L) 0.4 μL, ddH2O 6.2 μL, pMD18-T-VP 3 μL, 总体系为20 μL。荧光定量PCR反应程序:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s;60 ℃退火15 s, 72 ℃延伸40 s, 共38个循环。荧光定量PCR反应结束后制作熔解曲线, 反应程序:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 40 s, 95 ℃ 15 s。
1.5.2 特异性检测
用引物GPV-VPRT-PCR-F/R对实验室保存的鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒等进行PCR检测。
1.5.3 灵敏度分析
将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5×102个拷贝/μL, 以各梯度稀释液为模板进行PCR反应。最低起始模板浓度即为该Real-time PCR反应的灵敏度。
2 结果
2.1 pMD18-T-VP重组质粒的构建结果
以病毒DNA为模板进行PCR反应, PCR 产物大小约407 bp。将PCR产物克隆进pMD18-T载体, 经PCR扩增和双酶切鉴定后, 最终测序结果证明重组质粒为阳性。该测序结果与GenBank中公布的GPV核衣壳蛋白基因序列的相似性为98.3% (见图1) 。
2.2 荧光定量PCR 结果
2.2.1 扩增曲线分析
将标准质粒pMD18-T-VP进行10倍梯度稀释后, 选取3.5×104～3.5×107个拷贝/μL的稀释样品作为模板进行PCR反应, 扩增曲线见图2。模板浓度越高, Ct值越小, 即扩增曲线越早进入对数期。阴性对照在36个循环后出现扩增现象, 熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。
2.2.2 标准曲线分析
PCR扩增结束后, 根据起始模板浓度和相应的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数r2 =0.975, 扩增效率E=86.2% (见图3) 。
2.2.3 熔解曲线分析
目的产物熔解温度为88 ℃, 引物二聚体熔解温度为82 ℃。在3.5×102个拷贝/μL的模板浓度下, 虽然也有相同熔解温度产物的产生, 但是其扩增Ct值已经与空白对照很相近, 结果为阴性 (见图4) 。
2.2.4 灵敏度分析
从扩增曲线可见, 当模板浓度为3.5×103个拷贝/μL时, 荧光定量PCR 可以扩增出特异性产物。当模板浓度为3.5×102个拷贝/μL时, PCR反应虽然能扩增出相同熔解温度的条带, 但是其Ct值已经基本与空白对照重合。因此, 该SYBR GreenⅠReal-time PCR 方法检测灵敏度为3.5×103个拷贝/μL。
2.2.5 重复性试验结果
对于不同浓度的模板, 4个平行样品之间的Ct值差异不显著, 表明该方法具有很好的重复性 (见图5) 。
2.2.6 特异性检测结果
针对实验室保存的与鹅细小病毒共感染的其他病毒鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒进行特异性检测。图6为GPV的扩增曲线, 其余模板均为阴性, 即该引物对GPV具有很好的特异性 (见图6) 。
3 讨论
试验建立的针对鹅细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法在病毒3.5×103～3.5×107个拷贝/μL的浓度范围内具有很好的检测效果。荧光定量PCR 技术较其他技术有灵敏度高的显著特点, 因此试验同时要严防污染问题, 即需要实验人员良好的操作技能和实验室的洁净环境。
在临床上, 仅依靠症状和病理变化不能很好地区分鹅细小病毒病和其他鹅病毒病。目前, 用于诊断鹅细小病毒的病毒分离培养和中和试验存在诸多弊端, 例如:达不到快速、准确诊断;依赖操作人员的技术判断误差较大;容易与其他鹅病毒病 (鹅源新城疫、鹅流感) 感染相混淆;更为重要的是不能很好地用于早期临床诊断 (敏感性差) 。而实时荧光定量RT-PCR的敏感性高、特异性强、操作方便, 便于早期临床检测[5], 但也存在技术操作复杂、成本高以及不能很好地现场应用等缺点[6]。本试验建立的鹅细小病毒实时荧光定量PCR检测方法可以结合传统的诊断方法, 为该病的防制提供技术支持, 但该方法与荧光杂交探针实时PCR方法相比, 其检测特异性、灵敏性还有待提高。
参考文献
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