RT-PCR检测

RT-PCR检测（精选8篇）

RT-PCR检测 篇1

摘要：根据基因库中建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列,设计并合成3对特异性引物,利用荧光RT-PCR方法在蜘蛛兰中检测到普通RT-PCR-琼脂糖电泳法检测不到的微量病毒。熔解曲线分析表明,每一扩增产物为单一产物形态。通过测序和同源性分析,试验证实扩增产物序列的实际长度与预期完全相符,蜘蛛兰样品的扩增产物基因序列与基因库中建兰花叶病毒相应序列的同源性为94%～96%。与普通RT-PCR的相比,荧光RT-PCR方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点,可应用于种苗中微量建兰花叶病毒的早期检测。

关键词：建兰花叶病毒,荧光RT-PCR,快速检测,蜘蛛兰

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(OdontogLossum ringspot virus,简称ORSV)是发生最为普遍的兰花病毒,广泛分布于全世界栽培兰花的地区[1,2,3,4,5,6],这2种病毒传染性强,其中CymMV相对ORSV更易传染,在市场上蝴蝶兰、文心兰和卡特兰CymMV的感染率高达66%以上[7],病毒侵染导致植株生长不良甚至死亡,有时病毒感染后还会在植株的营养生长期出现较长时间的隐症现象,但带毒植株开花小而少,花期缩短,发病兰株观赏价值和经济价值大为下降,还会导致种质退化,对兰花产业造成严重危害。

多年来,国内学者不断深入地对CymMV的检测技术开展研究工作:1997年,潘俊松等[8]从石桷兰中分离出CymMV用于制备抗血清;郑平等[9]用组织涂抹酶联免疫吸附技术检测CymMV和ORSV;周国辉等[10]用RT-PCR方法对病毒分子进行鉴定;2007年施农农等[11]对用电镜法对CyMV和ORSV进行超微结构观察;2008年高焕利等[12]用IC-RT-PCR检测CymMV,提出了该方法可检测到CymMV分离物的最低病毒量为2.72×10-7μg/mL(428个拷贝)。2006—2008年期间,笔者在根据文献资料的多种方法对147个样品进行CymMV检测,并相应的隔离栽培,但不时发现有部分初检为阴性的样品,经过一段时间养护后复检为阳性,对苗圃中兰花种苗的检测也经常发现这种情况。这就涉及检出限的问题,说明有部分样品中只含有微量CymMV,用前述的方法不能被检出。

为解决检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题,笔者摸索建立了利用实时荧光PCR仪快速检测微量建兰花叶病毒的方法,使建兰花叶病毒的检测水平从灵敏度、准确性、稳定性上有所提高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。

供试材料为蝴蝶兰(PhaLaenopsis sp.)(1#)、卡特兰(CattLeya sp.)(2#)、文心兰(Oncidium sp.)(3#)、蜘蛛兰(Arachnis sp.)(4#)、皇后兰(GrammatophyLLmn sp.)(5#)、蕙兰(C.Faberi)(6#),所有样品之前经ELISA筛检,并由笔者所在实验室分类保存,其中本试验所用的卡特兰、文心兰和蜘蛛兰为加保护液冻存的叶片组织,其他为从植株上采的新鲜叶片。

1.1.2 供试试剂。

供试试剂为:UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒(上海Sangon),MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒(上海Sangon)、One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(大连Takara公司)。

1.1.3 供试仪器。

供试仪器为:Bio-Rad Opticon 2荧光定量PCR仪(美国),Thermo Labsystem MuLtiskan Mk 3酶标仪(上海雷勃),TC-96/H/G基因扩增仪(大和热磁),VARIAN CAR Y50紫外-可见分光光度计(美国)。

1.2 引物设计与合成

查询NCBI基因库(GeneBank),根据CymMV保守序列,设计并合成3对特异性引物(表1)。

1.3 RNA提取

样品用液氮研磨成粉状,称取粉状未解冻试样(约为100 mg),提取步骤参照RNA抽提试剂盒推荐方法稍加调整,因试样较粘稠,每100 mg试样加0.8 mL裂解液提取,洗脱体积为50μL。取20μL RNA提取物用无菌水稀释100倍在分光光度计上以波长260 nm检测总RNA含量,以A260/280比值和200～400 nm扫描图检测RNA纯度,纯化提取物直到A260/280比值>1.9。将提取物10μL/管分装在RNAase free的PCR管中,-80℃保存备用。

1.4 普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒,反应条件参照文献[7]。反应结束后,取C1、C4、C7产物分别为4.0、5.0、6.0μL,各加0.5μL上样缓冲液,于1.2%琼脂糖凝胶上(含EB 0.2μL/mL)进行电泳。

1.5 荧光RT-PCR定性检测和熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR试剂盒进行荧光PCR定性检测,具体操作步骤:每孔加RT-PCR Buffer(内含dNTP Mixture,Mg2+,SYBR誖Green I)25μL,反转录酶和Taq酶混合物2.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C7)各1.0μL;水20μL;最后加1.0μL标准品或试样,制成总体积为50μL反应液体系,以无菌水代替试样作空白对照,加盖密封,1 000 r/min离心1 min,在荧光PCR仪上逆转录和扩增反应,经优化后的一步法RT-PCR反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,15 s;(3)94℃,5 s;(4)55℃,30 s;(5)72℃,20 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环30次;(8)72℃,5 min。将扩增产物进一步做熔解曲线分析:55～94℃;每0.5℃读板1次,每点持续5 s。

1.6 荧光RT-PCR定量检测

由于普通RT-PCR与荧光PCR定性检测存在差异,对有差异结果通过与一定浓度的重组质粒同时扩增进行定量分析。

1.6.1 标准品的制备。

将得到的经纯化的扩增产物,与质粒(p UCm-T载体)连接并克隆,提取相应的重组质粒,制成100 ng/mL的溶液,以此作为标准品储备液。

1.6.2 一点法粗略定量检测。

将C4重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.8×102质粒/μL标准使用液。4#样品和标准品在相同条件下进行反应:RT-PCR Buffer 12.5μL,反转录酶和Taq酶混合物1.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C4)各0.5μL;水10μmoL;最后加0.5μL标准品或试样,制成总体积为25μL反应液体系,反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,2 min;(3)94℃,30 s;(4)、55℃,30 s;(5)72℃,25 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环35次;(8)72℃,10 min。

1.6.3 绝对定量法检测。

将C7重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.6×107、2.6×105、2.6×102质粒/μL的标准使用液。将1#、4#和5#样品和标准品在相同条件下进行反应,引物为C1,其他反应试剂同1.62,反应条件参照文献[13]。对线性范围内未知样品用绝对定量法计算其原始拷贝数,对线性范围以下的样品进行半定量分析其浓度范围。

1.7 测序验证

收集1.4和1.6的扩增产物,经纯化、克隆,委托上海Sangon测序。

2 结果与分析

2.1 CymMV的普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测结果

用所设计3对的CymMV PCR引物进行RT-PCR反应,能够成功地在部分兰花病样总RNA抽提物中扩增到与预期大小相符的单一明亮的DNA电泳条带(图1)。由图1可见4#样在电泳图上未检出CymMV,但该植株再经过3个月的隔离栽培后出现症状,并用ELISA和PCR方法均检出CymMV,随后逐渐枯死。

注:图中1为DNA Marker,2～8、9～16、16～22孔依次为1#～6#样品C1、C4、C6和相应的空白对照的产物。

2.2 荧光RT-PC定性检测结果

由图2可知,4#样的总RNA提取物经荧光RT-PC定性检测发现该蜘蛛兰已被CymMV感染,但其含量极低,对产物进一步进行熔解曲线分析,结果4#样与其他样品的产物Tm都是78.0℃,并由图3可知,其熔解曲线均为单一产物形态,表明4#样与其他样品的具有相同的单一产物。

2.3 荧光RT-PCR半定量检测结果

由图4可知,4#样的CymMV C4模板浓度<2.8×102质粒/μL的C4重组质粒模板浓度,因重组质粒中的模板为双链DNA,0.5μL重组质粒模板数为2.8×102×2×0.5=2.8×102拷贝,即4#样的CymMV C4模板<2.8×102拷贝。由图5可知,4#样的CymMV C1模板<2.6×102拷贝,同时可以看出,2.6×102拷贝和2.6×100拷贝扩增曲线并无明显的区别,因此当模板数<2.6×102拷贝,只能进行定性分析。

2.4 测序结果

测序结果表明,所有扩增产物的实际长度与预期完全相符。应用NCBI基因库的BLAST对产物进行同源性分析,C1产物与基因库中CymMV相应序列的同源性≥96%;C4产物同源性89%～99%。C7产物的测序结果同源性比较见图6,由图6可知,1#样蝴蝶兰同源性≥96%;5#样皇后兰同源性≥97%,与AM055640.2所报道的序列完全相同,与1#样有5个碱基的差异(同源性97%);4#样蜘蛛兰与基因库序列的同源性94%～96%;与基因库中EU672821.1序列最接近,存在7个碱基的差异(同源性96%);4#样与1#样有12个碱基的差异(同源性94%),4#样被其他样品污染的可能性极小。因此,认为该植株在引进时已经携带微量的CymMV。

3 结论与讨论

3.1 建立了微量CymMV的快速检测方法

传统的PCR-电泳方法无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析,必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力,而且电泳分辨率限制了该方法的检测灵敏度。

荧光RT-PCR法在检测时可进行实时观察扩增状态,因此在很大程度上加快检测速度;该方法因所有试验在封闭系统内完成,可变因素大大减少,比普通PCR方法灵敏度提高了102倍;因为不需要进行后期处理,可防止强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。本研究建立的CymMV实时荧光RT-PCR检测方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点,可应用于种苗中微量CymMV的早期检测,并对深入开展CymMV生物学特性研究打下基础。

3.2 检测灵敏度可达基因拷贝数仅在个位数

荧光RT-PCR检测方法不但可以定性分析,也可进行定量分析,导入基因拷贝数解析,在本文中主要针对病毒含量在定量限(2.6×102拷贝)以下的样品进行分析,因此只能通过半定量方法推算其基因拷贝数仅在个位数。

3.3 荧光RT-PCR定性和绝对定量检测对引物要求高

荧光PCR法的荧光扩增曲线,不能分辨扩增产物有几个,因此必须是单一产物的扩增。扩增结束时,可用熔解曲线法对扩增的特异性进行验证。因此,要求引物具有高度的特异性和目标基因的保守性。

荧光RT-PCR定量检测方法分为绝对定量和相对定量法,相对定量法检测成本高,本研究主要针对生产应用,因此,采用了绝对定量法,该种方法对于引物的特异性、保守性和产物的稳定性要求较高,所应用的引物应经过反复验证。

本该研究中,最初设计了7对引物,其中C1和C7互为巢式扩增引物,就是为了防止出现非特异性扩增而设计的。经反复试验从中筛选出3对符合要求的引物:C1、C4和C7。这3对引物中,C1和C7的产物保守性相对较高。C7产物序列较短,扩增快速度快,定性快速检测时宜选用C7引物;在定量检测时,C1产物通过与质粒连接作为标准品,可获得较好的定量效果[13];C7引物的定量方法有待进一步研究。

RT-PCR检测 篇2

目的:建立人偏肺病毒(hMPV)核酸特异的快速、敏感的`TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法.方法:分别设计hMPV特异的引物与荧光标记探针,合成hMPV绝对定量RNA模板,建立实时荧光定量PCR方法,并与常规RT-PCR平行比较,对其灵敏性、特异性和可重复性,以及用于临床样本的适用性等进行评价.结果:本方法可对hMPV进行特异性诊断,检测灵敏度可达10拷贝/25 μL,检测线性范围至少可达10 1～10 6拷贝/反应,且实验重复性好,初步应用于北京地区采集的158份临床鼻咽拭子标本,定量RT-PCR检出31份标本阳性,明显高于常规RT-PCR方法(22/158).结论:建立了人偏肺病毒TaqMan-MGB探针定量RT-PCR检测方法,并初步证实可用于临床鼻咽拭子标本的检测,为开展hMPV的流行监测及临床早期诊断提供了技术手段.

作 者：陆柔剑 张陵林 谭文杰 周为民 王仲 彭 阮力 LU Rou-Jian ZHANG Ling-Lin TAN Wen-Jie ZHOU Wei-Min WANG Zhong PENG Kun RUAN Li 作者单位：陆柔剑,张陵林,谭文杰,周为民,阮力,LU Rou-Jian,ZHANG Ling-Lin,TAN Wen-Jie,ZHOU Wei-Min,RUAN Li(中国疾病预防控制中心,病毒病预防控制所,北京,100052)

王仲,WANG Zhong(北京协和医院,北京,100730)

彭,PENG Kun(北京市第六医院,北京,100007)

RT-PCR检测 篇3

1 材料与方法

1.1 杂交技术和逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)

最大优点是可进一步对病毒进行基因型研究, 不会受到获得分型单克隆抗体的限制, 对流行病学研究具有重要意义。

1.2 标本采集

1.2.1 粪便采集

发病首日采集, 最多不能超过发病急性期48～72h。取病毒排出量最多的稀、软便, 成形便和肛拭子诊断意义小。一次流行至少采集10例患者粪便, 每份标本量约1～5mL。标本置4℃可存放2～3周, 运送要求低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充, 有助于病原的诊断。饮用水需用大容量 (5～100L) , 浓集病毒后再检测。

1.2.2 牡蛎富集

牡蛎为病毒传播媒介, 发病大多与食用牡蛎有关。NV抵抗力强, 在外界环境中存活较久。其外壳为蛋白质, 表面带负电荷, 易吸附于颗粒物表面, 在颗粒物和浊度较高的水内, 病毒随颗粒物沉淀于水底, 牡蛎通过食物链摄取、富集病毒。在体内病毒浓度比水中的浓度要高很多倍, 人一旦食用污染的牡蛎, 易造成暴发流行。

1.3 NV浓缩

1.3.1 有机絮凝沉淀法

主要使用聚乙二醇 (PEG) 沉淀。PEG是具有强烈吸水性及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物。先改变样品pH值, 使病毒颗粒与样品微粒分开, PEG把病毒沉淀下来, 达到浓缩的目的。目前对于固体样品PEG沉淀法是最有效的浓缩方法。

1.3.2 膜过滤法

通过改变膜的p H值使之与带有电荷的病毒颗粒结合捕捉病毒。这种方法通常用在浓缩大体积的黏度小、内容颗粒小的液体食品或水中。在检测海水、生活污水中的NV曾用过这种方法, 为瓶装水和其他饮料浓缩NV提供了参考。

1.4 样品前处理

1.4.1 粪便浓缩液制备

用PBS缓冲液将粪便制成10% (g/v) 的悬液, 剧烈振荡后, 置4℃, 12 000rpm, 20min离心。取上清于1.5mL的无RNA酶的离心管中, 置-20℃中保存, 备用。

1.4.2 牡蛎浓缩液制备

用竹签、手术刀等切断牡蛎的贝柱, 打开壳, 去除外膜, 将消化腺周围的脂肪组织尽量用手术刀、小镊子等去除, 取出消化腺 (去除干净) 。将消化腺置匀浆器中快速匀浆后放入灭菌的三角烧瓶中, 加入7倍的甘氨酸缓冲液, 室温下充分振荡后分装于50m L离心管中, 置4℃, 3 000g, 30min离心。取上清液转移至新的无菌的50mL离心管中, 调pH值至7.5, 加入等体积16%的PEG6000, 轻微混匀, 4℃沉淀4小时后, 置4℃, 3 000g, 30min离心, 弃上清。沉淀用2mL 0.15 M Na2HPO4重悬, 室温下100rpm振荡20分钟后, 分装于1.5mL的无RNA酶的离心管中, 置4℃, 10 000g, 30min离心。将上清夜移至新的1.5mL的无RNA酶的离心管中, 并调节p H值7.4, 置-20℃中保存, 备用。

1.5 核酸提取

1.5.1 RNA提取 (Trizol试剂方法)

按照使用说明书, 提取上述处理后样品中的RNA, 用DEPc处理过的二次水溶解作为RT-PCR模板, -20℃保存, 备用。取牡蛎样品浓缩液、粪便样品浓缩液300μL, 加入1m L TRIZOL溶液, 上下颠倒混匀后, 加入200μL氯仿, 剧烈摇动15sec, 冰盒中放置3min 4℃, 12 000g离心15min, 离心前管中出现分层可重新摇动使之混匀。取出离心管吸上清于另一无RNA酶的1.5mL离心管中, 不要吸入中间的DNA层。加入700μL的异丙醇, 冰盒中放置10min之后12 000g, 4℃离心10min。弃离心管中的液体, 加入75%乙醇1m L, 上下颠倒3～5次, 室温放置2min, 7 500g, 4℃, 离心5min;重复洗涤一次。弃管中液体, 室温下倒置10min, 加入20～50μL的DEPC处理过的水, 溶解RNA。冰盒放置备用或-70℃保存。

1.5.2 RT-PCR过程 (反应体系的配置)

采用一步法荧光RT-PCR试剂盒。反应体系:buffer12.5μL+逆转录酶0.25μL+Tag酶0.5μL+RNA酶抑制剂+引物1μL+1.5探针+RNA9.25μL, 一共25μL体系。PCR反应条件:42℃15min;95℃2min;95℃5sec;51℃35sec, 40个循环。

1.5.3 制作标准曲线

将标准品贮存液梯度稀释为2×106, 2×105, 2×104, 2×103, 2×102, 2×101copies/μL, 6个浓度的标准品稀释液各取5μL为模板 (其他组分同上表) 待测样品, 一同进行PCR扩增, 制作标准定量曲线。

1.5.4 荧光PCR注意事项

RNA的操作过程中一定要戴手套及口罩, 并尽量减少RNA酶污染。吸头、离心管等应用DEPC处理。进行数个RT-PCR反应时, 先配制各种试剂的混合液, 包括无RNA酶的水、反转录缓冲液、随机引物、dNTP混合物、逆转录酶等, 然后再分装到每个反应管中。这样, 取的试剂体积更准确, 减少试剂损失, 避免重复分取同一试剂, 减少实验操作及实验之间的误差产生。使用逆转录酶时, 应轻轻混匀, 避免起泡, 吸取之前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保存中含有50%的甘油, 黏度高应慢慢吸取, 并且应在实验前才从-20℃中取出, 使用后也应立即放回-20℃中保存。PCR反应液中含有Taq DNA聚合酶等, 为防止失活, 融化后应轻轻混匀, 避免剧烈操作。实验操作各个阶段应在不同的实验室或在实验室相对隔离的不同区域内进行, 一般分为试剂准备区、样品处理区、PCR反应及产物检测区等。在实验操作时, 各阶段应使用专用的仪器和设备, 以防止污染。分装试剂时务必使用新的枪头, 以防止样品间的污染。

2 结果

所检测的结果按照参比曲线计算浓度进行报告时, 计算方法:Ct≤X的样品, X≤Ct

3 讨论

NV在人体外很难繁殖, 一旦存在食品或水中, 就能引起食物中毒[4]。从阳性牡蛎样品不同部位检测中可以发现[5], 牡蛎内脏团中检测到NV, 而肌肉、鳃等部位未检测到NV。尽管一只牡蛎每小时可以过滤10～20L水, 通过滤食作用将水体中的NV富集在消化道内, 但是NV无法在牡蛎消化道内增殖, 也无法扩散到牡蛎的其他部位。Schwab等[6]通过分析牡蛎组织内NV的吸收、分布和排泄情况发现, 不管接种病毒的多少, 消化道和胃均可以检测到NV。在水体中NV含量非常少, 不可能达到人为模拟试验的浓度。我国居民在食用牡蛎的时候, 有时为了获得更好的口感, 对牡蛎的加工和处理也不够充分, 从而导致NV食物中毒传播和流行。牡蛎中污染NV主要分布于消化道, 检测样品中牡蛎的检出率最高。在冬季采集到96个牡蛎样品中, 能检出18个阳性, 阳性率为18.8%。检测结果说明, 牡蛎中被NV污染程度较为严重, 具有明显的季节性分布, 冬季是NV污染的高峰期, 主要集中在气温较低的月份中。NV多侵袭成年人和较大年龄儿童, 流行无明显季节性[4]。NV对各种理化因子有较强的抵抗力, 冷冻数年或60℃加热30分钟后仍能存活, 只有在含氯消毒剂作用30分钟后才被杀死。NV对热、乙醚和酸稳定, 室温p H2.7环境下存活3h, 20%乙醚4℃处理存活18h, 60℃孵育30min仍有感染性, 也耐受普通饮水中3.75～6.25ppm的Cl-浓度 (游离氯0.5～1.0ppm) , 但在处理污水的10ppm的Cl-浓度中被灭活。NV耐热、耐冻、耐酸碱, 生吃牡蛎或加热未熟透的水产品食物, 是导致NV食物中毒暴发流行的常见原因[4]。

参考文献

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[3]刘翼, 戴迎春, 姚英民, 等.广州市某医院儿童秋冬季诺瓦克样病毒感染的分子流行病学研究[J].中华流行病学杂志, 2005, 26 (7) :525.

[4]陆建荣, 何连生.诺如病毒感染现状及其防治措施[J].中国公共卫生管理杂志, 2008, 24 (1) :72.

[5]柳淑芳, 李振, 周德庆.青岛地区贝类产品中诺如病毒的感染和流行初探[J].渔业科学进展杂志, 2009, 30 (1) :61.

RT-PCR检测 篇4

荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度高, 并且可以有效的防止检测过程中样品的污染, 极大的提高了检测的准确性。此外荧光定量RT-PCR检测方法灵活性也好, 可一次获得样品的多个遗传信息, 这就大大的缩短了检测时间, 为A型流感病毒患者的治疗创造了最佳治疗时间。本次研究选取2011年9月至2012年3月我院收治的10例A型流感病毒感染者, 随机分为两组, 对照组5例进行常规检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。两组临床资料进行分析, 情况如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究病例10例, 其中女性6人, 男性4人, 年龄5~70岁。小孩4例和老人3例比重较大, 男女比例相当。10例患者中, 发烧咳嗽的有1例, 浑身酸痛流涕的有2例, 出汗咳嗽流涕的有1例, 发烧浑身酸痛的有2例, 发烧并且出汗的有1例, 浑身酸痛兼出汗的有1例, 发烧、浑身酸痛、出汗、咳嗽流涕的有2例。两组在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

对照组5例进行常规检测, 采用血清学检测方法和病毒分离培养方法进行检测。实验组5例采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件, 计数资料行χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

实验组荧光定量RT-PCR方法检测时间短, 且具有特异高, 敏感性高的特点。这些特性对疾病治疗也有极大的帮助。对照组发现有3例病情加重, 其中1例并发淋巴系统疾病2例并发肺部细菌感染, 继发性肺炎主要症状表现为持续发烧、头痛、呕吐、恶心、嗜睡、食欲不振、吐浓痰、痰液黏稠且黄、少数痰中带血、病人面色发黄。并发淋巴系统疾病的患者表现为淋巴结中大、身体浮肿、淋巴管扩张扭曲、局部淋巴管管壁及其周围组织发生炎症细胞浸润、浸润的细胞中有大量噬酸性粒细胞。实验组有2例病人并发肺部细菌感染, 症状表现为发烧、恶心、呕吐、嗜睡惊厥等症状, 没有发现有淋巴系统病变的病例。经化验科检验, 肺部细菌感染的继发性肺炎主要是感染金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌和肺炎链球菌。实验组治疗时间为1~3周, 对照组治疗时间为2~4周, 其中有1例病情严重的为6周左右。有1例因病情恶化转移到上级医院去接受治疗。值得提醒的是, 在研究过程中发现A型流感病毒容易感染其他住院病人。而这些病人都是些免疫能力相对比较低的病患。见表1。

注:*与对照组比较1) P<0.05。

3 讨论

A型流感病毒具有很强的侵袭力, 而且对药物的治疗具有抵抗力的突变或是变异, 可以对病人的健康造成威胁。对照组并发症较高, 可能是因为血清学检测特异性和敏感性不高, 检验的准确性低从而有误诊影响到对疾病的治疗或是错误治疗诱发病毒变异, 这些因素都可能加重疾病或是引起并发症;病毒分离培养方法至少需要21d才能得到检测结果, 检测时间过长, 有些患者所感染的病毒在检验过程中可能已经发生突变或者是变异, 从而影响到治疗的效果。A型流感病毒极易突变, 不正确的治疗以及治疗时间过长均易导致突变, 从而加重治疗的困难性。而且突变后的A型流感病毒株具有更强的毒力和攻击性。此外, 耐药性也是一个不可忽视的问题, 在确诊之前采用广谱抗病毒药物, 不仅易导致耐药还可能导致突变从而贻误病机。从感染A型流感病毒的人群分析, 老人和小孩所占比重相对较大, 老人免疫系统功能退化而小孩免疫系统尚未发育好, 这两大人群共同特点就是免疫力比较差。因此加强对老人和小孩的保护也很重要。感染A型流感病毒后, 人体的免疫力降低, 原本寄居于人体的正常菌群如金黄色葡萄球菌变成致病菌, 从而引发一系列的感染。早期识别以及采取长期隔离防范措施看来对预防受到感染的免疫功能受损患者发生 (医院性) 流感病毒爆发不失为是一种谨慎的作法[1]。然而, A型流感病毒感染早期症状并不明显, 只有50%左右的有明显的类似于呼吸道感染疾病的症状。这就加重了防治的难度。到医院就诊的都是症状明显、病情较严重的患者。这就需要医院有快速的检测结果和尽早的治疗。荧光定量RT-PCR检测方法正好弥补了血清学、病毒分离检测方法的不足, 对A型流感病毒的检测时间短, 异性高, 敏感性好, 为疾病A型流感病毒感染的尽早治疗创造了条件。荧光定量RT-PCR检测方法不仅对A型流感病毒的治疗有积极作用, 而且有利于隔离传染源, 切断传播途径, 保护易感者, 减轻人们的恐慌心里和心理压力。有利于提高治愈率, 缩短治病时间, 提高病人的生活质量。

摘要：目的:探析荧光定量RT-PCR检测方法对A型流感病毒检测的快速性、敏感性和特异性以指导临床治疗。方法:选择我院2011年9月至2012年3月收治的10例感染A型流感病毒病人, 随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果:实验组的确诊率和治疗效果均高于对照组, 且所用的检测时间和治疗时间均短, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:荧光定量RT-PCR检测A型流感病毒准确率高, 对临床治疗有积极的指导作用。

关键词：荧光定量RT-PCR,A型流感病毒,检测方法

参考文献

RT-PCR检测 篇5

马铃薯S病毒是马铃薯重要病毒之一,1948首次发现和报道于荷兰,在许多种植马铃薯的地区皆有发现,并且分布广,曾是荷兰马铃薯生产病毒防治对象之一。其危害程度因品种和株系不同而异,一般减产10%～20%,患病植株常形成小块茎。马铃薯S病毒是单链RNA病毒,质粒形态为弯曲纤维状,正常长度为650 nm,直径12～13 nm。马铃薯S病毒易通过汁液传毒。

我国防治马铃薯病毒病的主要方法是选育抗病品种 ,或采用组织培养方法生产脱毒种薯等, 快速、灵敏、特异性好的病毒检测技术是杜绝马铃薯 S病毒的关键。目前主要采用指示植物和血清法等方法进行检测。指示植物法耗时长,占用空间大,灵敏度低,且对症状的观察需要很多经验的积累,因此一般不作为最终鉴定。在血清学鉴定中以ELISA应用最广,ELISA虽然可以在短时间内检测大量样品,但对浓度极低的病毒(如韧皮部病毒和休眠未出芽或自然老的块茎的病毒却不足以做出可靠的病毒判断,同时季节性的变化常阻碍阳性与阴性样品的区分[3],存在着假阳性或假阴性现象,而且只是检测了病毒的外壳蛋白(CP),其遗传信息量只占整个病毒遗传信息量的 5%～10%,无法区分因 CP基因有一定同源性的病毒类型[4] 。随着分子生物学的发展, 聚合酶链式反应(PCR)得到了迅速而广泛的应用。应用此项技术检测植物病毒具有快速、灵敏、简便、特异性强等优点,而且可检测出植物组织中含量极低的病毒RNA[5], 能检测到休眠种薯或含量极少的韧皮部病毒,其灵敏度是ELISA的104倍[6],适用于快速早期鉴定马铃薯脱毒种薯的质量以及从国外引种时种薯种质量检测,为马铃薯病毒检测提供了更有效的手段。本文开展了马铃薯S病毒的RT-PCR检测技术的研究,旨在建立检测PVS快速、准确、灵敏、有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

感染有PVS病毒的马铃薯试管苗由华中农业大学园艺林学院提供。脱毒试管苗由湖北恩施中国南方马铃薯研究中心提供。

1.2 主要试剂与耗材

TRIZOL提取试剂盒,M-MLV Reverse Transcriptase,Oligo(dT) primer购自Promega公司;TaqDNA聚合酶,dNTP Mixture,100bp DNA ladder,Ribonuclease Inhibitor等购自博大泰克;其它试剂均为国产分析纯。试验过程中所用的试剂、枪头、离心管等须经高压蒸汽[5]灭菌,但不用DEPC处理。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取

采用TRIZOL试剂法提取总RNA。TRIZOL试剂法提取总RNA参照试剂盒说明书进行。具体方法如下:称取100 mg马铃薯样品组织直接放入高温高压消毒过的1.5 mL的离心管中,加入少量液氮,迅速用研磨棒研磨成粉末,然后按50～100 mg组织加入1 mL TRIZOL,室温放置5 min,使其充分裂解, 彻底分离核蛋白复合体。12000 r·min-1, 4℃离心5 min,弃沉淀。小心吸取上清液,移入新的离心管中。匀浆裂解液中按200 μL氯仿/mL TRIZOL加入氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,室温静置15 min。12000 r·min-1,4℃离心15 min。吸取上清液转移至另一新的离心管中,向上清中加入等体积的异丙醇或2倍体积乙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,室温下静置10 min。12000 r·min-1, 4℃离心10 min。小心弃去上清,RNA沉于管底。缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1 mL,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,8000 r·min-1,4℃离心5 min后小心弃去乙醇,室温晾干或真空干燥5～10 min,加入20 μL灭菌双蒸水溶解沉淀,分装备用,-20℃保存。

1.3.2 引物设计与合成

根据已报道[5]的 PVS的外壳蛋白基因序列,设计一对PCR引物。5′端引物:5′-GCCGCATTTGACACATTCGAT-3′,3′端引物:5′-CAATCTCAGCGCCAAGCAT-3',由上海生物工程公司合成。预计 PVS两引物间序列长199 bp。

1.3.3 DNA的合成

以总RNA为模板,合成cDNA第一链。将反应混合物各组分放置冰上,离心管中依次加入总RNA 3 μL,Oligo(dT) primer 1 μL,再加入ddH2O至12 μL,轻轻混匀,振荡3～5 s。然后将混合物在70℃放置5 min,再置冰上冷却30 s,离心5 s。将离心管置于冰上,依次加入以下成分:5×反转录酶Buffer 5 μL, RNA酶抑制剂(20U)1 μL, dNTP混合物1 μL,反转录酶1 μL,再用无Rnase的灭菌双蒸水调至总体积25 μL,瞬时离心混匀,37℃温育1 h,置70℃ 10 min灭活,合成PVS的cDNA第一链。

1.3.4 PCR扩增

采用50 μL体系,以cDNA第一链为模板,PVSF、PVSR为引物进行PCR扩增,在200 μL薄壁PCR管中分别依次加入各反应物,反应体系具体为: 10×Taq Buffer 5 μL, 10 mmol·L-1dNTP 1 μL, cDNA模板2 μL,10 pmol/μL引物PVSF 1 μL,10 pmol/μL 引物 PVSR 1 μL, (5U)TaqDNA聚合酶1.2 μL,灭菌双蒸水38.8 μL。轻弹离心管底部使所加试剂充分混匀,稍稍离心将管壁液滴收集到离心管底部,PCR自动扩增仪进行扩增。反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min, 60℃复性1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。

1.3.5 PCR产物鉴定

反应结束后,取PCR产物5 μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳, 经溴化乙锭染色5 min,然后在紫外灯下观察结果、照相,与DNA Marker比较,分析产物大小。

1.3.6 RT-PCR重复性鉴定

用引物 PVSF、 PVSR 对提取的各马铃薯病毒RNA 及脱毒试管苗 RNA 样品分别进行 3 次 RT-PCR 扩增。

2 结果分析

2.1 总RNA完整性

从植物组织中提取 RNA 是进行植物分子生物学研究的必要前提 ,要进行核酸分子杂交 、RT- PCR等分子生物学研究 ,都需要有高质量的RNA。用RT- PCR方法检测马铃薯病毒,第一步就是要得到病毒RNA模板,而病毒RNA的完整性无法用简单的方法加以直接判断,须通过总RNA 的质量来间接判断,单纯检测总RNA的完整性可以用非变性凝胶电泳。TRIZOL试剂提取得到的总RNA在琼脂糖凝胶上的电泳结果分别见图1。从图1可以看出,用TRIZOL试剂提取的总RNA电泳后可见3条较清晰的条带,它们分别是28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA,这表明总RNA具有较好的完整性,说明本试验采用TRIZOL法成功地从感病马铃薯叶片中获得了质量较高的总RNA。

2.2 总RNA纯度

本实验中成功地从马铃薯病叶组织中提取到质量好 ,纯度高的总 RNA ,样品的 RNA 浓度和纯度结果见附表。纯度好的核酸其 A260 nm/A280 nm值应大于 1.7 。由表1中可以看出,TRIZOL试剂提取总RNA的A260/A230值介于2.0～2.4之间,说明盐类小分子的污染较少;A260/A280值介于1.8～2.0之间,说明所提取的总RNA中没有蛋白质及其他有机溶剂的污染;结果表明 ,植物组织中的酚类化合物、多糖和蛋白质等杂质抽提充分,说明提取的RNA样品质量好,纯度高。

注:1 ,2 ,3 ,4分别表示不同样品提取的 PVS RNA;核酸的浓度以OD260nm的读数计算, 公式如下: 总核酸质量浓度 =OD260nm×45×稀释倍数/1 000(g·L-1) ,核酸的纯度以OD260nm/OD280nm的值表示。

2.3 PVS扩增结果

以TRIZOL方法提取的病毒总RNA为模板,经RT-PCR扩增后,在琼脂糖凝胶电泳中呈现阳性反应条带,与理论片段长度199 bp相一致,而阴性对照未出现任何扩增条带图,(图2)这表明用RT-PCR检测PVS特异性强,能准确检测到目的片段的存在,从而建立了有效的PVS的RT-PCR检测体系。

M-DL 100bp Maeker;1-PVS阳性毒株;2-感染PVS马铃薯块茎;3-感染PVS马铃薯叶片;4-脱毒试管苗;

2.4 RT-PCR的重复性

将脱毒试管苗、PVS病毒苗RNA 经过 3 次重复的 RT-PCR 检测,结果均一致,表明该 RT-PCR 系统重复性好。

3 结论与讨论

RT-PCR技术以其灵敏度高、特异性能强、快速、简便等特点而深受分子生物学工作者的青睐,已被广泛应用于植物病毒的检测和诊断。但RT-PCR反应条件严格,反应体系中的诸多因素都会影响试验结果的稳定性。只有研究出适宜的反应程序、反应体系,才能获得稳定的试验结果。

本试验建立了一种适宜从马铃薯植物中直接提取植物病毒 RNA的有效方法。本试验采用TRIZOL 公司生产的植物病原RNA提取试剂,直接提取植物组织中的病毒RNA。与以前先提纯植物病毒粒体本身, 然后酶解植物病毒的外壳蛋白获得 RNA[7]方法相比,本方法操作简单,所需试剂少,适宜于小样品提取,而且试验结果稳定。该方法快速有效,不失为提取高等植物组织中病毒 RNA 的有效方法。试剂法提RNA时,能有效除去样品中蛋白质、酚、小分子及盐等物质,保证了RNA的生物学活性,而且能有效地防止酚类化合物的氧化,可特异性地沉淀出核酸中的mRNA,从而保证了PVS病毒mRNA的纯度和完整性。TRIZOL试剂法丰富了植物病毒 RNA的抽提技术 ,为进一步开展植物病毒的分子生物学研究提供了前提和必要条件。

同时建立了PVS 的标准 RT- PCR 检测程序 ,在基因水平上为PVS的检测提供了更新手段 。试验证明所设计的引物特异性很强 ,在进行 PCR扩增时只扩增出了PVS病株199bp的特异 CP基因片段 , 而健康对照却没有任何特异 DNA 片段扩增出来;三次试验结果一致,表明该RT-PCR重复性好。随着各种生物学试剂的商品化, 此技术已不再昂贵,而且方法简单、快速 、重复性好[7], 整个检测不耗时, 并且克服了ELISA法灵敏度不高、易出现非特异性反应以及价格昂贵等缺点,是病毒检测中具有广泛应用前景的一项分子检测技术。

快速、简单、有效的总RNA TRIZOL试剂提取方法与PVS病毒RT-PCR检测方法的应用,将为植物大田早期诊断提供技术支持, 同时为病毒病害的研究提供有价值的数据和手段, 也为脱毒种薯和种苗的检测和鉴定提供了更为快速灵敏简便的检测技术, 对马铃薯质量的提高以及马铃薯产业的健康发展具有极其重要的理论意义和应用价值。

摘要：从感染PVS病毒的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA,进行反转录cDNA的合成,用特异性引物进行PCR扩增,得到一条长度约为199 bp的特异性PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。在基因水平上为PVS的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法,为PVS的防治提供了有效手段。

关键词：马铃薯S病毒,RT-PCR,病毒检测

参考文献

[1]魏延安.世界马铃薯产业发展现状及特点[J].世界农业,2005(3):29~32.

[2]Hooker WJ.马铃薯病害及其防治[M].石家庄:河北科学技术出版社,1992.129~131.

[3]袁小环,李青.血清学方法和分子生物学方法检测植物病毒研究进展[J].热带农业科学,2001(6):63~68.

[4]Jelkmann W,Keimkonrad R.An im m uno-capturepolym erase chain reaction and plate-trapped ELISA forthe detection of ap-ple stem spitting virus[J].Phyto-pathology,1997,145:499~504.

[5]俞键祁骥杜荣骞一种马铃薯病毒诊断新方法-RT-PCR[J].南开大学学报,2005,38(5):40~43.

[6]Rudra P.Singh and Mathuresh Singh.Speeifie Deteetionof Potato Virus Ain Dormant Tu by Reverse TranacriptionPolmerase Chain Reaetion.Plant disease[J],1998(2):230.34.

RT-PCR检测 篇6

1 材料与方法

1.1 样本来源

所检测的200份咽拭子样本均采自佳木斯市中心医院门诊部患者, 主要是具有发热症状的呼吸道传染性疾病病例。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒 (KIT 74104) 及RT-PCR反应体系试剂盒 (KIT 210212) 均为德国QIAGEN公司产品;FQ-PCR试剂盒为北京金豪公司生产, RT-PCR引物购自大连宝生物公司, RNA酶抑制剂 (promega) 由上海生物工程公司提供。

1.3 主要仪器设备

Z233MK-2台式高速小型离心机购自德国Eppdendorf公司, 7300基因扩增仪购自美国ABI公司, Gene Genius凝胶成像分析系统BIO-RAD购自美国伯乐公司, FS-91自动DNA扩增仪购自上海复生生物公司。

1.4 方法

病毒RNA提取、FQ-PCR、RT-PVR、扩增产物电泳分析方法均按试剂盒及仪器操作说明书进行。

2 结果

2.1 2种方法检测的阳性率结果

在200份来自临床的咽拭子检测标本中, 用FQ-PCR检测后甲型流感病毒检测阳性的为96份, Ct值最小为12.95, 最大为24.63, 阳性率为48.0%;用RT-PCR检测后结果甲型流感病毒检测阳性的为69份, 凝胶条带在235bp处出现, 阳性率为34.5%。2种方法检测的阳性率差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

2.2 2种方法全程检测所需时间

FQ-PCR:RNA病毒提取需1 h, 配制反应体系及实时荧光RT-PCR反应需2.0～2.5 h, 整个过程大约共需要3.0～3.5 h。

普通RT-PCR:RNA病毒提取需1 h, 实验设计及PCR反应体系配制约需1 h, RT-PCR反应约需4 h, RT-PCR产物检测约需2 h, 整个过程大约共需要8 h。

3 讨论

FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测, 从而实现对起始模板定量及定性的分析。在FQ-PCR反应中, 随着PCR反应的进行, PCR反应产物不断累计, 荧光信号强度也等比例增加[1]。通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进行定性及定量, 它具有灵敏度高、特异性强、所需时间短的优点, 并且实现了PCR检测的密闭操作, 克服了普通RT-PCR易污染以及强致癌物溴化乙啶对操作人员的危害的缺点, FQ-PCR则更体现了其应用的价值[2]。

摘要：目的 比较实时荧光PCR检测 (FQ-PCR) 与RT-PCR在鉴定甲型流感病毒中的优劣, 建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法 对200份临床采集的咽拭子样本进行FQ-PCR与RT-PCR检测, 综合比较2种监测方法之间的差异。结果 FQ-PCR检测200份临床咽拭标本, 96份甲型阳性, 阳性率为48.0%;从RNA提取到检测结果仅需3～3.5 h。RT-PCR检测200份临床咽拭标本, 69份阳性, 阳性率为34.5%;从RNA提取到检测结果约需8 h。结论 FQ-PCR方法快速、特异、灵敏, 在甲型流感病毒检测中具有较大的应用价值。

关键词：实时荧光PCR,RT-PCR,甲型流感病毒

参考文献

[1]程晓雯, 周丽, 赵锦, 等.荧光定量RT-PCR在流感病毒检测上的应用.中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18 (3) :289-290.

RT-PCR检测 篇7

1 材料与方法

1.1 标本

黑龙江省2012年58例散发风疹疑似病例, 采集发病早期患者的血清标本和咽拭子标本。标本在冷藏条件下运送风疹实验室。

1.2 风疹Ig M抗体测定

血清标本进行风疹Ig M抗体检测。使用德国维润赛润公司生产的试剂盒进行风疹Ig M抗体检测。

1.3 real-time RT-PCR检测

咽拭子标本进行real-time RT-PCR检测。使用QIAGEN公司生产的试剂盒进行风疹病毒RNA提取。引物、探针和反应体系采用北京金豪公司生产的试剂盒。反应结束后通过荧光定量PCR仪对结果进行判定。

2 结果

2.1 血标本采集与患者出疹时间间隔

58例风疹疑似病例血标本, 采集血标本最短时间是出疹当天采集, 最长时间是出疹后7天采集, 其中多数病例是在出疹后2~3天采集的。出疹3天内采集的血标本占总标本数的63.8%。

2.2 风疹疑似病例临床标本的检测

在58例风疹疑似病例中, 应用real-time RT-PCR法对咽拭子标本进行风疹病毒核酸检测, 结果均为阳性;应用ELISA法检测风疹Ig M抗体, 48份为阳性, 占82.8%;10份为阴性, 占17.2%。在10份阴性血清标本中, 有5例再次采集了血标本, 其风疹Ig M抗体检测结果为阳性。见表1。

3 讨论

风疹和麻疹都为发热出疹性疾病, 由于临床症状相似, 在临床上不易区分, 临床风疹病例往往可能误诊为麻疹, 因此, 在消除麻疹的关键阶段, 特异性的实验室诊断显得尤为重要[2]。

目前RV的实验室诊断主要有以下3种方法:血清学方法、病毒分离、分子生物学方法等。血清学方法 (ELISA) 是一种快速、传统的实验室诊断方法, 但由于在发病早期风疹Ig M抗体产生较少或不产生[4], 在出疹后的前3天内, 风疹特异Ig M抗体检测可能会出现50%的假阴性结果[5]。通常情况下, 患者采血时间往往处于发病的初期, 本文中患者采血时间在出疹后3天内采集的标本数占总标本数的63.8%, 所以临床上用ELISA法检测风疹Ig M抗体作为确诊指标, 会发生假阴性的结果, 造成误诊[6]。相比之下, 咽拭子采集的最佳时间是患者出疹后3天内。咽拭子标本适用于病毒分离和分子生物学检测, 但对于风疹病毒分离来说, 由于所需时间较长, 不适于对病例早期诊断, 在实际诊断中很少使用。而近年来发展起来的实时荧光定量RT-PCR技术具有敏感、快速、简便和检测时间短等优点, 适用于作病例早期诊断的实验室检测依据。本文对58例患者的血清标本和咽拭子标本检测中也证实了这一点, 用real-time RT-PCR法检测咽拭子标本阳性率为100%, 而ELISA法检测风疹Ig M抗体阳性率为83%。对于在检测阴性的10份标本中, 有5份采集了第二份血清标本, ELISA法检测风疹Ig M抗体均为阳性。由此可见, real-time RT-PCR技术更适合于作病例早期诊断的实验室检查依据, 可作为ELISA法的一个补充诊断方法。

real-time RT-PCR法和ELISA法相结合对病例进行早期诊断, 不仅可以及时发现、诊断风疹病例, 为疫情处理赢得宝贵时间, 而且还可以提高实验室诊断阳性率, 减少假阴性的发生。

参考文献

[1]Yan Y.Epidemiologic and clinical features of measles and rubella in a ruralareainChina[J].JChinMedAssoc, 2005, 68 (12) :571-577.

[2]朱贞, 许文波, 李聪勇, 等.用一种新型诊断方法-比色法免疫学实验在检测风疹病毒中的应用研究[J].中国计划免疫, 2006, 12 (6) :489-494.

[3]陈刚, 张永乐, 徐爱芳, 等.麻疹病毒荧光定量RT—PCR反应体系的建立[J].中国卫生检验杂志, 2008, 18 (9) :1797-1798.

[4]张金菊, 牛桓彩.实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用[J].国际检验医学杂志, 2011, 32 (2) :256-257.

[5]Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubella virus infection[S].2ndedition, WHO.GenevaSwitzerland, 2007.32.

RT-PCR检测 篇8

1 材料和方法

1.1 引物

根据Gen Bank中发表的有关CSFV、PRRSV基因组全序列及部分序列,依据病毒各自的保守性区域,设计2对引物分别用于扩增CSFV 777bp和PRRSV 434 bp目的片断,引物序列如下:CFSV1:5'-GTCGTCAGTAGTTCGACG-3'(182-203);CSFV2:5'-ATGCTCTTTTGGGGCTAT-3'(941-961);PRRSV1:5'-GCCAGTTCCAGCCAGTCAATCA-3'(14929-14952);PRRSV2:5'-GCCCCGATTGAATAGGTGAC-3'(15343-15362)

引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,用双蒸水稀释为100μM,-20℃保存备用。

1.2 病毒及细胞

CSFV、PRRSV、PK-15细胞、Marc-145细胞均由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供。CSFV接种无PCV1感染的PK-15细胞,连续盲传6代后收毒。PRRSV接种Marc-145细胞,当细胞出现85%以上的CPE时收毒。

1.3 临床样品

共有来自新疆发病现地的20份送检病料,包括心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、血液,编号为XJ-1~20;来自山东发病现地的21份患病仔猪样品(心、肝、脾、肺、肾、淋巴结),编号为SD-1~21;来自吉林发病现地的48份送检病料,包括心、肝、脾、肺、肾、淋巴结,编号JL1-1~48,18份流产胎儿病料,编号JL2-1~18;来自黑龙江发病现地的12份流产胎儿病料,编号HLJ-1~12。所有样品用于m PCR临床样品检测及单个病毒的单重PCR检测。同时将这些病料组织匀浆处理后用PK-15细胞和Marc-145细胞接种传代后备检。

1.4 病毒总RNA的提取及cDNA的合成

用TRIzol试剂(Molecular Research Center,Inc.)参照使用说明书提取样品总RNA。

1.5 CSFV、PRRSV单重PCR反应

CSFV、PRRSV单重PCR反应在25μL体系中进行,包括10x PCR Buffer(500 m M KCl,100 m M Tris HCl,p H8.3)2.5μL,200μM d NTP 2μL,CSFV、PRRSV特异性特异性引物(Table1)10pmol各1μL,1 U Taq TM DNA聚合酶(Ta Ka Ra),c DNA模板各1μL。PCR反应程序如下:94°C,5 min;94°C,45 sec,50.4°C(CSFV)、58.6°C(PRRSV),1min;72°C,1min;72°C,10 min。取5μL PCR扩增产物于1%的琼脂糖凝胶于1×TAE(40 m M Tris-aceate[p H 8.0],1 m M EDTA)电泳鉴定。

1.6 PCR产物的鉴定

分别对CSFV、PRRSV的扩增产物进行胶回收,克隆到p MD18-T载体上,转化到DH5α,提取质粒后,送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.7 m PCR方法的建立及反应条件的优化

1.7.1 最佳反应引物浓度:

将CSFV、PRRSV的引物浓度在以5~20 pmol的浓度之间进行m PCR反应,取5μL PCR扩增产物在1×TAE电泳液中经1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.7.2 最佳反应退火温度:

为了确定m PCR反应的最佳退火温度,将混合好的反应体系在50~60℃的退火温度条件下进行m PCR反应,取5μL PCR扩增产物在1×TAE[40 m M Tris-aceate(p H 8.0),1 m MEDTA]电泳液中经1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.7.3 最佳反应Mg2+浓度

在Mg2+浓度设为1.5 m M、2.0 m M、2.5 m M、3.0 m M、3.5 m M、4.0 m M、进行m PCR反应,取5μL PCR扩增产物在1×TAE电泳液中经1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.7.4 最佳反应d NTP浓度

将d NTP浓度以200μM、250μM、300μM、350μM、400μM进行m PCR反应,取5μL PCR扩增产物在1×TAE电泳液中经1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.7.5 最佳反应酶浓度:

将Taq TM DNA聚合酶(5 U/μL)按0.5 U、1.0 U、1.5 U、2.0 U、2.5 U、3.0 U进行m PCR反应,取5μL PCR扩增产物在1×TAE电泳液中经1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.8 m PCR方法的建立

m PCR反应由两部分组成,包括m RNA反转录成c DNA和m PCR扩增。RT-PCR反应在20μL体系中进行,包括4 m L 1 x反转录溶液[50 m M Tris-HCl(p H8.3),75 m MKCl,3 m M Mg Cl2,10 m M DTT],6 m L d NTP,1 m L随机引物(50 p M),1 m L M-MLV反转录酶(Promega Corporation)和1 m L HPRI,7μL RNA及DEPC水。PCR反应在30μL体系中进行。反应混和物包括3 m M Mg Cl2,1x PCR Buffer(500 m M KCl,100 m M Tris HCl,p H8.3),300μM d NTP,5 pmol/each PRRSV;15 pmol/each CSFV病毒特异性引物,1.5 U Ta Ka Ra Taq TM Hot Start Version DNA聚合酶(Ta Ka Ra),用DEPC水补足体积。将上述混合物RT-PCR反应管中。其反应条件为:42°C,30 min;接下来94℃预变性5 min;94℃45 s;56.8℃1 min;72℃1min;35个循环;最后72℃延伸10 min。取5μL PCR扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.9 m PCR的敏感性

mPCR的敏感性参照Huang C(Huang C et al,2004)进行[9]。将目的片断克隆到PMD18-T载体上,质粒经提取后用双蒸水分别进行10倍的稀释,取每个稀释度的质粒为模板进行m PCR反应,检测其敏感性。

1.1 0 m PCR的特异性

以大肠杆菌、双蒸水、PCV2、PPV、PRV、PCV1、SIV、PRRSV、CSFV为模板进行m PCR反应,检测m PCR反应的特异性。

1.1 1 m PCR的重复性实验

以建立的m PCR诊断方法,分别对已知病毒临床样品、新疆、山东、吉林、黑龙江送检的临床样品以及病料在PK-15、Marc-145的细胞培养物和正常细胞对照样品重复检测3次,以验证试验的稳定性。

2 结果

2.1 PCR产物的鉴定

将CSFV、PRRSV扩增的目的片段经测序后,将其序列与Gen Bank中发表的序列经DNAStar进行基因序列同源性分析,结果表明所扩增的目的片断分别为各自病毒的的特异性条带。

2.2 m PCR最佳引物浓度

结果表明,PRRSV的引物浓度在5μmol,同时扩增CSFV的引物浓度在15μmol的条件下,m PCR反应扩增效果较好。

2.3 m PCR最佳退火温度

将混合好的反应体系在50~60℃的退火温度条件下进行m PCR反应。结果表明,m PCR反应在退火温度为56.8℃时扩增效率较好(图1)。

2.4 m PCR最佳Mg2+浓度

结果表明,m PCR反应在Mg2+浓度为2 m M条件下反应较好(图2)。

2.5 m PCR最佳d NTP浓度

结果表明,m PCR反应在d NTP浓度为300μM条件下反应较好(图3)。

2.6 m PCR最佳酶浓度

结果表明,m PCR反应在Taq TM DNA聚合酶浓度为0.3μL(1.5 U)下反应较好(图4)。

2.7 m PCR的敏感性

结果表明,m PCR的最低检测量分别为在病毒的单个PCR反应中,病毒的最低检测量分别为:CSFV,8.5 pg;PRRSV,8.3×10-2 pg(图5)。

2.8 m PCR的特异性

以大肠杆菌、双蒸水、PCV2、PPV、PRV、PCV1、SIV、PRRSV、CSFV为模板进行m PCR反应,结果表明PRRSV、CSFV均扩增出各自的特异性条带,而其余病毒模板均未扩增出条带(图6)。

2.9 样品检测结果

对XJ-1~20、SD-1~21、JL1-1~48、JL2-1~18、HLJ-1~12临床样品经过m PCR检测。同时将这些病料组织匀浆处理后用PK-15细胞和Marc-145细胞接种传代后备检(表1)。

2.1 0 m PCR与单重PCR的比较结果

利用建立的PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个病毒的单重PCR诊断方法与m PCR诊断方法对同一组织样品和病料的细胞培养物进行检测,结果显示两者的符合率为100%(表1)。

2.1 1 m PCR重复性实验

用建立的m PCR试验在不同时间对每份样品及病料接种细胞培养物重复检验3次,检验结果均一致。

3 讨论

PRRSV、CSFV是对养猪业造成影响最大的疾病。CSFV被OIE列为A类疾病,CSFV的自然分离株在毒性方面存在很大的变异。强毒株导致猪群急性感染和高死亡率,温和型毒株往往产生亚急性或温和型的感染,用低毒力株进行产后感染能导致温和型疾病或亚临床感染。然而,一些低毒力株能够对胎儿和新生仔猪导致死亡[10]。PRRSV被OIE列为B类疾病,在世界上养猪国家广泛流行。该病毒在主群中传播迅速,感染后2~3月能使猪群中95%的猪表现出血清阳性。PRRSV引起的繁殖障碍主要表现为流产、死产以及弱胎,出生的弱胎往往伴有呼吸道疾病和继发感染,出生后很快死亡。有些育肥猪可能表现出轻微的呼吸道疾病和继发性感染[11]。2006年以来在我国成为危害最为严重的疾病,造成全国猪场流行高热病。

%

本研究建立了1种新的热启动m PCR方法用于同时检测猪的2种重要病原体:PRRSV和CSFV。试验表明,该m PCR方法具有很好的敏感性及特异性,能够快速、准确的鉴定及区分PRRSV、CSFV2种RNA病毒,能够应用于临床样品中PRRSV和CSFV的单个或混合感染。在本实验中,使用一种热启动Ta Ka Ra Taq TM Hot Start Version DNA聚合酶用于PCR反应得聚合酶,由于RT-PCR反应不得不在较低的温度条件下进行,高温加热前,该酶的特性抑制了聚合酶的活性,从而抑制低温条件下由于引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。此外,对于m PCR反应,引物的设计至关重要。引物不仅决定着反应程序的退火温度,而且对m PCR反应的敏感性和特异性也起着很大的影响。由于m PCR同时加入了多队引物,因此引物间的相互作用也影响着m PCR的反应。针对以上情况,在扩增引物的设计上要统筹兼顾,好的引物设计决定着m PCR反应的成功与否。

随着养殖集约化提高,交通运输的方便,这些都为猪群的频繁接触提供了有利的条件,使发生混合感染的病例增多,这给疾病的诊断带来了很大的困难。而m PCR技术能够同时检测多种病原体,具有方便、快速、高敏感性和特异性的特点,近年来得到了广泛的发展[12,13,14],为病原体的常规分子生物学的诊断提供了1种新的方法。

相关知识

摘要：建立了1种一步法RT-PCR用于同时检测典型猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖呼吸道综合征病毒(PRRSV)的多重PCR诊断方法(Multiplex PCR,mPCR)。根据Genbank上公布的CSFV、PRRSV基因组全序列及部分序列,借助DNAStar和Oligo6.0基因序列和引物设计软件,设计2对特异性引物分别用于扩增CFSV、PRRSV病毒777bp和434bp的目的片断。该mPCR由RT反应和PCR反应构成。将病毒核酸连接到PMD18-T载体,提取质粒后,以10倍进行倍比稀释,取每个稀释度的病毒核酸进行mPCR反应,对CSFV、PRRSV的最低检测量分别为8.5pg、8.3×10-2pg。以PCV2、PCV1、PPV、PRV、SIV、E.coil和双蒸水为模板进行mPCR反应,扩增结果均为阴性,表明该mPCR具有较好的特异性。对临床样品的检测表明,本研究建立的mPCR诊断方法能够对CSFV和PRRSV进行快速的诊断,同时对CSFV、PRRSV在猪群中的流行病学调查也具有十分重要的意义。