高效毛细管电泳检测法（精选6篇）
高效毛细管电泳检测法 篇1
微流控芯片 (Lab- on- a- chip) , 又称微全分析系统、芯片实验室, 由Manz等在20世纪90年代最早提出。因其特有的分析速度快、试剂消耗少、成本低廉、集成化程度高、易于便携化及可抛弃式等优势, 得到了快速的发展。随着实践的深入进行, 尤其是为满足环境监测、食品安全检查和临床分析中对实时实地在线检测的要求, 微流控芯片实验室正在向微型化、集成化、便携化、自动化的方向迈进。
在与微流控芯片结合的方法中, 毛细管电泳是最常用和最适宜的分离技术之一。其采用电动进样方式, 避免了外部庞大的注射泵、阀的使用。而且, 分离效率受分离通道长度的限制较小, 有利于微型化、集成化、自动化分离检测设备的构建, 已经在微芯片上得到了良好的体现。
随着微芯片电泳的持续深入发展, 对其相适宜的微型化检测器的开发也倍受关注。检测器是开发集成化分离检测设备的重要组成部分, 且在微流控分析系统中其性能直接决定检测的灵敏度和应用范围, 以及检测装置的集成化和微型化程度。因而, 有关检测方法和检测器的研究是微流控芯片分析研究中一项重要任务。目前, 与微芯片电泳结合应用的检测器有光学检测器、质谱检测器和电化学检测器。但最适合集成化和小型化的是电化学检测器, 尤其是其中的电导检测器, 具有更好的通用性、便携性及成本低廉等特点。
电导检测 (conductometric detection) 的原理是基于分析物和背景缓冲溶液之间电导率的差别, 通过连续测量流经两电极之间电流的变化实现定量检测。理论上, 是一种简单和通用型的检测器, 适用于所有离子型组分特别是无机离子、氨基酸等小分子离子。成本低, 便于微型化和集成化, 具有广泛的应用潜力。按照检测电极与溶液接触与否, 分为接触式电导检测和非接触式电导检测。
一、接触式电导检测
在接触式电导检测中, 检测电极与芯片通道中的溶液直接接触, 容易造成电极中毒和腐蚀, 且在电极上易产生气泡。检测电流易受到高压电场的干扰, 造成灵敏度下降。同时, 检测器线路需要复杂和精密的保护, 以防止高压电场的损坏, 增加了制作工艺和成本。
二、非接触式电导检测
在非接触式电导检测中, 电极不与溶液直接接触, 而是在交流激发电压下与通道中的溶液耦合。相比接触式, 具有以下优势:1) 避免了电极中毒和气泡产生, 可使用的电极材料广泛;2) 检测器线路简单, 易于集成化;3) 可有效避免高压电场的干扰, 大大降低背景噪音, 提高检测灵敏度;4) 微电极制作技术繁荣发展, 可有效降低芯片制作成本, 利于便携式电导仪的开发。
(一) 原理
1998年Ze m ann等将电极轴向排列的结构引入毛细管电泳, 大大简化了电极和检测器线路的制作过程, 成为最常用的电极结构。此结构中, 电极在毛细管通道外, 不与溶液接触, 高频激发信号传送到电极上, 穿透绝缘层 (毛细管壁) 进入溶液, 在溶液中形成交流电流, 从另一电极输出通道中电流信号的变化。该变化传入信号处理电路, 最终经接收放大器转换后, 仍以电压形式输出。这一原理同样适用于芯片毛细管电泳。但是, 这两个电极之间也通过空气直接耦合, 称为泄漏电容, 会造成较强的背景干扰信号, 导致信噪比降低, 检测限下降。为避免泄漏电容的存在, 研究者们设想在两个电极之间进行法拉第屏蔽, 加入一个接地电极[3]。屏蔽后, 可有效隔离两个电极之间的耦合, 使其在毛细管内通过溶液电阻进行耦合。从而减小背景噪音, 提高检测。被广泛应用于最近几年的检测池结构。
(二) 影响因素
1.激发频率和激发电压
激发频率和激发电压是优化非接触式电导检测器性能的两个关键参数。激发频率对检测池的阻抗具有反作用, 对非接触式电导检测器的性能具有决定性影响。可以使用波德图对电极的工作频率进行优化。在不存在泄漏电容时, 输出电压随着激发频率的增加而增加, 达到最大值后进入平台期。理论上, 平台期内的任一频率都可以作为最佳频率, 且不会造成检测器的灵敏度下降。但是, 在实际检测池中, 增加激发频率在减少电极和溶液间的阻抗的同时, 也会减少泄漏电容的阻抗, 从而增加泄漏电容, 造成背景噪音增加。所以, 需要在综合考察激发频率对输出信号和噪音的影响后, 选择信噪比最佳的频率值。
2.绝缘层厚度
非接触电导法采用在电极和溶液之间加入薄的绝缘层, 使待测溶液与电极相互隔绝。研究表明, 绝缘层在保证绝缘效果的前提下, 其厚度越薄, 则容抗越小, 对电导检测的干扰也越小, 有利于提高检测的灵敏度。
3.电极间距
式中G为检测池的电导;A为电极截面积;l为电极之间的距离;κ为缓冲溶液的既定电导率。对于给定的检测对象, 要想提高溶液的电导以增加电导检测器的灵敏度, 可以增加电极截面积或减小电极之间的距离, 以增加响应电导信号的溶液体积。
此外, 在进行微芯片电泳分离时, 缓冲溶液浓度、分离电压、进样时间等分离参数对C4D的灵敏度也有重要影响, 是其性能优化时必须考虑的因素。
(三) 电极材料
作为微芯片电泳非接触式电导检测器的关键元件, MCE- CCD的广泛应用很大程度上得益于其微电极制作材料和制作技术的不断发展。以下综述近年来常用的电极材料。
(四) 金属
1.铂
铂, 是一种热电稳定性强的导电金属材料, 几乎全部来源于自然界。其作为高压输出电极和非接触式检测器电极材料广泛用于芯片毛细管电泳中。Lichtenberg等将两个铂电极置于已刻蚀的平行玻璃凹槽中, 两电极与微通道网络位于同一平面且垂直于微分离通道。可使交流激发信号垂直作用于电流方向, 保证固定的检测体积, 有效避免芯片上泄漏电容的产生。Liu等采用剥离工艺依次把一层厚20~30nm的钛粘附层和一层80~100 nm的铂层溅射在PMMA表面, 制作三层PM-MA芯片, 成功解决了将电极和绝缘层结合的困难。C. Huck等在Si O2上刻蚀出凹槽, 将钛 - 铂层通过电子束蒸发的方式沉积在槽中, 制作铂电极, 并用约120nm厚的Ba0.25Sr0.75Ti O3层覆盖电极, 以隔绝电极和溶液的直接接触。但是铂的价格较高, 增加检测器制作成本。
2.铝
铝因其轻、良好的导电性能及低廉的价格成为实际应用最为广泛的有色金属。Coltro等将一层厚100nm的铝层溅射在聚酯薄膜上制作固定电极, 并与聚酯增色剂 (polyester- toner) 微通道盖板结合, 制作PT芯片。简化了装置, 实现快速检测和良好的重现性。铝箔是一种用金属铝直接压延成薄片的烫印材料。因其廉价、一次性可抛弃式、柔软等优点, 适于微型化和便携式微流控分析系统的制作。Pumera等将铝箔剪成0.8mm×10mm大小的矩形作为电极, 使用环氧树脂直接固定在PMMA盖板 (125μm) 上, 有利于方便放置检测器的位置, 制作了廉价、高效、便携式的微芯片系统。继而, Wang等将该系统用于化学战剂降解产物的筛选和监测。在2003年, 该团队又对检测电极进行优化, 使其可以沿分离通道任意滑动, 成功设计制作了可携带式微流控芯片非接触式电导检测仪, 可通过移动电导检测器来获知分离路径不同位置的分离状态。
3.铜
铜是与人类关系非常密切的有色金属, 被广泛地应用于电气、轻工、机械制造、建筑工业、国防工业等领域。Tanyanyiwa等最早采用外部电极代替芯片结合电极, 使用两个厚50μm、宽2mm的铜片作为检测电极, 实现对离子化合物的检测。继而将此系统用于检测未衍生化的阴离子磺酸盐、羧化物、氨基酸、糖、人工增甜剂和多巴胺阳离子、麻黄碱、3- 甲氧基肾上腺素。Chen等同样用铜制作独立的外部电极, 与玻璃微芯片构成微分析系统。
随着非接触式电导检测的深入发展, 研究者们对简化操作工艺和提高检测灵敏度的要求愈发迫切。镀铜的印刷线路板是一种商业化产品, 是以绝缘材料为基材, 其上附有导电图形, 能够满足需求, 且已实现对饮料、酒和生化物质的分析。Guijt等以PCB上的镀铜制作检测电极, 并使用干膜光刻胶层压, 达到制作平整、光滑的电极的要求。
4.熔融金属
可注射的熔融金属具有低熔点、易于操控等特点, 用于制作检测电极, 可简化操作, 消除电极与芯片结合的困难。Thredgold等将熔融镓注射进入与微通道同时制作的电极通道, 实现了对钾、钠、锂的良好分离。但是注射金属通常都具有一定的毒性, 不利于商业化生产。
(五) 聚乙烯苯胺
聚乙烯苯胺具有高电导性、稳定、易制备和价格可接受, 以及与闪光焊技术结合可一步制作电极的优点, 使其成为LOC设备中受欢迎的材料。Henderson等[16]通过激光焊接法在聚乙烯苯胺膜上制作电极, 并成功与PDMS芯片结合, 用于微芯片非接触式电导检测, 创造了每个电极板0.07欧元的成本优势。
(六) 氧化铟锡
氧化铟锡主要的特性是其电学传导和光学透明的组合, 在高压电场中具有良好的耐受性和稳定性。Chen等利用丝网印刷技术和化学刻蚀技术在氧化铟锡导电玻璃上制作非接触式检测电极, 后与玻璃微通道结合, 实现对感冒药中氨基比林和咖啡因的定量检测。
三、应用
随着微芯片电泳非接触式电导检测持续深入发展, 其应用也越来越受到人们的关注。最有代表性的是在生物化学方面的应用。该方法已成功用于酶反应和免疫分析的小有机离子的检测。在药学分析领域, 主要用于手性分离、主要成分分析和纯度测定。在环境监测方面, 非接触式电导检测方法以其特有的优势对无机阳离子实现高灵敏响应。此外, 该方法在食品分析、临床诊断等方面的也具有广泛的应用。
高效毛细管电泳检测法 篇2
谷胱甘肽是生物体内重要的活性物质,具有抗自由基、抗氧化作用.谷胱甘肽有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式,在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数.
作 者：赵晓寅 孙彦 周天舒 施国跃 作者单位：北京师范大学化学学院,北京,100875 刊 名：分析化学 ISTIC SCI PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY 年，卷(期)：2009 37(z1) 分类号：O65 关键词：★ 注射用清开灵说明书
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高效毛细管电泳检测法 篇3
1 技术介绍
1.1 基本原理
毛细管电泳 (CE) 又称高效毛细管电泳 (HPEC) , 指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之问淌度和分配行为上的差异而实现的一类液相分离技术。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。C E所用的石英毛细管柱, 在p H>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流 (EOF) 两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出;中性粒子的电泳流速度为“零”, 故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都太于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
1.2 分离模式
CE有8种分离模式, 分别为:毛细管区带电泳 (CZE) 、毛细管凝胶电泳 (CGE) 、胶束电动毛细管色谱 (MECC, MEKC) 、毛细管等电聚焦 (CIEF) , 毛细管等速电泳 (CITP) 、毛细管电渗色谱 (CEC) 、非水毛细管电泳 (NACE) 、胶束电动毛细管色谱。
2 HPCE在药物分析中的应用
药物是指能影响机体生理、生化和病理过程, 用以预防、诊断、治疗疾病和计划生育的化学物质, 在人们的日常生活中是不可或缺的, 其质量的高低直接关系到人们的健康和生命安全, 所以需要一个全面、合理、科学、安全有效的质量监测方法来给大家提供一个安全的用药环境。近年来国内外大量的科学家投入到这项工作中, 药物分析分离的研究工作十分活跃。
中药的成分非常复杂, 一般含有糖类、油脂、维生素、蛋白质、有机酸、氨基酸、无机盐、鞣质、生物碱、挥发油等等。目前, 主要分析生物碱类、苷类、有机酸类、香豆素类、酚酸类成分。
2.1 生物碱类
生物碱为一类含氮的有机化合物, 是中草药中一类分布较广的化学成分, 存在于自然界 (一般指植物, 但有的也存在于动物) 。已知的生物碱种类已超过3000种, 由于其的碱性, 即存在-N-基, 可调节溶液的p H值, 使其带有一定的正电荷, 可采用毛细管区带电泳 (CZE) 模式分析[2]。有时可以使用不同的缓冲溶液及不同的p H值或加入适当的有机改性剂, 使结构相近的同类生物碱达到分离的目的。
王峻梅等[3]以1m mol/LHAc+2 m
mol/LSD缓冲液为电泳介质, 分离电压14.0KV, 用高频电导法实现了对千金藤属植物粉防己中粉防己碱和去甲粉防己碱两种生物碱的测定。陈康等[4]对10个不同产地麻黄样品中麻黄碱和伪麻黄碱进行定量分析, 得出结论为不同产地的麻黄生物碱含量各不相同, 且相互间具有良好的精密度和线性关系。
郑一宁等[5]摘要采用高技毛细管电泳电导检测法分离麻黄碱和伪麻黄碱。初步探讨了分离机理, 建立了检测方法。以柠檬酸一柠檬酸钠为缓冲体系, 铜盐为络合剂, 在p H值为4.5、电压13.5 k V的条件下, 盐酸麻黄碱和伪麻黄碱得到了较好的分离, 加入适量乙醇可改善峰形和分离效果。用该法以水扬酰胺为内标, 对古盐酸麻黄碱和伪麻黄碱的实际样品进行检测, 回收率97.3%~101.1%。
2.2 有机酸类
有机酸成分解离后带负电荷, 可以CZE模式分析, 但在中性成分后出峰, 分析时间较长。采用高效CZE模式, 样品和标准品在20 min内得到基线分离。陈帆等对药用海藻羊栖菜中的氨基酸进行分离测定, 用高离子强度Tris硼酸缓冲溶液在优化条件下对l8种常用的氨基酸进行分离可得到l7个峰 (其中亮氨酸和异亮氨酸为1个色谱峰) 。Cao等以CZE-E法分析了满山红中原儿茶酸、丁香酸、香草酸等有机酸的含量。
2.3 苷类
苷类又称配糖体。是糖或糖的衍生物与另一类非糖物质通过糖的端基碳原子连接而成的一类化合物。刘峻等采用胶束电动毛细管电泳法对不同来源得黄花倒水莲提取物中皂昔的含量进行了测定, 在内可以完成样品中皂昔的含量测定。陈缵光等采用毛细管电泳安培法测定鸡矢藤中熊果苷的含量。Cao Yau将毛细管电泳一电化学法检测器成功成应用于中药大麻的分析中, 测定大麻中种活性成分和种碳水化合物。
3 前景
高效毛细管电泳HPCE已应用到分析、分离的各个方面, 且具有高灵敏度、高速、样品耗用量少、重现性好、自动化等优点, 随着商品化仪器的不断改进, 必将在分析领域得到更为广泛的应用。
参考文献
[1]罗国安, 王义明.毛细管电泳的原理及应用.色谱, 1995, 13 (4) :254.
[2]Liu Y M, Shen S J.J.Chromatogr.A, 1993, 634;329-333
[3]王峻梅.毛细管电泳高频电导法测定粉防己药材中的生物碱[J].分析试验室, 2004, 23 (12) :12.
[4]陈康, 林文津, 林励.HPCE法测定不同产地麻黄中麻黄碱和伪麻黄碱的含量[J].中材, 2005, 28 (8) :664.
高效毛细管电泳检测法 篇4
关键词：荆半夏,指纹图谱,高效毛细管电泳
半夏为天南星科多年生草本植物, 半夏Pinellia temata (Thunb.) Breit的干燥块茎, 具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效[1]。
1 材料与仪器
Waters高效毛细管电泳仪, Millennium 32色谱工作站, 石英毛细管 (75μm×60cm, Waters公司) , 超纯水器 (Mill-Qplus USA) , SK5200LH型超声波仪 (上海科导超声仪器有限公司) , TGL-16B离心机 (上海安亭科学仪器厂) 。苯甲酸, 分析纯 (标示纯度为99.5%) , 武汉有机化工厂, 批号20040212。荆半夏药材为野生品, 采自湖北省荆门市京山汤堰并经鉴定为正品。硼砂、氢氧化钠、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸等均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品的制备
取荆半夏适量, 于40℃烘干8h, 粉碎, 过100目筛。精密称取生药粉末2g, 用95%乙醇渗漉, 收集渗漉液100mL, 回收乙醇, 浓缩物混悬于10mL水中, 置分液漏斗中, 用乙酸乙酯萃取3次, 每次15mL, 合并乙酸乙酯液。减压回收乙酸乙酯至干, 残渣用甲醇溶解并定容至10mL, 以0.45μm滤膜过滤。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取苯甲酸对照品5mg, 用甲醇溶解并定容至25mL, 然后精密量取0.5、1、2、3、4、5mL分别置10mL容量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 即得。
2.3 测定方法的建立
综合考虑介质、检测波长、运行电压、温度、进样量等实验条件, 以出峰多、分离度好并确保主要化学成分在指纹图谱中出现为标准, 确定CE条件如下:分离电压为20kV, 极性为正极到负极;重力进样, 时间5s;检测波长220nm;运行缓冲液为20mmol/L硼砂溶液 (四硼酸钠1.907g于25℃时溶于水并定容至250mL即得) , pH=9.18, 25℃时以pH计测定。每次进样前, 均用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗1min, 纯水冲洗2min, 最后用运行缓冲液冲洗毛细管柱3min, 每次分析后用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗10 min, 水冲洗10min。所用溶液均经0.45μm纤维树脂膜过滤。在上述分离条件下, 半夏中苯甲酸的迁移时间约为4.3min, 与其它成分分离较好 (图1, 2) 。
2.4 精密度试验
取40μg/mL的苯甲酸对照品溶液按2.3项下所述电泳条件连续进样5次, 分别计算苯甲酸的峰面积, RSD为0.92%, 表明仪器精密度良好。
2.5 线性关系考察
分别取10、20、40、60、80、100μg/mL的苯甲酸对照品溶液, 按2.3项下所述电泳条件分别进样, 以苯甲酸浓度 (μg/mL) 为横坐标, 苯甲酸的峰面积为纵坐标, 回归得方程:Y=1003.54X-331.62, r=0.9991。表明在10～100μg/mL范围内线性关系良好。
2.6 重现性试验
精密称取同一批半夏样品粉末2g共5份, 按2.3项下所述电泳条件进样分析, 计算峰面积, 得苯甲酸的平均含量为0.42mg/g, RSD为2.0%, 表明该法重现性好。
2.7 稳定性实验
取半夏样品溶液, 分别在0、2、4、6、8、10 h进样, 测定苯甲酸峰面积, 结果RSD=1.2% (n=6) 。
2.8 加样回收率试验
取已测苯甲酸含量的半夏样品9份, 分别加入苯甲酸对照品50、100、200μg, 按2.2.1项方法制成溶液, 测定其回收率 (n=3) , 结果平均回收率分别为94.6%、97.9%、96.9%;RSD分别为2.2%、1.8%、1.7%。
2.8 样品测定
将半夏药材按溶液制备项下处理后, 按2.3项下所述电泳条件进样分析, 3批半夏药材中苯甲酸含量分别为0.43mg/g、0.42mg/g、0.41mg/g。
3 结语
本文用毛细管区带电泳法测定了荆半夏药材中苯甲酸的含量。考察了电泳分离的条件, 得出了最佳电泳分离条件, 并对样品分析的回收率和精密度进行了测定, 建立了HPCE以苯甲酸为对照品的指纹图谱, 表明在4.3 m i n时分离较好。本实验应用H P C E对在中医药临床中常用的半夏进行分析, 方法学考察下的各项结果就完全可以达到指纹图谱测定的要求, 为此种药物研发提供一定的标准。
参考文献
高效毛细管电泳检测法 篇5
1资料与方法
1.1一般资料
正常组、变异体组、缺铁性贫血组分别选取10名正常人(无糖尿病、贫血等疾病的健康人)、血红蛋白变异体患者、缺铁性贫血患者,静脉采全血6 m L,平均分为两份,加入抗凝剂EDTA,制成血液样本,于4°C环境下保存。见表1。
1.2对象的纳入标准
血红蛋白变异体组病例纳入标准:临床检查中Hb A1c结果与血糖结果不符,经血红蛋白电泳检测后确认存在血红蛋白变异体的病例。缺铁性贫血组病例纳入标准:根据临床血液学依据[2]。正常组纳入标准:经全面检查后,排除糖尿病,贫血等的健康人。
1.3仪器和试剂
毛细管蛋白电泳仪和伯乐D10糖化血红蛋白分析仪,及其各自配套试剂。
1.4原理
毛细管电泳法原理:在碱性缓冲液及高电压环境下,由于血红蛋白不同组分所携带电荷数差异的存在,在电场力的作用下其泳动速率也存在差异,因而可以完成不同组分的分离,并予以测定[3]。伯乐D10糖化血红蛋白分析仪原理:采用高效液相色谱法(HPLC)检测全血糖化血红蛋白,由于糖化后的血红蛋白所带电荷数的差异,测量其在波长为440 nm时的吸收情况,通过软件进行测定和计算,从而完成糖化血红蛋白的测定[4]。
1.5方法
1无干扰因素的情况下两种方法的比较:取正常组样本分为两组,分别用毛细管电泳法和伯乐D10糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白,记录其结果,并进行两独立样本的t检验,分析两种方法测得的糖化血红蛋白含量。2糖化血红蛋白变异体对两种方法的影响选取变异组的样本血,分为两组,分别编号。分别采用上述两种检测方法对两组样本血进行糖化血红蛋白的检测,记录其数据,进行统计学分析。将样本委托上海伯豪生物科技有限公司进行血红蛋白基因测序,得出变异体类型。3缺铁性贫血对两种方法的影响选取缺铁性贫血组的样本血,分为两组,并予以编号。采用上述两种检测方法对两组样本进行检测,并进行血清学检查,记录数据
1.6统计方法
采用软件SPSS 17.0进行统计学处理,计量资料用平均数±标准差(±s)表示,P<0.01为差异有统计学意义。
2结果
2.1无干扰因素的情况下两种方法的比较结果
经两独立样本t检验得P>0.05,t<2.101,认为两种检测方法在无干扰因素情况下测得糖化血红蛋白含量差异无统计学意义,二者相关性良好,见表2。
2.2两种检测方法的检测结果
伯乐A10糖化血红蛋白分析仪测得的Hb A1c结果与实际血糖值不符,而毛细管电泳法测得结果与血糖值基本一致。变异体类型主要为Hb E、Hb J-Bangkok、Hb New York、Hb G-Taipei和Hb F,见表3。
2.3缺铁性贫血对两种检测方法的影响
缺铁性贫血对两种检测方法的影响见表4、表5。3讨论
糖化血红蛋白是糖基化的血红蛋白,因其生成量取决于血糖浓度,与进食等因素无关,故临床上通过测定糖化血红蛋白的含量可以诊断患者是否患有糖尿病以及反映糖尿病治疗情况和预后。糖化血红蛋白测定是指测定糖化了的血红蛋白占总的血红蛋白的比例,正常人糖血红蛋白约占4%~6%,>6.5%基本可以确定为糖尿病患者,因为较血糖检测稳定,故糖化血红蛋白检测在临床具有重要的意义。检测糖化血红蛋白的方法有很多,如高效液相色谱法,免疫层析法、电泳法等,高效液相色谱法是目前最经典的检测方法之一。该次研究用毛细管电泳法与伯乐D10糖化血红蛋白分析仪(其原理为高效液相色谱法)做对比,比较二者相关性以及得出毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的优势变异体组的有关结果显示,毛细管电泳法的检测结果与实际血糖结果一致,而伯乐D10糖化血红蛋白分析仪的结果不一致。故在变异体存在的情况下,毛细管电泳法的优势性显而易见,这与某研究表明的电泳法可以分离绝大部分血红蛋白变异体相一致[5];而伯乐D10糖化血红蛋白分析仪不能提示血红蛋白变异体,其检测结果的准确性完全取决于变异体糖化率和正常血红蛋白糖化率的一致性。而后者结果的偏差很容易造成临床上的误诊。缺铁性贫血(IDA)的血清学检查结果显示,空腹血糖无明显差异,缺铁性贫血组血清铁含量明显减少,总铁结合力明显增加,糖化血红蛋白含量增加,IDA使得Hb A1c检测结果高于正常值,经补铁治疗后,结果均下降。但伯乐D10检测仪仅可显示糖化值的变化,无法确定是否有缺铁性贫血病史;毛细管电泳仪可得出Hb A2值,目前Hb A2的临界值为2.25%,可以根据其结果对IDA进行筛查。并且,在进行糖化血红蛋白的检测过程中,毛细管电泳法对环境条件、温湿度、p H的要求均低于伯乐D10糖化血红蛋白分析仪。且操作性更强,可重复操作,样本用量较小。
综上所述,毛细管电泳法具有精确性高,操作性强,受干扰因素少的优势,更加符合现代医疗的要求。与伯乐D10糖化血红蛋白分析仪相比,毛细管电泳法在缺铁性贫血或糖化血红蛋白变异等存在的情况下,对诊断更加具有参考价值,可以提示变异体存在与否以及其类型,提示是否有缺铁性贫血的发生,诊断准确性更高,更具有临床参考价值,建议在临床中推广使用,以提高糖化血红蛋白的检测效率与精确度,减少误诊的可能性。
参考文献
[1]王宏平.糖化血红蛋白的检测意义[J].中国实用医药,2007,2(6):10-11.
[2]邓家栋.临床血液学[M].上海:上海科学技术出版社,2001:23-86.
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[4]杨兴萍.美国伯乐D-10糖化血红蛋白分析仪的性能评价[J].检验医学与临床,2011,8(21):2683-2684.
高效毛细管电泳检测法 篇6
关键词：高效毛细管电泳法,麻保沙星原料药含量,测定方法
临床上应用的麻保沙星为动物专用的一种第3代氟喹诺酮类抗菌药, 该药物的特点为抗菌谱广、抗菌活性强等, 同时该药物还具有较高的生物利用度, 毒性也相对较低, 临床应用较为安全, 被视为动物的一种专用药。现阶段存在诸多采用HPLC法、LC-MS法对麻保沙星进行测定的报道[1]。毛细管电泳为经济、快速、高效的一种分离分析方法, 本次研究中笔者建立一个专属性强、精确高效的毛细管电泳法对麻保沙星原料药含量进行测定的方法, 从而为麻保沙星的质量监控提供依据。
1 材料与结果
1.1 实验仪器与试剂
本次实验所应用的仪器主要包括有:毛细管电泳仪 (购自北京彩陆科学仪器有限公司) , HW-2000型色谱工作站, CL102型紫外检测器以及石英毛细管 (均购自河北永年锐沣色谱器件公司) 。本次实验所用试剂包括有:磷酸二氢钠, 硼酸钠, 磷酸氢二钠以及磷酸, 均为分析纯;实验用水为重蒸水。以上所要应用的所有样品以及缓冲液都利用0.45Lm滤膜进行过滤。麻保沙星样品, 批号为20091013, 2 0 0 9 1 0 1 6, 2 0 0 9 1 0 1 9, 为实验室自制;麻保沙星对照品批号为Y0000820, ID0035Y9, 由欧洲药典委员会提供。
1.2 方法与结果
1.2.1 色谱条件
本次研究中所用毛细管柱为没有涂层的石英毛细管柱, 规格为75µm×70cm, 电泳介质为pH值为9.2, 在使用前首先进行脱气处理。浓度为15mmol/L的硼酸钠缓冲液, 进样方式为高度差法进样10min, 检测波长设定为295nm。所有操作均在室温下进行[2]。
1.2.2 溶液配置
15mmol/L的硼酸钠缓冲液:精密称取2.86g硼酸钠置于500mL的容量瓶中加水溶解并定容, 在0.45µm的滤膜条件下进行虑过处理, 并对滤液进行10min的超声处理。
1g/mL的麻保沙星样品溶液:精密称取10mg的麻保沙星置于10mL的容量瓶中加水溶解并定容, 摇匀后精密量取该溶液分别加水进行稀释, 配制成浓度为10、20、40、60、80、100µg/mL的溶液[3]。
1.2.3 线性范围
将以上所配置的麻保沙星系列浓度的溶液进行进样检测, 并将质量浓度作为横坐标, 以峰面积为纵坐标展开线性回归, 结果发现, 该组浓度溶液得到线性方程为Y=362.81X+159.09, r=0.9997。研究结果显示麻保沙星浓度在10～100µg/m L的浓度范围内存在良好的线性关系。
1.2.4 精密度
在以上实验条件下, 将浓度为80µg/mL的麻保沙星样品溶液进行6次重复实验, 对该方法的精密度进行考察, 结果发现, 该方法得到RSD为1.2, 精密度良好。详见表1。
1.2.5 回收实验
分别精密量取麻保沙星对照品0.64, 0.80, 0.92g, 将其分别配制成浓度为64, 80, 92µg/mL的对照品溶液。将其进样检测, 对其峰面积进行测定, 结果发现, 该组溶液的回收率平均为100.1%, RSD值为0.98%。详见表2。
1.2.6 样品测定
取麻保沙星样品3批, 在选定的电泳条件下对其进行含量测定, 结果见表3。
2 讨论
本次实验中在相同质量浓度下对磷酸盐缓冲液、硼酸钠缓冲液、硼砂-磷酸盐缓冲液这3种缓冲液体系进行了比较, 结果发现硼酸钠缓冲液对麻保沙星的分离相对比较理想, 因此本次实验选择硼酸钠做为毛细管电泳的介质溶液。大多数情况下溶液的pH值的大小会对毛细管表面特性以及柱壁以及溶质的电荷差异产生明显的影响, 改变其彼此间的作用, 从而使分离效果发生变化[4]。本次实验经研究证实将pH值为9.2的硼酸钠溶液作为缓冲液效果十分理想。
在展开毛细管电泳的过程中, 分离电压为对电渗流进行控制的一个十分重要的参数, 同时也是对分离度、分析时间进行控制的一个十分重要的因素[5]。高电压为使快速、高效能够得以实现的前提, 本次实验对10, 15, 20, 25kV的电压展开了对比实验。结果发现, 电压的增大, 会导致出峰的时间发生明显的缩短, 在分离电压>20kV后因焦耳热过大, 导致柱效率明显降低, 峰型变差[6]。因此本次实验中将分离电压控制在20k V, 进样时间为10s。采取毛细管电泳法对麻保沙星进行分析, 缓冲液选择浓度为15mmol/L, p H值为9.2的硼酸钠溶液, 进样时间设定为10s, 分离电压控制在20k V。该条件下麻保沙星迁移时间相对适中, 分离度相对较高, 峰型较为理想, 具有较高的精密度, 并且浓度在10-100Lg/mL之间存在良好的内线性关系, 该方法的回收率也相对较高, 经试验证实在此条件下对麻保沙星的质量分数进行测定结果为99.3%。以上实验结果证实该方法具有柱效率高, 分析时间短, 样品、溶剂用量少, 能够为对麻保沙星进行分析测定提供良好的分析方法。
参考文献
[1]邱银生, 吴佳.动物专用氟喹诺酮类药物研究进展简介[J].中国兽药杂志, 2008, 32 (3) :46-48.
[2]王志强, 陈杖榴.动物专用氟喹诺酮抗菌新药-麻保沙星[J].中兽医医药杂志, 2011, 22 (14) :38-41.
[3]冯利, 庞静秋.高效液相色谱法在药物分析专业的应用[J].黑龙江医药, 2009, 16 (21) :43-44.
[4]李云峰, 曾振灵, 陈杖榴, 等.麻保沙星在猪体内的药物动力学[J].中国兽医学报, 2009, 34 (2) :177-178.
[5]王蕊, 远立国, 朱理想, 等.麻保沙星在番鸭体内的药代动力学研究[J].中国兽医学报, 2010, 40 (21) :89-92.