PCR检测法

PCR检测法（精选12篇）

PCR检测法 篇1

布鲁菌病是由布鲁菌属的细菌引起的急性或慢性人兽共患传染病。布鲁菌( Brucella) 可感染羊、牛、猪及鹿等经济动物,也可感染人类,导致重大的经济损失和严重的公共卫生问题。近年来,全国布鲁菌病发病呈逐年上升趋势,疫情较重的省份主要集中在华北地区和西北地区,而山西省疫情回升尤为突出,解放后,山西省曾发生过4 次大流行,人间、畜间布鲁菌病都呈现逐年上升趋势,给养殖业造成重大的经济损失,严重危害人类健康和社会稳定。传统的检测方法耗时较长,且对于实验室操作人员存在很大危险,因此找到一种敏感、快速、准确检测方法,从而为防疫部门提供有效防控措施和科学决策具有十分重要意义。

1材料

1. 1 菌株

标准菌株:猪种布鲁菌、牛种布鲁菌、羊种布鲁菌,均购自中国兽医药品监察所。对照菌株:大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌,均由中国动物卫生与流行病学中心提供;疑似布鲁菌病的血液样品,由吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心协助采集。

1.2主要试剂

RNase A、DL - 2 000 Marker、Mg Cl2( 25 mmol/L) 、蛋白激酶K、Taq DNA聚合酶( 5 U/m L) 、2. 5 mmol/L d NTP混合液、6 × Loading Buffer、CTAB / Na Cl,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 溶菌酶、DNA提取试剂盒,均购自北京天为时代科技有限公司; Tris碱、无水乙醇、Na2EDTA、琼脂糖、HCl、Tris饱和酚、异戊醇、Triton X - 100、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠( SDS ) 、2 - 巯基乙醇、氯仿,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

2 方法

2. 1 引物设计与合成

从NCBI基因库网站的Gen Bank数据库中查找布鲁菌的基因组序列( 登录号为JF918757) ,选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31 基因的特异性保守区段,大小为1 817 bp,设计PCR引物,引物由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。引物序列: 上游引物P1 ( 20 bp)5' - GCCATCTCAGTTCGGATTGC - 3'; 下游引物P2( 19 bp) 5' - CAGCGCCTTCGGGTAAAAC - 3'。

2. 2 模板DNA的提取

将试验用各菌株分别接种于TS液体培养基中,37 ℃ 培养36 ~ 48 h; 振荡、摇匀后吸取1. 5 m L菌液置2 m L离心管中,10 000 r/min离心1 min; 弃上清液,按DNA提取试剂盒说明书操作,提取细菌DNA于- 20 ℃冰箱中保存,备用。

2. 3 PCR反应体系的建立

采用50 μL反应体系: 上、下游引物( 20 μmol/L) 各1 μL、200 μmol / L d NTP 4 μL、10 × Buffer 5 μL、1. 5 μmol / L Mg2 +3 μL、Taq DNA聚合酶0. 25 μL、3 nmol / L DNA模板1 μL、无菌三蒸水34. 75 μL,最后用已灭菌的超纯水补至终体积为50 μL。同时以水代替模板DNA作为空白对照。

2. 4 PCR反应程序的确定

经优化,PCR反应程序为: 94 ℃ 预变性2 min;94 ℃ 变性45 s,55 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,共35 个循环; 最后72 ℃ 再延伸10 min,4 ℃ 保存。取5 μL的PCR产物,用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 PCR特异性的测定

分别取牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌、大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌制备相应的模板DNA,按照建立的布鲁菌PCR检测方法分别进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2. 6 PCR敏感性的测定

对牛种布鲁菌模板DNA进行10 倍系列稀释,使各稀释度1 μL模板DNA的含量分别为150 pg、15 pg、1. 5 pg、150 fg、15 fg。按照建立的布鲁菌PCR检测方法,对各稀释度的模板DNA进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2. 7 PCR重复性和稳定性的测定

分别以相同批次培养的牛种布鲁菌、羊种布鲁菌和猪种布鲁菌提取的DNA为模板,进行6 次PCR扩增,检测所建立的布鲁菌PCR方法的重复性。分别以不同批次培养的牛种布鲁菌、羊种布鲁菌和猪种布鲁菌提取的DNA为模板,进行6 次PCR扩增,检测所建立的布鲁菌PCR方法的稳定性。

3 结果与分析

3. 1 DNA提取结果

本试验分别对各菌株的DNA进行提取,并用分光光度计分别检测其OD值,结果OD260/ OD280值均在1. 60 ~ 1. 75 之间。PCR扩增产物经0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测( 100 V恒压1. 5 h) ,结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌;2.羊种布鲁菌;3.猪种布鲁菌;4.大肠杆菌;5.马流产沙门杆菌;6.克雷伯杆菌。

由图1 可知,6 种细菌的DNA条带均清晰可见,无拖尾现象,亮度达到了预期效果,说明本试验提取的DNA含量较高,没有受到RNA和蛋白质污染。

3. 2 PCR扩增结果

本试验对牛种布鲁菌的DNA进行PCR扩增,同时以水作为空白对照,PCR扩增产物经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90 V恒压1 h) ,结果见图2。

由图2 可知,目的条带出现在250 ~ 500 bp之间,且偏向500 bp处,目的条带大小为384 bp,这与预期结果一致,而空白对照泳道未出现扩增条带。

M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌PCR扩增结果;2.空白对照。

3. 3 PCR特异性试验结果

大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌与布鲁菌的交叉反应较多,因此本试验分别提取牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌、大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌的DNA进行PCR扩增试验,其产物经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90V恒压1 h) ,结果见图3。

M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌;2.羊种布鲁菌;3.猪种布鲁菌;4.大肠杆菌;5.马流产沙门杆菌;6.克雷伯杆菌。

由图3 可见,牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌的扩增条带出现在250 ~ 500 bp之间,且靠近500 bp处,即384 bp,而大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌均未出现相应DNA的PCR扩增产物,即均呈阴性。

3. 4 PCR敏感性试验结果

对牛种布鲁菌模板DNA进行10 倍系列稀释,共稀释5 个浓度,按照建立的布鲁菌PCR检测方法,对这5 个稀释度的模板DNA分别进行PCR扩增,并用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90 V恒压1 h) ,结果见图4。

由图4 可见,牛种布鲁菌的DNA稀释100 倍时仍有清晰的扩增条带出现,而高于此稀释倍数未出现扩增条带。

3. 5 PCR重复性和稳定性试验结果

本试验首先对相同批次的布鲁菌培养物进行PCR扩增,重复6 次,试验结果均相同; 然后,再对不同批次的布鲁菌培养物进行PCR扩增,重复6 次,试验结果也均相同。说明本试验建立的布鲁菌PCR检测方法的重复性和稳定性较理想。

M.DL-2 000 Marker;1.150 pg;2.15 pg;3.1.5 pg;4.150 fg;5.15 fg。

4 讨论

布鲁菌是人畜共患病的病原菌,给人类健康及畜牧业发展造成了极大危害,受污染的乳制品和肉制品等已成为布鲁菌病重要的传染源,如何快速检测布鲁菌,对于布鲁菌病防治具有重要意义。

随着分子生物学技术的发展和完善,A. Feketi等[1]最早进行了布鲁菌PCR检测方法的探索,首先对布鲁菌编码43 ku外膜蛋白( OMP) 基因进行PCR扩增,然后又对布鲁菌BCSP31、16SrRNA、OMP2b等基因展开了PCR扩增方法的研究,之后成功地用于布鲁菌病的特异性诊断和临床实践应用中。1995年,唐浏英等人设计了多组引物对布鲁菌36 ku的OMP31 基因进行扩增,结果表明,不同引物的敏感性存在差异( 10 fg ~ 100 pg) 。邱昌庆等[2]对牛奶中的布鲁菌进行PCR扩增检测,结果表明,灵敏度为50 cfu / m L。G. G. Baily等[3]选取牛种布鲁菌的31 ku外膜蛋白基因的核苷酸保守序列设计5 个引物B1 ~B5,并以5 个引物的不同组合进行PCR扩增试验,结果表明,B4 和B5 为最佳配对引物。李玉兰等[4]用此对引物对6 个种的布鲁菌DNA进行扩增,结果表明,此对引物特异性良好,可检出的布鲁菌DNA最低敏感值为0. 95 pg。

在本试验中,根据编码牛种布鲁菌膜外蛋白BSCP31 基因核苷酸序列设计1 对PCR引物,经PCR反应条件的优化和反应程序的确定,成功扩增出了预期的384 bp目的基因片段,PCR敏感性试验结果显示最低可检测到1. 5 pg。本试验结果与G. G. Baily等[3]、李玉兰等[4]的研究结果相近,说明本试验设计的引物所扩增出的384 bp核苷酸保守序列具有较高的同源性。可见,本试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有特异性强,敏感性高,操作简单、方便、快速的特点,对布鲁菌的快速检测具有重要的实用意义。

摘要：为了研究快速检测布鲁菌的通用PCR体系,试验从GenBank数据库中查到布鲁菌的基因组序列(登录号为JF918757),并选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31基因的特异性保守区段,设计了1对PCR引物,对PCR扩增条件进行优化。结果表明:能够扩增出牛种、羊种、猪种布鲁菌模板DNA的384 bp目的基因片段,而对大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌均呈阴性,最低检出浓度为1.5 pg/μL,对同批和不同批的菌株进行6次PCR扩增,重复性和稳定性较好。说明试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性。

关键词：布鲁菌,PCR,BSCP31基因,鉴定

PCR检测法 篇2

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势.简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的.影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景.

作 者：赵红庆 苑锡铜 黄留玉 ZHAO Hong-qing YUAN Xi-tong HUANG Liu-yu 作者单位：军事医学科学院,疾病预防控制所传染病控制中心,北京,100071刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：18(5)分类号：Q503 R372关键词：多重PCR 病原 检测 影响因素

PCR检测法 篇3

关键词：梨孢镰刀菌 PCR 条件优化

中图分类号：Q36 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）06-0028-02

1 引言

本文建立了梨孢镰刀菌的PCR检测方法，在制麦早期内检出大麦内部的梨孢镰刀菌，及早地防止毒素对原料的污染以及有效地控制啤酒喷涌，对大麦品质的判断提供了简单易行，快速的手段，从而为提高麦芽品质奠定了基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

梨孢镰刀菌Fusarium poae（AY188915.1）来自本实验室从澳大利亚大麦（Hordeum sp.Schooner）中分离鉴定的菌株；禾谷镰刀菌是本实验保存；大肠杆菌（CGMCC-1.1369）、乳酸克鲁维酵母（CGMCC-2.1494）购自中国微生物菌种保藏中心；乳酸杆菌来自北京三元食品有限公司技术中心实验室。

2.1.2 主要试剂

溶菌酶、RNaseA、EDTA、SDS、NaCl、无水乙醇、等均为国产分析纯；琼脂糖（Spain Agarose香港基因公司分装）；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、100bp DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，PDA培养基，PBS溶液。

2.1.3 仪器

ZPS-250 h智能恒温恒湿培养箱，Unic-7200紫外分光光度计，低速离心机LD4-2A（2800×g），高速冷冻离心机B22 m，2100P型自动糖化器，精密电子称，电热鼓风干燥箱，HH-6数显恒温水浴锅，GeneAmp PCR System 2400 PCR，PAC300电泳仪，Tanon GIS 2010凝胶成像仪，离心机2K15（Sigma），Thermo pH计，LRH-250生化培养箱，Cintra 20分光光度计。

2.2 实验方法

2.2.1 模板DNA的提取

在无菌条件下，用灭菌处理的接种环挑取梨孢镰刀菌菌落，接种于5ml PDA培养基中，28℃培养3天后使用无菌滤纸进行过滤获得菌丝体。称取约0.1g菌丝体提取基因组DNA，提取方法参考文献。

2.2.2 扩增引物的设计

依据引物设计原则，利用生物软件ClustalW比对及Primer 5.0设计引物，引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。引物的基因位点为46-337，PCR扩增产物长度分别为292bp。

2.2.3 PCR反应

梨孢镰刀菌基因组DNA的PCR扩增，反应体系为：模板1μl，上游引物0.5μl（25μmol/l），下游引物0.5μl（25μmol/l），10×扩增反应缓冲液2μl，PCR染料2μl，dNTPs 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，无菌超纯水13μl，总体积为20μl。

离心混匀后置PCR仪上进行自动化扩增反应，循环参数为94℃预变性5min，94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

2.2.4 PCR反应条件的优化

（1）退火温度的优化。设置退火温度的梯度为49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃，在这几个退火温度中优化出最适退火温度。（2） Taq DNA酶浓度的优化。Taq DNA酶的浓度梯度为1.0U、1.5U、2.0U、2.5U，相对应的体积为0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl，在这几个酶浓度中优化出最适酶浓度。（3）Mg2+离子浓度的优化。Mg2+离子浓度的梯度为：1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM，已知Mg2+离子浓度为25mM，所需要的体积分别为：0.8μl、1.2μl、1.6μl、2.0μl，在这几个浓度中优化出最适Mg2+离子浓度。（4）循环数优化。设置循环数为28、30、32，从中优化出最适循环数。

3 结果与讨论

3.1 梨孢镰刀菌的存在位置以及生长活动

观察图1（a）中的大麦表面的光学显微镜图，可以发现镰孢菌菌丝可以透过大麦种皮生长；图1（b）是麦芽染菌图片，A所指是镰刀菌存在于大麦腹沟位置，B所指为菌丝由麦芽根部伸出，C所指为镰刀菌包围种子。

3.2 PCR反应结果

3.2.1 PCR反应条件优化结果

（1）最适退火温度的选择。退火温度为49℃～54℃时都有特异性的目的带扩出，且无非特异性条带。比较可知退火温度为52℃时292bp目的帶较宽较清晰，故选52℃为该引物检测梨孢镰刀菌的最适退火温度。（2）最适Taq DNA酶浓度的选择。体积为0.4μl即浓度为2.0U时，目的带较亮较清晰，故0.4μl为Taq DNA酶的最适用量。（3）Mg2+离子浓度的选择。最适Mg2+离子浓度为2.0mM。（4）循环数的选择。循环数为30时，PCR扩增效果最佳，故选择30次循环为最适循环数。

3.2.2 引物的特异性分析

使用微管蛋白基因的引物同时对大肠杆菌、乳酸杆菌、乳酸克鲁维酵母、禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌以及阴性对照进行PCR检测，阴性对照和对照组均无条带扩出，可知，该引物具有良好的特异性。

3.2.3 DNA的最低检出限的确定

使用紫外分光光度计测定260nm波长下的OD值为0.8336，DNA含量=417μg/ml，将其逐步进行10倍系列稀释，将这些DNA稀释液作为模板进行PCR反应，梨孢镰刀菌DNA的最低检测限为417pg。

4 结语

本研究结果表明，使用PCR手段检测梨孢镰刀菌的方法是可行的，且检测的周期短，具有很高的灵敏度，避免在后续的啤酒发酵工序中由梨孢镰刀菌产生的毒素造成原料的污染和浪费，在制备麦芽时起到了预防的作用。

参考文献

[1]俞大钹.镰刀菌分类学的意义.微生物学报，1977，17（2）：163-171.

一种PCR抖动检测算法及实现 篇4

在数字电视广播系统中, PCR (Program Clock Reference) 节目时钟参考, 作为整个MPEG-2传输流的统一时钟, 它的作用在于将发送端的27MHZ时钟以时间戳格式注入码流中, 终端能够根据该信息无偏差地恢复出发送端的参考时钟, 用以调整本地系统时钟计数器STC (System Time Counter) 来达到收发两地的时钟同步, 通常情况下, 传输码流经过复用和再复用后, PCR值并不能完全精确地反映信源编码端的时间信息, 这种现象称为PCR抖动, 如何正确检测和处理PCR抖动对于整个数字电视系统的音视频数据同步起着关键作用【1-3】。

目前关于PCR抖动重点集中在PCR校正算法及STC时钟恢复电路研究上【4-7】, 本文给出了一种完整的标识 (mark) , 非标识 (unmark) 两种类型的基于状态机模型PCR抖动检测算法和实现, 该算法在泰鼎多媒体技术有限公司最新高端数字电视芯片上得到了实际应用, 具有较强的实际应用价值。

2 PCR抖动检测和处理

2.1 PCR/STC差值计算公式

PCR、STC作为系统时钟采样, 具有相同的组成, 均由33位的Base计数器和9位的Extension计数器两个部分共计42位组成, 33位的Base部分由27M系统时钟经过300分频后获得采样值, 用于作为解码音视频同步参考值;9位的Extension部分直接由27M系统时钟获得采样值, 用于时钟恢复电路的锁相环电路修正系统时钟参考值。

本文中, PCR、STC计数器实际采用一组3个32位寄存器用于存贮42位时钟采样值, 分别为高位、低位、扩展位寄存器, 其中高位寄存器存贮33位Base部分的最高位, 低位寄存器存贮Base部分的低32位, 扩展位寄存器存贮9位Extension部分, PCR和STC差值计算公式如下:

其中:∆ (i) 表示第i次P C R与S T C差值;PCRHigh, PCRLow, PCRext分别表示存贮PCR高位值、低位值及扩展寄存器值;STCHigh, STCLow, STCext分别表示存贮STC高位值、低位值及扩展寄存器值。

2.2 状态机模型

由于网络传输等原因, TS码流在传输过程中会存在个别数据包出错的可能, 为了避免此类错误检测, 本文采用了两阶段PCR抖动检测算法, 其有限状态机模型如图1所示:

Lock状态, 系统位于PCR稳定状态, 当STC和PCR差值小于PCR抖动阀值, 系统进入Lock状态;系统第一次检测到PCR和STC差值大于阀值, 系统进入Unlock临界状态;系统检测到“不连续指示”标识或连续两次检测PCR和STC差值大于阀值时, 系统进入Unlock状态。本文采用5400000tick=200ms作为PCR发生抖动阀值。

2.3 PCR抖动检测

PCR抖动检测算法流程描述如下:

当第一个PCR值到达时, PCR值被装载到STC计数器中, 系统进入PCR抖动和系统时钟同步恢复流程;

对每一个新的PCR包, 检测包头“不连续指示”字段是否置1, 如果置1, 则为mark类型PCR抖动;系统进入Unlock状态, 进入PCR抖动处理流程。如果该字段不为1, 进行unmark类型PCR抖动检测, 计算STC和PCR差值;

当差值小于阀值时, 系统进入Lock状态, 此时系统时钟恢复电路通过该差值锁相环电路修正解码器的系统时钟, 使其达到和编码器一致的27MHz时钟, 同时输出到STC计数器, 用于解码器产生解码和显示的同步信号。当检测到连续两次差值均大于一个阀值时, 系统进行unlock状态, 此时进入PCR抖动处理流程。

2.4 PCR抖动处理

在Unlock状态时, 系统进入PCR抖动处理流程, 其算法流程描述如下:

设置PCR抖动标志寄存器, 系统时钟恢复电路在unlock状态下不再修正解码器的系统时钟, 在PCR抖动结束前, 一直使用本地固定27MHZ时钟作为系统时钟输出;

当下一个PCR到达时, STC计数器重新装载最新的PCR值, 此时PCR抖动结束, 系统进入下一轮PCR检测及处理阶段, 系统时钟恢复电路恢复时钟同步机制, STC计数器作为解码器STC时钟输出。

3 算法实现及测试

在实际产品开发中, 本文将整个PCR抖动检测模块设计为一个独立的内核任务, 在Nucleus内核中运行, 同时该内核任务通过消息机制通知上层音视频模块PCR抖动消息。当系统初始化完成后, 该内核任务被激活, 进入就绪状态。图2显示了系统检测到unmark类型PCR抖动测试实际场景截图:

当系统检测到PCR抖动时, 解码器音视频同步模块使用本地固定27MHZ时钟作为PCR抖动期间同步基准, 实际测试结果表明在PCR抖动期间音视频缓冲区数据得到了完全正确显示, 取得了较好的实际应用效果。

4 结语

本文针对实际数字电视产品开发中PCR抖动所引起的接收端解码器音视频数据不能完全同步显示问题, 给出了完整的PCR抖动检测及具体实现, 该算法及实现在泰鼎多媒体技术有限公司最新高端数字电视芯片产品上进行了实际应用, 具备较强的实际应用价值。

摘要：在实际数字电视产品开发中, PCR抖动会导致终端音视频数据无法完全正确显示。给出了一种基于有限状态机模型的PCR抖动检测算法及在Nucleus嵌入式实时操作系统下实现。该算法及实现在泰鼎多媒体技术有限公司最新高端数字电视芯片上得到了实际应用, 具有较强的实际应用价值。

关键词：PCR抖动,Lock,Unlock,Nucleus

参考文献

[1]钟玉琢, 王琪, 赵黎等.MPEG2运动图像压缩编码国际标准及MPEG的新进展[M].北京:清华大学出版社, 2002

[2]卢官明, 宗昉.数字电视原理[M].北京:机械工业出版社, 2004.

[3]刘修文.数字电视有线传输技术[M].北京:电子工业出版社, 2002.

[4]张炜, 刘鹏, 李兵兵.基于MPEG-2的PCR校准策略[J].中国有线电视2006, 19:1913-1917.

[5]杜邓宝, 潘长勇.数字电视传输系统中PCR抖动的校正分析与实现[J].电视技术, 2005, (7) :47-50.

[6]张磊, 王宏远.基于改进的PCR校正算法的MPEG2复用器电路与应用[J].电视技术, 2006, (3) :14-16.

PCR检测法 篇5

羊流产衣原体的PCR检测方法研究

根据羊流产衣原体16S rRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼农原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的`卵黄囊膜均未扩增出相应的片段.敏感性试验表明,该体系可检测到2 pg的衣原体DNA.

作 者：张莉 王英珍 鄢明华 李秀丽 ZHANG Li WANG Ying-zhen YAN Ming-hua LI Xiu-li  作者单位：天津市畜牧兽医研究所,天津,300112 刊 名：天津农业科学 英文刊名：TIANJIN AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)： 15(2) 分类号：S852.67 关键词：羊流产衣原体   PCR   检测  

PCR检测法 篇6

关键词：PCR检测；iss基因；套式；检出率；大肠杆菌

中图分类号： S852.61+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0069-02

收稿日期：2014-11-07

基金项目：国家自然科学青年基金（编号：31302128）。

作者简介：樊琛（1978—），女，山东聊城人，博士，副教授，主要从事病原体分子生物学、食品安全研究。E-mail：fanchen7810@126.com。iss基因（increased serum survival gene）是编码大肠杆菌补体抗性的基因，大小为309 bp，在人源、禽源大肠杆菌中皆有发现。1979年，Binns等从人源大肠杆菌ColV、I-K94质粒获得iss基因表达，能显著增强含此基因大肠杆菌对1日龄雏鸡的毒力，还能增强转化菌的血清抗性[1-2]。目前，国外相关研究者大多将iss基因检测作为大肠杆菌毒力检测的参考指标之一，以1次PCR检测结果iss+或iss-来判定iss基因在大肠杆菌中的存在情况。大肠杆菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探针方法检测，这2种方法检测结果可能出现不符合性，即某菌株PCR检测可能为iss+而探针检测为iss-，或PCR检测为iss-而探针检测为iss+[3-5]。而在实际应用中，多以PCR检测结果判定iss在大肠杆菌中的存在情况。本试验探讨PCR方法检测大肠杆菌iss基因缺陷的原因和改进方法，以提高PCR检测大肠杆菌iss基因的准确性。1材料与方法

1.1菌株及其来源

10株大肠杆菌，分别采自黑龙江省、山东省、贵州省、新疆维吾尔自治区、北京市等地的鸡场。

1.2引物合成

1.3酶类及主要生化试剂

蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA连接酶、pMD19-T vector克隆载体及相关试剂，均购自宝泰克生物工程公司；DNA胶回收试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；所用试验试剂均为分析纯。

1.4大肠杆菌DNA提取

将待测菌琼脂板划线分离，挑取平板上菌落直径2 mm的单菌落；加入40 μL裂解液（10 mmol/L Tris-Cl、pH值为7.5，1 mmol/L EDTA）和50μg/mL蛋白酶K，混匀；55 ℃温育10 min，再于80 ℃温育10 min，加80 μL灭菌三蒸水，-20 ℃保存。

1.5iss基因检测扩增反应体系

iss PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板5 μL、灭菌三蒸水33.5 μL，rTaq酶0.5 μL，共50 μL。套式PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板 2 μL、灭菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL，共50 μL。

1.6扩增反应程序

1.6.1rTaq酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复2次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.6.2KOD酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复1次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。同时做空白对照。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2结果与分析

由表1可见，10株大肠杆菌都含有iss基因；rTaq酶1次PCR检测4株菌株为阳性，6株为阴性，检测率为40%；套式PCR检测出现特异条带，2株菌株检测为阴性，扩增出的iss基因经序列测定，其核苷酸序列符合已发表的iss基因核苷酸序列，rTaq酶套式PCR检出率为80%；KOD酶1次PCR检测7株菌株为阳性，3株为阴性，检出率为70%，但重复性上有差异，阴性、阳性菌株有所不同，套式PCR检测也出现特异条带，10株大肠杆菌都含有iss基因，检出率为100%，扩增出的iss基因经序列测定，其核苷酸序列与已发表的iss基因核苷酸序列也相符。

3结论与讨论

研究发现，iss基因在致病性大肠杆菌中的存在率要高于非致病性大肠杆菌。Johnson等对20株禽大肠杆菌进行iss基因扩增及致病性试验，结果表明，6株致病性菌株为iss基因扩增阳性，14株非致病性菌株中有11株未扩增出iss基因、3株扩增出iss基因[7]。关于iss基因的定位，近来普遍认为iss基因是定位在ColV质粒上。有研究表明，在产生大肠菌素V（colicin V）的菌株中，人血液中有95.5%的菌株携带iss基因，肠道中有68.8%的菌株携带iss基因；禽源大肠杆菌iss基因与ColV同时出现的概率很高，iss基因很可能与ColV质粒连在一起[8-9]。大肠杆菌ColV质粒是低拷贝的大质粒[10-11]。本试验PCR所用模板为菌体经蛋白酶K消化后的粗提物，菌体消化程度可能影响PCR扩增效率，采用常规质粒提取及大质粒提取方法均未获得ColV质粒。另外，由于ColV质粒在各菌株中的拷贝数可能有所差异，也会导致ColV质粒极低拷贝的菌株在1次PCR时未能扩增出目的条带。

试验结果表明，rTaq酶与KOD酶1次PCR时，iss基因的检出率分别为40%、70%，套式PCR检出率分别为80%、100%，KOD酶检测大肠杆菌iss基因的检出率均高于rTaq酶，KOD酶对大肠杆菌iss基因扩增效率优于rTaq酶。在重复性方面，KOD酶1次PCR检测10株菌株中有2株菌株出现差异，可能与模板制备中菌体消化裂解程度及操作误差有关；KOD酶套式PCR结果无差异，采用KOD酶套式PCR检测能降低大肠杆菌iss基因的漏检率。

参考文献：

[1]Tivendale K A，Noormohammadi A H，Allen J L，et al. The conserved portion of the putative virulence region contributes to virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J]. Microbiology，2009，155（2）： 450-460.

[2]Ozawa M，Harada K，Kojima A，et al. Antimicrobial susceptibilities，serogroups，and molecular characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolates in Japan[J]. Avian Diseases，2008，52（3）： 392-397.

[3]Skyberg J A，Johnson T J，Johnson J R，et al. Acquisition of avian pathogenic Escherichia coli plasmids by a commensal E. coli isolate enhances its abilities to kill chicken embryos，grow in human urine，and colonize the murine kidney[J]. Infection and Immunity，2006，74（11）： 6287-6292.

[4]樊琛，王亚君，李一经. iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J]. 畜牧兽医学报，2005，36（1）：58-61.

[5]Johnson T J，Wannemuehler Y，Doetkott C，et al. Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostic tool[J]. Journal of Clinical Microbiology，2008，46（12）： 3987-3996.

[6]樊琛，程霜，刘桂芹，等. 鸡大肠杆菌iss毒力基因研究进展[J]. 江苏农业科学，2014，42（8）：53-54，128.

[7]Johnson T J，Wannemuehler Y M，Nolan L K. Evolution of the iss gene in Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）： 2360-2369.

[8]Oguttu J W，Veary C M，Picard J A. Antimicrobial drug resistance of Escherichia coli isolated from poultry abattoir workers at risk and broilers on antimicrobials[J]. Journal of the South African Veterinary Association，2008，79（4）： 161-166.

[9]Chuba P J，Leon M A，Banerjee A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J]. Molecular & General Genetics，1989，216（2/3）：287-292.

[10]Johnson T J，Giddings C W，Horne S M，et al. Location of increased serum survival gene and selected virulence traits on a conjugative R plasmid in an avian Escherichia coli isolate[J]. Avian Diseases，2002，46（2）：342-352.

[11]Lefebvre B，Gattuso M，Moisan H，et al. Genotype comparison of sorbitol-negative Escherichia coli isolates from healthy broiler chickens from different commercial farms[J]. Poultry Science，2009，88（7）：1474-1484.何静茹，李振坚. 外源激素对美花石斛试管内花芽分化的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（11

PCR检测法 篇7

1.1 一般资料

选取自2011年1月至2013年12月间我院收治的乳腺癌患者共76例,年龄为39～54岁,平均为43.6±2.5岁,所有患者均经手术病理证实为乳腺癌,同期选取非癌症患者共75例作为对照组,年龄为37～52岁,平均为41.3±2.6岁,其中患有高血压的患者有8例,患有乳腺增生的患者有20例,患有肝炎的患者有6例,患有糖尿病的患者有3例,健康人员有38例。两组受检人员在年龄、体重、意识等方面不具有明显差异。

1.2 检测方法

取患者肘静脉血液2ml进行分离处理,取血清标本从实验室采用PCR产物酶联免疫检测方法进行检测,其中所应用的监测仪器为美国PE公司生产的PE2400型PCR扩增仪和Bio-Rad公司生产的全自动酶联检测仪,所采用的酶标软板是华美生物工程公司生产的,所使用的试剂均是有相应公司提供的标准试剂,在检测过程中严格按照检测规范中的检验方法进行,对患者血清中的抗P53蛋白抗体进行检测。

2. 结果

本组7 6例乳腺癌患者的检测结果中共检出抗P53抗体呈阳性的有30例,其阳性率为39.47%,对照组75例受检者中检出抗P53抗体呈阳性的有0例,所有均呈阴性,抗P53蛋白抗体的检测特异性为100%;乳腺癌患者组的抗P53抗体明显高于对照组,p<0.05,详见表1。

3. 讨论

PCR产物酶联免疫检测方法是PCR检测发展而来的一种全新检测方法,其在检测上将PCR技术和酶联免疫方法结合起来,从而有效提高了临床检验的灵敏度和特异性,在临床细菌检测、病毒检测、支原体检测等中具有重要价值,对于临床诊断具有重要的参考价值[1]。本文主要对PCR产物酶联免疫检测方法在乳腺癌患者临床检验中的应用进行了分析,结果显示,在抗P53蛋白抗体的检验上,乳腺癌患者组的阳性检出率为39.47%,明显高于非癌组受检者,这说明PCR产物酶联免疫检测方法能够对乳腺癌患者的抗P53抗体进行有效检验,且对于非癌受检者,采用PCR产物酶联免疫方法进行检测的抗P53抗体均呈现阴性[2].抗P53抗体对乳腺癌的诊断特异性为100%,这说明PCR产物酶联免疫在乳腺癌临床检测方面具有突出效果,特异性高,能够较为准确地将乳腺癌患者与非癌患者进行区分,从而为乳腺癌的临床诊断提供重要依据。有研究表明采用ELISA方法进行检测,其阳性率明显低于采用PCR产物酶联免疫检测的患者组[3],这说明采用PCR酶联免疫检测方法能够明显提高抗P53抗体的阳性检出率。

PCR产物酶联免疫检测方法是先将PCR产物通过一定方法固定在微孔板上并与特异性探针进行杂交,然后用酶联免疫方法来检测相应信号,其中检测方法主要有特异性探针包被法、夹心杂交法以及PCR产物捕获法,可用于细菌检测、病毒学检测等多种临床检验当中,且操作容易,稳定性较为良好,能够有效减少放射性污染,从而提高检验数据的准确性。在检验过程中,仪器检验显示的数据较为客观,真实贴近检验物的真实情况,减少了主观因素对临床检验结果的影响。且特异性强,在本次研究中,对乳腺癌患者的血清抗P53蛋白抗体进行检验的特异性达到了100%,这说明PCR产物酶联免疫法在血清抗体检测方面的表现突出,具有较高的特异性,同时在检测过程中还能够对PCR产物进行定量,使得检测结果更加客观真实。PCR产物酶联免疫检测还能够对大量样本进行同时检测,且检测仪器采用的是全自动化模式,在保证数据真实准确的同时大幅度提高了检测速度,使得临床检验效率得到大幅提升,对于早期诊断具有较高的临床价值。在本次研究中,采用PCR产物酶联免疫方法进行检测血清抗P53蛋白抗体,其特异性达到了100%,阳性检出率达到了39.47%,这说明PCR产物酶联免疫是临床上检测抗P53蛋白抗体的理想检验工具,对于乳腺癌患者早期诊断和后期治疗预后具有重要价值。

综上所述,PCR产物酶联免疫检测方法将PCR技术和酶联免疫方法结合起来,能够快速对检测物进行检测,有效提高了临床检验的灵敏度和特异性,对早期诊断和后期治疗具有重要参考价值,值得在临床检验中推广。

参考文献

[1]孙峰,林兰,刘继斌.免疫PCR法检测乳腺癌患者血清p185抗体的临床价值[J].齐齐哈尔医学院学报,2013,(23):3442-3444.

[2]赵春燕,曹娜娜.免疫PCR技术检测肠出血型大肠埃希菌O157:H7[J].临床检验杂志,2010,28(5):332-333.

PCR检测法 篇8

目前PCV-2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸分子杂交技术等,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想,因此生产实践中需要一种快速、特异、敏感的PCV-2检测技术来准确检测圆环病毒病,并为该病的防治提供事实和理论依据。本试验旨在对比新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室建立的常规PCR和荧光定量PCR检测方法的优缺点,为实验室或者临床中PCV-2的准确、快速检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光定量PCR仪,购自Bio-Rad公司;普通PCR仪,购自Eppendorf公司;琼脂糖,购自Invitrogen公司;PCR试剂盒、DL-2 000 Marker等,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 标准阳性模板

包含PCV-2-ORF2全基因的重组质粒p MD-PCV-2-ORF2,新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室构建保存。

1.3 标准阳性模板的制备

培养含p MD-PCV-2-ORF2的工程菌,提取质粒,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,并计算标准品的拷贝数。将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝数/μL后再倍比稀释成含质粒数量分别为109,108,107,106,105,104,103,102,101,100拷贝数的标准阳性模板,-80℃保存,备用。

1.4 引物设计与合成

1.4.1 荧光定量PCR引物和探针的设计

根据Gen Bank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物和Taq-Man探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成,探针的5'端用FAM标记,3'端用TAMRA标记,扩增目的片段长度为106 bp。具体序列如下。

引物F(上游):5'-CCCTATGTAAACTACTCCT C-3';引物R(下游):5'-GGAAGTAATCAATAGTG-GAAT C-3'。

探针序列:5'-(FAM)ACCATAACCCAGCCCT-TCTCC(TAMRA)-3'。

1.4.2 普通PCR引物和探针的设计

根据GenBank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物,扩增目的片段长度为494 bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列如下。

引物P1(上游):5'-CACGGATATTGTAGTCCT-GGT-3';引物P2(下游):5'-CGCACCTTCG-GATATACTGTC-3'。

1.5 反应条件

1.5.1 荧光定量PCR反应条件

经过反复试验确定出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中Premix Ex Taq 12.5μL,上、下游引物(终浓度为10μmol/L)各0.5μL,探针(终浓度为10μmol/L)0.25μL,模板DNA 2μL,去离子水9.25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,57.4℃退火延伸30 s,40个循环。

1.5.2 普通PCR反应条件

经过反复试验选出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中上游引物P1 1μL,下游引物P2 1μL,10×PCR Buffer(Mg Cl2Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,La Taq(2.5 U/μL)0.25μL,模板DNA 5μL,去离子水11.25μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,54℃退火40 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,置紫外灯下观察。

1.6 临床样品检测

临床送检的158份病料用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 重组质粒浓度的测定

提取的p MD-PCV-2-ORF2质粒,经核酸蛋白分析仪测定其质量浓度为449.9 ng/μL,并计算其拷贝数为9.84×1010拷贝数/μL,OD260/OD280值为1.80,符合纯度要求。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

根据重组质粒浓度测定结果,选择106,105,104,103,102,101拷贝数/μL 6个梯度浓度的质粒为模板,制作标准曲线(见图1)。标准曲线斜率为-3.354,轴截距为35.337,线性方程为Y=-3.354X+35.337,相关系数r为0.999,表明线性关系很好。

2.3 荧光定量PCR敏感性试验

以10倍系列稀释的p MD-PCV-2-ORF2标准质粒(1.0×106~1.0×101拷贝数/μL)为模板进行扩增,1.0×101拷贝数/μL仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为1.0×101拷贝数/μL。荧光曲线见图2。

2.4 普通PCR特异性与敏感性试验

选用101~1010拷贝数/μL 10个梯度浓度的质粒为模板进行扩增,凝胶电泳结果显示:当模板浓度≤1.0×104拷贝数/μL时,无法扩增出特异性目的条带。凝胶电泳检测结果见图3。

2.5 临床样品检测

对临床送检的158份病料用常规PCR法和荧光定量PCR法进行检测,结果见表1。荧光定量PCR法比常规PCR法的检出率高出8.86个百分点,表明荧光定量PCR法更加敏感。

-.PCR阴性对照;M.DL-2 000 Marker;1~10.101~1010拷贝数/μL。

3 讨论

断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年首次在加拿大的SPF猪群中被发现,随后在世界范围内广泛流行,自2001年起,我国的一些猪场也发现了PMWS[3]。PMWS主要侵害6~12周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及黄疸,造成病猪免疫机能下降、生产性能降低。现已证明PCV-2是导致PMWS的主要病原,特别是在有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)存在的情况下,该病的阳性率更高[4],是当前严重危害我国养猪业的重要疫病之一。

圆环病毒病的确诊需要进行病毒分离,PCV-2在细胞上不产生细胞病变,且需将PCV-2盲传多代后才能使病毒有效增值,有时连续传代会导致病毒抗原性的改变,因此病毒的分离费力耗时,不适合快速诊断。国内外已有多种诊断试剂盒,如ELISA、IFA等,但其非特异性较高,且价格昂贵。常规PCR方法可以快速、敏感、特异地定性检测PCV-2,具有简单、易操作、设备价格较低、人员素质要求不高的优点,但也存在非特异性扩增造成的假阳性结果需要PCR后处理的缺点。荧光定量PCR可以对样品中的病毒含量进行准确的定量检测,具有结果直观、灵敏度高、特异性强的优点[5],同时也存在设备及试剂价格较高、对人员的素质要求较高、在基层推广性低的缺点。

参考文献

[1]ALLAN G M,mc NEILLY F,KENNEDY S,et al.Isolation of porcine circovirus 2 like viruses frompigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

[2]李海超,王娟,黄秀梅,等.猪圆环病毒2型免疫应答机制研究进展[J].动物医学进展,2014,35(2):105-109.

[3]吕艳丽,杨汉春,郭鑫.用PCR方法检测猪圆环病毒Ⅱ型[J].中国兽医学报,2002,22(6):552-554.

[4]张治涛,李玉峰,姜平,等.猪圆环病毒2型感染的检测与流行病学调查[J].中国兽医学报,2008,28(3):227-231.

PCR快速检测大肠杆菌的研究 篇9

大肠埃希氏菌 (Escherichia coli, 简称E.coli) 习惯称为大肠杆菌, 分类于肠杆菌科, 归属于埃希氏菌属。由于大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌, 常随粪便从人及动物体排除, 广泛散播于自然环境中, 因此一旦检出大肠杆菌, 即意味着样品直接或间接地被粪便污染。因此, 大肠杆菌被用作饮用水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标。我国食品和饮用水的相关国家标准中就明确规定了大肠杆菌的检出限。

大肠杆菌的传统检测和计数方法是MPN法 (most probable number, 最大可能数) , 此法的基础是大肠杆菌在生长培养基上进行乳糖发酵、产气和形成吲哚, 但这一方法需要6-7d的时间, 已不能适应现代化品质管理的原则。聚合酶链式反应技术 (Polymerase chain reaction, PCR) 是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术, 能够快速、特异地在体外上百万倍的扩增目的基因或DNA片段。本研究以β-葡萄糖苷酸酶基因uid A设计引物, 研究建立PCR技术快速检测大肠杆菌的方法。

2实验部分

2.1药品和仪器

2.1.1实验菌株

大肠杆菌 (Escherichia coli ATCC 25922) ;大肠杆菌 (Escherichia coli CMCC 44102) ;大肠杆菌 (Escherichia coli ATCC8099) ;金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus CMCC 26003) ;枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis CMCC 63501) ;肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae) ;链霉菌 (Streptomyces radiopugnans) 。

2.1.2实验药品

蛋白胨, 酵母抽提物, 琼脂糖, 琼脂粉, BR OXOID;PCR试剂盒, Marker DL2000, 基因组提取试剂盒, 南京诺唯赞生物科技有限公司。

2.1.3实验仪器

Mastercycler personal型PCR仪Eppendorf;FR-980型生物电泳图像分析系统上海复日科技有限公司;TC-512型PCR仪Techne公司。

2.2实验方法

2.2.1菌株活化培养

将冻存菌中接种至LB固体培养基, 37℃培养12-36h后, 挑取单菌落接种至液体培养基, 摇床培养。

2.2.2基因组DNA的提取

冻存菌活化后, 挑取单菌落接种至液体培养基, 37℃摇床培养12-36h。按照细菌基因组提取试剂盒操作步骤提取基因组, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.2.3引物设计

查阅Genebank基因数据库, 调取E.coli uid A基因全 ( (转转下下页页) ) 序列, 使用软件Vector NTI 9.0设计引物:Primer F:5'-AGCGTTGAACTGCGTGAT-3', PrimerR:5'-GTTCTTTCG-GCTTGTTGC-3'。PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

2.2.4 PCR反应体系和反应条件

以非大肠杆菌属微生物为阴性对照进行PCR反应, 用1%的凝胶电泳分析PCR结果, Marker DL2000作为分子量的对照。PCR反应体系为:2×Taq Mix:25μL;primer F 1μL;primer R 1μL;基因组1μL;dd H2O 22μL。PCR扩增条件:94℃预变性5min;再按下列参数进行循环反应, 94℃变性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸30s, 30个循环;72℃延伸5min, 冷却至4℃。

2.2.5检测限的确定

根据参考文献[1]的方法进行。配制一定浓度的大肠杆菌菌悬液, 梯度稀释后取1m L离心, 用试剂盒提取基因组进行PCR, 同时涂布于固体培养基上进行菌落计数。

2.2.6 PCR方法检测蔬菜样品

购买新鲜的蔬菜样品22份, 各取20g加入50m L的LB培养基, 37℃, 150r/min摇床富集培养, 6h后取出, 取1m L培养基离心后用试剂盒提取基因组进行PCR检验。

3结果与讨论

3.1 PCR引物的特异性验证

目标基因的选择及特异性引物的设计是PCR方法成功的关键。文献报道PCR技术检测大肠杆菌常用的靶基因有:alr、gad、cyd A、Lac A、Lac Z、tuf等, 对应编码大肠杆菌丙氨酸消旋酶基因的保守区、细胞色素D泛醇氧化酶亚基、谷氨酸脱羧酶、硫基半乳糖苷乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、高保守性延长因子基因序列等。uid A是编码β-葡萄糖苷酸酶的基因。据报道, 94%-97%的大肠杆菌都能具有这种基因, 而食品和水中其他非大肠菌群细菌几乎都缺乏这种酶基因。因此有研究基于uid A基因设计引物进行PCR以检验大肠杆菌[2,3]。本研究根据uid A基因设计了全新的特异性引物, 以非大肠杆菌属细胞为对照进行PCR, 结果如图1所示。由图可见, 三种大肠杆菌在484bp处均扩展出特异性条带, 与引物扩展片段的长度一致, 而非大肠杆菌属细胞在此位置均没有扩展条带出现, 多次实验重现性良好。由此可见, 本研究所用基于uid A基因设计的引物特异性较高, 可用于快速检验大肠杆菌。

3.2检测限的确定

DNA模板的提取方法、PCR的反应条件 (如退火温度等) 对PCR方法的检测限和灵敏度影响较大。本研究采用商业试剂盒提取细胞基因组DNA进行PCR, 并将大肠杆菌进行梯度稀释后结合平板涂布确定PCR方法的检测限。PCR反应条件为:退火温度55℃、延伸温度72℃, 实验结果如图2所示。其中泳道1和2在目标基因片段处有条带, 泳道3、4和5没有目标扩展条带。结合平板计数结果, PCR方法的检出限为2.4×102CFU/m L, 与郝江燕等人的研究结果较为一致[1]。

3.3 PCR方法检测蔬菜样品

PCR之前细菌的富集增殖过程对反应的灵敏度有较大的影响。Bai[4]的研究指出, 使用多重PCR检测E.coli O157:H7时, 如果不经过增菌处理, 检测限为104CFU/g, 如果增菌6h之后再进行PCR, 检测限为10CFU/g, 提高了103倍。因此本研究采取了先增菌6h之后再进行PCR检测。22份样品中有14份样品检出大肠杆菌阳性, 检出率为63.6%。由于样品成分较多, 诸如氯化钠、二价盐、SDS、ED-TA、尿素、叶绿素、多酚化合物、多糖、可溶性蛋白、疏水性蛋白之类的杂质可能会抑制PCR, 特别是样品中目标菌浓度较低的时候, 高背景干扰将会影响结果的可靠性。因此在以后的研究中, 如何去除这些杂质以消除对PCR过程的影响也是一个研究的方向。

4结论

目前, 食源性大肠杆菌的主要检测包括:培养法、仪器分析法、生物传感器法、PCR法等。PCR是一种体外特异性扩增DNA片段的分子生物学技术, 灵敏度高、快速准确、特异性强, 广泛用于各种食源性致病菌的检测中。本研究根据大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶基因uid A设计全新的特异性引物建立了大肠杆菌的快速检测PCR方法。该方法特异性强, 本实验中所用的非大肠杆菌属均没有出现扩增, 检测限为2.4×102CFU/m L, 增菌6h之后, 22份蔬菜样品中有14份样品检出大肠杆菌阳性, 检出率为63.6%, 从增菌培养开始10h之内可出检测结果。与传统大肠杆菌检测方法相比较, PCR法快捷、易于操作、且所需样本极少。具有经济意义和推广价值。

摘要：大肠杆菌是常见的肠道菌, 也是食品中常用的粪源性污染卫生细菌学指标。本研究根据β-葡萄糖苷酸酶基因uid A设计引物建立大肠杆菌的快速检测PCR方法。结果显示该方法特异性好, 对大肠杆菌培养液的检测限为2.4×102CFU/m L, 22份蔬菜样品大肠杆菌检出率为63.6%。

关键词：大肠杆菌,PCR,检测,uidA

参考文献

[1]郝江燕, 胡文忠, 何煜波等.鲜活农产品中大肠杆菌的PCR检测[J].食品工业科技, 2013, 34 (17) :150-153.

[2]张亮, 刘磊, 豆艳丽等.浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立[J].甘肃农业大学学报, 2012, 47 (3) :124-128.

[3]舒畅, 姜琛璐, 钟慈平等.三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立[J].食品工业科技, 2014, (12) :49-54.

PCR检测法 篇10

关键词：茶炭疽病菌,分离,培养,PCR检测

茶炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)——茶园中发生最为普遍的真菌病害。主要为害当年生成叶,发病面积通常占到全叶片的1/4—1/2,少部分危害老叶和嫩叶,越冬后期病斑在早春仍然影响茶叶的光合作用与营养生长[1]。其侵染病原一茶长圆盘孢菌(Gloeosporium theae-sinensis Miyake,简称为Gtm)侵染茶树后发病严重时致茶树年年减产明显,茶苗也损失不小:如1991年福建省福鼎茶区茶炭疽病在暴发成灾。1992年春茶减产15%—23%,秋茶减产25%—30%,许多茶苗地也普遍发生炭疽病,致使几亿株苗木积压[2,3]为了有效的防治茶炭疽病,及时准确的病害诊断是关键,而茶炭疽病诊断至今主要沿用传统的肉眼观察症状,但肉眼观察症状在初期易与一些虫害引起的症状混淆,而后期又难以与茶云纹叶枯病、茶轮斑病等区分开来。即使有些使用相差显微镜检测,但必须有病原菌孢子才能下结论,而且难以区分到病原菌小种的程度,准确性也不是很高,另外操作烦琐,检测灵敏度低,不利于茶炭疽病的及时防治,也不适应在抗炭疽病的育种上的检测需要。

20世纪80年代中期,PCR技术作为一种体外迅速、大量扩增目的基因的技术被建立,由于其特异性与灵敏度高,而且检测快速,现已广泛地应用于植物病害诊断中,如甘蔗内生菌[4]与柑桔黄龙病[5]利用PCR技术研究能在未显症状前检测出病原,而且快速准确方便。我国茶炭疽病菌PCR检测刚处于起步阶段,对目的片段核苷酸序列的测定及分析尚未见报道[6]。本文旨在前人研究的基础上建立茶炭疽病菌PC R检测方法,通过对目的片段核苷酸序列的测定及分析,以明确我国茶炭疽病原菌与世界其它地区炭疽病原菌及其近缘与形似菌的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 菌株分离与培养

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基成分:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml[7]。

(2)分离培养设置22℃、24℃、28℃三个培养温差,恒温培养3d。

1.2 PCR检测

1.2.1 引物序列

采用巴拿马的一篇文献中报道的Glomerella cingulatastrain AR4041 28S rRNA基因间隔区[8],应用DNAstar软件设计出1对特异引物,委托上海生物工程公司合成,其序列为:上游引物Gc1:5'-F1:gagaccgatagcgaacaagt-3';下游引物Gc2:5'-R1:ag(a/c)cattacgccaacatcct-3'。预期扩增产物长度为241bp。

1.2.2 菌液总DNA提取(CTAB法)

每样品取300μl菌液放入1.5ml离心管中,加入600μl经65℃预热的2%CTAB抽提缓冲液,65℃水浴30min,期间不时摇匀,加入600μl氯仿/异戊醇(24:1)剧烈振荡30s,12,000rpm高速离心机上离心10min,取上清液置于新的1.5ml离心管中,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)温和地混匀,12,000rpm高速离心机上离心10min,取上清液置于新的1.5ml离心管中,加入1/10体积3mol/LNaAc (pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇,混匀后置-20℃冰箱中20min,4℃下12,000rpm高速离心机上离心10min,弃上清液,沉淀分别用冷70%乙醇和冷无水乙醇各洗一次,室温下风干,溶于50μl双蒸水中(用手指轻弹离心管使沉淀充分悬浮),-20℃保存。

1.2.3 PCR反应体系

本实验rTaq酶、Buffer和dNTP均购置上海生工(Sangon),在PCR管中建立PCR反应体系(终体积20.6μL),在冰上操作。

1.2.4 PCR反应程序

将PCR管放入Eppendorf梯度PCR扩增仪(德国产)中进行扩增。反应程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,5℃退火30s,72℃延伸60s,35个循环;72℃延伸5min。

1.2.5 PCR产物电泳检测

PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后在Vilber Lourmat凝胶成像系统(法国产)观察和照像,根据有无特异扩增带(241bp)检测样本炭疽病原菌的有无。

1.3 序列测定与分析

PCR产物核苷酸序列由上海英骏生物技术有限公司测序服务中心用3730测序仪测定,测序结果运用Blast在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中比对,并应用DNAStar软件包进行序列分析。

2 结果与分析

2.1 茶炭疽病菌的分离、鉴定。

从中国常德东山峰农场茶园采集的病叶采用PDA培养基24℃或28℃,3天分离获得,编号C1、C2。培养出两种形态的病原菌C1、C2。

1培养性状分离纯化的菌株在PDA上24℃或28℃培养3～5d后,菌落2～3mm C1菌落为灰白色,C2菌落呈黑褐色,都表现了典型的Colletotrichum属的细菌的特征。

2菌体形态及染色反应采用显微镜观察菌丝与孢子形态。分生孢子梗短线状单生,无色,单胞,顶端各着生1个分生孢子。分生孢子梭形,细小,两端稍尖,无色,单胞,内含1至数个小油球。菌丝体的发育适温为25-27℃,这与谢宝林2007年报道的一致。

2.2 茶炭疽病菌PCR检测方法建立

2.2.1 病样总DNA的提取

菌液用CTAB法进行DNA抽提,以此DNA作为PCR扩增的模板。由于PCR反应中模板量和浓度都有一定的要求,当DNA浓度较高或杂质较多时,可用双蒸水稀释(1/10)。以其为模板。

2.2.2 病菌rRNA基因间隔区序列PCR扩增

根据文献合成的茶炭疽病菌菌特异性引物(Gc1和Gc2,目的片段大小为241bp),以病原菌总DNA抽提物为模板,经PCR扩增,产物电泳,可见单一明亮的预期大小条带(图1)。序列分析表明,扩增产物核苷酸序列与已报道的Gc 28S rRNA基因间隔区序列高度同源(见表1)表明本研究采用的PCR方法能对我国茶炭疽病菌进行检测,其实用性研究值得进一步展开。

M:Marker DL2000;1—5:东山峰病叶抽提DNA;6:健康茶叶抽提DNA

2.3 茶炭疽病原菌28S rRNA测定与分析

PCR扩增产物经上、下游引物双向直接测序,拼接后获得新台糖10号病样中炭疽病菌28S rRNA基因间隔区核苷酸序列(代号Gc),如表1所示。采用BLAST软件比对,经DNAStar软件包分析,结果表明,一、湖南茶区,PDA培养出来的两个真菌分离物在28SrRNA基因片段上一致,并都与炭疽菌属的一个种具有99%以上的同源性。

3 结论与讨论

根据茶病原菌Gc 28S rRNA基因间隔区核苷酸序列设计特异性引物,建立反应体系,应用PCR扩增检测茶炭疽病是完全可行的。本研究以一对文献上报道的引物研究发现PCR检测结果的稳定性不太好,关键是实验条件要求较严格。例如本研究中,退火温度50℃时,可检测出阳性,当退火温度为52℃时,往往导致检测不出目的条带。另外,PCR检测对样品菌液的新鲜度要求较高。本研究中以菌液提取DNA。但这一点不利于病叶的及时检测,对PCR检测方法在茶生产中的应用有一定的影响。对于PCR检测的灵敏度,使之对炭疽病的早期防治和抗炭疽病育种有价值,有待以后进一步研究。由于茶炭疽病在Genbank中尚未见报道,而这段测出的序列与其它炭疽病的同一率很高,而序列又短,难以通过同源序列比对找出合适的特异引物对,但通过炭疽病序列的进一步测定,对我国茶炭疽病与其它炭疽病病原菌的亲缘关系可以进行一些探索。目前,为了对茶病原菌做进一步鉴定,尚需对病原菌进行回接实验。

PCR产物测序结果表明东山峰发生的炭疽病菌28SrRNA基因间隔区核苷酸序列与世界上已报道的炭疽病菌相应区段核苷酸的相似率接近100%,病菌高度的同源验证了本文所建立的茶炭疽PCR检测程序的正确性,也初步表明茶炭疽病原菌稳定性极高,变异性较小,这对茶炭疽病原菌的检测及防治比较有利。但由于茶炭疽广泛发生于世界茶区,其病原的稳定性、变异性有待进一步研究。

参考文献

[1]张赘,付桂玲.有机茶园常见病虫害及防治措施[J].植物保护, 2004,(3):16

[2]蔡煌.福鼎县茶炭疽病危害严重[J].福建茶叶,1992,(4):30-31

[3]蔡煌.茶炭疽病在福鼎县的流行及防治[J].中国茶叶,1992,(6):20

[4]周凌云,周国辉.甘蔗宿根矮化病菌PCR检测技术研究[J].广西农业生物科学,2006,25(2):172-174

[5]田亚,柯穗,柯冲.应用电镜与PCR技术检测王官溪蜜柚黄龙病病原[J].植物病理学报,2000,30(1):76-81.

[6]周凌云,童雄才,粟本文,许东林.PCR技术在茶树病害检测中的应用展望[J].福建茶叶,2007,(1):30-32

[7]方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社,1998:179-210

[8]Farr,D.F.,Aime,M.C.,Rossman,A.Y.and Palm,M.E.Species of Colletotrichum on Agavaceae[J].Mycol.Res,2006,(110):1395-1408

PCR检测法 篇11

【关键词】泌尿系结核；PCR检测；诊断

1资料与方法

1.1病例 我院2006～2012年门诊及住院患者中经病理或实验室检查明确诊断为泌尿系结核患者40例作为实验组，40例非泌尿系结核患者作为对照组。实验组中男24例，女16例，年龄24-70 岁。对照组40例，为同期住院病人中已确诊的非泌尿系结核患者，性别比例，年龄，与实验组相似。

1.2方法 尿液收集方法，是留取晨尿的中段尿10ml于无菌试管中，送至检验科，收到标本后，将处理后的样品2ul加入专用毛细管中4000rpm离心3min，插入圆形卡盘倒置20秒钟后放入仪器中设置循环条件：93℃→2秒预变性，然后按93℃5秒→57℃45秒，做40个循环，最后置37℃延伸1秒。本试验方法按试剂说明书操作.试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供，核酸打增仪为ROCHE公司生产的LightCyc[er（争自动荧光定量分析系统）I.ightCycler专用软件计算结果。

1.3统计学处理：：采用S P S S 1 3 . 0 软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

40例确诊的泌尿系结核病人尿标本PCR检测31例阳性，阳性率 77.5%（ P<0.01），40例非结核泌尿系统感染病人均为阴性。两组差异無统计学意义（P>0.05）结果见下表：

3 讨论

泌尿系统从肾，输尿管，膀胱至尿道都可发生结核病变；发生于这些器官组织的结核病称为泌尿系统结核病。泌尿系统中最常见，最先发生结核病的器官是肾，泌尿系统结核最主要是肾结核，一般都继发于其他部位的结核病灶，绝大多数继发于肺结核血行播散，或来自骨关节结核，肠结核播散。肾结核如未得到及时诊断和治疗，肾内干酪性坏死物或含结核分枝杆菌的尿液下行向输尿管，膀胱及尿道播散，形成输尿管结核，膀胱结核及尿道结核甚至波及男性生殖系统[1]。泌尿系统结核的早期诊断至今是未解决的难题。严重影响患者的预后。尿沉渣找抗酸杆菌是发现泌尿系统结核病的重要手段，但不能作为诊断肾结核的唯一依据，因包皮垢杆菌，枯草杆菌也是抗酸杆菌，易和结核分枝杆菌混淆，造成假阳性。而且由于结核菌的遗传特性决定结核菌的生长周期长，致使常规检查细菌学方法存在着灵敏度低、操作复杂、需时较长和影响因素较多、不易标准化等特点。PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种酶促化学反应，可以在试管里将待测的目的基因在很短的时问内扩增几十万倍乃至上百万倍，大大提高了基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度[2]。

荧光定量PCR技术具有较高的敏感性和特异性的特点。尿标本简单易取，取样不会给患者带来痛苦和增加感染机会，较x线检查诊断肾结核有早期诊断的优势。由此可见，荧光PCR技术检测尿中结桉杆菌对临床肾结核及泌尿系结核的诊断且有无可代替的重要作用。由于PCR方法敏感性高，有假阳性的可能，因此要特别注意标本之间的污染，所用的用具应使用一次性无菌容器。而且尿标本必须采集24h尿，否则取样太少可影响尿中结核菌漏掉。标本的前处理也很重要需严格掌握实验条件，破壁不完全和DNA链被破坏均可造成假阴性[3]。

本实验中40例肾结核病人尿标本31例检测阳性，阳性率77.5%，非结核泌尿系统感染病人尿标本40例均阴性。检测结果与尿涂片检抗酸杆菌阳性率有明显差异，本组确认的31例病人均多次做涂片抗酸菌检测，仅6人出现阳性，阳性率%，由此看出荧光PCR技术检测尿中结核杆菌适用于临床肾结核及泌系系结核的检测，有助于早期诊断，具有不可代替的重要作用。

参考文献：

[1] 唐神结 高文.临床结核病学.北京：人民卫生出版社，2011：457

[2] 辛茶香，刘珍琼，熊国亮.荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌DNA的应用价值.国际检验医学杂志。2007。28（3）：196-201

PCR检测法 篇12

1 资料与方法

1.1 一般资料

择取常州第一人民医院接受检测治疗的50例心血管内科急性心肌梗塞患者作为观察组, 其中26例男性患者, 24例女性患者。年龄范围36~85岁, 平均年龄 (61.02±6.63) 岁。并抽取同期在该院体检的20例健康者作为对照组, 其中男性11例, 女性9例。年龄范围35~83岁, 平均年龄 (58.85±7.74) 岁。两组研究对象之间的一般资料差异无统计学意义 (P>0.05) , 试验可比性突出。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测方法检测肠道病毒核糖核酸

肠道病毒RNA提取—取血清的样本100μL, 在血清中加入GITC变性液220μL, 加入氯放与异戍醇的按照49:1进行混合的液体50μL, 加入p H值为4.0的Na Ac30μL, 水饱和酚150μL, 将这些液体混合之后进行剧烈的振荡, 然后在-20℃的温度直线冷却10 min, 之后再进行5 min (13000 r/min) 的离心运动, 取出其中200μL的液体, 在其中加入200μL的异丙醇, 之后将新得到的液体在-20℃的环境之下静置1 h, 再次进行10 min (13000 r/min) 的离心运动, 除去上部分的清液, 将剩余部分利用乙醇进行洗涤沉淀之后自然挥发或者烘干之后放置备用[2]。

PCR方法检测肠道病毒RNA———PCR的成分与比例为双蒸水14.3μL、10 X Buffer 2μL、10 mmol Mg Cl23μL, 15 mmol d NTP4μL, 引物Q1 0.5μL, Q2 0.5μL, Taq酶0.3μL, 逆转录酶AMV0.3μL;42℃恒温水浴逆转录30 min之后就能够实现RNA的扩增。扩增的程序为95℃变性进行5 min, 60℃复性30 s, 70℃延伸90 s, 实现35个循环之后在进行70℃的延伸5 min。将扩增的产物取出5μL之后加入酚蓝显示剂, 之后将混合物点样在3%琼脂糖凝胶省, 经过30 min 100V的电泳之后在紫外线之下观测结果[3]。

1.2.2 病毒分离与鉴定

利用常规的病毒分离与鉴定的方法对病人血清中的病毒进行分离, 该种方法利用的是Hep-2细胞。当病人的血清出现细胞病变时, 利用肠道病毒组合血清与Coxb V单价血清对其进行鉴定。这种病毒分离与鉴定的方法能够对血清与Cox B V1-6型毒株进行诊断。

1.2.3 Cox B V中和抗体检测

分步取患者在入院初与出院前采集的两次血清, 通过自身分离病毒或者Cox B V1-6型作为抗原进行检测[4]。血清需要经过1:10稀释, 稀释之后的血清要在55℃的环境之下进行30 min的灭活, 之后经稀释的比例增加到1:320, 将再次稀释后的血清与100 TCID50病毒进行等量的混合, 将混合液置于35℃的环境之下进行1 h的结合, 之后进行细胞接种, 将细胞与病毒进行对照, 终点为病毒被完全抑制、细胞病变终止。以阳性为标准进行判定, 双份的血清抗体滴度升高的幅度大于4倍, 单份血清与正常人的血清抗体滴度的比例大于1:80。

1.2.4 ELISA检测方法

取患者的血清样本, 将血清在56℃的环境下进行30 min的灭活, 然后在血清中以此加入酶结合物与底物, 之后振荡1 min进行混合, 将混合液进行倍比稀释 (1:2~1:4000) , 之后将稀释液放置在96孔微量培养板中为生长液, 每一个稀释度放置4个复孔。在复孔中加入50μL病毒液, 混合均匀之后在温度为37℃、还有2%二氧化碳的培养箱中进行培养。对培养箱中的情况观测5 d, 之后用Reed-Muench方法进行结果的计算[5]。

Reed-Muench法:观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数, 按以下公式计算出该病毒液的TCID50。

log TCID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数距离比例= (高于50%的百分数-50%) / (高于50%的百分数-低于50%的百分数) 。

1.3 统计方法

选用统计学软件SPSS13.0对试验数据实施系统化处理, 运用χ2对试验所得计数数据进行检验。当对比差异P<0.05时, 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR检测方法与病毒分离检测方法

50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例, 检出率为40%;病毒分离法分离出病毒4株, 检出率为8%, 其中Cox B 1型为1株、4型为2株、埃可病毒15型为1株。在PCR检测方法检测的20例阳性中, 分离病毒检测出其中阴性的12例, 两者共同检测为阳性的4例, 两者共同检测为阴性的为34例, 总符合率为81.9% (见表1) 。两种方法对比之后差别非常显著, 差异χ2=8.748, P<0.05, 有统计学意义。对照组中的20例, 病毒分离没有分离出病毒, PCR检测方法检测出阳性1例, 误差率为2%。

2.2 ELISA检测方法与中和Cox B V中和抗体检测方法

50例患者中用ELISA方法检测阳性为12例, 阳性率为24%;Cox B V中和抗体检测出阳性为10例, 阳性率为20%;两种方法检测都为阳性的共10例。ELISA检测为阳性的12例中, Cox B V中和抗体检测方法检测为阴性的共2例, 两种方法都为阴性的35例, 总符合率为96.8%, 两种方面差异无统计学意义 (χ2=0.149, P>0.05) 。见表2。

3.4对比结果

通过上述的实验结果表明, PCR能够更加快速、特异与可靠的进行诊断, 在当天就能够得到检测结果。在50例患者中阳性20例 (40%) , 而病毒分离仅仅4例 (8%) 。在病毒分离阳性的4例中, PCR阳性4例, 此外的16例PCR阳性病例病毒分离全部为阴性, 因此PCR的敏感度较高, 差异有统计学意义 (χ2=8.748, P<0.05) 。

3讨论

PCR是体外DNA或RNA扩增的方法, 这种扩增具有选择性[7]。通过对特定的微生物物种的特异性基因区域进行体外扩增, 然后通过一定的DNA分析技术确定微生物的种类与含量。PCR反应主要包括三个阶段:对目标DNA系列进行加热变性;引物退火复性;在聚合酶作用之下DNA进行引物延伸。PCR检测方法特异性高, 能够在较高的温度之下进行连续反应;敏感度高能够将微量的把DNA进行百万倍以上的扩增, 能够满足检测分析所需要的DNA数量;反应速度快, PCR能够在2 h内完成30次左右的循环扩增;可扩增RNA或c DNA, 能够利用寡脱氧胸昔引物和逆转录酶将m RNA转变成单链c DNA, 再将单链c DNA进行扩增, 在m RNA很少的情况之下也能够进行序列分析。通用引物PCR特点为使用一对引物对多个模板进行同时扩增, 但扩增产物大小相同, 难以区分。多重PCR采用多对引物对多个模板同时扩增, 按照产物片段不同长度进行鉴别, 但是引物多, 结果会产生一定差异。该研究肠道病毒检测中将二者结合, 取长补短。

袁长青[7]等人研究发现, PCR检测方法是利用肠道病毒的特异性引物检测标本中和肠道病毒RNA同源的基因序列, 将其作为判断结果的依据。对DNA进行重复的扩增之后检测方面的灵敏度能够增加大10-5~10-6μg。该研究结果显示, 50例患者中通过PCR检测方法检测出EV-RNA阳性的为20例, 检出率为40%, 这说明PCR检测方法具有特异性高、敏感度高、速度较快, 能够更加快速、特异与可靠的进行诊断。

朱坤[8]等人指出, 在肠道病毒的PCR检测过程中也会出现一些问题。主要包含:假阳性问题, 是指不应该出现阳性结果时出现了阳性结果;假阴性问题, 是指在应该出现阳性结果的时候并没有出现阳性结果。该研究结果显示, 在PCR检测方法检测的20例阳性中, 分离病毒检测出其中阴性的12例, 两者共同检测为阳性的4例, 两者共同检测为阴性的为34例, 总符合率为81.9%。由此可见, PCR技术灵敏度、特异性等方面有了较大的发展, 而且已经在分子生物学等学科中得到了广泛的使用, 有着不可比拟的优越性。虽然在某些方面依旧存在着一些局限性, 但是随着PCR技术与其他各项技术的不断发展, 将能够弥补这些缺陷, 成为生物技术发展领域的趋势所在。

参考文献

[1]张崇森, 刘永军, 王晓昌.环境水体中肠道病毒的膜吸附一洗脱浓缩方法的研究[J].环境科学, 2007, 28 (7) :1543-1547.

[2]费选文, 林祥伟, 谢若男.应用4种方法检测肠道病毒的结果分析[J].海峡预防医学杂志, 2009, 9 (1) :45-46.

[3]裘湛, 闻岳, 黄翔峰.Pc R-DGGE技术在水解酸化缺氧法处理采油废水的微生物研究中的应用[J].环境污染与防治, 2006, 28 (6) :439-442.

[4]吴小兵, 董小岩, 伍志坚.一种快速高效分离腺病毒伴随病毒的方法[J].科学通报, 2010, 45 (19) :2071-2075.

[5]沈晓丽.点免疫结合试验测定柯萨奇病毒B组抗体在临床的应用[J].中华心血管杂志, 2011, 20 (2) :1129-1134.

[6]牛玉宏, 杨英珍, 虞勇.肠道病毒基因实时定量RT-c R方法的建立[J].复旦学报 (医学科学版) , 2001, 28 (6) :542-544.

[7]袁长青, 叶建锋, 李君文.改进的PCR技术快速检测水中肠道病毒的研究[J].中国卫生检验杂志, 2011, 12 (4) :132-133.