核酸定量检测法

核酸定量检测法（精选9篇）

核酸定量检测法 篇1

摘要：目的 探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)对涂阴肺结核诊断的临床价值。方法 选择2014年6~12月株洲市中心医院结核门诊涂阴肺结核病患者131例(涂阴肺结核组),肺结核确诊患者114例(肺结核确诊组),其他肺病患者123例(其他肺病组)。对患者进行痰抗酸染色、结核菌素皮肤试验(TST)、痰固体培养和Xpert MTB/RIF检测,分析Xpert MTB/RIF检测的阳性率和特异度,判断其在涂阴肺结核中的诊断价值。结果 Xpert MTB/RIF检测在涂阴肺结核组中阳性率为80.92%(106/131),在肺结核确诊组中为82.45%(94/114),在其他肺病组中为0.81%(1/123),涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率明显高于其他肺病组,差异有高度统计学意义(P<0.01);涂阴肺结核中痰培养检测阳性率为71.76%(94/131),明显低于Xpert MTB/RIF检测阳性率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Xpert MTB/RIF检测阳性率和特异性较高,对涂阴肺结核早期诊断有重要的意义。

关键词：结核分枝杆菌,利福平耐药实时荧光定量核酸扩增,诊断,鉴别,特异度

近年来,结核患者日益增多,目前肺结核的实验诊断主要应依靠痰涂片找抗酸杆菌、结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)及痰培养。 因痰涂片对痰液标本内结核杆菌含量要求高,达到一定浓度方能检测阳性,涂阴肺结核患者往往因为痰涂片抗酸染色阴性,临床上不易早期发现,常被延误治疗。 TST是个操作简单、方便、快捷的筛查结核的免疫学方法,在临床上应用广泛,但有较高的假阳性和假阴性率,对结核感染与卡介苗接种后感染无法鉴别,降低了它的临床价值[1]。 痰液结核杆菌培养是诊断结核病的金标准,但结核杆菌生长缓慢,培养周期长,且对实验室生物安全级别要求高,故传统的临床诊断涂阴肺结核试验方法有限。 因此,寻找一种能快速、敏感诊断涂阴肺结核的实验技术十分重要。

利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert MTB/ RIF) 检测技术对结核杆菌具有较高的敏感性和特异度[2]。本研究通过对131例涂阴肺结核和123例其他肺病患者进行Xpert MTB/RIF检测, 探讨Xpert MTB/ RIF在涂阴肺结核快速、早期诊断中的临床价值。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2014年6~12月到株洲市中心医院(以下简称“我院”)结核门诊就诊患者为研究对象。 入选涂阴肺结核患者131例(涂阴肺结核患组), 年龄18~82岁,平均(41.2±15.3)岁;肺结核确诊患者114例(肺结核确诊组),年龄21~79岁,平均(39.6±16.5)岁;其他肺病患者123例(其他肺病组),年龄17~78岁,平均(40.4±17.5)岁。 该研究经我院医学伦理委员会批准, 所有参与研究者均签署了知情同意书。

1.2诊断标准

1.2.1入选标准肺结核确诊患者除有发热、 咳嗽、咳痰、盗汗等临床表现及影像学资料支持外必须有痰结核分枝杆菌培养结果。 涂阴肺结核诊断标准:1具有午后低热、咳嗽、咯血、盗汗、乏力等典型肺结核临床症状及肺部CT表现者; 2痰涂片抗酸染色阴性者; 3支气管或肺部组织病检支持结核性改变者;4诊断性抗结核治疗2个月后症状改善,复查CT提示有好转者[3]。

1.2.2排除标准1影像学不典型者行支气管镜检查或病理检查明确为非结核感染者;2仍不能明确者行诊断性抗结核治疗2个月后症状及影像学病变无改善者。 3常规行痰涂片、痰固体培养,排除结核感染者。 1.2.3其他肺病者包括肺病肿瘤(25例)、 普通肺炎(53例)、支气管扩张(15例)、慢性阻塞性肺疾病(26例) 肺部其他疾病(4例)。

1.3研究方法

对所有入选患者均进行TST、痰固体培养和Xpert MTB/RIF检测。 TST所用试剂购自北京高科技生命科技开发有限公司,痰固体培养基为罗氏培养基,由珠海贝索公司生产,Xpert MTB/RIF仪器及试剂由美国Cepheid公司研发生产,均在有效期内使用。 特异度= 真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)×100%;阳性预测值=真阳性人数/(真阳性人数+假阳性人数)× 100%; 阴性预测值=真阴性人数/(真阴性人数+假阴性人数)×100%。

1.3.1 TST试验吸取试剂5 U(0.1 m L)注入前臂内侧上中1/3交界处皮内,形成皮丘。 经72 h观察注射部位反应,考虑到现代人卡介苗接种率高,本研究以硬结的横径及纵径平均≥10 mm为阳性。

1.3.2痰固体培养痰培养采用4%氢氧化钠处理分离培养。吸取痰标本到前处理管中,加入4%氢氧化钠前处理液充分混匀, 静置15 min后取吸管吸取前处理液均匀接种在培养基斜面上,观察培养情况,记录生长结果[4,5]。

1.3.3 Xpert MTB/RIF检测取1 m L痰液标本与含氢氧化钠及异丙醇的处理液按1∶2比例混合,在涡旋震荡器上震荡15~30 s, 室温静置15 min。 取混合液2 m L转移至一次性多室塑料反应盒中, 然后将反应盒放置到检测模块中, 仪器进行自动化分析, 约2 h后可读取结果[6]。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间比较采用 χ2检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Xpert MTB/RIF在肺结核确诊组与其他肺病组的检测情况比较

通过检测发现Xpert MTB/RIF检测在肺结核确诊组中为82.45%(94/114),在其他肺病组中为0.81% (1/123), 肺结核确诊组中Xpert MTB/RIF检测阳性率明显高于其他肺病组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 Xpert MTB/RIF检测对肺结核确诊组的阳性预测值为98.95%(94/95),阴性预测值85.92%(122/142)。 2.2 Xpert MTB/RIF、TST在涂阴肺结核组与其他肺病组的检测情况比较

涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率为80.92%(106/131),其他肺病组中Xpert MTB/RIF检测阳性率为0.81%(1/123)。涂阴肺结核组中Xpert MTB/ RIF检测阳性率明显高于其他肺病组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 涂阴肺结核组中TST检测阳性率为64.89%(85/131), 与涂阴肺结核组中Xpert MTB/ RIF检测阳性率80.92%比较, 明显低于涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率, 差异有高度统计学意义(P < 0.01)。Xpert MTB/RIF检测对涂阴肺结核的阳性预测值为99.07% (106/107), 阴性预测值83.00%(122/147)。 见表1。

注:Xpert MTB/RIF:利福平耐药实时荧光定量核酸扩增;TST:结核菌素皮肤试验

2.3 Xpert MTB/RIF、痰培养在涂阴肺结核与其他肺病组的检测情况比较

涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率为80.92%(106/131),痰培养检测阳性率为71.76%(94/131)。 涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率明显高于痰培养检测阳性率,差异有统计学意义(P < 0.05)。 涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测特异度为99.19%(122/123),与涂阴肺结核组中痰培养检测特异度100.00%(123/123)相比,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见表2。

注:Xpert MTB/RIF:利福平耐药实时荧光定量核酸扩增

3讨论

肺结核是世界上致死率最高的传染性疾病之一, 随着社会老龄化,肺结核患者逐年增加[7,8,9]。 目前我国肺结核实验室常规检查方法是痰涂片找抗酸杆菌,其耗时短、花费小,但检查敏感度低、对标本含菌量高, 致使很多涂阴肺结核患者漏诊[10]。 痰培养结核杆菌是结核诊断的金标准[11],但痰培养方法存在周期长、 敏感度相对低,对实验室的生物安全要求高,耗时长,不易普及[12],造成涂阴肺结核临床诊断困难、治疗延误。 早诊断、 早治疗涂阴肺结核患者对控制结核病的传播、减少结核耐药,具有十分重要的社会意义。 因此临床上亟需开发出一种快速、准确、安全的诊断方法。

Xpert MTB/RIF检测法是利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术, 采用Cepheid公司Gene Xpert检测系统,针对rpo B基因81bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针,检测其是否发生突变[13],它是将样品的准备、 定量PCR扩增和荧光检测集于一体的核酸扩增检测分析系统。 操作简单,无需太多培训,只需要在标本盒中加入待检测标本,系统可自动完成标本纯化、离心、DNA提取、DNA特异序列检测, 2 h内便可得到检测结果[14],封闭性好,不易造成交叉污染,对涂阴肺结核患者的敏感度高[15]。 多中心研究证实Xpert MTB/RIF检测敏感度与特异度高、 耗时短,被世界卫生组织为遏制结核病推荐的检验方法[16]。 本研究中对131例涂阴肺结核组患者痰液予Xpert MTB/RIF检测,阳性率为80.92%(106/131),肺结核确诊组中Xpert MTB/RIF检测阳性率为82.45% (94/ 114),两者阳性率均高,差异无统计学意义(P > 0.05)。 其他肺病组中Xpert MTB/RIF检测阳性率为0.81% (1/123)。 涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率明显高于其他肺病组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 提示Xpert MTB/RIF检测对肺结核患者有较高的敏感性。

TST是结核感染诊断的一个重要参考指标[17],将结核杆菌产物注入体表,如受试者感染了结核分枝杆菌, 则形成超敏反应性炎症,出现红肿、硬结[18]。 临床使用非常广泛,但其特异性受到接种卡介苗和非结核分枝杆菌的影响,且有较多的假阴性,临床意义有限[19]。 本研究中对涂阴肺结核组患者中行TST检测,阳性率为64.89%(85/131),与涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率(80.92%)比较,明显低于涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测阳性率,差别有统计学意义(P < 0.01)。 Xpert MTB/RIF检测对肺结核确诊组的阳性预测值为98.95%,阴性预测值为85.92%;对涂阴肺结核的阳性预测值为99.07%,阴性预测值为83.00%。 说明对怀疑涂阴肺结核患者行Xpert MTB/RIF检测对诊断有较大帮助。痰结核杆菌培养是结核病诊断金标准, 本研究中, 涂阴肺结核组中痰培养检测阳性率为71.76% (94/131), 与Xpert MTB/RIF检测阳性率[80.92%(106/131)]比较,痰培养检测阳性率明显低于Xpert MTB/RIF检测阳性率,差异有统计学意义(P < 0.05)。 涂阴肺结核组中Xpert MTB/RIF检测特异度高达99.19%(122/123),与涂阴肺结核组中痰培养检测特异度[100.00%(123/123)]比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 但痰培养对实验室生物安全级别要求高,不能常规开展,且耗时长,培养周期为6~8周,不利于患者的早期合理治疗[20]。 Xpert MTB/RIF检测自动化程度高, 唯一手动操作就是将标本置入一次性标本盒内,检测报告时间2 h,比痰培养节省甚多时间[21]。

Xpert MTB/RIF检测是一种简便、快捷、准确的检测方法[22],综合国内外的诊治报道[23,24,25,26,27]进展,临床应用高于TST、痰培养,可更好地辅助临床医师对涂阴肺结核患者进行早期诊断和治疗, 为结核病的控制、预防提供了有力的帮助,值得临床推广。

核酸定量检测法 篇2

近年来, 将染料自缔合或诱导缔合用于核酸定量测定备受关注[1～3]. 但是将酶与染料的缔合用于核酸定量测定尚未见报道. 氯化血红素(hemin)可作为辣根过氧化物酶(HRP)的模拟酶, 能催化H2O2氧化对-羟基苯乙酸(p-HPA)生成荧光产物--联二对-羟基苯乙酸的反应[4,5].

作 者：魏玲 杨黄浩 陈小兰 曲会英 许金钩 作者单位：魏玲(现代分析科学教育部重点实验室,厦门大学化学系,厦门,361005;新疆昌吉师范专科学校,昌吉,831100)

杨黄浩,陈小兰,曲会英,许金钩(现代分析科学教育部重点实验室,厦门大学化学系,厦门,361005)

乙肝患者脱氧核糖核酸的检测 篇3

1 方法

①血清标志物指[3]:HBsAg 、乙型肝炎表面抗体 (hepatitis B surface antibody, 抗- HBs) 、HBeAg、乙型肝炎e抗体 (hepatitis B e antibody, 抗- HBe) 、乙型肝炎核心抗体 (hepatitis B core antibody, 抗- HBc) 的检测:应用酶联免疫法, 试剂由上海科华或郑州安图生物工程有限公司提供;②HBV-DNA定量测定:采用PCR体外扩增检测技术, 试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供, 该试剂盒的检测下限为1.0×103copies/ml, 用罗氏480实时荧光定量仪进行检测, 操作过程严格按照说明书进行;③肝功能检测采用DimenSion全自动生化分析仪和DimenSion原装试剂;④B超测定肝、脾质地、大小, 以肝脏回声光点增粗以及脾脏厚度增加视为异常。

分别就HBeAg (+) 、HBeAg (-) 患者对年龄、肝功能、HBV-DNA载量、B超检查进行比较分析。

2 讨论

乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 是引起乙型病毒性肝炎的病原体。我国乙型肝炎表面抗原 (hepatitis B surface antigen, HbsAg) 阳性有1.2亿人, 慢性乙型病毒性肝炎2000～3000万人, 其中每年约30万人进展到肝硬化、肝癌。严重损害了人民的身体健康。然而HBsAg (+) 并不代表着疾病的活动和需要治疗, 作为基层的医生, 掌握患者的最佳治疗时机尤为重要。

HBV血清标志物检测是目前临床上诊断乙肝最常用的指标。它主要反映人体对HBV的免疫反应状态, 不能直接反映HBV在患者体内的复制情况。而且HBV血清标志物复杂多样, 临床上难以根据这些结果对HBV感染复制情况进行准确判断。血清中HBV-DNA定量是反映病毒复制的最直接标志, 是评价传染性的最可靠的方法, 荧光定量PCR技术能从DNA水平鉴别乙肝病毒的活动, 对HBeAg (-) 患者尤为重要, 是判断病情与预后、衡量抗病毒疗效的关键指标。

慢性HBV感染的自然史一般可分为3期, 即免疫耐受期、免疫清除期和非活动或低 (非) 复制期。在基层医院, 很多医生对于乙肝抗病毒治疗存在误区, 认为只要HBV-DNA为阳性即应抗病毒治疗。有研究结果数据表明HBeAg (+) 患者, 仅有一部分人为肝功能异常患者[4]。这部分人是抗病毒治疗适应证的人群。并且HBeAg (+) 患者中随着年龄增大, 肝功能异常以及肝脾异常者的比率逐渐增加, 这充分说明了HBeAg (+) 患者即使肝功能正常, 但是随着年龄增大, 仍存在病情进展的风险, 所以这部分患者是需要定期随访的。

有研究数据表明HBeAg (-) 患者随着年龄增长肝功能以及肝脾异常也逐渐增多, 在35岁以后较为明显, 可能与此年龄患者机体免疫功能逐渐完善, 开始了自身对乙肝病毒的免疫清除有关 。在HBeAg (-) 者中存在HBV-DNA>104copies/ml, 肝功能异常, 这一部分人并没有达到完全的免疫清除, 体内仍有肝炎病毒复制, 可能伴有HBV前C区变异, 这种变异导致不能产生HBeAg, 但不影响HBV复制和传播, 这些患者均属于抗病毒治疗适应证范围。HBV前C变异与乙型肝炎慢性化, 慢性肝炎活动加剧, 重型肝炎和肝癌有关。因此, 对于HBeAg (-) , 而HBV-DNA水平较高的患者应给予重视。

乙肝在中国主要以母婴传播为主, 其他一部分为血液、体液性、医源性、性接触等传播。然而HBsAg (+) 并不代表着疾病的活动和需要治疗, 作为医生, 应掌握患者的最佳治疗时机, 与患者建立良好的沟通, 并让患者知晓定期随访的重要性。因此, 正确的解读乙肝三系、HBV-DNA, 结合肝功能和影像学检查是很有必要的。应常规检测HBV-DNA定量, 定期复查肝功能, 肝脾超声检查, 为慢性乙型肝炎的规范性治疗提供依据。

参考文献

[1]李梦东.实用传染学.人民卫生出版社, 1998:104.

[2]李朝路, 刘卫芳.乙肝治疗的研究概况.中国现代临床医学, 2008, 10 (1) :40-43.

[3]中华医学会肝病分会、中华医学会感染病分会联合制定.慢性乙肝防治指南.中华传染病杂志, 2005, 23 (6) :421-431.

核酸检测个人总结 篇4

为积极响应开发区对疫情防控的部署，切实保障人民群众生命健康安全，20xx年10月23日五一社区开展第十五轮全员核酸采样活动，社区全体工作人员12人、社区监督委3人、班组长8人、海医一附院医疗小组6人、挂钩科室社会事业管理科6人、公用事业公司2人、房地产公司9人、联防大队2人、社区志愿者10人共46人参加，严格按照应检尽检、愿检尽检、不漏一户、不漏一人的要求，有序开展核酸采样工作。

采样当天，工作人员早早已经到达采样现场，再次检查物资是否到位、规范整理现场设施、人员分工等准备工作。现场工作人员分别在入口处测体温、亮绿码；在等候区指导群众提前扫码录入信息同时为儿童、老人做好预登记工作；在通道分流群众有序前行，指引弱势群体走“绿色通道”；在采样区维持现场秩序，协助信息员加快录入被采样人员身份信息。各个环节人员配合密切，快速有序开展信息登记工作，减少现场工作人员的工作量，加快检测速度，做到不扎堆、不空挡，做好检测人员的衔接，最大限度提高采样工作效率。

此次核酸采样工作共设立1处核酸采样点，4个采样台，共计采样99管1968人次，上门采样的特殊老年人等群体33人次、圆满的完成了此次核酸采样工作。

核酸定量检测法 篇5

1 材料与方法

1.1 资料来源

桂林市疾病预防控制中心2010-2014年疾病汇总数据和中国疾病控制信息系统“疾病监测信息报告管理系统”中的手足口病报告病例。

1.2 实验室检测

由各就诊医院对发病3d以内的部分病例采集咽拭子及时送往桂林市疾病预防控制中心,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法,对肠道病毒总核酸、Cox A16和EV71进行病毒核酸检测,将检测结果及时反馈,再由病例报告单位确定实验室检测病例。

1.3 统计方法

相关数据导入Excel 2010软件进行统计,使用SPSS21.0软件进行数据统计分析,计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 手足口病病毒核酸检测结果

2010-2014年共检测4 720份咽拭子标本,检出EV型、EV71型和Cox A16型病毒。其中EV型阳性3 115份,阳性率为66.0%;EV71型1 141份,阳性率为22.2%;Cox A16型667份,阳性率为14.1%。各年间三型病毒分布差异有统计学意义(χ2=724.85,P<0.01)。每年EV型阳性检出率均最高,在65%左右,EV71型总阳性检出率高于Cox A16型,每年分布不一。见表1、图1。

n(%)

2.2 病毒检测阳性结果的性别分布

2010-2014年对于EV型、EV71型和Cox A16型每种病毒,男性阳性检出率均高于女性,男性共检出阳性2 697次,女性共检出阳性1572次,男女性别比为1.72∶1,但各型病毒性别间差异无统计学意义(χ2=0.50,P>0.05)。见图2。

2.3 手足口病检测结果年龄分布

2010-2014年手足口病报告病例最小为1月龄,最大为23岁。每一年报告病例均集中在<4岁年龄组,发病率前3位分别是2岁、1岁和3岁组。见表2。

2.4 各型手足口病病毒的时间分布

2010-2014年全年都有病例报告,但3种病毒的检出率都存在明显且相似的季节高峰,1-2月呈分散存在;从3月起,EV型和EV71型呈较快速度上升,Cox A16型的快速上升出现在4月,高峰值出现在4月和5月;之后3种病毒的检出开始减少,只在小范围内回升。见图3。

3 讨论

手足口病在全国多个地区,如安徽、山东、广东和浙江等出现过局部流行,该病的传染能力很强,传播范围广,疫情控制难度大。同时,引起该病的各种病毒间不存在交叉免疫,所以感染手足口病后不能产生长期免疫,此点对手足口病的防控十分重要。2008年5月2日,卫生部将手足口病作为丙类传染病管理。

桂林市在2010-2014年报告的手足口病以肠道病毒EV型多见,而其中又以EV71型为主,Cox A16型次之。全年均有病例报告,但EV型、EV71型和Cox A16型均存在明显的季节高峰。从3月开始出现较快速的病例增加,4-7月成为EV型和EV71型病例出现的发病高峰,而Cox A16型的季节高峰为4-6月,与陈德颖等[4]报道的发病高峰为5-7月虽不完全一致,但十分相似;与相关研究中南昌市的发病高峰一致[5]。在人群分布方面,男性和女性的发病不一致,前者高于后者,与相关研究的结果一致[6,7]。探究性别间的发病差异,可能是男性和女性对于手足口病免疫能力的差别或是男性更喜欢户外活动,从而导致接触病原体的可能性较高。一般成年人可以通过隐性感染获得免疫力,但儿童的免疫功能低下,是该病的高发人群。血清流行病学研究表明,新生儿由于带有母体血清抗体,44%具有病毒抗体,但1个月后抗体会迅速下降,1~23月龄的儿童病毒抗体阳性率仅为0.8%;在2~5岁,血清阳性率以每年12%的速率提高;到5~6岁时血清抗体水平达到一个稳定的状态,约为50%[8]。不同年龄组人群经历的手足口病发病次数不同,且经历的病毒株型别也不同,所以不同年龄组的发病可能不一。此调查中的高发人群集中在4岁以下儿童,发病最高的是2岁年龄组,与朱渭萍[9]等的研究结果一致。

[n(%)]

注:a缺失2例,b缺失7例,c缺失17例。

2011-2014年,EV型阳性检出率基本稳定在65%左右;EV71型除2013年阳性检出率较低外,其他年份也都较稳定;而Cox A16型各年的检出率波动较大。手足口病病毒EV71型是导致重症和死亡病例的危险因素,同时,虽然感染Cox A16型病毒的患者出现重症的可能性较小,但加强手足口病疫情的监测和报告,通过早发现、早报告、早诊断、早隔离和早治疗等一系列措施,可以有效控制该病的扩散。鉴于手足口病好发于儿童群体,各级卫生行政部门、医疗卫生机构、教育部门、托幼机构和社区卫生服务中心之间的协调和合作十分重要,包括储备应对暴发流行的物资、加强宣传、做好日常监测、做好预防接种和健康教育等工作。此外,应重点关注高发人群和高发季节。

参考文献

[1]周霞.盱眙县2010年手足口病流行病学分析[J].江苏预防医学,2010,22(4):49.

[2]刘民,刘闯.手足口病的流行病学特征及预防[J].中国皮肤性病学杂志,2010,24(7):591-594.

[3]Tom Solomon,Penny Lewthwaite,David Perera,et al.Virology,epidemiology,pathogenesis and control of enterovirus 71[J].Lancet Infect Dis,2010,10(10):778-790.

[4]陈德颖,林向利,杨正辉.利用国家疾病监测信息管理系统开展手足口病监测报告[J].疾病监测,2006,21(8):435-436.

[5]胡茂红,陈盛恩,吴景文,等.2009-2013年南昌市重症手足口病疫情分析[J].中国病原生物学杂志,2014,9(11):1025-1028.

[6]郭汝宁,张正敏,杨芬,等.广东省手足口病流行特征和危险因素研究[J].中华流行病学杂志,2009,30(5):530-531.

[7]林明.2 654例手足口病流行病学特征分析[J].应用预防医学,2009,15(4):210-211.

[8]Ooi EE,Phoon MC,Ishak B,et al.Seroepidemiology of human enterovirus71[J].Emerg Infect Dis,2002,8:995-997.

核酸定量检测法 篇6

关键词：儿童手足口病,诊断应用价值,肠道病毒核酸检测

手足口病是儿科常见病和多发病,近年来发病率明显上升,感染肠道病毒是导致其发病的主要原因,肠道病毒多达20种以上,其中较为常见的是CA16、EV71两种。5岁以下儿童是手足口病的高发人群,口腔黏膜出现散在疱疹,手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹是患儿的主要临床表现,多数患儿1周之内可自行痊愈,但病情严重者会发生心肌炎、肺水肿等并发症,甚至死亡。因此,及时准确的诊断对临床治疗和预后具有重要意义[1]。本文选取抚顺市中心医院儿科门诊收治的297例疑似手足口病患儿作为研究对象,现作如下报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料:

选取2015年1～10月抚顺市中心医院儿科门诊收治的疑似手足口病患儿297例作为研究对象,其中男160例,女137例,平均年龄(5.2±1.3)岁。本次研究纳入的患儿临床诊断结果符合《手足口病诊疗指南》中手足口病的临床诊断标准[2]。

1.2 方法:

所有患儿入院24h内给予血细胞分析以及生化系列、C反应蛋白(CCRP)检查,48h之内进行心电图、胸部X线检查。病原学具体检测方法:无菌采集297份咽拭子样本,将其置于MEM采样液中,密封,2h之内低温(4℃)运送至实验室。采用AB 7500 Fast荧光定量扩增仪以及由广州中山达安基因试剂公司提供的核酸检测试剂对肠道病毒通用型(EV)、肠道病毒CA16、肠道病毒EV71进行检测,一切操作按照试剂盒上的要求进行。

1.3 统计学方法:

借助SPSS21.0版本的统计学软件对研究数据进行处理分析,所有计数资料使用百分比(%)进行描述,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与其他肠道病毒检查率相比,肠道病毒通用型阳性检出率最高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

3 讨论

肠道病毒是导致小儿手足口病的主要原因,若不及时采取治疗措施,就会危及患儿生命安全[3]。EV71是诸多肠道病毒中较为常见的一种,其发生感染后具有2～7d的潜伏期,隐性感染率较高,此外EV71感染性极强,可在短时间内呈现大范围流行性感染,病情难以得到有效控制,增加了临床诊断和治疗的难度。所以,针对早期感染EV71的患儿要及时进行筛查和诊断,这对提高临床治疗效果和改善患儿预后具有至关重要的作用。分离、培养细菌的传统的诊断手足口病方法,不仅操作繁琐,且假阴性率较高,严重影响临床诊断和治疗。本研究结果显示,297例疑似样本中,肠道病毒通用型阳性236例(84.6%)、肠道病毒CA16阳性7例(2.4%)、肠道病毒71阳性1例(0.3%),肠道病毒阴性53例(17.8%),其中肠道病毒通用型检出率最高。上述数据提示临床必须对手足口病患儿早期诊断给予高度重视,以提高病原学依据。值得注意的是,进行肠道病毒核酸检测标本采集过程中,尽量收集粪标本,条件允许的情况下可同时联合咽拭子标本检测,以提高检测结果的准确性和可靠性。除此之外,在手足口病流行季节,对公共场所、幼儿园等要加强通风管理,加大流行性疾病的宣传力度,及时有效隔离手足口病患儿,避免或者杜绝此种疾病的大肆传播[4]。

综上所述,儿童手足口病应用肠道病毒核酸检测,具有显著的诊断价值,可为手足口病病原学提供准确可靠的确诊依据,值得临床积极推广应用。

参考文献

[1]戴光跃.肠道病毒核酸检测在儿童手足口病诊断应用价值[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊),2015,15(27):172-173.

[2]吴亦栋,周俊,陈东,等.肠道病毒核酸与抗体联合检测在手足口病病原早期诊断中的应用[J].中华检验医学杂志,2015,20(6):397-401.

[3]李国辉.儿童手足口病检验及治疗进展[J].海南医学,2012,23(23):129-131.

核酸定量检测法 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究对象为我院收治的日本血吸虫患者病例和同期健康体检者，分别抽取23例和20例，在日本血吸虫患者中有男12例，女11例，年龄25～74岁，平均（51.3±13.6）岁；健康组中有男12例，女8例，年龄23～75岁，平均（52.1±13.5）岁。研究对象性别、年龄差异不具有统计学意义（P>0.05），存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 研究方法

对所抽取的日本血吸虫患者和健康体检者分别采用PCR法和LAMP法对血清DNA进行检测，并将两种检测方法的检测结果以及疾病组和健康组的检测结果进行对比分析。

1.2.2 检测方法

血清DNA模板的制备：选取若干条日本血吸虫成虫，分别加入大批150µL的生理盐水中，将其研磨后加入200µL的虫体消化液，并在65℃条件下反应1h，充分振荡，而后采用400µL酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）溶液进行抽提，采取转速为12000r/min的离心机进行10min的离心操作，加入等体积的酚、氯仿（24∶1）溶液进行抽提，而后同样转速下离心10min，取上清液，而后加1/10体积浓度为2mol/L的乙酸钠，将2.5倍体积的冷无水乙醇予以加入，在-20℃条件下保存2h，而后以上离心条件进行10min离心操作，将上清液丢掉，采用600µL浓度为70%冷乙醇对沉淀进行洗涤，以上离心条件下进行10min离心，在37℃的干燥箱中进行烘干，而后加入100µL的TE缓冲液对沉淀进行溶解[2]。

1.3 数据处理

研究中所得到的相关数据采用SPSS14.0统计学数据处理软件进行处理分析，计数资料采用t检验，组间对比采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

经统计得知，本组23例血吸虫患者经PCR法检测结果发现，阳性病例14例，阳性率为60.87%；LAMP法检测结果发现阳性病例22例，阳性率为95.65%。由此可知，LAMP法的检测阳性率高于PCR法，且两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。两种方法对20例健康体检者的血清DNA检测结果发现全部呈现阴性，不存在明显的假阳性病例。详见表1。

3 讨论

现阶段在临床上血吸虫病依旧为对人类健康造成严重危害的一种寄生虫病，最近几年以来由于化学药物在疫区得到十分广泛的应用，血吸虫病的低虫荷感染致使常用的粪便涂片检查法以及血清学诊断法阳性率逐渐降低，又由于气候的变化以及人口流动增加等诸多因素的影响，造成血吸虫病的发病率特别是输入性血吸虫病的发生率正在呈现不断上升的趋势[3]。然而现阶段经典的粪检法只能够在血吸虫成虫产卵后的急性病变期才能够得到准确的检测，但是常规的免疫学检测法诸如ELISA和COPT法的抗体阳性检出时间相对较长，最早是在感染后4周，也就是说不管是粪检法还是免疫学诊断方法都不能够在血吸虫感染的潜伏期展开准确的早期诊断，所以对于控制疾病的传播而言新的血吸虫病早期快速诊断方法的临床意义十分显著[4]。现阶段已经有相关的国外文献对采取用降落PCR技术可以在感染曼氏血吸虫后2周的小鼠模型血清中对阳性结果予以检测到进行了报道，另有学者则对采取PCR法自患者血清以及粪便中检测出曼氏血吸虫特异的DNA进行了报道了，同时指出PCR法的临床诊断价值相当显著，值得临床给予关注[5]。本次研究中以动物模型实验研究为基础，进一步应采取PCR法和LAMP法核酸检测法对23例日本血吸虫患者的血清DNA进行了检测，并对检测结果展开了初步的评价分析，结果显示，PCR法能够检测到阳性病例14例，阳性率为60.87%，然LAMP法则能够检测出阳性病例22例，阳性率为95.65%，这一结果显示LAMP法的敏感性相对于PCR法具有较高的优势，更加重要的是LAMP法的诸多优势为PCR法所无法比拟的，譬如说LAMP法不需要进行长时间的温度循环，所用的仪器相对较为简单，操作较为简便，且结果能够用肉眼进行直接观察，从而致使该方法有望成为对日本血吸虫病进行早期快速诊断以及疗效考核的一种新的有效方法，这对于及时确诊，对传染源进行阻断，避免血吸虫病发生快速传播等均具有十分重要的临床价值[6]。

综上所述，采用核酸测定法对日本血吸虫的诊断以及病情评估具有重要意义，且两组不同检测方法的检测结果间存在十分明显的差异，因此值得临床对其给予高度重视。

摘要：目的 对核酸检测在日本血吸虫病诊断中的应用价值进行分析探讨。方法 随机抽取在2009年1月至2012年4月间我院收治的23例经ELISA以及IHA检测法均呈阳性日本血吸虫患者病例, 并抽取同期健康体检者20例, 对这两组患者的血清采用PCR法和LAMP法对DNA进行检测, 并对检测结果进行对比分析。结果 经比较发现, 两种不同方法的检测结果差异显著, 表现为LAMP法的阳性率高于PCR法, 且 (P<0.05) 。结论 对日本血吸虫患者展开核酸检测, 对于诊断而言具有重要意义, 且不同的检测方法其检测的阳性率存在较大差异, 值得临床给予关注与重视。

关键词：核酸检测,日本血吸虫,诊断,临床价值

参考文献

[1]陆正贤, 许静, 龚唯, 等.聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA的实验研究[J].中国人兽共患病学报, 2007, 23 (15) :157-160.

[2]钟华, 赖旭龙, 魏荣平, 等.一种从大熊猫粪便中提取DNA的改进方法[J].动物学报, 2009, 49 (25) :670-674.

[3]尹东, 陈红根, 许雪萍, 等.3种CAg检测方法评价吡喹酮治疗日本血吸虫病疗效的比较[J].中国临床药理学与治疗学, 2010, 19 (22) :177-179.

[4]孟玮, 吴忠道, 余新炳, 等.日本血吸虫肺期童虫收集方法的实验研究[J].中国人兽共患病杂志, 2009, 21 (12) :173-175.

[5]洪佳冬, 何蔼, 王轶, 等.日本血吸虫核酸在宿主体内的代谢[J].中国人兽共患病杂志, 2010, 18 (21) :159-162.

核酸定量检测法 篇8

2000年, 日本学者Notomi等发表了一种新的恒温核酸扩增方法, 即环介导等温核酸扩增法 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) [2]。它的设计思路完全不同于主流的PCR技术, 其特点是针对靶基因的6个区域设计4条或6条特异引物, 利用一种链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 在等温条件 (65℃左右) 下进行反应, 通过引物独特的反转设计, 对自身进行链置换扩增。该扩增方法不需要昂贵的仪器设备, 操作过程简单, 耗时1 h即可将目的基因扩增109～1010倍。对扩增结果的判定起初是通过电泳检测, 经改进后可以通过肉眼进行观察判定, 因此, 该方法大大简化了操作过程, 降低了操作成本, 并且适用于现场检测。

1 LAMP技术原理

利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊内引物 (FIP由F1C和F2组成;BIP由B1C和B2组成) 、外引物 (F3和B3) , 特异地识别靶序列上的6个独立区域。FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对, 启动循环链置换反应。F3引物与模板上的F3C区域互补, 引起合成与模板DNA互补的双链, 从而挤掉FIP引起的DNA单链。与此同时, BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合, 形成的环状结构被打开, 接着, B3引物在BIP外侧进行碱基配对, 在聚合酶的作用下形成新的互补链。被置换的单链DNA两端均存在互补序列, 从而发生自我碱基配对, 形成类似哑铃状的DNA结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构, 进行再循环和延伸, 靶DNA序列大量交替重复产生, 形成的扩增产物具有花椰菜形状的茎-环结构, 在恒温条件65℃左右进行扩增, 在45～60 min的时间里扩增可达到109～1010数量级[3]。若在此基础上设计两条环形引物, 能使反应时间缩短近一半, 可以在30 min内完成, 大大提高检测的效率[4]。

2 引物设计

LAMP技术的核心在其独特的引物设计, LAMP引物的设计与PCR有一定相似性, 却也存在差异, 如果按照PCR引物设计的方法去筛选, 无法得到合适的引物, 应遵循如下几点基本原则。

2.1 引物间距

F2引物的5'端到B2引物的5'端的距离, 最好控制在120～180 bp, F2引物和F3引物之间以及B2引物与B3引物之间的距离应在20 bp以内。

2.2 引物Tm值

Tm值视模板CG含量而定, 正常情况或者富含GC区域的Tm值为60～65℃, 富含AT区域的为55～60℃, 同时, 引物Tm值应满足F3/B360℃;B2>65℃。

2.3 引物末端稳定性

F1C和B1C引物5'端以及F2/B2、F3/B3引物3'端的6个碱基的自由能应小于-16.72 KJ/mol。

2.4 GC含量与发卡结构

引物GC含量最好在40%～60%, 太高或太低都会影响结合效果。另外, 设计时应尽量避免在3'端形成互补的发卡结构, 这点与PCR引物的设计相同。

2.5 片段长度

为了提高扩增效率、缩短反应时间, 扩增的靶序列长度最好不要超过300 bp。

3 操作步骤

DNA检测基本操作过程是将LAMP反应体系 (除Bst DNA聚合酶) 混合后, 95℃加热5 min, 使模板变性解链 (这个过程并不是必须的) , 再加入8 U Bst DNA聚合酶, 此后, 在60～65℃的水浴锅中保温60 min进行反应, 然后在高于80℃的温度下加热2 min, 使Bst酶热失活, 终止反应。也有报道称, 可采用冰浴降温的方法终止反应[5]。RNA检测需要在上述反应体系中加入反转录酶, 其他操作步骤与DNA检测操作相同[6]。

4 结果判定

LAMP技术判定核酸扩增结果应用的主要手段包括电泳检测、观察是否有沉淀产生、观察是否有颜色变化等。

4.1 基于电泳方法的结果判定

LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎-环状结构, 通过琼脂糖电泳检测可观察到形成梯形状条带。目前, 这种检测方法已经很少被用于结果判定, 但通过电泳检测可以对引物筛选、反应温度、反应体系等参数进行优化, 是初期研制工作的必要步骤[7]。4.2基于沉淀反应的结果判定2001年Mori等发现反应副产物焦磷酸离子和反应体系中的镁离子可发生反应生成焦磷酸镁沉淀。因此, 反应结果可通过肉眼判断。若管内液体浑浊, 离心或静置后有白色沉淀集于管底则为阳性, 否则为阴性[8]。为消除肉眼观察的误差, 现在已研制成功专用的LAMP终点浊度测定仪。2004年Mori又利用这个特性设计了一种LAMP产物的实时检测装置, 可以在不改变反应温度的条件下根据是否形成白色沉淀同时检测多个样本的LAMP反应情况, 对反应进行实时定量检测[9]。随后又根据这种方法开发了一种浊度实时检测仪来定量模板DNA的含量。

4.3 基于颜色反应的结果判定

LAMP扩增反应的结果判定有电泳、浊度分析和染料比色分析等方式, 其中观察染料颜色的变化最为方便。常见的染料有SYBR green、Picogreen[10]、碘化丙啶 (Propidium iodide) [11]、钙黄绿素 (calcein) [12]和羟基萘酚蓝 (Hydroxy naphthol blue, HNB) 等, 其中SYBR green和HNB的检测灵敏度相当, 是calcein检测灵敏度的10倍, 但calcein只在LAMP反应发生时才会染色, 相较于SYBR green任何扩增都能染色来说特异性更强, 假阳性率低;SYBR green在反应结束后加入, HNB在反应开始前加入, 判定结果时无需打开反应管, 可减少交叉污染的机会。

5 应用LAMP技术检测食品的实例

徐义刚等[13]根据GenBank中发布的金黄色葡萄球菌Sa442基因序列, 利用LAMP引物设计软件Primer Explorer 3.0, 设计4条引物, 应用LAMP技术对检测食品中金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度及用于检验检疫实践的可行性进行了验证。结果证实, 经过引物的精确设计, 建立了金黄色葡萄球菌LAMP方法, 60 min内即可完成检测;通过对26种共45株细菌进行LAMP扩增, 所试的20株金黄色葡萄球菌均为阳性结果。说明该LAMP方法具有高度特异性;证实该方法具有较高的检测灵敏度, 对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度可达25 CFU/ml, 污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42 CFU/g;与PCR法及实时荧光PCR方法检测灵敏度相比, LAMP法的检测灵敏度比PCR法高1个数量级, 而与实时荧光PCR方法的检测灵敏度基本相同。

赵玉龙等[14]应用LAMP技术检测奶粉中的致病细菌小肠结肠炎耶尔森氏菌 (Yersinia enterocolitica) , 针对该细菌的16S～23S rDNA间区 (16S～23S rDNA internal transcribed spacer, ITS) 靶序列中6个基因区段, 设计3对引物, 在Bst聚合酶的作用下对靶序列进行恒温扩增。结果证实, 该技术灵敏度和特异性均较好, 利用这种技术检测Y.enterocolitica整个检测反应只需1 h, 阳性结果可直接观察反应液中有无焦磷酸镁白色沉淀, 而无需经电泳检测, LAMP对Y.enterocolitica的检测灵敏度可达到8 CFU/反应, 此试验证实该方法对Y.enterocolitica的检出率与传统PCR方法一致, 适宜进行现场检测。

易海华等[15]针对编码O157:H7脂多糖的rfbE基因和编码H7鞭毛抗原的fliC基因特征性保守序列, 建立了食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的环介导等温扩增技术快速检测方法。结果表明, LAMP法可以在1 h内完成检测工作, 检测出肠血性大肠杆菌O157:H7的灵敏度为96.72%, 特异度为85.71%, 准确性为93.26%。

此外, 食品中志贺菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌及阪崎杆菌等微生物的LAMP检测方法也已经被建立起来[16,17,18,19,20,21]。

6 展望

核酸定量检测法 篇9

TEM-1是第一个被人们认识的β-内酰胺酶, 也是革兰阴性菌中最常见的β-内酰胺酶[1], 是细菌耐β-内酰胺类抗生素最原始的机制之一。该酶主要见于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌, 也见于产气肠杆菌、摩氏摩根菌、奇异变形菌、雷氏变形菌、沙门菌属等肠杆菌属, 90%以上的氨苄西林耐药的大肠杆菌产TEM-1型酶, 能够在不同革兰阴性菌种间传播, 比较具有代表性。

核酸探针技术是基因检测的常用方法, 准确、可靠。试验从患病毛皮动物组织分离、鉴定病原菌, 同时用核酸探针检测临床分离株的耐药基因TEM-1, 以期了解病原菌对β-内酰胺类药物的耐药现状, 为兽医临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌

42株毛皮动物病原菌, 由青岛农业大学兽医微生物学实验室分离、保存。其药敏试验结果见参考文献[2]。

1.2 试剂

TaqE (5 U/μL) 、dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 、pMD18-T 载体, 购自TaKaRa公司;GoldView核酸染料, 购自北京赛百盛基因技术有限公司;DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ, 购自Roche (罗氏) 公司;NC膜, 购自Pall公司。

1.3 TEM-1基因的PCR扩增

根据GenBank中登录号为AB28299的TEM-1基因全序列设计1对引物 (由北京赛百盛基因技术有限公司合成) , 长度为301 bp, 序列为上游引物P1 5′-GGTGCGGTATTATCCCGTGTTG-3′ (22 bp) , 下游引物P2 5′-GCTCGTCGTTTGGTATGGCTTC-3′ (22 bp) 。

采用丙酮、溶菌酶及蛋白酶K等制备细菌DNA模板, 进行PCR扩增。反应体系 (25 μL) :超纯水13.25 μL, DNA模板5 μL, 10×Buffer 2.5 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 2 μL, P1、P2 (25 μmol/L) 各1 μL, TaqE 0.25 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。

1.4 TEM-1基因的克隆测序及同源性分析

将TEM-1基因的PCR扩增产物纯化回收, 将回收产物与pMD18-T载体进行连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 选择阳性转化子保存。取阳性菌液送宝生物工程 (大连) 有限公司测序, 测序结果用Blast进行同源性分析。

1.5 TEM-1基因核酸探针的制备

纯化回收TEM-1基因的PCR产物, 用罗氏公司的试剂盒进行地高辛标记制备探针, 对该探针的标记效率、特异性、敏感性进行检测。

1.6 细菌分离株的斑点杂交检测

将42株G-病原菌分离株的模板DNA点在NC膜上, 经烤膜、预杂交、杂交、免疫学检测, 建立检测耐β-内酰胺类药物细菌的斑点杂交方法。

2 结果

2.1 TEM-1基因的PCR扩增结果

提取耐β-内酰胺类细菌的DNA为模板, 利用TEM-1基因的引物对其进行PCR扩增, 结果见图1, 可见1条特异性条带, 大小与预期的301 bp相符。

M. DL-2 000 Marker;1, 2.TEM-1基因的扩增产物。

2.2 TEM-1基因的序列比对结果

将菌株的TEM-1基因片段克隆测序, 测序结果为GGTGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGA-GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA-CTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCT-TACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGC-TGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCTGCCAACTT-ACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAAC-CGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC-CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATA-CCAAACGACGAGC。将测序结果经NCBI中的Blast进行序列比对, 证实该克隆片段与其他耐β-内酰胺类药物细菌TEM-1基因的核苷酸同源性达99%～100%。

2.3 探针的敏感性、特异性检测

选择PCR检测TEM-1基因阳性的2株细菌的DNA、金黄色葡萄球菌标准株的DNA, 用标记好的核酸探针检测探针的特异性。结果表明, 该探针对金黄色葡萄球菌标准菌株的检测无阳性杂交信号, 而对同源DNA的检测有明显的特异性斑点, 为强阳性。这说明该探针有较高的特异性。该探针对同源DNA的检出限量为52.9 pg。

2.4 细菌分离株的探针检测结果

用地高辛标记的TEM-1基因片段作为核酸探针对42株致病菌 (其中37株经药敏试验检测为阳性, 5株为阴性, 阳性率为80.95%) 进行斑点杂交, 结果见图2。

A1～A7, B1～B7, C1～C7, D1～D7, E1～E7, F1～F7.细菌分离株的模板DNA。

由图2可见, 斑点杂交共检出38株阳性, 4株阴性, 阳性率为90.48%, 该方法与药敏试验方法的符合率为92.11%。其中, 药敏试验检测C3和C6菌株为阳性, 而探针检测为阴性;药敏试验检测B7、C2和F1菌株为阴性, 而探针检测为阳性;剩余菌株药敏试验与探针检测相符合。

3 讨论

将42株分离的革兰阴性病原菌用临床常用的青霉素、氨苄西林、先锋V、头孢噻肟钠和头孢克肟5种β-内酰胺类药物进行药敏试验, 结果显示β-内酰胺类药物的耐药情况严重, 其中有50%以上的菌株对青霉素、氨苄西林、头孢克肟耐药, 但对先锋V、头孢噻肟钠等少数几种药物较敏感。药敏试验结果进一步证实β-内酰胺类药物均呈现多重耐药, 42株病原菌中二耐及三耐菌株占49.3%。同时多数病原菌还与氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类以及林可酰胺类产生多重耐药性。

核酸探针用于对耐药性的检测相对于药敏试验有许多优点。探针具有敏感性高、分辨率高、容易判断结果、能在一张膜上检测大量标本等特点。据相关文献报道, 用核酸探针技术进行检测, 其灵敏度高于其他方法, 能有效地减少漏检。本试验中, 核酸探针的阳性率为90.48%, 纸片扩散法的阳性率为80.95%, 核酸探针法灵敏度明显高于纸片扩散法。试验中有的样品用药敏试验检测为阳性时, 用斑点杂交检测却为阴性;而有的样品用药敏试验检测为阴性时, 用斑点杂交检测却为阳性。这些现象可能是由以下几方面的原因造成的: (1) TEM-1基因是革兰阴性菌中最常见的β-内酰胺酶耐药基因, 但也存在少量TEM-2和SHV等基因型, 药敏试验阳性菌株的耐药基因可能为其他类型的耐药基因, 而不是TEM-1基因, 因此造成探针检测阴性。 (2) 药敏试验受外界条件的影响, 如药敏试验中涂板不均匀导致细菌生长密度不一致, 抑菌圈过大或过小;抑菌圈大小是人为测量的, 难免存在误差等导致出现假阴性和假阳性。

作为抗菌药物β-内酰胺类在临床上广泛应用, 在药物筛选和诱导的双重作用下, 细菌的耐药性普遍呈现高水平、高耐药和多重耐药趋势, 给抗菌药物的研制和应用带来极大的挑战和考验。目前, 病原菌耐药的形势已相当严峻, 必须采取积极有效的措施来延缓或避免细菌产生耐药性, 应重视药敏试验, 根据药敏试验选择敏感药物, 以提高治疗的准确性, 延缓细菌耐药性的产生。

参考文献

[1]王春新, 祁国阳, 糜祖煌, 等.铜绿假单胞菌β-内酰胺类抗菌药物耐药相关基因研究[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2006, 26 (7) :610-613.