毛细血管电泳仪

毛细血管电泳仪（精选10篇）

毛细血管电泳仪 篇1

传统的毛细管电泳仪信号采集与处理系统因其体积大、效率低、不具有网络通信功能, 己不能满足向微型化、智能化发展的需要。嵌入式技术和通信技术近年来的迅速发展, 在各行各业得到了广泛的应用。嵌入式设备以其体积小、功耗低、处理能力强等优点, 结合微处理器的系统电路和其专属的软件, 可以提高效率, 降低成本[1,2]。基于ARM的嵌入式数据采集与处理系统具有低成本、低功耗、实时性能好、智能程度高及易于扩展等特点, 在工业测量、控制、医疗等领域具有较为广阔的应用前景, 且便于携带。

本文选用S3C2410嵌入式微处理器和CS8900A为主体的硬件系统架构, 设计出一种基于Linux操作系统毛细管电泳信号采集系统。实现毛细管电泳信号采集、存储、处理及显示的一体化功能。为开发高性能、集成化、便携式的新型微小生化分离分析系统奠定了一定的技术基础。

1 系统硬件设计

1.1 系统组成

本系统以S3C2410微处理器作为硬件核心, 设计了集实时数据采集、存储、处理、在线传输于一体的的硬件电路。硬件电路主要由数据采集模块、数据处理模块、通讯模块等组成。系统架构如图1所示。

系统由信号采集模块、数据处理模块、存储模块、数据传输模块和显示模块等组成。

1.2 信号采集模块

信号采集模块把由光电倍增管 (PMT) 采集的荧光信号, 经放大、滤波处理后, 进行A/D转换, 然后将转换成数字信号, 送入到数据处理模块。

PMT输出的是一个微弱的电泳信号, 其中含有大量噪声, 而且还受到工频、静电和电磁耦合等共模干扰, 因此, 前置放大、滤波电路的精度、稳定度、灵敏度直接决定整个系统的性能指标。本系统选用ICL7650高精度、低温漂运算放大器, 采用正向放大接法, ±5V双电源供电。滤波器选用TI公司推出的TLC04-50巴特沃斯四阶开关电容滤波器, ±5V双电源供电, 采用级联的方法。

A/D转换是数据采集系统的重要部分, 本系统选用18位、串行高速A/D转换器MAX132, 该芯片分辨率高, 在-512-+512 m V范围内可提供2μV的分辨率, 功耗低, 转换速度高, 可达每秒100次, 4线串行接口易于跟其他所有的微处理器进行连接。采用+5V单电源供电, 典型供电电流为60m A, MAX132芯片功耗低, 价格低, 体积小, 特别适用于低功耗、便携式应用场合, 其应用电路如图2所示。

1.3 数据处理模块

数据处理模块选用S3C2410芯片, S3C2410是samsung公司为手持设备设计的基于ARM920T内核, 采用0.18μm制造工艺的32位微控制[3]。该处理器片上资源十分丰富, 拥有:独立的16KB指令和数据Cache, 全性能的MMU, 支持TFT的LCD控制器, NAND闪存控制器, 3路UART、4路DMA、和4个带PWM的时钟, I/O口, RTC, 8路10位ADC, 触摸屏接口, IIC-BUS接口, I-IS-BUS接口, 2个USB主机接口, 1个USB设备接口, SD接口和MMC接口, 2路SPI。S3C2410处理器工作频率最高可达到203MHz。

1.4 数据存储模块

数据存储电路负责存储数字采集电路输出的数字信号, S3C2410支持从NAND Flash启动, 为提高性价比, 系统采用NAND Flash与SDRAM组合, 选用两片NAND Flash (Micron公司生产的MT29F2G16AABWP-ET和Samaung公司生产的K9F2G08U0M-PCBO) 保存内核、应用程序、用户数据和运行中产生的各类数据;选用两个32M的SDRAM芯片K4S561632C-TC75, 由ARM把实时采集的数据存储到SDRAM, 存满数据后, ARM便通过以太网芯片将数据发送给计算机。

1.5 以太网模块

由于S3C2410内部没有集成以太网控制模块, 选用CS8900A作为网卡, 该芯片是Cirrus Logic公司生产的低功耗16位以太网控制器。S3C2410使用CS8900A-Q3控制器扩展网络接口模块, 按照16位方式连接, 如图3所示。把CS8900A设计为Memory模式, CS8900A复位默认工作方式为I/O模式, 以提高访问速度。

2 系统软件设计

构建毛细管电泳仪信号采集系统的软件, 主要包括系统的引导, 内核和文件系统的移植 (分为嵌入式操作系统、引导驱动程序、文件系统) 和应用程序4部分[4]。

2.1 引导驱动程序

引导驱动程序把操作系统和硬件平台衔接在一起的纽带, 通过驱动程序, 实现初始化硬件设备、内存映射, 从而引导操作系统内核为系统提供合适的软硬件环境。采用U-Boot, 通过基于Linux的U-Boot编译;基于PC机的超级终端设置和基于超级终端的U-Boot烧写, 实现适合系统引导程序。

2.2 Linux内核移植

Linux操作系统具有内核小, 源代码开放, 良好的可移植性, 易于裁减, 可以自由修改源代码, 具有极强的可定制性, 内核直接提供网络支持等优点。对S3C2410处理器支持性相当好, 且S3C2410有庞大的用户群, 可以获得丰富的开发调试信息。

我们使用Linux-2.6.14内核, 编译器为arm-linux3.4.1。内核的移植流程如图4所示。

2.3 根文件系统移植

根文件系统移植是所有UNIX系统不可或缺的组件, 挂载根文件系统是Linux内核在系统启动期间进行的最后一步操作。由busybox制作基本的根文件系统, 我们选择的版本是busybox-1.1.3和arm.1inux.3.3.2, 具体步骤如下: (1) 建立基本目录。 (2) 依次添加/bin、/dev、/ete、/lib目录中的内容。 (3) 重新配置编译内核, 添加对NFS文件系统的支持。文件系统的挂载工作是Linux在启动之后执行。

2.4 应用程序

毛细管电泳仪数据采集系统应用软件部分包括了信号采集、数据处理、显示等模块。本文对采集模块进行简略分析如下。

2.4.1 AD驱动程序信号采集

AD转换将采集的模拟信号转换成数字信号, 其驱动程序负责完成AD转换器的打开、关闭及对转换的结果进行读取等操作。由于linux-2.6.14.1内核中没有AD驱动, 因此得编写驱动程序并加载到内核中。AD驱动实现流程如下:

(1) AD转换驱动程序初始化、设备注册,

(2) 调用open () 函数, 打开AD设备,

(3) 调用write () 函数, 进行信号的采集、转换和输出,

(4) 调用read () 函数, 进行模数转换,

(5) 调用release () 函数, 释放设备。

2.4.2 采集应用程序的编写

根据所设计的数据采集系统的硬件电路, 相应的软件模块框架如图5所示。

3 结论

本文以高性能处理器S3C2410为核心, 构建了一个集信号采集、存储、处理及显示为一体的毛细管电泳仪信号采集系统, 以高精度、低功耗、小尺寸和低成本为设计目标, 精心设计系统的硬件和软件, 实现了毛细管电泳仪信号采集系统微型化、智能化, 为研制小型、便携的毛细管电泳仪奠定了一定基础。

参考文献

[1]陈艳华.基于ARM的嵌入式系统开发与实例[M].北京:人民邮电出版社, 2008.

[2]刘凯.ARM嵌入式接口技术应用[M].北京:清华大学出版社, 2009.

[3]S3C2410_userhandbook.pdf[EB/OL].http://www.samsung.com.

[4]孙纪坤, 张小全.嵌入式Linux系统开发技术详解——基于ARM[M].北京:人民邮电出版社, 2006.

毛细血管电泳仪 篇2

建立了喜树果中喜树碱的高效毛细管电泳安培检测方法.着重探讨了缓冲溶液种类、浓度、酸碱度及操作电压、进样时间等对检测的影响.Na2B4O7-NaOH(Na2B4O7浓度为30 mmol/L)为电泳介质,在15 kV高压,pH 9.0的.碱性条件下用柱端安培检测喜树碱含量.该法的线性范围为:1～100 mg/L,Y=11 020+1 014.6 ρ,r=0.999 4,检出限为0.5 mg/L.

作 者：黄宝美 姚程炜 边清泉 王秀峰 莫金垣 HUANG Bao-mei YAO Cheng-wei BIAN Qing-quan WANG Xiu-feng MO Jin-yuan 作者单位：黄宝美,边清泉,王秀峰,HUANG Bao-mei,BIAN Qing-quan,WANG Xiu-feng(绵阳师范学院,化学系,四川,绵阳,621000)

姚程炜,YAO Cheng-wei(中国气动中心第四研究所,四川,绵阳,622653)

莫金垣,MO Jin-yuan(中山大学化学,与化学工程学院,广东,广州,510275)

毛细血管电泳仪 篇3

【关键词】糖化血红蛋白；毛细管电泳法；干扰因素

【中图分类号】R331 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）08-0058-02

2型糖尿病是一组以血糖水平增高为特征的代谢疾病，患者长期血糖升高不仅影响其生活质量，还会诱发糖尿病肾病等并发症发生，威胁患者生命安全。糖化血红蛋白 A1c（HbA1c）是评价糖尿病血糖控制水平的首选指标，目前，市场上供实验室选用的测定HbA1c的方法至少有30余种，其中毛细管电泳法根据糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带电荷不同进行分离，一直用于国际临床化学与检验医学联合会发布的一级参考方法[1-2]。但是任何引起血红蛋白数量与质量变化的因素都可干扰 HbA1c 测定，对检测结果产生影响[3]，本研究通过分析毛细管电泳法检测糖化血红蛋白与常见干扰因素的相关性，旨在为其应用提供依据。现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料地中海贫血组：我院2014年1月至2015年12月门诊及住院地中海贫血患者19例，其中男12例，女7例，年龄20～58岁，平均年龄（39.1±4.26）岁，α型10例，β型9例，均符合地中海贫血诊断标准[4]。肾功能衰竭组：肾功能衰竭患者52例，其中男性39例，女性23例，年龄23～64岁，平均年龄（40.5±3.84）岁。阿司匹林组：服用阿司匹林超过1个月的患者50例，其中男性31例，女性19例，年龄18～59岁，平均年龄（40.1±3.97）岁。正常对照组：经基因确认为非地中海贫血，且血红蛋白毛细管电泳结果为异常峰的受试者23例，其中男性14例，女性9例，年龄19～57岁，平均年龄（39.6±3.58）岁。四组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法所有研究对象入组后，于清晨采取空腹肘静脉血3ml。凝血60min（20～25℃）后，离心（4000r/min）取血清，-80℃存储待测。采用法国Sebia CaPilarys毛细管蛋白电泳分析仪，DS-5糖化血红蛋白电泳检测仪（离子交换层析法），Becman Au5400全自动生化仪（免疫比浊法）测定4组HbA1c。HbAlc试剂盒及校准品、质控品均为原装配套。采用日本日立医疗器械有限公司生产的7600-110分析仪检测空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）。

1.3统计学处理应用SPSS17.0对实验数据进行处理。正态计量资料采用（均数±标准差）表示，采用ANOVA方差分或者S-N-K检验；计数资料用[例（%）]表示，采用χ 检验或者秩和检验；以P<0.05为差异其有统计学意义。

2结果

2.1四组血糖指标比较四组的FPG、2hPG比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2不同方法检测四组血清HbAlc比较毛细管电泳法检测地中海贫血及服用阿司匹林超过1个月的患者HbAlc水平结果均明显高于离子交换层析法及免疫比浊法，差异具有统计学意义（P<0.05）；肾功能衰竭组患者HbAlc三种检测方法比较，差异无统计学意义（P>0.05）；对于经基因确认为非地中海贫血，且血红蛋白毛细管电泳结果为异常峰的正常对照组，离子交换层析法及免疫比浊法均正常，与毛细管电泳法差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

3讨论

2型糖尿病是临床上的常见病和多发病，近年来随着生活水平的提高以及饮食结构的改变，其发病率呈现上升趋势，同时其诱发的急慢性并发症严重影响患者的身心健康和生活质量，且致残、致死率较高[4-5]。HbA1c是红细胞中血红蛋白与葡萄糖的结合产物，与糖尿病慢性并发症的发生和发展密切相关，已被用于糖尿病诊断及病情评估[6]。

目前，HbA1c的常规检测方法有两大类，一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同建立的毛细管电泳法及离子交换层析法，另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构差异建立的免疫比浊法及亲和层析法等，其中毛细管电泳由于高效率、运行成本低、高选择性等特点被用于HbA1c的检测。但是文献报道[7-8]，毛细管电泳法检测HbA1c容易受多种因素影响，如药物、血红蛋白病等。本研究中毛细管电泳法检测地中海贫血及服用阿司匹林超过1个月的患者HbAlc水平结果均明显高于离子交换层析法及免疫比浊法，差异具有统计学意义（P<0.05），提示地中海贫血、长期服用阿司匹林对毛细管电泳检测HbAlc存在干扰。研究表明，肾功能衰竭患者无论采用何种方法都无法克服干扰因素，本研究中，三种检测方法检测HbAlc比较，差异无统计学意义（P>0.05），进一步证实了文献报道[9]，因此，不宜采用HbA1c来反映体内平均血糖水平，应采用其他指标对血糖进行检测。此外，对于经基因确认为非地中海贫血，且血红蛋白毛细管电泳结果为异常峰的正常对照组，离子交换层析法及免疫比浊法均正常，与毛细管电泳法差异具有统计学意义（P<0.05），提示除了药物及地中海贫血对毛细管电泳检测HbAlc存在干扰外，还存在一些其他因素，如高脂血症、族群及妊娠等[10]，因此建议毛细管电泳与其他技术联合检测HbAlc。

参考文献

[1]张传宝，闫颖，赵海舰，等.对4个HbAlc测定系统的精密度和正确度验证[J].中国糖尿病杂志.2011.19（11）：805-808.

[2]胡应秀，张红梅.免疫透射比浊法测定HbAlc的可靠性研究[J].吉林医学，2011，32（24）：4969-4970.

[3]李卿，刘文彬，金中淦，等. 毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的分析性能评估[J].检验医学，2015，30（2）：181-184.

[4] 王瑜，焦亚彬，王祎波，等.胃转流术对非肥胖型2型糖尿病治疗作用的临床研究[J].中华内分泌外科杂志， 2011，05（06）： 408-411.

[5] 崔建峰，陈涛，石力，等. 2型糖尿病胃转流术后胰高血糖素样肽-1的变化及其意义[J].山东医药， 2013， 53（29）： 10-12.

[6]温应方，林敏，刘桂荣，等.广东梅州地区的异常血红蛋白的分子流行病学调查[J].重庆医科大学学报，2011，36（12）：1496-1499.

[7]温冬梅，张秀明，索明环，等.血红蛋白变异体对糖化血红蛋白测定结果的干扰及处理[J].中华检验医学杂志，2014，37（2）：123-126.

[8]徐安平，夏勇，纪玲，等.血红蛋白变异体对糖化血红蛋白不同检测系统的影响[J].中华检验医学杂志，2015，38（7）：470-474.

[9]张捷，杨硕. 糖化血红蛋白检测的标准化进程及临床应用[J].中华检验医学杂志，2012，35（6）：511-516.

[10]李娅，宋宇，段勇.糖化血红蛋白检测的局限性[J].中华检验医学杂志，2012，35（6）：501-504.

毛细管电泳技术的研究应用 篇4

关键词：毛细管电泳,原理,应用,展望

1 概述

毛细管电泳又称高效毛细管电泳, 包括电泳、色谱及其交叉内容, 是一类以毛细管为分离通道, 以高压直流电场为驱动力, 以样品的多种特性为根据的液相微分离分析技术。CE是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展, 它使分析科学从微升水平进入纳升水平, 并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。1983年, Hjerten先后提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法, 不仅大幅度提高了电泳效率, 而且使之可以成为操作自动化, 便于进行定性和定量工作。现在, 毛细管电泳已经成为一种相当普遍的微量分离分析方法。随着相关标准方法的建立和推广应用, 毛细管电泳已逐渐成为某些标准和常规的分析方法。

2 毛细管电泳分离技术的基本原理

在电场的作用下根据离子的迁移速度不同, 以高压电场为驱动力, 以内径10-100μm的毛细管为工具对样品组份进行分离和分析, 毛细管电泳技术采用熔融石英管毛细管柱, 石英管外包裹聚酰亚胺涂层以保持石英管的弹性, 毛细管的内径达到微米级。因此, 一方面可以分析量非常少的样品如单细胞组份的分析, 另一方面因为比表面积大, 横截半径小, 具有较快的散热速度, 克服了传统电泳散热效率差而不能采用高电场分离的问题。在毛细管电泳分离过程中, 样品分子的迁移是有效电泳速度和电渗速度的综合表现。由于在毛细管中电渗速度比电泳速度大一个数量级, 因此能实现样品组份同向泳动。

3 毛细管电泳技术的应用

3.1 在中药方面的应用

毛细管电泳技术 (CE) 应用到药学等领域是在八十年代后期出现的, 其最高柱效可达到105个理论板数, 最高灵敏度可以达到10-19mol, 有区带电泳, 凝胶电泳等多种模式。CE正逐渐成为药物鉴定的参考或标准方法, 2010版药典化药品种中就有采用了分离效能高的毛细管电泳法, 而其中抑肽酶增加的去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶和去丙氨酸-抑肽酶检查就是采用毛细管电泳法[2]。

中药品种繁多、且产地各异、成分复杂, 对药物进行定量分析是不可少的一项任务, 如应用毛细管电泳法可以同时测定中成药中人参皂苷Rgl、Re、红景天苷、淫羊藿苷、腺苷5种苷类成分的含量。陈琴华[1]等对植物药和中药中黄酮类化合物采用不同的毛细管电泳分离模式 (有CZE、MEKC和CEC) 使之从中药和多种植物中更好的分离得到。此外, 毛细管电泳技术在医药方面不仅可以进行定量分析, 还可以用作建立复杂样品的指纹图谱, 对手性药物进行分离分析和药物筛选或与其他仪器联用进行定性分析。

3.2 在食品方面的应用

食品安全关系着每个人的身体健康和生命安全, 关系到社会稳定和国家经济的健康发展。因此食品安全成为了社会关注的重点问题, 随着人们生活的水平的不断提高, 食品也各式各样, 但是食品中不乏掺有添加剂等危害人体健康的化学成分, 对食品安全检测重要性也不言而喻, 许多营养物质和有害物质的检测给传统的检测方法带来了很大的挑战, 因此研究者们开始试着将毛细管电泳技术应用在食品检测从而取得了较好的结果, 为食品检测开辟了一条新的途径。

比如脂肪酸检测应用中最广泛的检测方法是气相色谱法 (GC) 和高效液相色谱法 (HPLC) 。但是GC和HPLC分析方法测定时过程较为复杂, 而采用毛细管电泳 (CE) 技术进行脂肪酸检测时, 其优点是步骤简单、溶剂量少、分离模式多、分析时间短、环保等。利用CZE的分离模式, 基于样品荷质比的差异对样品分离, 检测食用油是否掺假及源产地[1]。又如有学者利用毛细管电泳法直接快速的测定出枳实和枳壳中的橙皮甙和柚皮甙这两种成分。

3.3 在临床医学上的应用

由瑞典Uppsala大学的Tiselies教授在上世纪三十年代创立的界面电泳成为早期的毛细管电泳技术, 他在电场的作用下将蛋白质分子分成球蛋白和白蛋白等4个区带。随后又在1950~1960年间发明了纸上电泳, 这一技术在医学和生物实验室得到了广泛的应用, 大量的检测资料也证明了电泳图谱和有关临床病理是有所联系的。另外通过对支持介质的不断改进, 各种电泳技术也得到了相应的发展和应用, 使得电泳区带分离更加清晰, CE在临床应用上也更为广阔。

3.4 在生命科学方面的应用

另外毛细管电泳技术在生命科学中也发挥着重要角色, 其运用于DNA的分析中最重要的优点是能够实现微量DNA的检测, 当使用LIF检测器时, 它可以从几十纳克的固相硅胶树脂中检测到被吸附的几个纳克甚至是几个皮克的DNA。所以, 从若干细胞或者是几微升的血液中提取的DNA时可以直接被CE所定量分析, 这用做PCR的扩增。而在微量氨基酸的测定中, 利用高效毛细管区带电泳直接紫外检测法可以完成对8种非衍生化氨基酸的有效分离, 将该方法用于由糖蜜生产的亮氨酸发酵液中缬氨酸和亮氨酸的含量测定时, 也能取得相当好的效果。

4 展望

毛细管电泳技术现在已经成为一种基础性的分析工具, 其应用范围不断扩大, 并且随着不同领域研究的发展, 其方法技术不断优化更新, 而作为一种高效的分离技术因其具有样品处理步骤方便简单、又可以实现多种组分的同时测定、高效快速、自动化操作以及超低的检出限, 因此CE被广泛的应用于食品、医药、临床、生命科学等方面的分析、分离、检测, 另外毛细管电泳技术和其他检测方法的联用也将成为一种新的技术, 将在各个领域得到更大的发展空间。

参考文献

[1]陈琴华, 李鹏, 朱军.毛细管电泳技术在黄酮类化合物分析中的应用进展[J].医药导报, 2012, 31 (10) :1329-1333.

[2]于虹敏, 林文津, 徐榕青.毛细管电泳技术在药学研究的应用概述[M].药物研究.

毛细血管电泳仪 篇5

用高效毛细管电泳法测定姜黄素类化合物中姜黄素的含量.姜黄素在0.450～4.049 g/L内峰面积和浓度有良好的`线性关系(r=0.999 2).方法的精密度RSD=1.25%(n=6),平均回收率为99.8%.适用于含姜黄素的样品中姜黄素含量的测定.

作 者：胡孝忠 刘保启 王玉春 丁良 作者单位：胡孝忠(河北大学,化学与环境科学学院,河北,保定,071002;河北北方学院,基础部,河北,宣化,075131)

刘保启,王玉春(河北大学,化学与环境科学学院,河北,保定,071002)

丁良(河北省职工医学院,理学院,河北,保定,071000)

毛细血管电泳仪 篇6

配位作用即维持形成诸如Co Cl3-6NH3等“复杂化合物”的作用力。根据现代配位化学理论, 配位作用指可以作为Lewis酸的离子或原子与含有孤对电子的的Lewis碱以共享电子对的方式发生的作用。

1.1 配位化合物。

配位化合物, 简称配合物的定义根据中国化学无机化学命名原则可描述为:由可以给出孤对电子或多个不定域电子的一定数目的离子或分子 (配位体) 和具有接受孤对电子会多个不定域电子的空位的原子或离子 (形成体) , 按一定组成和空间构型所形成的化合物。因此, 配合物中至少有配位体 (简称配体) 和形成体两部分, 除此之外, 有抗衡阴离子和抗衡阳离子 (counterion) 存在用来平衡电荷。配位化合物中可以提供电子的配体和可以接受电子的形成体是至关重要的。

1.2 形成体。

作为形成体, 需要有接受电子的能力, 因此必需具备价层空轨道。事实上, 元素周期表上的元素的原子 (离子) 几乎都具有价层空轨道。但常见的是金属原子 (离子) , 最常见的是价层空轨道能量相近d和f区金属元素的离子, 它们易于组合形成各种类型的杂化轨道, 接受配体提供的电子对。由于形成体通常由带正电荷的阳离子充当, 因此又常称为中心离子 (center ion) 。但也有电中性的原子甚至带负电荷的阴离子作为中心原子的。

1.3 配位体。

配位体可以是分子也可以是离子, 可以是小分子或离子 (例如:H2O、NH3等) 也可以是大分子 (如多肽、蛋白链等生物大分子配体) 。配位体中直接提供孤对电子给中心离子的原子叫配位原子, 如NH3中的N、H2O中的O等。作为配位原子应当具有孤电子对, 常见的配位原子为P区非金属元素的原子C、N、P、O、S、F、Cl、Br、I等。

2 配位作用在毛细管电泳中的应用

2.1 无机阳离子的分析。

无机阳离子主要指无机金属离子, 此外还包括NH4+等。无机离子的常规分析手段是离子色谱, 自从Hjertén于1967年首次采用CE实现Bi3+和Cu2+的分离以来, 无机阳离子的CE研究越来越广泛。众所周知地, CE的分离是基于带电粒子的淌度的差异。对于无机金属阳离子而言, 其电泳淌度可示如下式:

式中qi代表金属离子的水合阳离子的电荷数, η指电解质的粘度系数, ri则为水合离子的半径。由式可知, μep (ion) 与ri成反比, 与qi成正比。对于许多价态相同的金属离子而言, ri的差异决定了它们在CE分离中的分离情况。然而, 许多高价态的金属离子具有非常相近的ri。通过一种辅助配体与阳离子发生配位作用来扩大阳离子间的淌度差异成了CE无机阳离子分析的必要手段。在CE阳离子分析中, 主要有两种方式:一是在工作缓冲液加入络合剂, 进样后络合剂和阳离子在毛细管内形成络合物, 又称为在柱络合;二是在测定前在样品中加入过量络合剂, 络合反应在样品进入毛细管测定前已经完成, 即柱前络合。

2.2 配体交换手性拆分。

配体交换手性拆分技术按中心离子的种类, 可分为两种。

二价过渡金属离子作为中心离子。常见的中心金属离子有Cu2+和Ni2+, 其中Cu2+的应用尤其广泛。这种方式的主要原理为:通过中心金属离子与一种含有两个配位原子手性配体 (一个对映体) 形成络合物。当分析物 (A) 遇到这种络合物时, 其左旋 (S-A) 、右旋 (R-A) 对映体会分别交换一个与中心离子结合的手性配体与中心离子发生配位作用, 并且左、右旋对映体的这种交换能力受手性配体的影响而通常存在差异, 从而能实现手性分离。硼酸根阴离子作为中心离子。硼酸根 (B (OH) 4-) 中的B是缺电子原子, 其配位数为4, 因此能与O、N或S等配位原子发生配位作用。并当形成络合物后有5元或6元环 (两个配位原子间隔2个或3个C原子) 形成时, 这种络合作用更加明显。

3 配位作用对配体性质的影响分析

配体与形成体发生配位作用后, 形成体与配体的电子排布都会受对方的影响而发生改变, 从而会带来多方面物理、化学性质的改变。此处所谓的配位作用对配体性质的影响, 可以认为是配合物与配体之间的性质差异。

3.1 紫外-可见吸收性质。

紫外-可见吸收光谱) 是由价电子在能级之间的跃迁而产生的。电子跃迁的能级差约为1-20eV, 所吸收光的波长约为12.5-0.06μm, 即UV-Vis所考察的波长范围。配合物区别于配体的UV-Vis性质主要体现在两个方面:配位场跃迁光谱和电荷迁移光谱。配位场跃迁光谱。配位场跃迁包括d-d跃迁和f-f跃迁。元素周期表中第四、第五周期的d区过渡金属元素分别含有3d和4d轨道, 镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道。在配体的存在下, 过渡金属元素五个能量相等的d轨道及镧系和锕系元素的七个能量相等的f轨道分别分裂成机组能量不等的d轨道及f轨道。当它们的离子吸光后, 低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道上去。这两类跃迁分别称为d-d跃迁和f-f跃迁。由于这种跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生, 故称配位场跃迁。

电荷迁移跃迁光谱。常见的电荷移跃迁发生在以金属为主要成份的分子轨道与以配体为主要成份的分子轨道之间。在辐射下, 分子中原定域在金属M轨道上的电荷转移到配位体L的轨道, 或按相反方向转移, 所产生的吸收光谱称为电荷迁移跃迁光谱。如果配体只是σ给予体 (如NH3, CH3-) 或既是σ给予体又是π给予体 (如X-, S2-, O2-等) , 可发生从配体到金属的荷移跃迁 (LMCT) 。这种荷移跃迁相当于中心体的还原, 配体的氧化, 中心体越易还原, 其吸收光的波长越长。当配体含有较高能级的空的π轨道。且与富电子的离子如Fe2+生成配合物时, 可发生从金属到配体的荷移跃迁 (MLCT) 。电荷迁移跃迁谱带的ε数量级在104左右, 一般出现在紫外区域。因此应用这类谱带进行定量分析时, 在一些原本吸收很弱的配体 (如糖类、氨基酸等) 具有重要的意义, 可大大提高检测灵敏度。

3.2 发光性质。

一般来说, 荧光物质的刚性和共平面性增加, 可使分子与溶剂或其它溶剂分子的相互作用减小, 即使外转移能量损失减少, 从而有利于荧光发射。不少有机化合物虽然具有共轭双键, 但由于不是刚性结构, 分子处于非同一平面, 因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成配合物, 随着分子的刚性增强, 平面结构的增大, 常会发生荧光。例如滂铬BBR不发荧光, 而他与Al3+配合物具有强荧光。在这种情况下, 通常要求金属离子的外电子层结构具有与惰性气体相同的结构。并且, 配合物的荧光强度随金属离子的原子量增加而减弱 (也称重原子效应) , 吸收峰和发射峰也相应向长波长方向移动。

3.3 其它影响。

当配体化合物与中心离子形成配合物之后, 除了产生新的分子吸光性质、发光性质之外, 还有产生了磁性、手性以及新的红外光谱性质等。此外, 配体化合物形成配合物后所具有的一些新的生物活性也正是目前人们研究的热点, 如一些铂配合物的抗肿瘤活性。总的来说, 当一些原本具有生物活性的有机配体或微量元素形成配体之后, 正面效应大致有以下几点:1、可具有原有机物成分和微量元素更强的生物活性;2、可提高某一成分的生物活性或降低其毒副作用;3、可以产生两者所不具备的新的生物活性;4、可增大微量元素的生物利用度 (增大了亲脂性, 促进吸收) 。例如维脑路铜配合物的高抗氧化活性、橙皮苷铜配合物的抗炎抗水肿活性以及绿源酸配合物更强的抗菌活性等。

摘要：毛细管电泳是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大的创新和发展。而配位作用是指可以作为路易斯酸的金属离子与含有孤电子对的路易斯碱以共享电子对的方式发生的相互作用。本文对配位作用基本理论做了介绍, 并探讨了配位作用在毛细管电泳中的应用。

关键词：毛细管电泳,配位作用,应用

参考文献

[1]陈义, 毛细管电泳技术及应用, 化学工业出版社, 2000

[2]郑一宁, 麻黄碱和伪麻黄碱的毛细管电泳-电化学分离检测, 高等学校化学学报, 2002

毛细血管电泳仪 篇7

关键词：毛细管电泳,形态分析,金属硫蛋白

金属硫蛋白 (metallothionein, 简称MT) 是一类广泛存在于生物界、低分子量、富含半胱氨酸、可被金属和其他因素诱导合成的细胞内金属结合非酶蛋白质。MT在生物体内有很重要的生理作用:清除体内自由基、防止机体衰老;解除重金属的毒性;参与体内微量元素的代谢;增强机体对各种不良状态的适应能力;锌元素的贮存库;防止细胞癌变等[1]。研究MT与金属结合形态有利于了解生物体内非必需金属解毒, 消除自由基抗衰老, 必需微量金属元素储存运输等生理过程。

到目前为止, 对于金属硫蛋白的研究很多, 尤其是动物金属硫蛋白。研究这类物质的方法很多。总体看来, 无非是寻找一种恰当的分离手段, 并结合恰当的检测手段, 也就是所说的联用技术, 即有效分离手段和检测手段的复合连接组合。包括:高效液相色谱 (HPLC) 、离子色谱法 (IC) 、超临界流体色谱法 (SFC) 、气相色谱法 (GC) 和毛细管电泳 (CE) 等分离手段, 所连接检测系统包括:电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 、光学发射光谱 (OES) 和微波诱导等离子体质谱 (MIP-OES-MS) 和直流等离子体 ( (DCP) COES) 和 (MS) 、石墨炉原子吸收 (GFAA) 、电化学技术等。就分离方法而言, CE有其他分离方法所不具有的优点:高分辨率、高速度、样品消耗量小, 不破坏生物样品原始形态、生物活性, 能真正做到活体分析;其理论塔板数为几十万每米, 高者可达几百万甚至上千万每米, 通常对实际复杂样品的分析较为理想, 还可同时分离电泳淌度相似或差别不大的蛋白质的不同结合形态。鉴于以上优点, 使其成为更适于蛋白质形态分析的一种新型分离技术。对于检测技术来说, 光谱学方法最为普遍、电化学检测器经济实用、质谱 (MS) 检测器灵敏度较高、免疫学分析在蛋白质样品分析中的作用也日益显著。本文对近20年来CE与各种不同检测手段:免疫分析法、光谱学方法、电化学法和质谱 (MS) 法等的联用在金属硫蛋白的形态分析中的应用进行评述。

1 金属硫蛋白简介

金属硫蛋白自从1957年Margoshes和Vallee[2]从重金属镉蓄积的马肾中分离出后, 已有40余年的历史。然而不同生物种中, MT在其体内产生原因和生理作用不尽相同。动物MT的表达受金属离子、激素、炎症等因素的调节, 现在一般认为动物和真菌的MT参与重金属离子的解毒及金属离子的代谢[3];还发现MT和一些脑部病变有关。植物MT基因的表达也受金属离子及其它因素, 如糖饥饿、胁迫、激素、热激、损伤、病毒侵染、虫害等的影响。植物MT的功能目前尚不明确, 由于它具有结合金属离子 (如Cu2+, Zn2+, Cd2+等) 的能力, 因此认为它在解除重金属离子的毒害[4]、维持组织中金属离子的稳定以及调节金属离子向特定组织的运输等方面起作用。另外, 利用某些金属硫蛋白在发育过程中表现出程序表达的特点, 通过改变Zn2+浓度来调节金属硫蛋白, 进而调控基因的表达。一些研究中还发现金属硫蛋白与植物的抗逆反应、胚芽发育、果实成熟、衰老等生理过程有关[5,6,7]。

金属硫蛋白系列的共同特点是相对分子量低:约为6000～7000道尔顿, 含有60～63个氨基酸残基;高金属含量, 每分子蛋白可结合7个二价金属离子, 如Cd, Zn等, 或多至18个一价金属离子, 如Cu, Ag等;蛋白中的所有半胱氨酸残基均以还原态出现, 并与金属离子通过巯基键结合, 从而具有金属巯基化合物的光谱学特征。MT的光吸收特征除与它的氨基酸组成有关外, 也与它所结合的金属种类密切相关[8]。如Zn-MT在220nm高度吸收, 而Cd-MT在250nm处高度吸收;全部的氨基酸残基中含有23%～33%的半胱氨酸残基, 没有二硫键、芳香族氨基酸和组氨酸;半胱氨酸残基在全部氨基酸序列中的分布保守性很强, 这就使得研究其与金属作用情况成为可能。MT的存在形式及稳定性与它是否结合金属、所结合金属的种类及环境的pH密切相关, 一般说来, 金属硫蛋白本身以配位键等形式结合金属离子, 构象坚固, 热稳定性较其他蛋白质高;而对酸碱承受能力低, 一般稳定存在的pH值区间在一个pH值单位左右, 如果超出这个范围, 就会有部分金属游离出来。

植物中金属硫蛋白和动物体内的金属硫蛋白有所不同, 它们在空间结构上有较大的差异, 根据文献中核磁共振测定的键合序列绘制大鼠肝脏MT-2的三维图 (见图1) , 而植物金属硫蛋白[20]的可能三维结构图 (见图2) 与之有较大差别, 图2为豌豆根部MT-1。植物MT可以分为三类:Ⅰ类MT的半胱氨酸残基 (Cys-) 按CC, CXC, CXXC的方式排列, 集中分布在肽链的N端和C端;Ⅱ类MT的Cys则散布在整个肽链中;Ⅲ类MT又称为植物螯合剂 (phytochelatines, 简称PC) , PC不是基因编码产物, 是以谷胱甘肽为底物酶促合成的多聚物, 富含Cys[9]。

β.Domain, consist of 9 cysteine residues;α.Domain, consist of 11 cysteine residues

Consist of 12 cysteine residues

2 生物样品的预处理

不同的基体分析研究方法有所不同, 组织、生物体液、细胞培养物这些复杂样品要设计开发切实可行的研究方案。传统的通过细胞液样品半纯化MT的方法即凝胶排阻色谱法[10,11], 用一些不同尺寸的凝胶分离, 快速分离少量样品不太适用。

分离MT简便易行的方法还有以下三类:首先, 因Cd, Zn等的MT热稳定性好, 可以根据他们的热稳定性进行粗分离, 以排除其他杂蛋白干扰, 粗略估计, MT能承受60℃高温10min或100℃高温1min, 温度、时间的选择不固定, 还要根据所纯化的蛋白质质量大小。其次, 含有复杂金属键合形式的MT不像其他蛋白质那样在低pH值容易变性, 因为各种金属的稳定常数与pH值密切相关, 因此, 纯化MT时通常也可依靠调整pH值, 通过它的调整能够有意识地改变蛋白质结构中的金属离子量, MT样品经酸性脱蛋白处理后就能够进行CE分析。再次, MT结构稳定, 对有机溶剂耐受力较强, 如:乙醇、丙酮、乙腈等, 在50%的有机溶剂水溶液中也能稳定存在, 而很多别的蛋白质会在这样的条件下变性沉降, 生物样品经有机溶剂处理脱杂蛋白后, 接下来就是用生物凝胶色谱介质脱盐, 此过程一般会导致分析样品的稀释, 需要进一步的浓缩, 在保证MT不变性的前提下至少要浓缩到80%, 两步溶剂提取过程是从动物组织中大规模提取MT的常用方法, 此方法更适合于MT半纯化及浓缩, 同时也更适合于分析检测。

3 毛细管电泳的分类及在MT中的应用

CE是近十几年迅速发展起来的一种新型分离技术, 应用范围广泛, 主要用于分离不同的金属离子和各种无机阴离子等, 并能进行复合体系的机理研究[12]。也用于分离各种有机小分子及一些具有生物活性的大分子如多糖、核酸、蛋白质等。在蛋白质样品的制作与分离中, 有许多其他方法不能取代的优点:样品消耗量小, 峰容量高, 灵敏度高, 重现性高, 通用性广等。具备丰富的分离模式:毛细管区带电泳 (CZE) 、胶束电动色谱 (MEKC) 、等速电泳 (ITP) 、聚丙烯酰胺涂层毛细管电泳等。

3.1 毛细管区带电泳及应用

用普通内壁未经修饰的熔融石英毛细管分离时, 离子强度 (IS) 高有利于蛋白质与毛细管内壁发生作用, 以提高分离效率, 但过高的离子强度容易产生较大的焦耳热, 因此, 应选择恰当的离子强度。中性酸度的缓冲溶液因没有电渗流或电渗流很小而使分离效率更高些。对于MT异构体的分离, 可以选用偏酸性或中性pH值的缓冲体系, 如:磷酸盐及两性离子缓冲液。另外, 可以在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂或有机溶剂[13], 以减小毛细管内壁的一些硅醇基团和一些蛋白质的相互作用。为提高对MT的分离效果, Thore W.Wilhelmsena等人[14]在分离马肾MT的两种形态时, 通过在缓冲液中加入环糊精等添加剂, 对毛细管内壁也做处理, 涂聚丙烯酰胺涂层, 并讨论不同添加剂种类及浓度对分离度的影响机制。

3.2 胶束电动毛细管电泳 (MECC) 及应用

在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 能够得到较好的分离效果, 主要原理就是胶束卷入分离体系中, 在水溶性电解质溶液的亲水环境中形成表面带负电、中心有强疏水性的SDS胶团, 分离过程主要决定于它们的亲水性及所带电荷的不同。SDS胶团尺寸大小恰好在5000道尔顿左右, 与MT分子尺寸大小相近, 它能有效拦截MT分子或与MT分子相互竞争, 达到较好的分离。因而, 在电泳分离过程中只需改变胶束浓度, 不必改变缓冲溶液pH值等其他电泳条件就能够有较好的重现性。通常分离条件下, SDS的浓度在60～120mM, 所用的毛细管为50cm×75μm未修饰的毛细管, 300mM硼酸钠缓冲溶液, pH=8.4～10.4, 分离电压10kV。

3.3 聚丙烯酰胺涂层毛细管电泳[15]及应用

普通的熔融石英毛细管内壁可以经过修饰, 以改变表面电性、水溶性、化学特性等。目前, 最常用的商品化毛细管带有氨基修饰的带正电的酸性涂层, 中性不带电涂层, 各种亲水性、疏水性等涂层。对于MT异构体来说, 中性不带电涂层能得到较好的分离效果。氨基修饰的带正电的酸性涂层毛细管更适合分离那些带正电的蛋白质, 一般pH值应低于蛋白质的等电点 (pI) , 但一些氨基修饰的毛细管不适合在pH<3.5的条件下测定MT, 因理论上多数MT异构体的pI在4～4.5之间, 极少数MT-1和MT-3在较大的范围, 可能达到碱性范围, 为能使被分离物都得到较好的分离, pH一般选中性或偏碱性, 最高可以达到8, 应用高离子强度的磷酸盐作缓冲溶液, 改进的内壁涂层[16]还有聚乙烯亚胺和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸共聚涂层等。Shunsuke Nakamura等人[17]利用镉离子诱导鼠肝细胞, 胞液中产生两种金属硫蛋白, 并对其进行毛细管电泳研究, 得知两种金属硫蛋白对重金属Cd、Cu等的解毒效果有所不同, 所用的就是内壁经聚丙烯酰胺处理过的毛细管。

4 检测方法的选择

以前研究者建立许多专门分析方法并把它用于数量不断增长的MT分析中, 许多年来的分析集中于外生物种的研究, 然而近些年来, 更关注于内生物种研究, 如组织或生物体中金属蛋白质[18], 目前用于MT的定性、定量分析技术方法很多, 能和毛细管电泳有效在线联用的主要包括以下几类:光谱学分析法、质谱法、电化学分析法等。这些方法也各有优缺点, 根据不同检测需要, 使用时要作恰当的选择。

4.1 光谱学分析法

光谱学分析法原理比较常用, 主要是基于样品的不同波长下的吸收强度来定量的。检测MT紫外吸收是最常用[19]、最经典的方法, G.ÁlvarezLlamas等[20,21]用CZE-UV分析研究兔肝脏的金属硫蛋白样品, Cd离子诱导下的鳗鱼体内金属硫蛋白及玉米种子中的金属硫蛋白样品, 通过不同的紫外吸收强度比较样品中的两种MT与Cd的结合形态。为选择MT的较大吸收波长, 并排除基体干扰, 可以用二极管阵列检测器, 进行波长时间扫描, 以得到波长、时间-紫外吸收强度的二维电泳图, 从而确定恰当的紫外吸收检测波长。由于CE样品用量很小, 最低达到fmol级, 对于实际生物样品UV检测限可能达不到要求, 需要对样品富集放大。

荧光检测法也可以直接测定MT总量, 主要是MT分子中所包含的巯基基团和荧光基团试剂发生反应, 用N-[4- (二甲氨基-2-苯并呋喃基) 苯基顺丁烯二酰亚胺] (DBPM) 联合凝胶过滤色谱法, 用于鼠组织样品中MT及其类似物的分析, 这种方法的线性关系很好和灵敏度很高。在MT的二维结构鉴定中拉曼光谱和红外光谱也是常用的重要手段, 高宏等[22]对金属硫蛋白 (MT) 进行分离, 得到单一的MT-1和MT-2组份, 并用傅立叶变换拉曼光谱 (FT-RS) 和傅立叶变换红外光谱 (FT-IR) 测定它们的二级结构, 通过拉曼光谱位移和红外光谱吸收峰研究MT主链的α-折叠、β-转角变化, 发现不同亚型MT结构的区别主要表现在肽链骨架上, 反应红外和拉曼谱中酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅲ带的峰的位移、峰形和强度有所不同, 而两种MT的金属簇结构无明显差异。

另外, 核磁共振 (NMR) 在化学、生物、医药等领域有非常重要的用途。早在上个世纪80年代NMR就已经用于动物MT三维结构的分析, 作为一种结构鉴定技术, 和MS一样, 被期望是高效分离方法的一种优良联用手段。CE与NMR的联用方法已用于氨基酸、代谢药物等小分子的测定, 此联用技术受灵敏度低、仪器过于昂贵等条件限制。随着仪器灵敏度的不断提高、超导NMR的广泛普及, CE-NMR有望用于MT的三维结构解析及与金属亲和力的研究。此外, 在生物样品中MT形态分析还有X射线衍射方法, 用此法研究斑海豚肝脏中Hg-MT时发现[4], 肝脏中的Hg与MT结合, 对肝脏无毒害作用, 目前此类方法由于技术条件限制, 未能与CE在线联用。

4.2 质谱法 (MS)

像MT这样的待测物, 在形态分析的研究中发展软离子质谱法, 也有更直接的方法——电喷雾离子化质谱法, 这些都是研究金属硫蛋白的重要方法, 可以不依靠保留时间而直接确定分子量大小, 还可以直接确定同一样品中的金属硫蛋白中金属不同结合形态, 以及异构体、次级异构体。而MT被金属离子饱和后形成的加合物可以通过CE和电喷雾离子化质谱[23] (ESI-MS) 的在线联用来测定[24]。MS图谱解析运用量子化学计算方法, 可以通过MT配合物体系中金属配合形态来确定MT的α, β结构域的性质[18,24,25,26,27]。然而MS不能用于蛋白质的定量分析, 主要是因为本身的技术条件限制。

目前发展的激光辅助基质解析质谱 (MALDI-MS) , 已用于蛋白质组学领域研究, 所测样品可以是生物材料、细胞培养物, 并且有较高灵敏度, 在其应用中为提高灵敏度可以采用微扩散接口技术。

MALDI-TOF-MS由于样品用量小, 既可以离线分析又可以在线分析, 灵敏度高, 因此可以用作CE的检测器来测定MT的二聚体和多聚体以及脱辅基蛋白、失活蛋白等[28,29]。重复CE的分离结果, 排除复杂杂质成分的干扰。

另外, 还有电感耦合等离子体[15,16,19,30]质谱用于在线联用检测MT的报导。Maria Montes-Bayon等人[31]用毛细管电泳和毛细管液相色谱两种方法对兔肝的Cd-, Cu-, Zn-的两种金属硫蛋白的分离效果做比较, 所用的检测器为电感耦合等离子体[15,16,19,30]-碰撞室-质谱 (ICP-CC-MS) , 此方法也能较好地对分离出的两种金属硫蛋白进行有效检测。

4.3 电化学检测方法 (ECD)

检测MT总量的电化学检测方法, 主要是基于MT中的硫醇基和金属离子的氧化还原性质不同:巯基和所键合金属离子的电学活性不同, 产生不同的响应值。早期极谱法已用于研究MT脱辅基异构体和金属键合MT异构体, 此法后来进一步改进成为不同脉冲的伏安法或恒流计时电势分析法, 从而有效提高灵敏度, 尽管高分子量的含巯基蛋白质很难移动, 但线性范围还能达到0.31～8.06×10-8mol/L。经过后来的发展, 采用阳极溶出伏安法, 在pH<2条件下对Cd-MT进行分析检测。

不同脉冲模式阴极溶出伏安法也已用于MT的定量分析, 铜可以取代键合在MT上的金属, 和MT中的半胱氨酸残基形成高表面活性的亚铜离子配合物, 这种亚铜离子配合物能吸附在滴汞电极表面, 产生较强的还原信号, 检测限能低至2.00×10-10mol/L。检测MT, Zn-MT, Cd-MT可以用此方法, 用三苯基膦氧化膜覆盖的汞电极代替前面提到的工作电极, 以控制MT的吸附, 提高检测的重现性, 这一检测过程检测限可以达到8.90×10-10 mol/L。电分析化学方法检测MT总浓度可以达到很高的灵敏度, 然而需要提高样品纯度, 主要是因为许多电活性杂质干扰分析, 也限制电分析技术用于某些实际生物样品的定量分析。

电化学检测和CE的典型联用仪器是芯片CE, 主要是电化学检测的制作方法容易融入芯片CE的制作过程中, 通过刻蚀的方法就可以完成电化学检测和芯片毛细管电泳的集成制作, 所使用的电极是微电极, 微电极连接高频电导检测器。此仪器已用于蛋白质的检测, PMMA芯片和玻璃芯片电泳已用于蛋白质的免疫分析[32]。电化学检测中的安培检测技术, 具有比紫外检测更高的灵敏度, 且仪器简单、价格成本低、线性范围宽、操作简便, 所以其与毛细管电泳的联用在分析化学领域得到广泛的研究和应用[33], 也可以作为MT的检测方法。

5 主要困难

分析检测过程中最大的困难就是样品用量太小, 达到fmol级, UV, RS等检测手段达不到要求, 需要对样品浓集放大, 低离子强度的样品溶液可以通过流体力学注射方法富集;在电解质溶液中可以通过高的电场强度富集溶质, 蛋白质以高的速度在样品溶液中运动, 当它达到电解质溶液界面时, 而突然被减速富集从而导致界面处浓度高。此外, 对于内壁未经修饰的毛细管, 增大进样量也可以提高响应值, 低离子强度下的电动负载进样比一般电解质溶液进样灵敏度要更高些。等速电泳 (ITP) 的在线预富集技术也是很好的方法, 它的灵敏度和选择性更高。更简单一些的方法是在线固相萃取法 (SPE-CE) 分析MT异构体形态更普遍、经济, 如果选择恰当的反相材料和分离条件, 固相萃取法可以有效分离生物组织提取样品中的100种以上MT异构体, 用化学修饰过的琼脂糖凝胶与MT交换萃取[34], 至少能在5min内把MT浓度富集到100倍以上。

尽管CE或HPLC与各种先进的检测方法的联用, 提高元素分析的灵敏度、降低检测限, 通过它们的不同洗脱时间确定分子种类, 得出的结果仍不够客观, 也缺乏可供参考的文献资料[35,36]。到目前有很多研究方法, 但许多不能互相校正的方法用于有机体中MT的浓度的定量分析是不可靠的。这就使不同研究小组所获得的研究结果很难或者根本就不可能进行互相比较。

6 结论

毛细血管电泳仪 篇8

关键词：毛细管电泳,电致化学发光,检测器

0绪论

高效毛细管电泳(HPEC)是近30年发展起来的崭新的、先进的分离技术，其原理是根据被分离物质荷质比的不同，在高压电场作用下，各组分在毛细管内以不同的迁移速度，从毛细管的一端流向另一端，依次到达检测器被检出。迄今为止，常见的与HPCE联用的检测器有：紫外可见吸收、光激发荧光、质谱、安培检等检测器，其中前三种检测器已经商品化。在这些检测器中紫外可见检测器的通用性好，但灵敏度低;光激发荧光检测器中的激光诱导荧光检测器和质谱检测器灵敏度高，但是仪器非常昂贵;安培检测器由于其灵敏度高，仪器简单、价廉，在近年来得到较大的发展并有商品化的趋势，但通用性较差，在应用范围方面受到一定的限制。近年来发展起来的电致化学发光分析法的检测灵敏度可以与激光诱导荧光相媲美，因此国内外分析工作者开始把目标瞄准高效毛细管电泳—电致化学发检测器(HPCE-ECL)这一分离效率高、灵敏度高而开发成本低的检测器的研制及应用上面。本论文正是在这种背景下，进行毛细管电泳—电致化学发光检测器的研制，并对其电化学、电致化学发光、分离检测等性能进行表征。

1 实验部分

1.1 实验仪器

(1)+30KV/0.3mA高压电源(上海原子核研究所)

(2)MP—1型溶出分析仪(山东电讯七厂)

(3)GD-1型微光测量仪(西安瑞科电子设备有限公司)

(4)HW色谱工作站(南京千谱构件有限公司)

(5)LK98微机电化学分析系统(天津兰力科有限公司)

1.2 实验试剂样品

所用的Luminol是由美国Aldrich化学股份有限公司生产的，其它实验药品均为分析纯级药品。

1.3 实验方法

1.3.1 工作电极的处理

Pt圆盘工作电极用0.3的氧化铝进行刨光，用石英蒸馏亚沸水冲洗电极表面，并将电极置于石英蒸馏亚沸水中，用超声波除去电极表面残留的氧化铝。

1.3.2 毛细管的处理

(1)1.0mol/L Na OH清洗2h，石英亚沸蒸馏水清洗5～10min;(2)0.1mol/L HCl清洗0.5h，石英亚沸蒸馏水清洗5～10min;(3)0.1mol/L Na OH清洗0.5h，石英亚沸蒸馏水清洗5～10min。

1.3.3 高效毛细电泳—电致化学发光检测系统的研制

1）毛细管电泳—电致化学发光检测系统的基本构造

整个检测系统主要由以下各部分级成：(1)高压电源(HV);(2)高压屏蔽箱;(3)暗箱;(4)微光测量系统;(5)恒电压系统;(6)记录装置。

2）毛细管电泳—电致化学发光检测池的设计及加工

检测池由三部分组成：检测池的主体部分、工作电极部分、检测池薄层隔膜(Teflon薄膜)。

(1）检测池主体部分加工

采用厚度约为1cm的有机玻璃块(长和宽都应大于2.5cm，以便于整个ECL流动池的固定)，在其中间部分依次加工。

(1)毛细管进样口(直径d=0.4mm)，并用“环氧树脂”固定毛细管，作为整个流动池的进口。

(2)多空玻璃塞接口(直径d=3.7mm)，用“环氧树脂”固定。在有机玻璃块的顶部安装接地电极，并与多空玻璃塞相连，从而达到整个“ECL流动池”接地的效果。

(3)发光试剂进样口(直径d=0.4mm)，在有机玻璃块中上部加工，高于其它孔约0.5cm。

(4)出口(直径d=0.4mm)，嵌入不锈钢管(孔径较大的注射器针头)，兼作辅助电极。

(5)Ag/Ag Cl参比电极口(直径d=5.0mm)，并与出口相连。

由于检测池的主体部分为有机玻璃块，它对可见光有较好的透过性能，用它作为透光材料完全能满足应用较广的电致化学发光体系，包括：鲁米诺、联吡啶钌电致化学发光体系的测量要求，因为它们的发光波长都在可见区。因此我们在检测池的主体部分的中心位置空出直径d>3.0mm的空间作为透光窗。

(2）工作电极设计及加工

工作电极为铂圆盘电极，电极的外套为一平整的Teflon块，在其中一个对角的位置钻两个孔洞，可通过螺栓与检测池的主体部分相连。

(3）电致化学发光检测池的薄膜的设计及加工

选用Teflon薄膜，取2.5cm×2.5cm大小，厚度约为50μm，其中间挖去一细长形部分，长约为1.5cm，宽约为0.1mm，使得薄层池的体积约为3.5×10-2μL。

(4）细管电泳电致化学发光检测池的组装

通过检测池的三部分：检测池主体、工作电极以及检测池薄膜它们上面的螺栓口，用螺栓固定组装成电致化学发光检测池。

2 实验结果与讨论

2.1 高效毛细电泳—电致化学发光检测系统性能的表征

2.1.1 电致化学发光检测池的电化学性能的表征

用1×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]-1mol/L KCl溶液作循环伏安法测量以考察毛细管电泳-电致化学发光检测池的“三电极系统”电化学性能，结果如图1所示。所得到的循环伏安曲线的氧化峰电流(ipa)和还原峰电流(ipc)的比值接近1，相应的氧化还原峰电位差值(Ep)为89mV，表明K3[Fe(CN)6]在毛细管电泳—电致化学发光薄层检测池中的电化学氧化还原过程基本上是可逆的，即表明毛细管电泳-电致化学发光薄层检测池的三电极系统正常。

实验条件:K3[Fe(CN)6]浓度为1mmol/L,介质为1mol/L KCl,工作电极为铂圆盘电极,扫速为200mV/s

2.1.2 检测池的电致化学发光性能的表征

从检测池的“发光试剂进样口”加入Luminol溶液(1×10-5mol/L的Luminol-pH12磷酸盐缓冲液)，考察其在自制的毛细管电泳—电致化学发光检测池上的注动注射电致化学发光响应情况，结果如图2所示。由图可以看出该ECL检测池有较高的灵敏度，并且流动注射发光峰很窄，表明这种检测池的死体积很小可与高效毛细管电泳分离系统相匹配。

2.1.3 高效毛细电泳—电致化学发光分离检测系统性能的表征

我们在表征了电致化学发光检测器的性能之后，进一步将高效毛细管电泳分离系统与电致化学发光检测器偶合组成一个高效毛细管—电致化学发光分离检测系统(CPE-ECL)。接下来，我们用该CPE-ECL系统对经典的发光试剂Luminol对行分离检测(见图3)，以初步评价我们所研制的高效毛细管—电致化学发光分离检测系统的性能。实验条件如下：1mmol/L Luminol，缓冲液为0.02mol/L,pH12的磷酸盐，进样电压为18KV、进样时间为15s，分离电压为20KV。

实验条件：Luminol浓度为1×10-5mol/L;载液为p H12磷酸盐;流速为1.0mL/min;工作电极电位为800mV(vs.Ag/Ag Cl)

实验条件:Luminol浓度为1×10-3mol/L;缓冲介质：0.02mol/L pH12.0磷酸盐;工作电极电位为800mV

实验结果显示(如图3所示)在施加分离电压之后大约10分钟时获得一个很灵敏的、峰形尖锐的Luminol电致化学发光峰。这表明我们所研制的CPE-ECL检测器具有死体积小、灵敏度高良好性能。

2.2 结论

高效毛细管电泳—电致化学发光检测器性能的表征实验结果表明：本检测器具有良好的电化学响应、电致化学发光响应;将所研制的检测器与高效毛细管连用，用经典的电致化学发光体系Luminol—Na OH为分离检测对象，对检测器的分离效率、检测灵敏度进行评价，结果表明该检测器具有检测灵敏度高、重现性好等优点。因此，本检测器可进一步应用于微量离子，和生命物质如DNA、氨基酸、多肽、蛋白质等的分离检测。

参考文献

[1]邓延倬,金兰.高效毛细管电泳.科学出版社,2000.

毛细管电泳分离4种黄酮类化合物 篇9

1 实验

1.1 仪器与试剂

CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司);内径75μm,有效长度50cm的熔融石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂)。芦丁、槲皮素、山奈酚、木犀草素(上海试剂二厂)。珍菊降压片,菟丝子均为市售品(合肥大药房)。其他试剂均为分析纯试剂,实验用水为重蒸水。缓冲溶液和样品溶液使用前均过0.45μm滤膜。

1.2 电泳条件

在254nm的检测波长下,以pH值为9.0,浓度为0.04mol·L-1 Na2B4O7为缓冲溶液,分离电压为18kV,高差10cm,重力进样20s。进样前,依次用1mol·L-1的HCl冲洗5min,二次蒸馏水冲洗5min,1mol·L-1的NaOH冲洗10min,二次蒸馏水冲洗5min,最后再用缓冲溶液平衡10min。

1.3 样品溶液制备

将菟丝子磨碎,过80目筛,称取1g,用50mL乙醇溶液超声萃取1h后,冷却至室温,过滤,定溶于50mL的容量瓶。将珍菊降压片磨碎,过80目筛,称取1g,用25mL的乙醇溶液超声萃取1h后,过滤,定溶于25mL的容量瓶,

2 结果与讨论

2.1 电泳条件的优化

2.1.1 缓冲溶液种类、pH值、浓度的影响

分别以KH2PO4-K2HPO4、Na2B4O7-H3BO3和Na2B4O7作为电泳缓冲体系进行电泳分析,4种物质在Na2B4O7缓冲体系中分离较好,故选择Na2B4O7缓冲溶液。分别配制pH值为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5 Na2B4O7缓冲溶液实验,结果发现当pH<8.5时或pH>10.0时4种物质不能完全分离。在pH值在8.5 ～ 10.0 的范围内,随着pH值的增加,4种物质的迁移时间会有所增加,因此选择pH值为9.0,4种物质得到良好分离,且迁移时间较短。对浓度为0.01、0.02、0.03、0.04和0.05mol·L–1 Na2B4O7缓冲溶液分别进行实验,发现随着浓度增大,分离度逐渐增大,但当浓度过大时迁移时间过长,影响分离时间,因此选用0.04mol·L–1 Na2B4O7缓冲溶液。

2.1.2 分离电压和进样时间的影响

本实验还考察了分离电压为10、12、14、16、18、19和20kV时,对样品分离结果的影响。如图1所示。从图中可以看出,随着分离电压升高,各组分的迁移时间缩短。但是随着电压升高,产生的焦耳热会增加基线噪声,影响样品的分离度,故选择分离电压为18kV。实验采用重力进样,高差为10cm,考察了时间为5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s和40s时,对峰高的影响。峰高随着进样时间的延长而增加,但当进样时间超过20s时,山奈酚和槲皮素的峰增高不明显,因此选择20s作为进样时间。

2.2 线性范围、检出限和重现性

在上述最佳条件下,4种物质可以在7min内得到良好的分离,如图2所示。配制一系列不同浓度的混合标准溶液,测定峰高度h与物质的量浓度c的关系。得到4种组分的线性范围、回归方程、相关系数和检出限(S/N = 3),如表1所示。将一定浓度的混合标准溶液连续进样6次,得到芦丁、山奈酚、木犀草素和槲皮素迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为:0.96%、0.65%、0.93%、0.86%。峰高的相对标准偏差(RSD)分别为: 7.1%、7.51%、7.52%、8.38%。表明本实验重现性良好。

1.乙醇;2.芦丁;3.山奈酚;4.木犀草素;5.槲皮素

2.3 样品测定和回收率

利用上述最优化条件,对中药菟丝子和珍菊降压片中有效成分进行测定,得到了电泳图谱。如图3和图4所示,测得中药菟丝子中芦丁的含量为2.15mg·g-1,山奈酚的含量为3.75mg·g-1,槲皮素的含量为4.32mg·g-1,珍菊降压片中芦丁的含量为65.5mg·g-1。取6份已知含量的样品,定量加入混合标准品,得到菟丝子中芦丁、山奈酚和槲皮素的平均回收率分别为94.2%,107.8%和102.8%。珍菊降压片中芦丁的平均回收率为106.2%。

3结论

本实验首次建立了利用毛细管电泳法测定芦丁、山奈酚、木犀草素和槲皮素4种黄酮类化合物,4种物质在7min内实现了良好的分离。较其他检测方法相比,本实验具有样品用量少、快速、简单、低耗等优点。应用于中药菟丝子和珍菊降压片有效成份的测定,得到的结果准确可靠,该方法还可以推广应用于测定其他中草药中上述4种成分的含量。

参考文献

[1]裴凌鹏,惠伯棣,金宗濂,等.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展[J].食品科学,2004,25(2):203-207.

[2]XIAO J,CAO H.,WANG Y.,et al.Glycosylation of dietaryflavonoids decreases the affinities for plasma protein[J].Ag-ric.Food Chem.,2009,57(15):6642-6648.

[3]SLIMESTAD R,FOSSEN T,VERHEUL M.The flavonoidsof tomatoes[J].Agric.Food Chem.,2008,56(7):2436-2441.

[4]黄媛平.RP-HPLC法测定胆宁片中金丝桃苷的含量[J].亚太传统医药,2011,7(9):31-32.

毛细血管电泳仪 篇10

1资料与方法

1.1一般资料

正常组、变异体组、缺铁性贫血组分别选取10名正常人(无糖尿病、贫血等疾病的健康人)、血红蛋白变异体患者、缺铁性贫血患者,静脉采全血6 m L,平均分为两份,加入抗凝剂EDTA,制成血液样本,于4°C环境下保存。见表1。

1.2对象的纳入标准

血红蛋白变异体组病例纳入标准:临床检查中Hb A1c结果与血糖结果不符,经血红蛋白电泳检测后确认存在血红蛋白变异体的病例。缺铁性贫血组病例纳入标准:根据临床血液学依据[2]。正常组纳入标准:经全面检查后,排除糖尿病,贫血等的健康人。

1.3仪器和试剂

毛细管蛋白电泳仪和伯乐D10糖化血红蛋白分析仪,及其各自配套试剂。

1.4原理

毛细管电泳法原理:在碱性缓冲液及高电压环境下,由于血红蛋白不同组分所携带电荷数差异的存在,在电场力的作用下其泳动速率也存在差异,因而可以完成不同组分的分离,并予以测定[3]。伯乐D10糖化血红蛋白分析仪原理:采用高效液相色谱法(HPLC)检测全血糖化血红蛋白,由于糖化后的血红蛋白所带电荷数的差异,测量其在波长为440 nm时的吸收情况,通过软件进行测定和计算,从而完成糖化血红蛋白的测定[4]。

1.5方法

1无干扰因素的情况下两种方法的比较:取正常组样本分为两组,分别用毛细管电泳法和伯乐D10糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白,记录其结果,并进行两独立样本的t检验,分析两种方法测得的糖化血红蛋白含量。2糖化血红蛋白变异体对两种方法的影响选取变异组的样本血,分为两组,分别编号。分别采用上述两种检测方法对两组样本血进行糖化血红蛋白的检测,记录其数据,进行统计学分析。将样本委托上海伯豪生物科技有限公司进行血红蛋白基因测序,得出变异体类型。3缺铁性贫血对两种方法的影响选取缺铁性贫血组的样本血,分为两组,并予以编号。采用上述两种检测方法对两组样本进行检测,并进行血清学检查,记录数据

1.6统计方法

采用软件SPSS 17.0进行统计学处理,计量资料用平均数±标准差(±s)表示,P<0.01为差异有统计学意义。

2结果

2.1无干扰因素的情况下两种方法的比较结果

经两独立样本t检验得P>0.05,t<2.101,认为两种检测方法在无干扰因素情况下测得糖化血红蛋白含量差异无统计学意义,二者相关性良好,见表2。

2.2两种检测方法的检测结果

伯乐A10糖化血红蛋白分析仪测得的Hb A1c结果与实际血糖值不符,而毛细管电泳法测得结果与血糖值基本一致。变异体类型主要为Hb E、Hb J-Bangkok、Hb New York、Hb G-Taipei和Hb F,见表3。

2.3缺铁性贫血对两种检测方法的影响

缺铁性贫血对两种检测方法的影响见表4、表5。3讨论

糖化血红蛋白是糖基化的血红蛋白,因其生成量取决于血糖浓度,与进食等因素无关,故临床上通过测定糖化血红蛋白的含量可以诊断患者是否患有糖尿病以及反映糖尿病治疗情况和预后。糖化血红蛋白测定是指测定糖化了的血红蛋白占总的血红蛋白的比例,正常人糖血红蛋白约占4%~6%,>6.5%基本可以确定为糖尿病患者,因为较血糖检测稳定,故糖化血红蛋白检测在临床具有重要的意义。检测糖化血红蛋白的方法有很多,如高效液相色谱法,免疫层析法、电泳法等,高效液相色谱法是目前最经典的检测方法之一。该次研究用毛细管电泳法与伯乐D10糖化血红蛋白分析仪(其原理为高效液相色谱法)做对比,比较二者相关性以及得出毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的优势变异体组的有关结果显示,毛细管电泳法的检测结果与实际血糖结果一致,而伯乐D10糖化血红蛋白分析仪的结果不一致。故在变异体存在的情况下,毛细管电泳法的优势性显而易见,这与某研究表明的电泳法可以分离绝大部分血红蛋白变异体相一致[5];而伯乐D10糖化血红蛋白分析仪不能提示血红蛋白变异体,其检测结果的准确性完全取决于变异体糖化率和正常血红蛋白糖化率的一致性。而后者结果的偏差很容易造成临床上的误诊。缺铁性贫血(IDA)的血清学检查结果显示,空腹血糖无明显差异,缺铁性贫血组血清铁含量明显减少,总铁结合力明显增加,糖化血红蛋白含量增加,IDA使得Hb A1c检测结果高于正常值,经补铁治疗后,结果均下降。但伯乐D10检测仪仅可显示糖化值的变化,无法确定是否有缺铁性贫血病史;毛细管电泳仪可得出Hb A2值,目前Hb A2的临界值为2.25%,可以根据其结果对IDA进行筛查。并且,在进行糖化血红蛋白的检测过程中,毛细管电泳法对环境条件、温湿度、p H的要求均低于伯乐D10糖化血红蛋白分析仪。且操作性更强,可重复操作,样本用量较小。

综上所述,毛细管电泳法具有精确性高,操作性强,受干扰因素少的优势,更加符合现代医疗的要求。与伯乐D10糖化血红蛋白分析仪相比,毛细管电泳法在缺铁性贫血或糖化血红蛋白变异等存在的情况下,对诊断更加具有参考价值,可以提示变异体存在与否以及其类型,提示是否有缺铁性贫血的发生,诊断准确性更高,更具有临床参考价值,建议在临床中推广使用,以提高糖化血红蛋白的检测效率与精确度,减少误诊的可能性。

参考文献

[1]王宏平.糖化血红蛋白的检测意义[J].中国实用医药,2007,2(6):10-11.

[2]邓家栋.临床血液学[M].上海:上海科学技术出版社,2001:23-86.

[3]李卿,刘文彬,金中淦,等.毛细管电泳法检测糖化血红蛋白的分析性能评估[J].检验医学,2015,30(2):181-182.

[4]杨兴萍.美国伯乐D-10糖化血红蛋白分析仪的性能评价[J].检验医学与临床,2011,8(21):2683-2684.