冷冻保存（共9篇）
冷冻保存 篇1
1 稀释液和抗冻保护剂 (CPAS)
一般来说, 三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸和果糖或葡萄糖作为稀释基础液常用于兔精冷冻保存。事实上, 当比较几种兔精冷冻保存的稀释液时, 它们没有一种比三羟甲基氨基甲烷稀释液提供更好的结果。
正如多数家畜, 卵黄常用在兔精冷冻稀释液中, 其浓度变化范围在10%~20%。虽然脱脂牛奶的使用没有卵黄常见, 但是脱脂牛奶 (8%~10%的终浓度) 也在一些兔精稀释液中使用。一些研究者甚至发现脱脂牛奶没有三羟甲基氨基甲烷-柠檬酸-果糖-卵黄稀释兔精液的效果好。然而, 当使用高浓度二甲基亚砜时, 含有卵黄、脱脂牛奶、卵蛋白、乳白蛋白或大豆卵磷脂在解冻后并不会改善精子质量, 因而可以不用加入。
通常将甘油作为兔冷冻精液中唯一的抗冻剂所获得的效果要低于那些用新鲜的精子以及用其他抗冻保护剂 (乙二醇、二甲基亚砜或者酰胺类) 冷冻精子所获得的效果。因此, 虽然甘油仍然作为多数家畜精子最适宜的抗冻保护剂, 但它并不是兔精抗冻保护剂的选择。与甘油处理兔精相关的受精率问题是由于在冷冻保存后甘油对精子的影响, 而不是在雌性生殖道内的这种抗冻剂或者新鲜精液中的避孕效果。
然而, 什么原因引起兔精和其他家畜之间选择抗冻保护剂的差异?兔精不像其他家畜精子, 它表现出一种低水渗透系数和高活化能。用兔精冷冻保存的低分子量和高渗透性的稀释液中的抗冻保护剂 (如二甲基亚砜或酰胺) 而不是甘油的需要量与这一低水渗透值相符。
一般而言, 稀释液中抗冻保护剂浓度的降低对冷冻解冻后的精子质量起着良好效果。例如, Fox and Burdick (1963) 发现当稀释液中的甘油或乙二醇浓度低于4% (而不是8%) 时精子质量得到了改善, 这一发现也在后来的研究中得到了证实。然而, 在一些稀释液中使用了高浓度的二甲基亚砜 (12.4%~17.5%) , 降低了卵黄或脱脂牛奶的含量, 排除了这些高浓度的二甲基亚砜可能对精子的毒性作用。不过, 虽然精子活力随着二甲基亚砜浓度的增加而增加, 但是在一些研究中已经证实了在含有卵黄的稀释液中将这种抗冻保护剂的浓度增加4.5%~5%, 其对精子顶体和体内受精率就会产生副作用。如果在稀释液中添加二糖如蔗糖, 那么二甲基亚砜对精子顶体的副作用可能会降到最低。
2 影响冷冻保存的兔精液受精率和繁殖率结果的因素
当使用冷冻保存的精子进行人工授精 (AI) 时所看到的最大问题之一是获得结果的差异性。一些可能对结果产生的影响因素是有效精子数、原精液的浓度 (当使用固定的精液稀释更重要) 、雄性供体 (精子抵冻力) 以及授精的雌性受体。兔场也是一个重要因素 (依赖于兔场, 雌兔的管理是不同的) 。
通常使用冷冻保存的精子比使用新鲜精子进行人工授精时需要更多的有效精子数。如果单个的雄性被用于人工授精, 那么这些高剂量的有效精子数是一个问题, 因为少量的雌性可以从单个的雄性中获取射出的精液进行授精。此外, 多数研究一直使用少量的雌性授精 (低于20) , 因此精子受精力的估计并不准确。研究中精子数量变化很大, 因而比较起来十分困难。一些人对有效精子数进行研究 (一般每只雌兔有效精子数在3×106~15×106之间) , 而其他总精子数 (活精子和死精子) 浓度 (一般每只雌兔的有效精子数在25×106~30×106之间) , 或者确定精液稀释液 (授精的有效精子数变化依赖于原精液的浓度) 。
兔子的受精率和繁殖率是其重要特征。对授精的精子浓度或兔精冷冻保存受精力的稀释比研究的很少。最适宜的精子浓度可能会在使用稀释液配方之间有所不同。虽然冷冻保存的精子数量低于每只雌兔的有效精子数为1×106表现类似于新鲜精液的受精力, 但实际中会使用更高的精子数量。然而, 冷冻解冻精子的受精率并不是通过增加有效精子数数来弥补。冷冻前精液的稀释比 (1:10~1:100) 也不影响受精力。
关于用冷冻保存的兔精人工授精后获得少量的产仔数, 这一特征更取决于有效精子数 (达到一种上限) 或者稀释比。尽管受精率对有效精子数和稀释比产生类似的效果, 但是与每只雌兔的有效精子数为10×106或低比例精液稀释 (1:10) 相比, 当使用每只雌兔的有效精子数为1×106或者高比例稀释精液 (1:100) 时, 产仔数就会减少。也许在这些低剂量的有效精子数和高比例稀释中建立输卵管的精子库并不恰当。然而, 当用于每个雌兔的有效精子数超过10×106时产仔数并没有增加, 这可能表明在冷冻保存过程期间产生了对精子不可逆的损害 (可能与胚胎发育失败有关) 。
虽然多数研究表明冷冻保存的精子受精力比新鲜精子低 (≤60%) , 但是一些研究者发现用新鲜精子获得了类似结果 (受精率和/或产仔率) 。此外, 即便是报道了良好的受精率, 通常用冷冻保存精子比用新鲜精子进行授精的雌兔表现更低的产仔数 (低于2~3只) 。
3 使用冷冻解冻的精子人工授精后改善实验结果的方法
人们为了改善冷冻保存兔精的结果试验了几种方法。一些方法试图改善精子自身来提高冷冻解冻后以及用冷冻保存的精子进行人工授精的试验结果, 其他方法包括几种稀释液的引进或人工授精技术的改进。此外, 宫腔内授精也能被用于改善兔精冷冻保存的试验结果。接下来讨论使用过的 (或可能被使用) 技术来提高精子冷冻保存的结果。
3.1将精子放到卵子附近
在所有家畜中冷冻保存精子的主要特点之一是表现了一种与获能精子相似的状态。这种现象被命名为冻精获能。因而, 当把冷冻保存精子与新鲜精子相比时, 其在体内和体外都表现出活力的降低和功能的改变。这就迫使我们在接近于排卵时刻并且在雌兔生殖道深部进行人工授精。例如, 与新鲜精子相比, 使用冷冻解冻的精子对卵子进行受精几乎没有看到。此外, 当用新鲜精子授精时只在卵子附近发现了活精子。一些研究者发现大多数精子会到卵母细胞的透明带中去, 此时冷冻保存的精子受精率较高。人们提出将存活在卵母细胞附近的精子数作为一种方法来评估雌兔生殖道内精子运动能力以及精液质量。
子宫或输卵管内人工授精能够使精子更接近于卵子。它在多个家畜中被广泛用于改善冷冻保存精子得到试验结果的一项技术。当对家兔进行传统的人工授精时, 将精子输送到阴道深处的子宫颈附近, 由于这种家畜生殖道的特性使其很难按照常规技术进行子宫内或者输卵管内人工授精。据我们所知, 仅有一个报道是使用冷冻保存兔精进行子宫腔内人工授精并且是在试验情况下手术进行的。在接近排卵期使用冷冻保存精子进行人工授精是广泛应用于所有家畜的一种方法, 这种方法试图被广泛用于增加兔精冷冻保存的受精率。
虽然出现的任何方法能够被用于增加兔精冷冻保存受精率的目的, 但是在某些情况下由于经济成本和技术难题以及这些技术耗时, 现在大规模应用是不可行的。因此, 它们只能用于试验。
3.2改变原精液
迄今为止, 通过改变冷冻稀释液 (对不同的冷冻保护剂和稀释液的量, 或者含有不同成分进行试验) 或者配方 (对不同的冷冻、解冻率进行试验) 来试图提高精子冷冻存活率。然而, 一种增加冷冻保存后精子存活率的可供选择的方法将会作用于精子本身。
水中添加的维生素或者饮食中富含的矿物质 (Se, Zn) 和/或维生素 (维生素E或维生素C) 对兔原精液质量的影响进行了试验。通常食物或饮用水中添加维生素或矿物质增加精子质量, 通过提高精清和精子中的抗氧化剂如谷胱甘肽的S-转移酶以及谷胱甘肽-氧化酶的酶活性减少自由基的产生。然而, 这些补充过的饮食可能对冷冻保存后精子质量产生的影响还没有试验。
精液也可以在射精后进行改善。如上文所言, 胆固醇对膜的流动性有着很大影响以及在精子获能方面起着至关重要的作用 (精子获能期间已经发现了胆固醇) 。另一方面, 在野猪和马的冷冻过程期间表现出胆固醇下降, 这可能对解冻后降低精子的存活产生了影响。含有改善精子膜的胆固醇 (除去或添加) 在一项研究中进行了试验, 但是含有卵黄的稀释液提高了精子冷冻存活率。兔精子膜中表现出高水平的胆固醇;因此胆固醇处理可能对兔精冷冻保存没有任何好处。然而, 当除去卵黄的稀释液冷冻保存精子时这种处理方法可能会很成功。
译自:Eva Moce, Jose Vicente.Rabbit sperm ryopreservation:A review[J].Animal Reprodution Science, 2009 (110) :1-24.
冷冻保存 篇2
【摘 要】目的：探讨不同冷冻保护剂对-80℃低温冰箱冷冻保存血小板效果的影响。方法：采用-80℃低温冰箱对机采血小板进行冷冻保存，通过电镜对血小板超微结构变化的观察，流式细胞仪对CD42，CD61P的检测,比较5%二甲亚砜（DMSO）组、5%DMSO联合3%羟乙基淀粉（HES）组、5%DMSO联合0.25M海藻糖(TRH)组、5%DMSO联合3%HES及0.25M TRH组共4种冷冻保护剂的保存效果。观察四组冷冻保存血小板的回收率，MPV值，血小板超微结构，测定CD42b、CD62p 的表達水平。结果：回收率、CD42b结果 DMSO组分别与其他几组比较P＞0.05无统计学意义；MPV增加值DMSO组分别与其他几组比较P＜0.05有统计学意义。CD62P结果DMSO组分别与其他几组比较P＜0.05有统计学意义。结论：羟乙基淀粉和海藻糖与DMSO联用对血小板的冷冻保护有一定协同作用，它们与DMSO联用可作为冷冻血小板的保护剂进一步研究。
【关键词】冷冻保护剂；海藻糖；血小板；羟乙基淀粉；二甲基亚砜
【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）10-0059-02
犬精液冷冻保存条件的优化 篇3
1 材料
1.1 试验动物
5只成熟、有生育能力、健康的公犬, 年龄2～6岁。饲喂商品犬粮 (冠能) , 自由饮水, 圈养, 每天自由活动2次。试验开始前, 练习手握法采精。
1.2 药品
三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , Promega Corporation U.S.A.公司生产;柠檬酸、葡萄糖、甘油, 北京化学试剂公司生产;新鲜鸡蛋卵黄, 北京农业职业学院畜牧场提供;青霉素钠和硫酸链霉素, 华北制药股份有限公司生产。
2 方法
2.1 精液采集
利用手握法采集犬的精液, 收集第1、第2部分。将采集的精液汇集到一起, 保存在37 ℃水浴中。分成 4 等份, 其中1份作为对照, 3 份分别以1 000 r/min (1组) , 2 000 r/min (2组) , 3 000 r/min (3组) 3种离心条件离心5 min。精液冷冻-解冻 (冷冻温度为-120 ℃, 解冻温度为37 ℃) 后保存在 37 ℃水浴中, 0～6 h 测定精子活力、精子活率、精子畸形率、精子顶体完整率, 对精液质量进行评估。
2.2 精液冷冻保存
2.2.1 精液冷冻稀释液
A液:Tris 2.4 g, 柠檬酸 1.4 g, 葡萄糖 0.8 g, 青霉素钠0.06 g, 硫酸链霉素 0.1 g, 20枚卵黄, 加纯化水至 100 mL。B液:Tris 2.4 g, 柠檬酸 1.4 g, 葡萄糖 0.8 g, 青霉素钠0.06 g, 硫酸链霉素 0.1 g, 甘油12 mL, 20枚卵黄, 加纯化水至100 mL。
2.2.2 精液处理
离心:将汇集的精液分成 3 等份, 分别在 1 000 r/min、2 000 r/min、3 000 r/min 3种离心条件下离心5 min。
稀释平衡:弃掉上层液体 (留下 0.1 mL左右的精清) , 用A液稀释沉淀的精液, 稀释后精液密度为2亿/mL。稀释液与精液的温度相同, 均为37 ℃左右, 应防止温度的突然变化对精子造成损伤。37 ℃水浴5 min后, 加入等体积的B液稀释, 等温稀释后的精液用4层纱布包裹, 置于4 ℃冰箱中降温40 min。
2.2.3 精液冷冻与解冻
在4 ℃环境中将平衡后的精液吸到 0.5 mL 的冷冻管中, 封口, 在液氮罐口降温熏蒸后投入液氮罐中冷冻保存。解冻时将冷冻管从液氮中取出, 室温平衡30 s, 37 ℃水浴解冻。解冻后将精液倒入有盖的小离心管中, 在 37 ℃水浴中保存。第0小时、2小时、4小时和6小时对精液进行质量评估。
2.3 数据统计
试验设4个重复, 采用SPSS统计软件对数据进行统计分析, 并进行多重比较。
3 结果与分析
3.1 离心条件对犬精液冷冻保存后精子活率及精子活力的影响 (结果见表1)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。
由表1可知:0小时时, 1组、2 组、3组的精子活率分别为 (59.5±4.0) %、 (57.8±6.1) %、 (61.3±4.9) %, 差异不显著 (P>0.05) 。精子活率随保存时间的延长明显下降, 保存2 h时, 1组的精子活率显著高于2组、3组 (P<0.05) , 保存6 h时, 3组的精子活率较高 (P<0.05) 。 冷冻-解冻后 (0小时时) 1组、2组、3组的精子活力分别为 (52.9±3.5) %、 (49.5±2.5) %、 (50.8±3.1) %, 差异不显著 (P>0.05) 。随保存时间的延长精子活力明显降低, 保存2 h时, 1组的精子活力显著高于2组、3组 (P<0.05) 。精子活力与活率的变化趋势相似。
3.2 离心条件对犬精液冷冻保存后精子畸形率及精子顶体完整率的影响 (结果见表2)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。
由表2可知:解冻后 (0小时时) 1组、2组、3组的精子畸形率分别为 (34.4±5.8) %、 (33.4±4.6) %、 (36.9±7.1) %;保存2 h时, 采用2组的离心方式精子畸形率最高;保存6 h时, 采用3组的离心方式精子畸形率最高。精子畸形率随保存时间的延长而升高。解冻后 (0小时时) 1组、2组、3组的精子顶体完整率分别为 (32.5±5.2) %、 (31.3±4.6) %、 (33.5±4.6) %, 差异不显著 (P>0.05) 。3组精子顶体完整率均随保存时间的延长而升高。
4 讨论
试验采用3种离心条件对犬的同一份精液进行处理, 其他条件均相同, 精液解冻后放入37 ℃水浴中保存6 h, 每2 h进行1次精液质量检查。
4.1 离心条件对精子活率和精子活力的影响
精子活率和精子活力均随水浴保存时间的延长而快速下降, 0～2 h最明显。
4.2 离心条件对精子畸形率的影响
冷冻精液和新鲜精液相比, 解冻后精子畸形率明显升高, 新鲜精液精子畸形率<10%, 而解冻后精子畸形率>30%。畸形精子主要是尾部畸形精子和头尾分离的精子增多。
4.3 离心条件对精子顶体完整率的影响
解冻后的精子顶体完整率明显增加, 新鲜精液精子顶体完整率<10%, 而解冻后的3组精子顶体完整率均达到30%左右。随着保存时间的延长精子畸形率也明显增加。精液冷冻和解冻过程中对精子造成了不可逆的损伤, 顶体内含有受精所必需的酶类, 即使有些精子活力未发生变化, 但顶体的破坏最终会导致精子丧失受精能力。
5 小结
冷冻温度为-120 ℃, 解冻温度为37 ℃时, 随保存时间的延长, 精子活力和活率大幅度下降, 精子畸形率和精子顶体完整率显著增加。冷冻温度为-120 ℃, 解冻温度为37 ℃时, 保存0 h, 宜采用1 000 r/min离心5 min的方式;保存2～4 h, 宜采用2 000 r/min离心5 min的方式;保存6 h时, 宜采用3 000 r/min离心5 min的方式。
参考文献
[1]HARROP A E.Artificial insemination of a bitch with preserved se-men[J].Br Vet J, 1954, 110:424-425.
[2]马毅, 曹斌云, 姬云涛.山羊除精浆冷冻精液的研究进展[J].国外畜牧科技, 2001 (4) :33-35.
冷冻保存 篇4
关键词：脯氨酸；超低温冷冻保存；杉木；胚性愈伤组织
中图分类号：S722.3+7文献标识码：A文章编号：1004-3020（2014）03-0030-03
The Influence of Prolin on Cryopreservation of Callus of Cunninghamia lanceolata
Yao DanjingQu YiChen Jinhui
（College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry UniversityNanjing210037 ）
Abstract： To explore the role of prolin in the process of cryopreservation of embryogenic callus of Cunninghamia lanceolata，the cell survival of 14 days callus of Cunninghamia lanceolata of subculture was measured by the TTC method with different concentrations of proline in the pretreatment stage.The result showed that： in the pretreatment stage， when the concentration of proline was 0.5 g·L1，the cell survival was relatively the highest.It suggested that adding suitable concentration of proline in the pretreatment stage can improve the survival of cryopreservation.
Key words：prolin；cryopreservation；Cunninghamia lanceolata；embryogenic callus
杉木Cunninghamia lanceolata是我国特有的速生商品材树种，被广泛应用于木材和药用方面。目前利用杉木成熟合子胚能成功实现体胚发生 [1 ]，但是经过长时间的继代培养，体胚发生的能力会逐渐降低直至丧失。将超低温冷冻保存技术和杉木胚性愈伤组织培养技术结合起来，能长期保存植物材料并保证其遗传稳定性，可有效解决杉木胚性愈伤组织体胚发生能力衰退的问题 [2 ]。同时，脯氨酸可以提高植物对低温的耐受性 [3，4 ]，其在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面有着重要作用；另外还能作为植物细胞质内渗透调节物质、降低凝固点，防止细胞脱水 [5 ]。本试验在已研究的杉木胚性愈伤组织超低温冷冻保存技术的基础上，探讨在预处理阶段，不同浓度的脯氨酸对杉木胚性愈伤组织超低温冷冻结果的影响。
1材料与方法
本试验采用玻璃化冷冻法 [6 ]，对杉木胚性愈伤组织进行超低温冷冻保存。
1.1试验材料
本试验利用实验室诱导的胚性愈伤组织为起始材料，对经过14 d继代培养的材料进行超低温冷冻保存试验。
1.2试验方法
本试验在预处理阶段设置不同浓度的脯氨酸，每个浓度设置3组重复，取预培养20 d与复苏阶段的杉木胚性愈伤组织，测定细胞相对存活率。
1.2.1杉木愈伤组织继代培养
杉木胚性愈伤组织在改良的DCR培养基上能实现稳定增殖，具有体胚发生的能力。继代培养基为DCR+VC 10 mg·L1+2，4-D 10 mg·L1+BA 05 mg·L1+KT 05 mg·L1，谷氨酰胺045 g·L1，肌醇01 g·L1，水解酪蛋白05 g·L1，活性炭25 g·L1，水晶洋菜24 g·L1，麦芽糖20 g·L1，pH53。在23 ℃下暗培养，每25 d为1个继代周期。
1.2.2杉木愈伤组织超低温冷冻保存
（1）预培养：杉木胚性愈伤组织在不含激素的DCR固体培养基上进行预培养，23 ℃暗培养21 d。
（2）预处理：杉木胚性愈伤组织在添加05 mol·L1山梨醇的高渗固体培养基上进行预处理，添加不同浓度的脯氨酸（浓度0，05，10，20 g·L1），23 ℃暗培养5 d。
（3）冷冻方法：无菌条件下，将预处理后的杉木胚性愈伤组织放入18 mL冷冻管，每管05～06 g，加入冷冻液（含06 mol·L1山梨醇+10%DMSO的液体培养基），在冰上预冷20 min后吸去冷冻液，再次加入冷冻液，将冷冻管放入程序降温仪以-1 ℃/min 的速率梯度降温至-90 ℃，于液氮中保存，至少2 d以后进行解冻复苏。
（4）解冻与洗涤：将冷冻2 d以上的杉木胚性愈伤组织从液氮罐中取出，置于37 ℃水浴锅中解冻2 min，化冻后即用复苏液（含07 mol·L1山梨醇的液体培养基）洗涤3次。
（5）复苏与再培养：将解冻后的杉木胚性愈伤组织接种到含04 mol·L1山梨醇的固体培养基中，23 ℃暗培养2 d；2 d后，再将其接种到含02 mol·L1山梨醇的固体培养基中，23 ℃暗培养2 d。
nlc202309031224
（6）细胞生活力的测定：采用TTC法 [7 ]测定细胞存活率。称取100 mg待测材料，加15 mL04%TTC溶液，15 mL磷酸缓冲液（pH7，01 mol·L1），静置于23 ℃暗处。21 h后去上清液，加入5 mL蒸馏水洗涤细胞，重复3次。加入5 mL 95%乙醇，置于60 ℃水浴中30 min，期间轻轻摇动1～2次，静置于室温下至细胞无色。取上清液，在分光光度计485 nm处测吸光值。用相对存活率表示细胞的活力。
细胞相对存活率= 解冻后细胞TTC值未冷冻细胞TTC值×100%
2结果与分析
2.1杉木胚性愈伤组织超低温冷冻保存过程的生长状况
继代14 d的杉木胚性愈伤组织外观呈白色，细胞饱满含水丰富（图1A）；经预培养18 d后，杉木胚性愈伤组织颜色偏黄，略有失水现象（图1B）；预处理4 d，细胞呈黄褐色，高渗透压使愈伤组织出现了明显的失水现象，细胞质浓缩，该状态有利于冷冻（图1C）；高渗复苏3 d的杉木胚性愈伤组织生长缓慢，没有新愈伤组织出现（图1D）；复苏27 d的杉木胚性愈伤组织长出新愈伤组织（图1E）； 冷冻后恢复继代培养的杉木胚性愈伤组织与未经过冷冻处理的杉木胚性愈伤组织相比，含水量较多，刺状结构较少，愈伤组织细胞较为黏稠（图1F）。
图1杉木胚性愈伤组织各阶段的状态
A.继代培养的杉木胚性愈伤组织；B.预培养18 d的杉木胚性愈伤组织；C.预处理4 d的杉木胚性愈伤组织；D.高渗复苏3 d的杉木胚性愈伤组织；E.复苏27 d的杉木胚性愈伤组织；F.恢复继代培养的杉木胚性愈伤组织。
2.2脯氨酸浓度对杉木胚性愈伤组织存活率的影响
取预培养20 d与复苏阶段的杉木胚性愈伤组织，经过处理后，测其在分光光度计485 nm处的吸光值，通过公式计算，将细胞相对存活率绘制成图2。
在预处理阶段，添加不同浓度的脯氨酸对杉木胚性愈伤组织存活率有一定影响。由图2可以看出，当预处理阶段脯氨酸浓度为05 g·L1时，细胞存活率相对最高。
3讨论
目前，许多关于植物愈伤组织的超低温冷冻保存研究都已见报道，但少有人研究脯氨酸对植物愈伤组织超低温冷冻保存的影响。本试验在已研究的杉木胚性愈伤组织的超低温冷冻保存技术的基础上，探讨脯氨酸在其过程中的作用。试验在预处理阶段添加不同浓度的脯氨酸，以探求最适宜的脯氨酸浓度，使得冷冻后存活率更高。试验结果表明：在预处理阶段，脯氨酸浓度为05 g·L1时，细胞存活率相对最高。另外，通过试验可以发现经过预处理的杉木胚性愈伤组织明显失水，细胞质均高度浓缩，该状态有利于超低温冷冻保存，由此可见预处理是促进细胞质浓缩较为关键的一步。
参考文献
[1]席梦利，施季森.杉木成熟合子胚器官发生和体胚发生 [J ].林业科学，2006，42（9）：29-33.
[2 ]苗琦，谷运红，王卫东 等.植物组织培养物的超低温保存 [J ].植物生理学通讯，2005，41（3）：350-354.
[3 ]肖伏娥，胡扬.外源脯氨酸与水稻幼苗的抗寒性 [J ].湖南农学院学报，1988，（2）：2.
[4 ]乔俊鹏，夏鹏云，梅海军 等.脯氨酸，维生素C和CaCl2处理对深山含笑抗寒性的影响 [J ].江西农业学报，2010，22（2）：40-42.
[5 ]王小华，庄南生.脯氨酸与植物抗寒性的研究进展 [J ].中国农学通报，2008，24（11）：398-402.
[6 ]关静，龚承元，崔占峰 等.玻璃化冷冻保存细胞，组织研究进展 [J ].国外医学：生物医学工程分册，2004，27（4）：252-25.
[7 ]简令成，孙德兰，孙龙华.甘蔗愈伤组织超低温保存中一些因素的研究 [J ].植物学报，1987，29（2）：123.
（责任编辑：郑京津）
猪精液品质评价与冷冻保存技术 篇5
1 精液品质评价
1.1 精液量
公猪的射精量与睾丸的大小有直接关系, 一般猪场或人工授精站用电子天平称精液重量, 按照1 mL/g 计算。孙德林等[4]研究了不同品种公猪的射精量, 结果为杜洛克 (244.69 mL) ﹥长白 (238.27 mL) ﹥皮特兰 (206.24 mL) ﹥大白 (191.25 mL) 。同品种公猪的射精量与营养水平和饲养环境等因素有密切关系。
1.2 精子密度
精子密度是指每毫升精液中含有的精子数, 一般用精子密度仪或精虫计数器测定。精子密度是用来监测公猪健康状况和繁殖潜力的重要指标, 是优化个体遗传潜力的重要因素, 也是决定精液稀释倍数的重要依据。合格精液的精子密度为1.5亿～3.0亿/mL。
1.3 精子活力
只有直线前进的精子才是正常的运动形式, 直线运动的精子数占总精子数的百分率称为精子活力。精子活力检查常采用目测法, 用恒温载物台将精子加热到35～37 ℃, 在100～400倍显微镜下观察精子的运动状态, 每个样本观察3个以上的视野。精子活力常用十级制, 即0.1～1.0, 一般低于0.4级的精子不宜用于输精, 许多种公猪站以精子活力为0.7～0.8作为筛选标准[5,6,7]。
1.4 精子畸形率
精子畸形率是指异常精子占总精子数的百分率。如果精液中含有大量畸形精子, 其受精能力往往会降低。经过伊红或姬姆萨染色后, 用显微镜观察测定。精子畸形一般可以分为头部畸形、中段畸形和尾部畸形, 一般要求精子畸形率不得超过18%。要求每隔2周对每头公猪的精子畸形率检查1次。种公猪利用过度, 生殖系统出现生理性损伤或障碍, 不良的外部环境和饲养管理方法都是造成精子畸形的原因。
1.5 精液颜色、气味和pH值
正常精液颜色为乳白色、奶白色或浅白色, 精子密度越大的精液颜色越白, 密度越小越淡, 颜色异常的精液均应废弃不用。正常精液略带腥味, 一般无臭味, 气味异常的精液应废弃不用。正常精液呈中性或弱碱性, pH值为7.0～7.8, 可用pH试纸测定。
1.6 顶体完整率
顶体膜覆盖精子头部的2/3, 它含有穿透卵母细胞所必需的酶, 是保证卵母细胞受精所必需的, 没有顶体的精子不可能受精[6]。顶体完整率的评定费时、费力, 需要先进的显微镜和熟练的操作技能。顶体完整率是评定精子质量的重要指标, 一般认为顶体完整率小于51%的精液为劣质精液。
精液品质评定是保证动物优产优生的前提, 也是对精液稀释处理和冷冻保存的前提条件, 只有在对精液品质评定基础上冷冻保存优质精子才是发挥最佳生产性能的关键所在。
2 精液冷冻保存
精液保存方法是家畜人工授精技术的关键, 冷冻精液具有长时间保存优良动物品种、使用不受时空限制、利用效率高等优点, 因此精液冷冻技术受到育种工作人员的重视。牛精液冷冻技术得到了广泛应用;但由于猪精子对低温特别敏感, 发生冷休克, 解冻后精子复活率低, 异常精子多, 受胎率低, 产仔数少等原因而没有得到广泛应用。由于对冷冻-解冻机理、精子损伤机理等方面不完全清楚, 因此猪精液的冷冻保存技术目前主要处于试验阶段。
2.1 冷冻保存原理
用干冰 (-79 ℃) 、液氮 (-196 ℃) 和液氦 (-269 ℃) 等作为冷却源, 将采集的精液作特殊处理后保存其中, 使精子细胞的代谢活动完全受到抑制, 达到长期保存的目的, 当温度升高后又恢复其活性, 且具备受精能力。在精液冷冻保存过程中, 由于精子细胞内外温差巨大, 精子细胞处于脱水状态, 发生物理性和化学性损伤, 导致部分精子死亡, 这也是导致冷冻精子复活率低、异常精子多和受胎率低的原因[7,8]。研究表明, 在精液冷冻保存过程中加入冷冻保护剂, 可以降低其冰点, 增强精子的抗冻能力, 减少精子的损伤。深入开展冷冻保存过程中的精子损伤机理研究, 探寻防止精子发生冷休克的有效措施和方法是提高精液冷冻技术的关键所在。
2.2 稀释液和冷冻保护剂
在精液在冷冻保存过程中, 精子细胞外液首先形成冰晶, 细胞膜内外形成不同的渗透压, 使精子细胞处于脱水状态, 发生细胞化学性和物理性损伤, 此时加入稀释液和冷冻保护剂, 可以防止或减少以上损伤发生。稀释液是精子的保护剂, 主要由糖类、蛋白质、脂类和缓冲液等组成, 对精液的冷冻效果起决定性作用, 目前已经研制出多种稀释液可供生产使用。冷冻保护剂能有效防止冰晶形成, 减少细胞损伤, 同时能提高精子解冻后的复活率和保证顶体完整率, 提高精液的冷冻效果。冷冻保护剂主要有糖类、奶类、卵黄、甘油、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na) 等[8]。甘油在0 ℃以下具有水溶性, 有效防止冰晶形成, 防止精子细胞发生冻伤, 而且能够保持解冻精子细胞具有较高的复活率和顶体完整率, 是一种公认的理想冷冻保护剂, 但猪精液对其浓度很敏感, 使用时要控制其浓度。精液的冷冻方法主要有颗粒冷冻法和细管冷冻法, 国外多采用细管冷冻法, 国内多采用颗粒冷冻法。
2.3 解冻方法
解冻过程和冷冻过程一样, 均有形成冰晶过程的潜在危险, 对精子细胞产生损伤。研究表明, 解冻速率与冷冻速率相比对精子质量的影响更大。常用的解冻方法有干解法和湿解法, 不同的解冻方法和解冻温度对精子细胞的活性有不同影响。干解法:用干净的试管取3～4粒颗粒冻精, 在43 ℃水中摇动, 颗粒溶化至仅剩原体积的1/4～1/3时迅速取出, 借手温至全溶。湿解法:用干净的试管取2.9%柠檬酸钠溶液1 mL, 水浴恒温至40 ℃, 从液氮中取出3～4粒颗粒冻精, 迅速放人试管中至全部溶解。解冻后的精液采用人工授精技术——子宫颈输精法, 对发情母猪进行人工授精[9]。冷冻保存技术需要很长时间, 能够极大地延长优质种质资源的保存时间。但经过冷冻和解冻2个相反过程后的精液品质较原精液明显下降, 而且精液的冷冻保存对技术和设备要求均很高, 生产中应合理运用。
参考文献
[1]高飞, 岳奎忠, 杨增明.猪精液液态保存的研究进展[J].中国畜牧杂志, 2004, 40 (6) :46-49.
[2]李林林, 吴华莉, 刘东, 等.猪精液冷冻技术研究进展[J].安徽农业科学, 2006, 34 (11) :2410-2412.
[3]朱仕恩.猪精液冷冻技术研究[J].猪业科学, 2007 (5) :44-47.
[4]孙德林, 吕小燕.不同品种不同月龄公猪精液的比较研究[J].动物科学与动物医学, 2005 (2) :58-59.
[5]杨霞.猪精液冷冻技术的研究进展[J].饲料博览, 2009 (10) :13-16.
[6]陈龙, 朱化彬, 沙里金.猪精液冷冻保存影响因素研究进展及展望[J].中国生物工程杂志, 2008, 28 (6) :113-117.
[7]禚艳书, 王坚, 刘铁铮.猪精液冷冻保存研究进展[J].江苏农业科学, 2006 (3) :136-139.
[8]杜立银, 刘铁铮.添加剂在猪精液冷冻保存中的应用[J].江苏农业学报, 2008, 24 (3) :355-358.
羊肾原代细胞的冷冻保存试验 篇6
1 材料与方法
1.1 试验动物
试验用3日龄羔山羊购自平凉本地农户。
1.2 主要试剂
试验所用主要试剂有:人工综合营养液199、0.5%乳白蛋白水解物、Hanks液、双抗、5.6%NaHCO3溶液、0.25%胰酶溶液、犊牛血清、DMSO、EG、甘油、0.4%台盼蓝溶液等。
1.3 冷冻保护液配方
冷冻保护液Ⅰ:199 (40%) +0.5%水解乳蛋白 (40%) +小牛血清 (10%) +DMSO (10%) 。
冷冻保护液Ⅱ:199 (40%) +0.5%水解乳蛋白 (40%) +小牛血清 (10%) +甘油 (10%) 。
冷冻保护液Ⅲ:199 (40%) +0.5%水解乳蛋白 (40%) +小牛血清 (10%) +EG (10%) 。
试验分3组进行。试验Ⅰ组选用冷冻保护液Ⅰ, 试验Ⅱ组选用冷冻保护液Ⅱ, 试验Ⅲ组选用冷冻保护液Ⅲ。每组设3个重复。
1.4 羊肾原代细胞的制备
将3日龄羔山羊颈动脉放血致死, 立即无菌操作摘除两侧肾组织。随后剪除附着在肾脏上的脂肪, 并剥去肾包膜, 用剪刀将肾剪成两半, 剪除肾盂部分, 用Hanks液冲洗, 移入广口玻璃瓶中将其剪成1 mm3的碎块, 洗涤3次后于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶, 并调整pH至7.6左右, 振荡混合后置4℃冰箱内冷消化16 h。取出后小心吸弃上层胰酶溶液, 用洗液轻洗3次后, 即在洗液内以大口吸管吹打至液体发浑, 经用双层纱布过滤, 收集于离心管中, 以600 r/min离心沉淀5～10 min, 吸弃上清液, 加入营养液, 并用吸管充分吹打均匀, 按试验分组情况进行分装后按10%浓度加入各防冻剂, 并进行冻前各样品活细胞计数。
1.5 冷冻保存、解冻复苏和培养
冷冻保存:对盛装有各细胞冷冻保存液的小玻璃瓶外裹三层棉花, 每层厚约1 cm, 再用橡皮带扎紧, 直接移入-80℃超低温冰箱。
解冻复苏:从超低温冰箱取出盐水瓶, 除去棉花层, 待室温作用数分钟后 (以防玻璃瓶破裂) , 移入37～40℃的水浴锅内并适当摇晃, 直到完全解冻。各取少量进行解冻后活细胞计数。其余细胞悬液以500 r/min的速度离心沉淀10 min, 倾弃上清层, 彻底除去保护剂, 再往沉淀细胞内加入营养液, 充分混悬后分瓶培养。
1.6 活细胞计数
对冷冻前后的各样品进行活细胞计数。取一套血球计数板, 将特制的盖玻片盖在血球计数板上。用吸管吸5滴细胞悬液到离心管中, 加入5滴台盼蓝 (0.4%) , 并吹打均匀。然后吸取少量悬液沿着盖玻片边缘缓缓滴入, 要保证盖玻片下充满悬液, 不留气泡, 也不能让悬液流入旁边槽中。因活细胞不会被台盼蓝染色, 故在显微镜下透亮而不着色的为活细胞, 染成蓝色的即为死细胞。数出血球计数板四角的四个大方格中没有被染液染上色的细胞数目。活细胞浓度和细胞存活率分别按下列公式计算。
undefined
式中n表示每毫升细胞悬液中的活细胞数 (个/mL) , N表示血球计数板4个大格子的活细胞数。
细胞存活率undefined
式中N1表示冻前4个大格活细胞数, N2表示冻后4个大格活细胞数。
1.7 统计方法
试验数据进行方差分析与LSD法多重比较。
2 结果与分析
2.1 羊肾原代细胞的冷冻保存结果
羊肾原代细胞的冷冻保存结果见表1。
结果表明, 试验Ⅰ组与试验Ⅱ、Ⅲ组存在极显著差异 (P<0.01) , 试验Ⅲ组与试验Ⅱ组间存在显著差异 (P<0.05) 。因此, 对羊肾原代细胞冷冻保存效果最好的保护剂是DMSO, 其次是乙二醇, 最差的是甘油。建议保存羊肾细胞时优先选用含10%DMSO的细胞营养液进行冷冻保存。
2.2 冻后复苏培养
经冻存的羔羊肾原代细胞复苏后于体外培养, 其贴壁速度相对于分离后直接培养的要慢。分离后直接培养的羊肾细胞, 大约在45～60 min后就可贴壁, 且细胞变长, 呈现出生长态势, 而冷冻后复苏的细胞大约在接种培养后4～6 h才贴壁, 且在培养8～12 h后, 有10%左右的细胞死亡。在生长速度上, 分离后直接培养的羊肾细胞贴壁后即迅速生长, 而复苏后培养的细胞贴壁后生长速度较慢, 经过6～8 h的缓慢生长期, 其生长速度加快, 即与直接接种培养的细胞在生长速度上没有明显差别。
注:同列字母相同表示差异显著 (P<0.05) ;同列字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。
3 讨论
多年的基础研究证明, 冷冻保存时, 降温过程中细胞受到的损伤最大, 相变期 (降温平台期) 和相变后期内降温速度是影响细胞质量的两个关键阶段, 随着降温平台期的延长和/或降温速度的加快, 细胞存活率显著下降[1]。因此, 控制降温速度和时间的程序控制降温方式一度成为冷冻保存细胞的标准方式并沿用至今。该方式保存细胞的良好效果已得到了实验和临床验证。但由于程控降温需要昂贵的设备和耗时的操作, 人们从20世纪80年代起开始探索简便、经济的方法冷冻保存细胞。1983年Stiff等报道了将细胞直接置入-80℃冻存, 解冻后细胞也有较高的存活率。随后他们对60例自体骨髓移植患者的骨髓采用该方法冻存1～4周后回输, 患者均顺利地重建了造血功能。
试验证明, 当细胞悬液的温度较快下降到0℃以下时, 细胞内开始形成冰结晶, 这种冰结晶是使细胞产生机械性损伤的主要原因。温度继续下降, 细胞外相的冰结晶增多, 残留液中的盐类浓度增高, 水分从细胞内抽出, 其结果是细胞内的可溶性物质特别是电解质在残余的少量水中逐渐浓缩, 又使细胞发生渗透性休克。因此, 细胞在被冷冻至0℃以下时, 将先后或同时发生冰结晶形成、脱水和可溶性物质浓缩等三种变化[2]。在冷冻过程中主要有两种因素造成细胞损伤:①细胞内冰晶形成和重结晶。前者往往在降温速率太快时发生, 这可通过使用电脑控制的冷冻程序来避免;而重结晶一般是不适当复温所致。②“溶质损伤”。冷冻使电解质和溶质的浓度升高, 对细胞膜造成机械压力而损伤细胞膜和细胞器。要减少或避免这两种因素造成的损伤, 必须选择一个合适的降温和复温速率, 使得水分有充足的时间脱离细胞避免细胞内冰晶形成, 同时又不至于因细胞暴露在有害因子环境的时间过长导致“溶质损伤”和复温时的重结晶发生。
DMSO、乙二醇和甘油等均属于渗透性冷冻保护剂, 为非电解质小分子物质, 具有较强的亲水性, 而且易于穿透细胞膜, 可以减轻冰结晶对细胞的机械性损伤作用;此外借助弥散作用, 又可置换细胞内的水分, 避免因细胞内脱水而发生电解质浓缩, 且使细胞不致发生皱缩[3]。DMSO在常温下对细胞有一定的毒副作用, 但只要常温条件下放置不超过30 min, 其对细胞存活率不会产生影响。滴加保护剂到细胞悬液中时, 速度不能过快, 以免在细胞外瞬时产生很高的渗透压, 这样容易造成细胞膜损伤, 导致细胞死亡。
在本试验中, 在加入防冻剂后未进行4℃平衡作用, 致使电解质未能充分渗透到细胞内部, 冷冻时水分从细胞内抽出, 细胞内的可溶性物质特别是电解质在残余的少量水中逐渐浓缩, 使细胞发生渗透性休克, 这可能是细胞复苏率低的第一个原因。其次, 在冷冻时未经历程控降温缓慢冷冻的过程, 即直接投入-80℃冰箱进行快速冷冻, 细胞内产生冰结晶使细胞膜产生机械性损伤, 这可能是导致细胞复苏率不高的又一个因素。另外, 在试验过程中为了方便, 细胞保存时未使用安瓿而用玻璃瓶代替, 这样在复温解冻时为防止玻璃瓶爆炸, 有一个室温作用时间。这一过程可导致重结晶发生, 再次造成细胞损伤。这可能是导致复苏率不高的第三个原因。
细胞复苏后的体外培养:由于冷冻过的细胞相对于未经冷冻的细胞要脆弱, 为保证细胞的正常生长和增殖, 在接种细胞时, 细胞密度要适当大一些, 这样可使细胞的相互作用增强, 以利于细胞生长。在确保细胞生长所需营养成分的前提下培养液的用量也应比正常培养时减少20%左右, 以提高细胞贴壁速度。在本试验中, 复苏后的细胞在贴壁速度和初期生长速度比不经冷冻的细胞要慢, 且在培养8～12 h时有10%左右的细胞死亡。出现这一现象的原因可能是, 细胞从极低温度转到体外培养温度, 经历了一个巨大的环境变化, 这在一定程度上损伤了细胞, 因此在培养过程中, 它要经历一个较长的适应期, 一些活力不强的细胞在这一时期容易死亡。度过这个进期后, 细胞的生长速度和增殖速度恢复正常。
摘要：试验研究了3种不同冷冻保护剂二甲基亚砜 (DMSO) 、乙二醇 (EG) 和甘油对羔羊肾原代细胞存活率的影响及复苏后的培养情况。结果表明, 冷冻保护液Ⅰ极显著地高于冷冻保护液Ⅱ和Ⅲ的保护效果 (P<0.01) ;冷冻保护液Ⅲ显著地高于冷冻保护液Ⅱ (P<0.05) 。复苏后的羔羊肾原代细胞于体外培养时存在贴壁迟缓、前期生长速度较慢等现象。
关键词：羊肾原代细胞,冷冻保存,细胞培养
参考文献
[1]魏雪飞, 许贤豪, 张华, 等.免疫细胞的冷冻保存[J].中国神经免疫学和神经病学杂志, 2003, 10 (1) :39-41.
[2]殷震.动物病毒学 (第二版) [M].北京:科学出版社, 1997.
鸡睾丸生精上皮细胞冷冻保存研究 篇7
1 材料与方法
1.1 试验材料
广西土鸡(Guangxi native broilers)鸡苗,购自湖州广东温氏畜牧有限公司,常规饲养。
1.2 主要试剂
高糖DMEM培养基、胎牛血清,购于Gibco试剂公司;AKP试剂盒,购于华美生物工程有限公司;神经胶质细胞衍生的营养因子(GDNF),购于CytoLab Ltd.; Hoechst 33342、碘化丙锭、胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶(0.25%)、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、干细胞生长因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF),均购于美国Sigma(St.Louis,MO,USA)试剂公司。
完全培养基:在含10%胎牛血清、2%鸡血清的高糖DMEM培养液中添加1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL hIGF、10 U/mL LIF、5 ng/mL SCF、5.5×10-5 mol/L β-巯基乙醇、10 ng/mL GDNF。
1.3 石蜡切片
取4对睾丸用Bouin氏液固定,2 d后进行常规石蜡切片(切片厚度为5 μm)和H.E.染色,用光学显微镜(Motic BA400)观察,拍照。
1.4 生精上皮细胞悬液的制备
取20～30日龄公鸡用75%酒精消毒腹部,获取两侧睾丸,置于含双抗的PBS中浸洗3次;在体视显微镜下仔细剥离白膜和血管,剪碎,加入适量无钙离子、镁离子的PBS吹打数次,移入离心管中静置5 min;弃上清液,用10倍于组织块体积的胶原酶(1 mg/mL)消化,37 ℃作用30 min,期间每隔5 min混匀1次;第1次酶解后500 r/min离心2 min,弃上清液,之后用胰蛋白酶-EDTA(0.25%)消化5 min;收集细胞悬液,加含血清的培养基终止消化,用300目不锈钢网筛过滤,过滤液以1 200 r/min离心5 min;弃上清液,重新悬浮细胞,取少量细胞进行活率检测,剩余细胞用于冷冻保存研究。
1.5 细胞活率的检测
在1 mL细胞悬液或培养液中加入Hoechst 33342 6 μL、碘化丙锭8 μL,轻轻混匀后 37 ℃避光孵育15 min,荧光显微镜下观察,死细胞呈红色,活细胞呈蓝色[4]。
1.6 冷冻-复苏程序
生精上皮细胞沉淀加入4 ℃预冷的防冻液,悬浮后调整细胞浓度至5×106个/mL,分装于冻存管中;将冻存管置于4 ℃冰箱中平衡1 h,然后将冻存管装进隔热盒中,置-80 ℃冰箱中过夜,第2天转移到液氮中贮存。在液氮中贮存2周后,将冻存管取出迅速放入37 ℃水浴锅中,不时摇动,在1 min内使其完全融化,然后在超净台内无菌取出细胞,逐滴加入适量DMEM洗涤1次。
1.7 防冻液的筛选
1.7.1 不同浓度DMSO对生精上皮细胞冷冻保存效果的比较
在DMEM中加入20%胎牛血清和不同浓度的DMSO(2.5%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%),以复苏后细胞活率为指标确定DMSO的最佳浓度。
1.7.2 不同浓度蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的比较
以含20%胎牛血清和10% DMSO的DMEM为基础防冻液,以复苏后细胞活率为指标,比较不同浓度(0,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mol/L)的蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响。
1.8 复苏后的培养与鉴定
1.8.1 复苏后的原代培养
用含20%胎牛血清、10% DMSO、不含蔗糖的DMEM为防冻液冻存,复苏后的生精上皮细胞洗涤后用完全培养基调整细胞浓度为6×105个/mL,然后接种于24孔培养板上,于37 ℃、5% CO2培养箱中混合培养,24 h后换液以除去死细胞;每24 h观察1次,每48 h换掉2/3的液体。
1.8.2 AKP染色、鉴定
体外原代培养4～5 d 获得的SSCs集落进行AKP活性检测。孔板用PBS清洗3次后加入固定液固定15 min;再用PBS清洗3次去除固定液,加入新鲜配制的BCIP/NBT染色液,避光染色20 min;PBS清洗后,倒置显微镜下观察、拍照。
1.9 统计分析
试验重复4次,数据用平均值±标准差表示,组间资料应用单因素方差(One-way ANOVA)分析, P<0.05视为有显著性差异。各项统计均用SPSS 10.0软件在计算机上完成。
2 结果
2.1 石蜡切片观察结果
出壳后20～30 d的公鸡睾丸曲细精管结构典型,SSCs已经形成,但只有1层单层细胞,未见分化的生精细胞。SSCs和支持细胞都排列在曲细精管的基底膜上,两者形态差异明显:SSCs细胞核较大,呈圆形;而支持细胞核较小,呈细长梭形(见图1)。
注:粗箭头所示为SSCs,细箭头所示为支持细胞。
2.2 生精上皮细胞悬液的制备和活率检测
经两步酶消化,平均每个20～30日龄公鸡睾丸大约能够得到2×106～6×106个生精上皮细胞。细胞悬液经Hoechst 33342/碘化丙锭双重荧光染色,细胞活性清晰可辨,死细胞呈红色,活细胞呈蓝色,平均活率高达95%以上。
2.3 防冻液的筛选
不同浓度DMSO对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响见图2。由图2可见,DMSO的最佳浓度为10.0%,与其他各组差异显著(P<0.05)。不同浓度蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响见图3。由图3可见,添加蔗糖对生精上皮细胞冻存有害,随着蔗糖浓度的增加,细胞活率随之下降。
注:图中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
注:图中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.4 复苏后的培养与鉴定
生精上皮细胞冻存复苏后平均活率为(67.08±4.54)%。用完全培养基稀释后混合培养,刚接种时细胞为圆形,以均一的单细胞状态存在;1 h后支持细胞开始贴壁;2～3 h后绝大部分生精上皮细胞都已贴壁;24 h后支持细胞铺展呈长梭形或成纤维细胞状,面积较大,两侧有多个突起;SSCs为圆形,贴附在支持细胞上,单个或两个成串存在。混合培养4～5 d后,可见典型的SSCs葡萄串状集落(见图4),集落AKP染色呈深褐色,为阳性;而支持细胞单层不着色,为AKP阴性(见图5)。
3 讨论
SSCs属于成体干细胞,由性原细胞(gonocyte)发育分化而来。试验通过石蜡切片观察证实,公鸡在20～30日龄SSCs已经形成,且未发生分化,此时应是鸡SSCs取材的理想时期。Jung J G等[2]发现,4周龄莱航鸡睾丸细胞中诸多干细胞标志阳性细胞占0.33%～0.44%,显著高于24周龄的0.029%～0.072%。这也说明以幼龄动物为供体可获得纯度较高的SSCs。当然,并非供体日龄越小越好。李碧春等[5]发现,在孵化第16～19天鸡胚睾丸曲精细管的管腔中分布着精原细胞(即性原细胞),可见在鸡胚阶段SSCs尚未形成。
通过Hoechst 33342/碘化丙锭双重荧光染色可以准确地检测细胞活率[4]。DMSO是细胞冻存中最常用的渗透性防冻剂。试验通过检测细胞活率这一指标,发现对于鸡生精上皮细胞冷冻保存,DMSO的最佳浓度为10%,过高过低都会显著降低细胞活率。这与李碧春等[3]关于鸡胚精原细胞体外冷冻保存的报道一致。Izadyar F等[6]也用10%的DMSO成功地冻存了牛的A型精原细胞(包含SSCs)。但Izadyar F等[6]认为添加蔗糖对冻存牛A型精原细胞有利,蔗糖浓度为0.07 mol/L效果最好。本试验却发现添加蔗糖对冻存鸡生精上皮细胞有害,添加浓度越高对细胞的毒性越大。这可能是因为鸡生精上皮细胞对高渗透压敏感,在防冻液中添加蔗糖也就提高了溶液的渗透压,从而对细胞产生了高渗打击。
试验采用含20%胎牛血清的DMEM为基础培养液、10% DMSO为防冻液进行冻存,复苏后生精上皮细胞原代混合培养可形成典型的SSCs集落,集落呈碱性磷酸酶阳性,说明以10% DMSO为防冻剂的冷冻体系适合鸡睾丸生精上皮细胞冷冻保存,并且能够保存SSCs的增殖能力和干细胞潜能,为鸡SSCs移植、转基因等应用研究打下了基础。关于鸡SSCs冷冻保存方法的优化以及冻存后长期传代培养和鉴定还需要进一步研究。
参考文献
[1]采克俊,张易祥,丁志丽,等.精原干细胞的分离纯化方法[J].上海畜牧兽医通讯,2008(1):67-69.
[2]JUNG J G,LEE Y M,PARK T S,et al.Identification,culture,and characterization of germline stem cell-like cells in chickentestes[J].Biol Reprod,2007,76(1):173-182.
[3]李碧春,周冠月,陈国宏,等.鸡胚精原干细胞体外保存能力的研究[J].畜牧兽医学报,2007,38(7):657-662.
[4]CAI K,YANG J,GUANM,et al.Single UVexcitation of Hoechst33342 and propidium iodide for viability assessment of rhesus mon-key sperm using flow cytometry[J].Archives of Andrology,2005,51(5):371-383.
[5]李碧春,周冠月,孙思宇,等.鸡早期胚胎精原细胞和睾丸发生发育关系的研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(7):680-685.
冷冻保存 篇8
1 猪精子的特点
猪精子对低温打击和冷冻非常敏感, 主要表现为解冻后精子活力丧失, 精子膜选择通透性降低, 顶体膜损伤等。原因包括:①猪精子膜上胆固醇和磷脂的比例较低, 胆固醇的分布量外膜大于内膜, 当温度降低的时候, 由于膜上不同磷脂的相变温度不同, 导致膜成分侧移和重排, 膜表面脂质分离, 蛋白质不可逆地凝集在一起;②精子在冷冻过程中会产生活性氧 (Ros) , 可以氧化多不饱和脂肪酸, 使膜发生脂质过氧化[1]。活性氧是细胞需氧代谢过程中产生的不稳定代谢产物, 其产生和消除保持动态平衡。精液在冷冻解冻过程中破坏了这种平衡, 使精子膜的流动性下降, 产生过氧化损伤, 从而影响了精子的活力和质膜的完整性。
2 精液的预处理
2.1 精浆的处理
冷冻前对精子进行预处理是提高冻后精子活力和授精能力的第一步。冷冻精液制作过程中, 为防止精子发生冷休克必须在稀释液中加入含有卵磷脂的卵黄或脱脂乳[2], 但当稀释液中含有卵黄时, 精清对解冻后精子活力有不利影响, 精浆中尿道球腺分泌物 (BUS) 则是造成这一现象的主要原因。Morton等从山羊精浆中提纯了一种分子质量为55～60 ku的糖蛋白BUSgp 60, 它具有三酰甘油水解酶活性, 可以将脱脂乳中剩余的三酰甘油水解成脂肪酸, 后者对精子有不良反应, 其部分序列同各种类型胰脂肪酶具有50%～70%的同源性, 猪PL对精子的伤害作用同BUS和BUSgp60一致。因此, 在猪精液进行保存前, 要对精浆进行处理以减少精清对精子的毒害作用。一般认为, 用离心法洗涤精液是去除精清最迅速有效的途径。但在离心过程中会对精子造成机械性损伤, 其损伤程度随离心力、离心液及离心后剩余精浆浓度不同而有差异。Carvajal G等研究发现, 高转速短时间离心不影响精子的恢复和顶体的完整率。故推荐在猪精液低温保存方案中使用相对高转速的短时间离心, 即采用2 400 r/min离心3 min。
2.2 稀释比例
液态保存精液人工授精时每剂只需要20～30亿个精子, 冻精则需要更多的精子, 一般为50～60亿个, 精子密度为 (5～10) ×108个/mL。由于大剂量精液的冷冻受承载工具的限制, 研究高密度精液的冷冻可以减轻高倍稀释对精子造成的不利影响。用0.5 mL细管冷冻精液, 含精子量 1×109个, 解冻后进行人工授精, 可获得较好的繁殖效果。Saravia F等[3]报道, 以 2×109个/mL的密度冻存猪精子, 冻后活力平均为37%～46%。因此, 低剂量高密度的猪精液冷冻后也能达到输精要求, 但需要更多的研究来提高冷冻效果。猪射精量大, 精子密度较稀, 因此稀释比例一般不超过1∶4。
2.3 冷却和平衡
精液稀释后降温的过程是精子代谢减少的适应过程, 有一个数小时的冷冻平衡时间, 但过慢的冷却速度会使溶液的电解逐渐增高, 导致精细胞膜脂蛋白复合体破坏和膜分解, 当细胞膜脱水收缩达到临界最小体积时, 细胞膜的渗透性产生不可逆的损伤, 原来不能透过膜的溶质变成可渗透性的, 进而造成细胞损伤或死亡[4]。实际操作中一般认为冷冻时间以2.5～4.0 h为宜, 配好的稀释液在4 ℃下停放过夜, 可以达到更好的稀释冷冻效果。精液的平衡是指冷冻前在含甘油的稀释液中停留一段时间, 以达到精子细胞内外环境之间的平衡。但是甘油对精子有一定的毒害作用, 含量较大对精子细胞膜及顶体脂蛋白类综合体有破坏作用, 损害精子的授精能力。现在普遍认为甘油含量在4%或6%较为合适。近年来, 人们开始探索可以取代甘油的新型抗冻保护剂。Kobayashi等发现, 奶或其他外分泌腺分泌物中的乳铁蛋白可以明显提高精子的活率, 促进精子获能。Verberckmoes S等提出, 用含附睾液的稀释液冷冻精子后可获得更高的活力。Pena F J等研究发现, HA的样品有更多的精子表现高的脂质膜稳定性。Breininger E等的试验结果表明, α-维生素E可以改善低温保存后公猪精子的生物化学和运动学参数。胡建宏[5]的研究发现, 中草药可以替代部分甘油, 使甘油浓度由3 %降至1.5 %, 并且对猪冻后精子质量没有影响, 有利于改善猪冷冻精液质量。但遗憾的是, 临床上替代甘油的添加物仍处于研究阶段, 并未能真正应用于实践。
3 精液的冷冻
3.1 冷冻速率
冷冻过程中的精子细胞不但要对保存温度有耐受能力, 而且要能经受从射精到超低温的过程中活力不会过度降低。冷冻速率太慢时, 细胞与冷冻保护剂接触时间过长容易受冷冻保护剂的毒害作用而死亡或遭受破坏。冷冻速率过快时, 细胞内液体易导致结冰现象, 对细胞造成机械损伤, 解冻时的原理恰好相反[6]。Medrano A等[7]把降温分为两个阶段: (1) 从5 ℃到-5 ℃时, 降温速率从3 ℃/min到12 ℃/min不会对精子的浆膜导致重大破坏。但精子以24 ℃/min冷却到-5 ℃时会有轻微的破坏。 (2) -5 ℃到-50 ℃之间降温速率从15 ℃/min到60 ℃/min, 精子低温存活没有差异;降温速率在3 ℃/min到80 ℃/min之间精子的低温存活力没有太大差别。由于公猪精子对甘油的浓度敏感, 所以通常采用低浓度的甘油溶液进行快速冷冻。理想的冷冻速率为在3%甘油中, 0.5 mL细管采用30 ℃/min, 或0.25 mL细管采用50 ℃/min。当 5 mL大型细管在3.3 %甘油浓度下冷冻时, 为达到最佳的解冻效果, 冷冻速率应较慢, 为16 ℃/min[8]。
3.2 冷冻温度曲线
在精液冷冻技术中, 由冷冻温度和降温速度构成的冷冻温度曲线是影响精子冷冻后顶体完整率、授精率等生物参数的重要因素之一, 它决定着冷冻后精子存活率的高低。现在, 临床上应用的冷冻精液有颗粒和细管冻精两种。颗粒冻精滴冻的材料主要是干冰、不锈钢板、铝板和铜网。由于精液和冷冻面在冷冻前有着极大的温差, 加上冷冻面板质量、外界气温环境及导热性能的差异, 精液的降温速度缓慢, 通过危险区的时间延长, 很容易进入精液的危险温区内。而且颗粒冻精也较难进行不同来源的区别, 容易造成交叉污染。目前, 国内使用的聚氟乙烯板冻制颗粒精液效果好的原因在于其绝热性能好, 且有一定的厚度和重量, 减少了精液的初冻温度差异。实际生产当中推荐的始冻温度为-110～-120 ℃。但需要注意的是在滴冻结束后冷冻容器需加盖, 以保持正常的冷冻温度曲线。细管冷冻精液保存技术系成批性生产, 数百支细管精液一次性放入冷冻罐中, 每支细管精液的始冻温度是一致的, 减少了外界气温的影响, 降温速度快, 受胎率较高, 污染小, 但它的生产是将精液装入塑料细管中, 并放置于金属架或网盒等承载物体上, 这样就大大增加了精液细管的总容热量, 延缓了精液的总降温速度, 而且冻存的精液量太少, 一般1份需要解冻10～20根小型细管或2～3根扁平细管, 成本较高, 不利于输精和生产上普遍推广。近几年, 国外的学者又研究出5 mL大型细管, 不过由于在冷冻时内外温差较大, 细管中间的精子受冷不均匀, 达不到理想的冷冻效果, 大管形式冷冻的精液在精液表面的冷冻速率比中心要快3.75倍, 从而引起大管中的精子存活率明显降低。但是关于授精能力, 也有人认为在大型、小型和扁平细管授精力没有差异。
4 精液的解冻
快速解冻较慢速解冻对精子活力的恢复有利, 精子与浓缩溶液及低温保护剂接触的时间较短, 细胞内外能较快地达到平衡而使精子的活力得以恢复[9]。常用的解冻液成分大多为柠檬酸钠、葡萄糖、复方蔗糖。近年来, 一些研究者通过在解冻液中添加有益成分来增加精液解冻后的活力。Gadea J等发现公猪精液低温保存后谷胱甘肽 (GSH) 的含量降低, 在解冻液中添加GSH, 授精能力明显增强。有人在稀释液中添加N-乙酰半胱氨酸或L-半胱氨酸, 结果表明可以显著提高解冻后精子的活率和顶体完整率, 降低精子的低渗膨胀率。周佳勃在猪解冻液中添加牛血清白蛋白 (BSA) 发现, 加有BSA解冻液解冻后精子活力显著提高 (P<0.05) 。Hemandea M等[10]也详细研究了不同的解冻程序对精子活力的影响, 提出0.5 mL细管的最佳解冻速率为1 800 ℃/min; 0.25 mL细管冻精解冻可在37 ℃水浴30 s, 然后立即投入稀释好的2 mL解冻液中。
5 结语
目前, 从对猪精液冷冻技术环节的研究来看, 冷冻操作方法还处于探索阶段, 因此虽然猪冻精在1975年就有商业应用, 但应用还不到1% 。猪肉是我国肉类消费的主要来源, 约占肉类总消费的70%～80%, 对猪的精液冷冻保存是一项必须攻克的课题, 总的看来, 探讨分析冷冻-解冻过程中的损伤机理以改进猪精液冷冻与解冻的操作程序, 开发出新的冷冻保护剂和效果更好的解冻液仍是当前猪精液冷冻技术研究的首要任务。
摘要：相对于其他家畜而言, 猪精子对低温和冷冻都很敏感。目前, 对猪精子冷冻过程中的冷冻-解冻损伤机理还不十分清楚, 加上操作规范不统一, 使得精液冷冻技术在临床上应用不到1%。因此, 深入研究猪精液冷冻-解冻机理以完善操作过程中的关键环节, 提高受胎率和产仔数, 已成为国内外猪精液冷冻技术推广应用亟待解决的问题。近年来, 在猪精液冷冻各个环节的研究中有很大的突破, 取得了一定的成绩, 但是猪精液冷冻技术在生产中推广应用, 仍然有许多工作要做。
关键词：猪精液,冷冻保存,操作环节
参考文献
[1]BAILEY J L, BILODEAU J F, CORMIER N.Semen Cryopreservation in domestic animals:A damaging and capacitating phenomenon[J].Journal of Andrology, 2000, 21 (1) :1-7.
[2]GADEA J, GARCIA-VAZQUEZ F, MATAS C, et al.Cooling and freezing of boar spermatozoa:supplementation of the freezing media with reduced glutathione preserves sperm function[J].Andrology, 2005, 26 (3) :396-404.
[3]SARAVIA F, WALLGREN M, NAGY S, et al.Deep freezing of con-centrated boar semen for intru-uterine insemination:effects on sperm viability[J].Theriogenology, 2005, 63:1320-1333.
[4]COLLIN S, SIRARD M A, DUFOUR M, et al.Sperm calcium fructo-seels and chlortetracycline fluorescence patterns are related to the in vivo fertility of cryopreserved bovine semen[J].Andrology, 2000, 21 (6) :938-943.
[5]胡建宏.猪精液冷冻保存研究[D].杨凌:西北农林科技大学, 2006:76-89.
[6]CARVAJAL G, CUELLO C, RUIZ M, et al.Effects of centrifugation before freezing on boar sperm cryosurvival[J].Andrology, 2004, 25 (3) :389-396.
[7]MEDRANO A, WATSONL P F, HOLT W V.Importance of cooling rate and animal variability for boar sperm cryopreservation:insights from the cryomicroscope[J].Reproduction, 2002, 123 (2) :315-322.
[8]高俊锋.用0.25mL细管高密度冷冻保存猪精液的实用化研究[D].南京:南京农业大学, 2007:14.
[9]张忠诚.家畜繁殖学[M].3版.北京:中国农业出版社, 2000:232-233.
冷冻保存 篇9
关键词：胚胎,冷冻保存,冷冻保护剂,解冻
胚胎冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序使胚胎在-196℃温度下停止代谢活动, 而升温后又不失去代谢能力的一种长期保存技术, 是实现动物胚胎生产技术实用化和商业化的重要保证。1972年, Whittingham等首先发明了慢速冷冻法, 成功地保存了小鼠胚胎, 并在解冻后移植产下了后代。这种方法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 迄今为止, 已有多种动物胚胎经常规冷冻、解冻后移植至受体得到后代。
1 抗冻保护剂和冷冻保护液
在哺乳动物的胚胎冷冻过程中, 冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。-15～-50℃是一个致死温度区, 在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。抗冻保护剂主要分为3类: (1) 低分子质量可渗物质, 如甲醇、乙二醇 (EG) 、丙二醇 (PG) 、甘油 (GLY) 等一些醇类; (2) 低分子质量不可渗物质, 如葡萄糖、半乳糖、蔗糖等糖类; (3) 高分子质量不可渗物质, 如聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 、羟乙基淀粉以及其他一些聚合物。冷冻保护液常用杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) 来配制, 并且保持pH值为7.2～7.4, 也可用简单的生理盐水或TCM-199来配制。这些低温保护剂以不同的方法来保护胚胎细胞免受冷冻损伤, 有效的低温保护剂可将各种低温保护剂有机结合起来。
2 胚胎冷冻保存的方法
2.1 常规冷冻法
常规冷冻法分为慢速冷冻法和快速冷冻法。慢速冷冻法是最早建立的哺乳动物胚胎冷冻法, 该方法是在人工植冰后先以0.33℃/min的速度降至-35℃, 再以1℃/min的速度降至-80℃后投入液氮中冷冻保存, 整个过程约需3h。快速冷冻法是在慢速冷冻法基础上发展起来的, 比慢速冷冻法缩短降温时间1h。快速冷冻程序一般为胚胎先以1℃/min的速度由室温降至-5～-7℃, 植冰, 然后以0.1～0.5℃/min的速度降温至-35～-38℃, 平衡10min后投入液氮中保存。常规冷冻法经过30多年的发展, 冷冻效果已基本稳定, 目前仍在世界范围内广泛应用, 但该方法程序较繁琐、费时, 并且在冷冻过程中需要昂贵的程序降温仪。
2.2 玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻法是1985年发展起来的一种快速冷冻胚胎的方法, 使用的容器是0.25mL麦管。以3 000℃/min的速度降温时高浓度的冷冻保护剂变得黏稠, 由液态直接到无结构的玻璃样固体状态。至今已成功保存了小鼠、牛、羊、马、兔、猴及对冷极度敏感的猪和食肉动物等的胚胎。
但近年来为了克服常规麦管冷却和复温速度低的缺点, 一些学者在玻璃化过程中使用了特殊的小容积容器, 以减小玻璃化溶液的体积、提高冷却和复温速度, 从而提高玻璃化冷冻效果, 其中包括:开放式拉管 (OPS) 法、封闭麦管系统 (CPS) 、微滴、电镜铜网半开放麦管系统、尼龙环、冷环玻璃法等。
2.2.1 一步玻璃化冷冻法
玻璃化冷冻胚胎最简单的方法是将胚胎从生理溶液中直接移入玻璃化溶液中去, 然后将其投入液氮中保存。该方法是以乙二醇为主体抗冻保护剂, 添加高分子质量聚蔗糖和渗透压较高的蔗糖, 配制成高浓度的玻璃化溶液, 在室温条件下将胚胎直接装入含有玻璃化溶液的塑料细管中, 经短时间平衡后投入液氮。一步玻璃化冷冻法具备时间短的优势, 但为了防止胚胎细胞内冰晶形成, 抗冻保护剂必须充分渗透于胚胎细胞内部。在很大程度上, 抗冻保护剂的渗透性和它的毒性受温度影响, 最适的处理时间与温度是相关的, 在较低温度时处理时间可延长, 较高温度时可缩短。
2.2.2 两步玻璃化冷冻法
该方法的溶液由40%乙二醇、18%聚蔗糖和0.26%蔗糖组成。冷冻保存的基础液PBS辅以丙酮酸、葡萄糖、卡那霉素。冷冻分两步进行:冻存前胚胎在0.8mL 20%乙二醇液中平衡3min, 然后移到0.8mL的玻璃化溶液中短暂停留, 再装到0.25mL冻精细管中, 在30～45s内投人液氮罐中保存;解冻时在 (20±1) ℃的水浴中停留10s, 解冻后胚胎在0.7mL 8.5%蔗糖中洗脱保护剂。
利用两步玻璃化冷冻法体外生产牛胚胎, 可获得较高的成活率, 而且还可大大提高保护剂对胚胎各发育阶段的保护能力。这表明可通过提高降温速度降低胚胎在冷冻时造成的低温损伤。朱士恩等[1]用两步玻璃化冷冻法冷冻家兔扩张囊胚, 得到89%～90%的发育率, 妊娠率为29.2%。
2.2.3 开放式拉管 (OPS) 法
OPS法是丹麦人VajiaG于1996年发明的, 该方法使用拉得很细的薄壁细管, 利用毛细现象将极微量的冷冻液滴连同胚胎一起吸入毛细管内后再直接投入液氮中。OPS法采用的是混合保护剂, 不同研究者运用的保护剂不同。如El-GayarM采用20%乙二醇和20%DMSO用于山羊囊胚的冷冻保存, 而Otoerstein却采用16.5%乙二醇和16.5%DMSO并辅以蔗糖冻存马的胚胎。OPS法与传统玻璃化冷冻法相比具有快速的升温和降温速度, 从而减少冷冻损伤;操作更加简便, 可迅速装管和解冻以及去除保护剂;胚胎处于OPS管中, 在少量的高浓度保护液中冻存, 有利于减轻冷冻保护剂对胚胎的毒性。MoussaM等报道, 在马的胚胎冷冻中OPS法与常规冷冻法一样有效。据研究表明, 小鼠原核胚胎、山羊胚胎也适合用OPS法保存。ElGayarM等[2]应用OPS系统冷冻山羊第7天囊胚, 胚胎存活率达64%。
玻璃化冷冻法最不利的因素就是高浓度的冷冻液对胚胎造成的毒害作用, 因此胚胎暴露在冷冻液的时间应严格控制在一定范围之内。自玻璃化法出现以来, 许多研究工作都集中在发展各种有效的玻璃化溶液。事实上, 大部分低温保护剂都可作为玻璃化溶液。混合使用各种低温保护剂对降低玻璃化溶液浓度和减小毒性是有益的。甘油和乙二醇毒性小, 但是形成玻璃化能力差, 1, 2-丙二醇玻璃化形成能力较大, 但浓度大于10%时毒性很大。把1, 2-丙二醇加到甘油、乙二醇或DMSO中, 可使后者玻璃化溶液浓度降低, 增强玻璃化形成能力而毒性效应较低。
2.2.4 冷环玻璃法
这种方法具有降温速度快的优点。最初应用于小鼠和人的囊胚研究, 随后Oberstein N[3]在马胚胎的冷冻中进行了适当改进。玻璃化溶液的组成是17.5%DMSO和17.5%乙二醇, 再辅以1mol/L蔗糖及0.25mol/L聚蔗糖。操作分两步:胚胎首先在17.5%DMSO和17.5%乙二醇混合液中处理2.5min, 然后将胚胎移到附有玻璃化溶液的尼龙膜环上, 再将环投入浸在液氮中的冷冻管内, 胚胎接触保护液到投入液氮的时间为20～30s。环的直径为0.5～0.7mm, 固定在具有小磁球的不锈钢锥顶上。试验结果表明, ≤300μm的马胚胎利用冷环玻璃法冻存, 解冻后胚胎分级和活细胞数与程序化冷冻效果类似。利用冷环玻璃法冷冻大鼠胚胎有41%的胚胎正常发育。
3 冷冻胚胎的解冻
3.1 解冻
冷冻胚胎的解冻方法主要有慢速解冻法和快速解冻法, 快速解冻法优于慢速解冻法。当温度由-196℃回升到-50～-15℃时会形成细胞内冰晶;采用快速解冻法, 胚胎在30～40s内由-196℃迅速上升至30～35℃, 瞬间通过危险温区使冰晶来不及形成, 但由于温度急剧上升的热应激胚胎在解冻过程中常发生透明带破碎。DallW F等指出, 胚胎从液氮中取出后在空气中稍停留, 待温度缓慢回升到一定程度再水浴解冻可有效降低热应激。
3.2 脱除保护剂
胚胎解冻后必须迅速脱除保护剂, 使胚胎恢复到冻前状态, 以解除常温下保护剂对胚胎的毒性作用。如果解冻后直接移入生殖道或等渗液中, 因细胞内外存在较大的渗透压差, 胞外水分将会快速渗入细胞内, 甚至过度膨胀导致细胞崩解。早期研究结果表明, 胚胎解冻后冷冻保护剂的脱除可用递减冷冻保护剂浓度 (每步0.25mol/L) 的方法处理, 最后转移到含血清的PBS中保持5～10min, 于显微镜下观察, 当胚胎扩张至接近冻前状态时即认为保护剂已脱除。这种方法繁琐、费时, 但较为有效。现在用得较多的方法是采用蔗糖等非渗入性保护液一步或两步脱除, 但使用浓度很不一致, 还有一种方法就是在脱除保护剂的过程中逐渐升温。
参考文献
[1]朱士恩, 曾申明, 张忠诚.家兔扩张囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究[J].中国养兔杂志, 1997 (2) :16-18.
[2]El-GAYAR M, HOLTZ W.Thechnical note:vitrification of goatembryos by the open pulled straw method[J].Anim Sci, 2001, 79:2436-2438.