细管冷冻精液技术

细管冷冻精液技术（通用6篇）

细管冷冻精液技术 篇1

牛精液冷冻保存是将精液经过处理后, 再经超低温特殊处理, 达到长期保存的目的。目前主要是将细管冻精分装后, 在专用容器 (液氮罐) 内侵入液态氮 (-196℃) 中保存。其使用不受时间、地域及种公牛生产年龄的限制。

1 稀释作用及意义

稀释精液在于增加精液量, 扩大配种头数, 提高种公牛的利用率, 供给精子养分, 增加抗冻性, 防止低温打击, 延长精子的寿命, 便于精液的保存和运输。目前, 使用的稀释液主要是卵黄稀释液和无卵黄稀释液。稀释液具有保护精子免受冷休克, 补充精子能量, 减少精液黏稠度等作用。原精液采集后, 经过相差显微镜镜检、感官评测合格的精液, 取样稀释置于密度仪中, 按密度仪检测数据, 配制稀释液进行稀释, 稀释后每剂量0.25 m L细管中有效精子数≥800个, 解冻后活力不低于35%。

2 保存与检查

细管冻精经程控冷冻仪从4℃降温至-140℃后, 移至液氮中, 待液面稳定后, 一份样取3支细管冻精在40℃水中解冻10 s后取出擦干, 剪去两端封口, 用移液器 (管) 取固定量精液在37℃恒温板上镜检精子活力大于35%以上, 每25支细管分装一根拇指管, 4根拇指管 (100支) 再装入一个纱布袋内, 标注牛号、品种、生产日期等信息后入库贮存于液氮罐中, 液氮罐上也同样标注清楚贮存信息, 整个过程细管和包装物不得离开液氮, 经批次检测菌落数等指标合格, 可长期保存或发售。库存期间根据不同型号液氮容器液氮消耗情况, 液氮面每周最少检查一次, 并及时补充, 确保冻精提筒在液面以下, 不能按时补充液氮时, 将冻精纱布袋用长绳系牢沉到罐底, 一端系于罐口处, 可延长7~10 d的保存期, 冻精储存室内保持通风良好, 防止阳光直射及鼠害。

3 解冻与使用

取用冻精时, 尽可能用长镊子, 切勿将提筒或纱布袋提到临界线以上 (罐口10 cm左右) 。从液氮中取出细管冻精时, 要轻轻甩一两下, 将塑料细管的棉塞端放入35~40℃的温水中, 待管内精液融化后或细管颜色变白后取出备用。解冻后的精液镜检时, 精子的活力不低于标准方可用于输精, 也可在输精后留一点镜检或同时解冻一支抽检精子活力, 确保正常受精。解冻后的精液应立即输配, 不宜停放时间过长, 做到现解现输精。输精后保留细管空管, 并做好详细记录。

4 适时输精

母牛正常排卵是在发情结束后6~12 h, 精子在母牛生殖道的存活时间为8~20 h, 且还需要2~6 h的获能过程, 才能与卵子结合受精。精子15 min就会到达输卵管受精部位, 因此, 让精子早于卵子到达输卵管受精部位是提高受胎率的先决条件。

4.1 输精时间

母牛在发情后期, 精神平稳, 外阴部肿胀消失, 阴道不再流出透明液体。直肠检查卵泡胀大, 表面紧张, 有一触即破之感, 此时为最佳输精时间, 输精后确保牛处于安静状态, 2 h内限制饲喂饮水。

4.2 输精部位

最佳输精部位在子宫颈内口1 cm处即子宫体基部, 过浅易导致精子在母牛体内耗损过大, 影响受胎, 过深易损伤子宫内黏膜, 如确定了卵泡的发育位置, 可将精液直接输入相应的子宫角口内1~2 cm处, 输精时输精枪不能与子宫壁接触。

4.3 输精方法

直肠把握子宫颈输精法。将母牛保定, 左手插入母牛直肠轻轻握住子宫颈后端, 右手将输精器自阴门向斜上方缓慢插入5~10 cm (以避开尿道口) 后再改为平插送到子宫颈口, 缓慢越过子宫颈管中的皱壁, 到达适宜的输精部位, 慢慢注入精液后, 缓缓抽出输精器。

4.4 输精次数

每个情期输精一两次为宜。可在发情母牛发情盛期后4~6 h时, 进行第一次输精, 间隔8~12 h再进行第二次输精。

摘要：作者从稀释与解冻等多方面分享牛细管冻精的保存和使用的技术操作, 以供同行参考学习。

关键词：牛,细管冻精,保存,使用

肉羊细管冷冻精液的制作 篇2

1 精液冷冻前工作

1.1 种公羊饲养管理

种公羊精液品质好坏是整个冻精成败的决定因素。为此我们制定了科学合理的种公羊饲养管理操作规程和种公羊饲养标准, 使种公羊在整个配种期间始终保持中上等膘情, 具有良好的种用性能。

1.2 采精

采精后将精液及时通过窗口送到检精室并登记种公羊耳号, 初步确定采精数量, 并在20min内完成精液品质检查, 确定稀释倍数。

2 稀释

2.1 稀释液制作

取二水柠檬酸钠3g、葡萄糖3g, 加双蒸水100ml充分溶解后, 过滤3遍隔水煮沸消毒20min冷却降至室温, 加入新鲜卵黄25ml即配成基础液 (配方一) 。取基础液88ml, 加甘油12ml, 加3%多不饱和脂肪酸或VE, 再加入青、链霉素各10万单位, 混合均匀 (配方二) 。应用该稀释液精子解冻后顶体完整率达46.5%, 在37~38℃环境中放置5h的存活率达35%, 冻后冻精活力达0.42。

2.2 稀释

第一次稀释倍数应为最后稀释体积的50%, 用基础液也就是配方一稀释, 在30~35℃水浴锅内进行稀释, 要求精液与稀释液必须等温。

2.3 降温

将第一次稀释的精液与二液一同在0~4℃的恒温箱中降温1h。

2.4 第二次稀释

在0~4℃条件下用配方二液稀释至最终倍数。一定要求精液与稀释液必须是等温。

2.5 分装和平衡

加入二液后在低温柜中进行细管分装。分装好的精液应注意同方向在细管精液架码平, 在0~4℃条件下平衡2h, 使精液和稀释液以及稀释液中的抗冻剂甘油充分混合。

3 冷冻

应用自制冷冻箱冷冻, 初冻温度控制在90~105℃, 时间3min。冷冻温度控制在140℃, 温度6min, 在实际中也就是冻结网距液氮面在3~5cm。整个冷冻过程控制在9min以内。

4 保存

冷冻完成后, 按羊号投入盛满液氮的液氮罐中, 注意使细管棉塞封口端朝下, 以免棉塞爆出。定期检查液氮是否需补充, 以细管精液损坏。

5 解冻

经过多次试验, 最佳解冻温度为42℃温水中, 解冻8s。冻后精子活力达0.45, 冻精顶体完整率达50.2%。在实际操作中细管在空气中停留约1s再按上述解冻效果会更好。

摘要：该文详细介绍了肉羊细管冷冻精液的制作过程, 重点强调了稀释液的配制, 冷冻温度以及最佳解冻温度。

牛精液冷冻技术 篇3

为了在保存过程中保持精子活力, 在存取精液时应注意以下事项:

1. 编号存放。

冷冻精液的包装上须明确标明公牛品种、牛号、生产日期、精子活率及数量, 再按照公牛品种及牛号将冷冻精液装入液氮罐提筒内, 浸入固定的液氮罐内贮存。

2. 浸入液氮。

定期添加液氮, 使罐内贮存的颗粒冷冻精液或细管精液完全浸在液氮里, 且液氮体积不能少于罐体容积的2/3。用绳子拴系的精液包装物, 切勿因绳索缠结, 而使精液未能浸入液氮内造成温度升高。

3. 取用迅速。

在液氮中提取冷冻精液时, 不得提出液氮罐口外, 而应置于罐颈之下。要用电简照看清楚, 用镊子夹取精液, 做到目标准确, 动作利索。精液每次脱离液氮时间不得超过5秒钟。

二、液氮罐的使用

1. 保证安全。

不得用液氮罐盛装液氧、液态空气, 以免对罐体造成氧化腐蚀。新购或长期未用的液氮罐, 必须仔细检查, 确定外部无破损、无异常, 内部干燥、无异物, 颈管和盖塞完全, 贮精提筒完好。盛装液氮1天后观察液氮的损耗率, 各项指标合格后方可使用。

2. 注入液氮。

大液氮贮槽内的压力一般为2万～3万帕, 利用自身压力即可将液氮注入罐内。也可将液氮运输罐的液氮经漏斗注入贮存罐内, 为了防止液氮飞溅, 可在漏斗内衬一块纱布。

3. 贮存精液。

各种剂型的精液均须迅速放入经预冷的底布座袋贮丌, 或精手小提柄瓶筒置内内于浸, 丌罐入浸口液入的氮罐槽内, 沟纱液内布氮。袋面颗或以粒小下冷瓶, 将冻系提精一筒液标底可签部装固套入定入纱在罐口外。

4. 取用精液。

为了缩短开盖时间, 应事先做好准备工作。贮精提筒提至颈管基部, 在5秒钟内完成精液的取用操作, 并注意将精液容器再次浸入液氮内。

5. 补充液氮。

当液氮消耗1/2时, 即应补充液氮。罐内液氮的剩余量可用称重法来估算, 也可用细木条插至罐底, 经10秒钟取出, 测量结霜的长度来估算液氮的剩余量。

6. 液氮罐的保养。

液氮罐放置在凉爽、通风且干燥的室内, 严防受碰撞。注意保护盖塞和罐的颈管部, 此部分质地脆弱易于损坏。罐体不可横倒放置, 每年应清洗1次罐内杂质。空罐放置2天后, 用40～50℃中性洗涤剂擦洗, 再用清水冲洗多遍, 使之自然干燥。

三、冷冻精液的运输

由冷冻精液站提供的冷冻精液必须经过精子活率检查, 查验公畜品种、畜号及数量, 与标签一致、无误后方可运输。盛装精液的液氮罐必须确保其保温性能, 液氮罐应罩有保护袋或装入木箱内, 牢固稳妥, 严禁撞击和翻倒。另外, 运输途中要减少震动, 超过期限要注意补充冷源。当精液运达输精站时要办理好交接手续。

四、冷冻精液的解冻

由于剂型不同, 冷冻精液的解冻方法也有差别。颗粒冷冻精液解冻的稀释液要另配, 细管冷冻精液不需要解冻稀释液。

1. 颗粒精液的解冻。

先要配制解冻稀释液, 一般常用的是2.9%柠檬酸溶液、维生素B12 (0.5毫克/毫升) 溶液、葡柠液 (葡萄糖3%、二水柠檬酸钠1.4%) , 解冻液可装于玻璃安瓿中, 经灭菌后长期备用。

解冻时, 先取1～1.5毫升解冻液放入小试管内, 浸入40℃热水中经2～3分钟后投入1粒精液颗粒。待溶化1/3～1/2时, 即取出精液试管, 在常温下轻轻摇动至完全解冻后, 检查评定精子活率, 然后进行输精。

2. 细管精液的解冻。

由液氮罐内迅速取出一支细管冷冻精液, 立即投入40℃的热水中, 待精液基本溶化时, 用灭菌小剪剪去细管的封口端, 装入细管输精器中。检查细管精液品质, 可按批抽样评定, 不需每支精液液均均作作检检查查, 否则将会减少每头份精液的输精量及输入入精精子数。

3.注意事项。

牛冷冻精液人工输配技术 篇4

1 掌握好母牛发情特点

(1) 能繁母牛发情的时间较短。能繁母牛发情持续时间的长短与其垂体前叶分泌的性激素比例有很大关系, 能繁母牛的垂体前叶分泌的促卵泡素是各种家畜中最低的, 其具有促进卵子发育和发情的作用;而能繁母牛的垂体前叶所分泌的促黄体生存素又是各种家畜中最高的, 它具有促进卵子成熟和排卵的作用, 因此能繁母牛发情持续时间较短而排卵很快。

(2) 能繁母牛在交配结束后排卵。绝大多数能繁母牛具有一个特别之处, 其排卵是在交配结束后12~18 h内进行, 这与能繁母牛性中枢对雌激素的反应有很大关系, 当血液中含有少量雌激素时则兴奋, 而含大量雌激素时则抑制。当能繁母牛发情开始时, 其卵泡中只产生少量雌激素, 性中枢兴奋则产生交配欲, 当卵泡继续发育接近性成熟时, 迅速产生大量雌激素, 其性中枢受到抑制则交配欲消失;但其卵泡还在继续发育, 最后在促黄体生成素的协同作用下进行排卵, 排卵是发情结束的标志, 大多数能繁母牛是在拒绝爬跨的8~12 h之间进行排卵, 大多数能繁母牛的排卵时间是在22:00至凌晨3:00内进行, 因此能繁母牛的排卵是在交配欲结束后进行。

(3) 能繁母牛发情后阴道外观具有出血现象。相当一部分能繁母牛常在发情后2~3 d出现子宫内出血从阴道内流出, 其中以营养较好的能繁母牛常见, 出血量也较多。其原因是发情时子宫黏膜的血管增生, 子宫阜上的毛细血管破裂所造成的, 这方面属于正常现象。实践证明, 能繁母牛发情后出血量在20~30 m L时、血色是正常的, 对妊娠无不良影响;若出血较多而且颜色暗红或呈紫色, 则是其子宫内膜炎的征兆, 此时绝不能进行输配, 否则输配失败, 更为严重的是造成能繁母牛生殖道感染, 甚至不能生育。

2 做好母牛发情鉴定

(1) 外观表现鉴定。发情母牛外观主要表现为:发情前期神态不安、食欲减退、阴唇轻微肿胀、充血, 黏膜呈粉红色, 阴门排出少量清水样粘液, 粘性差, 不肯放牧, 寻找其他牛群, 但不接受爬跨。发情中期鸣叫不止, 两耳竖听, 追赶其他牛和爬跨其他母牛, 相互嗅闻, 举尾闪腰, 排尿次数多。阴门流出多量透明粘液。粘性较强, 阴唇肿胀明显, 色泽潮红, 愿接受爬跨, 被爬跨时站立不动并回头探望。发情后期不再鸣叫, 阴门排出的粘液由透明变半透明状, 量逐渐减少, 阴唇外缘有干壳, 肿胀逐渐消退, 出现皱纹, 食欲恢复, 不再接受爬跨。

(2) 直肠检查鉴定。母牛发情的实质是卵巢上有成熟的卵子排出, 通过直肠检查, 触摸卵巢上卵泡发育情况以及子宫变化情况作出判断;卵泡随着发情盛期的到来, 体积不再增大, 泡体由硬变软, 泡壁由厚变薄, 波动感明显, 并扩及整个卵巢, 最后破裂, 释放卵子, 并于卵巢上开成一凹陷, 后逐渐形成黄体;发情母牛子宫内膜增生充血, 旺盛期多数母牛被触摸时, 子宫卷曲收缩, 质地变硬, 呈“勃起”状, 体积比休情期大, 此为发情母牛又一特征。

(3) 种公牛试情鉴定。为进一步判定母牛是否正常发情, 就是母牛一般发情表现时, 为进一步明确, 让公牛接近母牛, 然后跟踪观察, 依据母牛的精神状态和公牛的行为表现来判定母牛是否正常发情[2]。

3 做好输精前准备

(1) 严格消毒。冻配器材、工作人员、输配环境都要严格消毒, 建立严格的卫生制度。器械采用细菌消毒柜消毒。工作人员在输配前验精和输精过程中不能喝酒、吸烟和使用刺激性大的消毒液。在工作中穿戴消毒灭菌的工作服, 并在洗手后进行操作, 应保持环境安静清洁。

(2) 解冻冻精。取适量解冻液放入清洁、灭菌试管中, 并将试管置于38~41℃的温水中升温, 打开液氮罐, 将冻精提到颈口, 用预冷的灭菌镊子取出冻精迅速放入解冻液中快速解冻。必须注意:所接触冻精的器械都应消毒、预冷;必须在20~30 s解冻结束, 做到现解冻现输配, 解冻到输精不能超过3 min。

(3) 保证精液品质。为了提高受胎率, 在输配前必须对解冻后的精液进行镜检, 观察解冻后精子的复苏率、活力以及品质, 冻精活力在0.3以上的方可输配, 否则不能保证母牛正常受精[3]。

4 合理选择配种时间和方式

采用“老配早、少配晚、不老不少配中间”的方法, 即年老体弱的母牛发情时间持续期较短, 排卵较早, 配种时间要适当提早;青年母牛发情持续期较长, 排卵较晚, 配种时间适当延长。采取复配方式, 坚持2次输精。即在母牛表现发情10~12 h进行第1次输精, 间隔10~12 h再重复配1次[4]。一般发情的母牛在第2天上午进行第1次配种, 以后间隔10~12 h再输配第2次。

5 适时输精

做好适时输精, 必须明确3个时间界线:一是一般母牛发情外观表现时间为20~26 h, 但品种、年龄、季节、个体的不同, 又有一定差异。黄牛为24~48 h, 水牛为36~48 h, 青年母牛为26~32 h, 壮年母牛为22~30 h, 老年母牛为18~24 h。二是排卵时间是在发情结束后6~12 h, 排出的卵子能正常受精时间仅为6~10 h。三是精子在母牛生殖器内存活的时间为12~20 h, 且有4~6 h获能过程才能与卵子结合受精。尽量采用同期发情输配, 这是目前提高受胎率的最好途径。

参考文献

[1]沈培敏.提高黄牛冻配受胎率的主要措施[J].畜牧与饲料科学, 2010 (2) :138-139.

[2]徐创林, 叶福香, 张爱萍.奶牛性控冷冻精液人工授精试验示范与探讨[J].畜牧与饲料科学, 2009 (9) :85-86.

[3]张新兰.提高奶牛人工授精受胎率的关键措施[J].畜牧与饲料科学, 2008 (6) :72.

猪精液冷冻技术研究进展 篇5

猪精液冷冻技术涉及多个步骤, 主要包括: (1) 公猪精液的采集; (2) 精液稀释液的配制; (3) 精液预处理; (4) 精液冷冻; (5) 精液保存; (6) 冻精解冻。其核心步骤是猪精液的冷冻、保存及冻精解冻。

1 精液的冷冻

1.1 冷却源

猪精液冷冻的冷却源主要有干冰 (-79℃) 、液氮 (-196℃) 、液氦 (-269℃) 。目前主要以干冰与液氮为主。研究表明, 使用干冰作为冷源制作的冻精在解冻后的精子活力略高于使用液氮作为冷源制作的冻精。但由于干冰造价高于液氮且不易保存, 因此实际生产中仍以液氮为主要冷却源。

使用液氮作为冷源制作冻精的方法, 目前主要有2种:细管冷冻法, 液氮颗粒冷冻法。由于颗粒冷冻精液较难进行不同头份 (来源) 的区别, 且容易造成交叉污染;而细管冷冻法的优点是不像颗粒冻精一样容易受污染, 且容积小、冷冻快, 受胎率也较高, 所以细管冷冻法在实际生产中的应用较多。目前, 研究者在细管冷冻法的基础上通过不断优化液氮面平衡高度与冻精管直径的大小来提高冻精的质量。液氮面平衡高度为5 cm时, 最适合使用0.25 m L细管;5 m L大管在3 cm平衡高度时使用效果最好。

1.2 精液稀释

猪精液稀释液为猪精液提供了必要的生存环境。研究者在常规的稀释液中添加Equex.STM (一种合成乳化清洁剂, 与卵黄共同作用能有效抑制顶体的异常变化) , 结果显示:添加Equex.STM的稀释液对冻精活率有提高, 与常规稀释液相比差异不显著 (P>0.05) , 但对冻精顶体完整率却有极显著的提高 (P<0.01) , 在一定程度上使冻精质量有所改善。

1.3 冷冻速率

冷冻速率对猪精液的冷冻至关重要, 在冷冻精液制作过程中必须提高冷冻速度, 温度须持续下降, 不能出现回升现象。精液在冷冻过程中应快速通过危险温区 (0~-60℃) , 这样才能提高冻精解冻后的活率。有研究表明, 采用50℃/min, 平衡温度-120℃、10 min, 精液的冷冻效果较好。理想的冷冻速率推荐为:0.5 m L细管采用30℃/min、3%甘油浓度, 或0.25 m L细管采用50℃/min、3%甘油浓度。

2 猪精液的保存

精浆是精液的重要组成部分, 具有调整精液p H值, 为精子提供营养物质, 防氧化等生理作用。精浆在冷冻精液中能乳化类脂、稳定精子膜中的类脂, 减小或抑制由于超低温冷冻保存而造成的类获能性变化, 从而起到保护精子的作用。有研究表明, 添加10%精浆冷冻保护剂对冻融后精子的品质有提高作用。一定浓度的精浆冷冻保护剂对猪精液的冷冻保存有利, 但若浓度过大, 却不利于冷冻精子存活。

3 猪冻精的解冻

解冻是猪精液冷冻保存的关键一步, 让精子在解冻后迅速恢复活力是十分重要的。目前常用的解冻液有Glucose-EDTA解冻液与DPBS-BSA解冻液。由于含糖的Glucose-EDTA解冻液给解冻精子及时补充了能量物质, 相对于不含糖含BSA的DPBS-BSA解冻液来说, 前者更能使精子快速恢复活力。在实际生产中, 推荐使用Glucose-EDTA解冻液用于冻精的解冻。

冷冻到-196℃的冻精在解冻过程中精子要两次经过临界温度区 (-60℃和-15℃) 。为使解冻后精子仍能存活, 只有通过适宜的解冻方法才能确保其复活。适当的解冻温度能使冷冻精子快速越过危险温区, 使玻璃化快速越过结晶态直接变为液态, 降低对精子的伤害。Olesenz等直接把0.25 m L微细管放于70℃水浴中解冻8 s;Woelders等的解冻方法是在39℃水浴中解冻30 s。目前研究证明, 37℃、30 s水浴解冻方法更适合0.25 m L细管猪冻精的解冻;颗粒冻精解冻适用干解法:40~45℃、8~10 s即可使精子的平均活率达到最高。

研究人员今后还需对猪精液冷冻技术的各关键步骤进行优化调节, 例如使用均匀降温的方式生产冻精, 使用高效的冷冻液等方式来提高冻精的使用效果。

参考文献

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[3]赵祥杰.猪精液颗粒冷冻技术的研究[J].东北农业大学学报, 2008, (3) :70-75.

[4]张渭斌.咖啡因对猪精液冷冻的影响及冷冻-解冻方法的优化[J].中国畜牧兽医, 2010, (10) :148-152.

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[6]刘彪.精浆对猪精液冷冻效果影响的研究[D].东北农业大学硕士学位论文集, 2012.

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[8]Olesen I.Effects of cervical insemination with frozen semen on fertility and litter size of Norwegian sheep[J].Livestock Production Science, 1993, 37 (1-2) :169-184.

[9]Woelders H, et al.Cryopreservation of boar semen:equilibrium freezing in the cryomicroscope and in straws[J].Theriogenology, 2005, 63 (2) :383-395.

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山羊冷冻精液人工授精技术要点 篇6

1 选好输精员

选择具有一定文化水平, 最好是专业技能、综合素质较高的人员担任输精员。经县级以上业务主管部门培训合格, 核发证书后才能从业, 不断加强职业道德教育, 并作定期考核。服从业务部门的领导和指导, 爱岗敬业, 有良好的职业道德和服务精神。

2 保证母羊正常的繁殖机能

母羊正常的繁殖机能是母羊进行人工授精配种受胎的前提。加强母羊配种前补饲, 确保母羊繁殖机能正常。生产中, 在发情配种前10～20 d, 每头母羊夜间补充玉米、豆类等混合精料0.25 kg、食盐20g/d、青饲料3～6 kg, 保证繁殖母羊有一个良好的体况, 促使母羊正常发情、排卵。

3 细管精液的贮存

贮存冻精的低温容器应符合GB5458-85《液氮生物容器》标准规定;专人负责及时补充液氮, 保证冻精浸在液氮中;每只公羊的冻精单独贮存;贮存冻精的容器每年至少清洗1次并勤换新鲜液氮;取放冻精时, 冻精离开液氮的时间不得超过5 min;取放冻精之后, 应及时盖好液氮容器塞, 以免液氮大量蒸发和异物落入。

4 输精器材消毒

输精器先用2%的碳酸氢钠清洗再用清水冲洗, 然后用蒸馏水冲洗数次, 最后用毛巾包好, 进行蒸汽灭菌。开膣器通常用酒精火焰消毒, 消毒之后的开膣器要置于生理盐水中待用。纱布、手巾、台布等用肥皂水洗干净, 冲洗2遍后进行蒸汽灭菌。

5 适时输精

1) 输精在输精室举行, 输精室面积20～30 m2为宜。

2) 发情鉴定。母羊发情征候: (1) 精神状态的变化。发情母羊常表现精神不安, 不时鸣叫, 爬墙, 并且有摇尾表现, 频频排尿;当用手按压其臀部时, 摇尾更甚;同时食欲减退, 反刍停止, 放牧时常常有离群现象;主动接近公羊, 爬跨其他母羊, 并接受爬跨, 两后腿分开, 呈交配姿势。 (2) 生殖道的变化。外阴部充血、肿胀;分泌物增多, 并有黏液流出;子宫颈口开张, 子宫颈充血, 子宫与阴道收缩加强。

3) 配种适期。母羊从性成熟开始, 每隔21 d左右发情1次, 发情持续期一般平均为30 h。发情开始后24～36 h为配种适期, 此时阴户红肿刚减退 (打皱) , 粘液由稀变浓, 躁动稍减, 老母羊、外来品种应稍提前, 小母羊、本地品种可稍延长。

4) 细管冻精解冻。直接置于37～38℃水浴中解冻10 min, 至冻精完全融化, 擦去细管表面水分后装枪输精。

5) 活力检查。取解冻后精液1滴于载玻片上, 加盖玻片, 立即在200～400倍显微镜下观察活力, 环境温度或载物台温度保持37～38℃;也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力, 每个样品观察3个视野, 注意不同液层内的精子运动状态, 进行全面评定。呈直线运动的精子数占总体精子数的30% (即活力0.3) 以上方可用作输精, 对活力在0.3以下的精液不能使用。

6) 输精量。一般一次为0.25 mL (一支细管冻精) , 有效精子数不少于5 000万, 一个发情期可输2次, 间隔8～12 h。每输精1次应换一套输精器械。

7) 输精。输精前, 操作人员要洗手, 把消毒好的输精器械用少量稀释液冲洗2～3次, 将精液装入输精器。有条件的地方, 将待配母羊送到输精室内的输精架上固定好, 进行保定, 一般情况下采用倒提后腿法进行保定。母羊保定好后, 用0.1%的高锰酸钾溶液擦洗外阴部, 进行消毒。输精员右手持输精器, 左手持开膣器, 先将涂有润滑剂的开膣器顺着阴门插入阴道, 旋转90度, 再将开膣器轻轻打开, 找到子宫颈口, 然后将输精针插入子宫颈0.5～1 cm深处, 轻轻注入精液, 最后缓慢取出开膣器和输精针开膣器在阴道内始终处于开张状态, 不能闭合, 以免夹伤母羊。

如果打开开膣器后, 发现母羊阴道内黏液过多或有排尿表现, 应让母羊排尿或设法使母羊阴道内的黏液排净, 然后将开膣器再插入阴道, 仔细寻找到子宫颈口, 再进行输精。遇到初配母羊, 由于阴道狭窄, 开膣器打不开, 只有进行阴道深部输精, 但应加大输精剂量 (2～3倍) 。输精后的母羊应保持2～3 h的安静状态, 不能让其接近公羊或强行牵拉。

8) 做好人工授精配种登记记录, 以便推算预产期。

6 返情情况观察