低温冷冻（共7篇）
低温冷冻 篇1
我国是水产大国, 水生生物资源十分丰富, 海、淡水鱼类总数达3000多种。近年来, 由于渔业资源捕捞过度、无序利用、环境污染及生态破坏等情况日益严重, 某些鱼类资源已出现衰退, 甚至濒临灭绝的状况, 如不及时采取保护措施, 若干年后, 在自然界中, 这些鱼类原种和良种的遗传资源将难觅踪迹。此外, 在养殖过程中, 缺乏合理、科学的育种路线, 近亲繁殖现象严重, 导致遗传多样性降低、对病害和恶劣环境的防御能力降低、繁殖力低下等, 致使病害发生率日趋上升, 造成了巨大的经济损失。目前, 鱼类种质资源保存及遗传多样性保护已成为水产养殖业中亟待解决的难题, 超低温冷冻保存技术研究的不断深入和应用范围的扩大, 为攻克这一难题提供了一条有效的途径, 是我国水产养殖业快速发展的一大助力。
1 鱼类精子超低温冷冻保存的基本原理
鱼类精子由头、颈和尾3部分组成, 头部为圆球形, 具鞭毛, 大小一般为30~35μm。其精液乳白色, 大多数呈弱碱性, p H值7.3~8.5, 浓度和密度随季节而变化。精液中金属元素有钾、钠、钙、镁、锌等。其中主要起稳定渗透压作用的钾和钠两种元素占总金属元素含量的比例高达99.7%~99.8%, 对精子的激活和抑制有着非常重要的作用[1]。精子被排入水中后便开始运动, 即激活。精子运动所需要的能量来自于原生质中的营养物质, 由于原生质极少, 导致精子被激活后寿命很短, 除此之外, 其能量还被用于调节细胞内的渗透压平衡。因此, 降低精子代谢率可以减缓其能量消耗, 延长精子寿命[2]。
鱼类精子超低温冷冻保存是通过采集成熟雄鱼精子进行抗冻保护, 使其在冷冻过程中免受或降低一系列的低温损伤 (冰晶损伤、溶质损伤等) , 迅速越过0~-60℃危险温度区, 最终进入超低温 (如-196℃的液氮等) 环境, 细胞代谢几乎完全停止, 进入休眠状态, 从而达到长期保存的目的。当条件适宜、有需要时, 取出低温区中的精子并解冻至常态, 恢复其内部正常的生化反应, 并具备正常的生物学功能[3,4,5,6]。陈松林等[7]通过对大菱鲆后代遗传结构影响的微卫星分析, 证实冷冻保存对冻精所育后代遗传结构和遗传多样性没有影响。
2 冷冻保存技术及其应用
自1953年英国学者Blaxter成功用干冰 (-79℃) 保存太平洋鲱鱼 (Clupea harengu) 精巢, 并获得大于80%的受精率后[8], 各国研究人员针对不同种类的鱼类精子低温冷冻保存技术展开研究, 其研究内容主要包括冷冻保存方法、抗冻保护液、降温、解冻速率、冷冻保存温度、抗冻剂去除等过程。
2.1 冷冻保存方法
由于试验条件和技术手段不同, 研究人员所采用的冷冻保存方法也不尽相同。目前较为常用的有小丸颗粒冷冻法、安瓿瓶冷冻法、冻存管冷冻法等。
小丸颗粒冷冻法是一种直接将精液滴到干冰或冷冻板上, 冻结成精液小颗粒, 然后转入液氮中保存的方法。其解冻时精子必须用解冻液解冻, 且解冻和精子的激活过程同步。该方法存在冻精活力不够高、存活时间极短等问题, 即使解冻和授精之间间隔l~5 min, 都会明显降低冻精能育性, 因而限制了这种方法的实用性[9]。
安瓿瓶冷冻法、冻存管冷冻法的优点是可避免精液与冷冻剂的直接接触, 解冻时直接将瓶或管置于室温或水浴解冻。但安瓿瓶体积较大, 封口操作麻烦, 降温速率不易准确控制, 解冻活力不够稳定。而冻存管冷冻法具有冷冻量大, 降温速率易控、操作简单便捷等优点, 其冷冻效果明显优于安瓿瓶[10], 由于冻存管体积小, 在液氮罐中操作方便, 且易于推广应用, 是一种较为实用的冷冻保存方法。
2.2 抗冻保护液
抗冻保护液由抗冻剂和稀释液两部分组成。不同鱼类的精子对抗冻保护液的成分和浓度要求不同, 在进行超低温冷冻保存试验之前, 大部分研究人员都会根据其生理特性进行筛选工作。适宜的抗冻保护液能最大限度地减少精子损伤, 起到良好的保护作用, 反之则会毒害细胞。
2.2.1 抗冻剂
抗冻剂具有稀释溶液中溶质浓度、降低超低温冷冻保存过程中细胞渗透性损伤、减少冰晶形成等作用, 是组成抗冻保护液的主要成分。由于鱼类精子的生理特性存在差异, 实验所用抗冻剂的种类和浓度选择也有所不同。
常用的抗冻剂主要包括甘油 (Gly) 、二甲亚砜 (DMSO) 、甲醇 (Me OH) 、乙二醇 (EG) 等, 这类抗冻剂能降低冰点、减少冰晶形成, 避免细胞内水分过分渗出造成细胞皱缩, 达到保护的目的。不同动物的种质细胞对抗冻剂的适应性和敏感性也不同, 如Gly在花鲈[11]、大黄鱼[12]等精子冷冻保存中效果良好;DMSO在真鲷[13]、日本蟳等[14]精子冷冻保存中效果明显;Pan等[15]认为10%Me OH对黄颡鱼精子冷冻保存有较好的保护效果, 得到了夏良萍等[16]的证实。王晓爱等[17]则认为Me OH和EG具有相似的保护作用, 是暗色唇鱼精子冷冻保存潜在的渗透性抗冻剂。
有些抗冻剂具有毒性, 会对细胞产生毒害作用, 影响精子的抗冻效果以及冻精解冻后的活力等。一般说来, 抗冻剂的浓度越高、平衡时间越长、平衡温度越高, 抗冻剂的毒性就越大。研究表明, 抗冻剂可明显降低淡水鲤科鱼类卵子的受精率和孵化率[18,19]。为了减轻抗冻剂的毒性, 研究人员采取了缩短抗冻剂与精子的接触时间、选择低毒、高渗透性的抗冻剂、多种抗冻剂混合以及非渗透性抗冻剂等方法来保持细胞膜的完整性。1987年陈松林[20]采用分步添加法成功降低了DMSO对精子的毒害作用;华泽钊[4]实验中发现40% (W/V) 的DMSO的毒性是22.8%DMSO+17.2%乙酞胺的近3倍, 也就是说抗冻剂混合后使用有可能会中和抵消部分单独使用时的毒性。
针对高浓度的抗冻剂的毒性作用, 一些学者研发了抗冻蛋白 (AFPS) 等天然抗冻因子。抗冻蛋白抗冻作用的一个特点是能够降低冰晶形成的温度, 从而在降低冰点的同时不改变溶点, 即热滞后效应[21];另一个特点是降低冰点的作用机制是非依数性的, 即其抗冻作用的大小与本性有关而与数量无关, 因此它对生物基质的渗透压影响很小[22]。研究发现, 鱼类的抗冻蛋白可以增强鲤鱼精子的抗冻能力[23], 直接向鱼体中注射抗冻蛋白可以增强鱼的低温耐受能力, 成功实例包括:虹鳟、罗非鱼等[21]。
2.2.2 稀释液
稀释液的作用是稀释抗冻剂, 降低其毒性, 形成一个适宜精子生存的环境, 以延长精子活力和保存时间。根据稀释液成分的复杂程度可分为复杂稀释液与简单稀释液。复杂稀释液一般是通过模拟精浆的主要离子成分配置而成的;简单稀释液则主要以碳酸盐为基础辅以其他离子成分配置而成, 或者直接以Na Cl溶液或一些单糖溶液作为稀释液。已用过的稀释液成分主要有:盐类 (如Na HCO3、Na Cl等) 、糖类 (如葡萄糖、果糖等) 、脂类 (主要是磷脂) 和蛋白质 (如卵黄、小牛血清等) 以及其他添加剂 (如甘氨酸、抗生素等) [2]。
不同鱼类精子对超低温冷冻保存所用稀释液的要求也不同。在部分鱼类精子的超低温冷冻保存中, 成分复杂的稀释液对精子的保存效果好于成分简单的稀释液, 如Mounib稀释液 (10.0 g/L KHC03, 2.0 g/L还原性谷光甘肽, 42.7 g/L蔗糖) 在红点鲑精液的超低温保存中的保存效果优于0.3 M葡萄糖溶液[24];对于某些鱼来说, 成分简单的稀释液也具有很好的保存效果, Ott等[25]配制的Na Cl、Na HCO2和磷脂组成的稀释液冷冻保存的大马哈鱼精液、Mc Niven等[26]利用简单的蔗糖或葡萄糖作为稀释液保存的虹鳟等。
2.3 降温、解冻速率
鱼类精子能在超低温状态下长期保存, 但在降温和解冻过程中极易受到溶液冻结、融化、降温、解冻速率、溶液渗透压、p H值变化等因素的影响而造成损伤, 这种损伤一般发生在危险温度区内。因此, 在危险温度区中需要采用合适的速率降温及解冻, 低于-60℃后温度可以迅速降到-196℃超低温[3]。
2.3.1降温速率
不同的降温速率会使细胞发生不同的生理变化并产生不同的损伤, 直接关系到冷冻保存效果。细胞-5℃时, 由于抗冻保护剂的作用, 溶液的冰点降低但未结冰;-5~-15℃时, 细胞外溶液开始结冰而细胞内仍未结冰。由于具有更高的化学能, 细胞内未结冰的水分子为了保持化学能的平衡, 会向细胞外流动。此时, 如果降温速度过慢, 细胞会产生严重脱水现象导致体积过度收缩而失去活性, 还会引起细胞外溶液出现部分结冰现象, 产生溶质损伤;降温速度过快时, 细胞内尚未外渗的水分会形成较大的冰晶, 导致细胞膜和细胞器遭到破坏, 从而产生细胞内冰晶损伤。目前, 科研人员较常用的方法是二步降温法 (以1℃/min的速度降温到-30℃;再以5~10℃/min的速度降至-100℃以下后直接投入液氮保存) [27]和干冰压片法 (将稀释后的精液迅速在干冰上压片, 冷冻5 min后投入液氮中保存) , 如虹鳟[28]等。林丹军等[12]在大黄鱼精子冷冻实验中采用直接投入液氮中保存的方法, 也获得了很好的保存效果。
2.3.2 解冻速率
解冻速率与解冻液的初始温度、精子与解冻液的比例、精子的体积和水浴的温度均有密切关系。精子冷冻后, 膜的渗透率发生变化, 可能造成渗透率过大或过小, 甚至完全没有渗透功能, 而有的细胞渗透率虽然没有发生变化, 但在复温过程中会产生细胞溶解、细胞结构损坏等, 解冻时需确保细胞安全度过危险温度区, 以防止冰晶损伤。目前常用的做法是水浴, 温度在35~40℃[13,16], 1~2 min内完成解冻;但林丹军等[12]用室温 (21~25℃) 解冻法解冻大黄鱼的效果也不错 (室温解冻必须在5 min之内完成) ;Kebby[29]在对条纹狼鲈的试验中, 快速解冻温度为50~60℃, 其受精率与慢速解冻时无显著差异。
2.4 冷冻保存温度
低温状态可抑制种质的代谢、繁殖, 防止其变异及衰老等, 当进入低温环境后, 生物细胞、组织、器官、胚胎甚至个体代谢都降至最低点, 进入损耗最小的休眠状态并被长期保存。如果在低温保存过程中, 细胞中的蛋白质、酶及其他结构没有被破坏, 则细胞解冻后的活力与各种功能将同时被恢复, 冻精受精率达到或接近鲜精受精的水平是完全可能的。一般说来, 温度越低, 保存的时间就越长[30,31,32,33,34]。不同细胞和生物体其特性以及相适应的冷冻保存方法不同, 其冷冻保存温度也不尽相同。从目前的研究现状来说, 液氮温度 (-196℃) 是较为常用的一种保存温度。如果采取适宜的冷冻保存方法, 在液氮环境中, 一般生物样品可保存十年以上。当温度下降到-700~-800℃时, 短期保存不会对细胞活性产生明显影响, 长期保存则会导致细胞存活率降低。
2.5 抗冻剂的去除
抗冻剂的毒性会在一定程度上影响种质细胞的生长发育, 因此, 冻精在解冻后需要尽量洗脱残留的抗冻剂, 以减少这种不良的影响。由于有较厚的细胞壁, 用离心方法可以洗脱海洋微藻的抗冻剂, 但对于没有细胞壁的动物种质细胞而言, 离心并不是一个适合的方法。目前, 研究人员最常用的是稀释法, 即在冻精解冻后增加其激活液的使用量以稀释抗冻剂浓度, 达到降低其毒性的目的。怎样更有效地降低或去除抗冻剂的毒性, 是亟待解决的问题之一。
目前, 世界许多国家的科研人员都在进行低温冷冻保存技术研究, 鱼类精子超低温冷冻保存技术已有较大地突破。国外研究成功的包括太平洋鲱鱼 (Clupea harengus) [8]、大菱鲆 (Scophthalmus maximus) [35]、虹鳟鱼 (Oncorhynchus mykiss) [36]、大西洋鲑 (Salmo salar) [37]等。在我国也取得了一些成效, 如草鱼 (Ctenopharynodon idellus) [38]、石鲽 (Kareius bicoloratus) [39]、翘嘴鳜 (Chuatsi basilewsky) [40]、黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco) [15,16]等。
3 展望
鱼类精子的超低温冷冻保存在部分鱼类研究上已取得了成功, 获得了较高的受精率、孵化率, 但是大部分鱼类仍然停留在对保存方法的摸索和实验阶段, 由于影响保存效果的因素较多, 且这些因素相互作用、相互影响, 使许多成功的实验结果存在无法重复操作的现象, 失败原因也难以追查。但随着研究手段的不断进步和完善, 鱼类精子超低温冷冻保存技术会日趋成熟, 为鱼类种质保存与优良品种培育的生产实践带来深远的影响。随着鱼类冷冻精子库的建立, 鱼类基因资源可以得到完全地保存;在较少的时间和空间条件下保证精子的供应, 提高选择育种的可行性;可以有效解决雌雄鱼性腺成熟不同步或地理分布不同产生的生殖隔离导致的人工繁殖困难;利用扩大杂交组合范围的方法, 克服长期近亲交配造成的种的衰退;通过技术手段使性转换个体得以自交;除此之外, 还可以排除病源感染威胁, 促进鱼类病理学发展;提高精液的利用率, 扩大苗种生产规模;使精液实现方便快捷的长距离运输, 节约繁殖育种资金;提供实验材料, 促进鱼类遗传育种和生物技术等相关实验研究的顺利开展等。
低温冷冻 篇2
关键词：兴国红鲤；精液；超低温保存
中图分类号：S965.116 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0277-02
收稿日期：2015-03-16
基金项目：江苏省科研院所社会公益研究与服务专项（编号：BM2006703）；江苏省水产三项工程项目（编号：K2006-3）。
作者简介：丁淑燕（1978—），女，山东烟台人，硕士，助理研究员，主要从事水产种质资源与遗传育种研究。Tel：（025）86581571；E-mail：dshy7869@sina.com。
通信作者：葛家春，博士，研究员，主要从事种质资源保藏与利用。Tel：（025）86581570；E-mail：gjc09@sina.com。兴国红鲤（Cyprinus carpio var.singuonesis）别称金狮红鲤，隶属鲤形目鲤科鲤属，是江西省兴国县特有的淡水养殖品种。在渔业生产上具有较广泛的实际应用价值。据史料记载，该鱼已有1 300年的养殖历史，具有体色全红、个体长大、背宽肉厚、肉质鲜嫩、繁殖力强等特点，深受广大渔业工作者欢迎。由于受到长期、密集的人工选育影响以及缺乏科学的选育指导，在形态和生长性状等方面出现了不同程度的衰退[1]。水产生物种质资源的保护关系到水产业的可持续发展。研究兴国红鲤精液的超低温保存，无论从良种的保存还是水产上的实际生产来讲都是很有意义的。本研究通过筛选D-20、Kurokura-1、Ringer液3种稀释液和二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（Meth）3种抗冻剂，并对冷冻保存的精子进行活力测定，旨在探索一套有效的兴国红鲤精子超低温冷冻保存方法。
1材料与方法
1.1试验材料
试验所用的兴国红鲤取自江苏洪泽水产良种场，充气运回后于笔者所在研究所水池内暂养。
1.2试验方法
1.2.1精液的采集根據鱼体质量，分别注射催产激素HRH-A2 5 μg/kg、HCG 250 IU/kg、DOM 1.5 mg/kg、脑垂体 5 mg/kg；12 h后，挤压腹部，若有精液流出，即可取精。方法为用干毛巾擦干其生殖孔，轻轻挤压雄鱼腹部，有精液流出，采集至干燥容器中。所采集的精液要求乳白色，无血液、粪便污染。
1.2.2精子的形态观察取1滴精液于干净载玻片上，通过自来水流水冲洗调节密度至适中，置于空气中干燥后，加苏木精染色液，后再次置于空气中干燥，再加入曙红染色液，空气中干燥后重新置于显微镜下观察，并进行显微摄影。
1.2.3精液质量的测定先用细口吸管吸1滴激活液于载玻片上，对准视野后，用解剖针针尖挑取培养皿中的精液，取出后立即在载玻片上的激活液中搅匀观察，激活液激活后测活力，大于90%用于保存。将精液稀释10 000倍，采用血球计数板计数，统计精子密度。
1.2.4稀释液的配制将精液经过不同稀释液适当稀释后，分别与含有16%DMSO、25%甘油、20%甲醇的同种稀释液等体积混合，使其终浓度为5×108 精子/mL，每管400 μL。以不含有任何保护剂的稀释液为对照组。每组试验均重复3次（n=3）。
1.2.5冷冻保存方法将配好的精液稀释液迅速按照下列程序进行冷冻保存：（1）两步冷冻：-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存；（2）多步冷冻：4 ℃平衡30 min，-20 ℃平衡15 min，-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存。
1.2.6解冻方法与精子激活经过一定时间的冻存，将冷冻管从液氮罐中取出，于37 ℃水浴90 s，用SM试剂（NaCl 2.6 g/L、KCl 0.4g/L、Tris-HCl 2.4 g/L，pH值为8.0）激活，具体激活方法为每900 μL SM试剂加入6 μL解冻后的精液，立即放入显微镜视野下观察精子运动力和寿命。
1.2.7精子活力的测定精子活力分别以精子寿命及精子运动力来评价，精子寿命是指精子被激活至绝大部分停止摇摆运动所需的时间。精子运动力指运动精子占全部精子的百分数。
2结果与分析
2.1兴国红鲤精子的形态观察
在400倍光学显微镜下，兴国红鲤精子头部为卵圆形，尾长而弯曲，形如蝌蚪（图1）。
2.2兴国红鲤新鲜精子的质量鉴定
该精子是一类分化程度很高的细胞，在精巢中不活动，与其生存水环境接触后，99%的精子被激活开始做快速直线运动，经稀释液一定程度的稀释，血球计数板计数，其精子浓度为3.2×1010精子/mL。
2.3兴国红鲤冷冻保存精子的活力测定
2.3.1稀释液对精子冷冻保存的影响应用上述含有16% DMSO的3种冷冻稀释液对兴国红鲤精子按照两步冷冻法进行冷冻保存，其冷冻保存效果见图2。在3种稀释液中，Ringer液的冻后成活率最高，达（83±9.6）%；寿命最长，达 （86.25±24.7） s。Kurokura-1、D-20液的冻后成活率和寿命分别为（33±20.6）%、（75±5.8）%和（54.5±28.2） s、（56.25±13.6） s。因此兴国红鲤精子冷冻保存的最适稀释液为Ringer液。
nlc202309040407
2.3.2保护剂对精子冷冻保存的影响用Ringer液作稀释液，按照两步冷冻法进行冷冻保存，比较了3种抗冻剂（DMSO、Gly、Meth）的冷冻保存效果，结果见图3。DMSO冻存兴国红鲤精子效果最好。8%的DMSO冻后精子成活率为（83±9.6）%，寿命为（86.25±24.7） s。12.5% 甘油、10%甲醇冻后精子成活率较差，分别为（7.5±9.6）%、（33±34）%；寿命较短，分别为（10.5±14.2）s、（40±36.9）s。
2.3.3冷冻程序对精子冷冻保存的影响用Ringer液作稀释液，8% DMSO作保护剂，比较了2种冷冻方法对兴国红鲤精子的冷冻保护效果，结果见图4。采用两步冷冻法保存的精子成活率为（83±9.6）%，寿命为（86.25±24.7）s，而三步冷冻法保存的精子成活率为（85±5.8）%，与两步冷冻法无显著差异，寿命为（68±6.7）s，与两步冷冻法差异显著（P<0.05）。
3讨论
目前，精液超低温冷冻保存的方法一般遵循的原则是慢
冻速融，本次试验的结果符合该原则。关于鱼类精液保存稀释液的配制至今没有一个统一的理论依据，而且由于试验用鱼种类的不同，稀释液可能也有所差异。目前用于鱼类精液超低温冷冻保存的稀释液配方多数都是借鉴家畜的精液超低温保存配方或者凭经验配制。一般来说弱酸性稀释液的保存效果高于弱碱性的稀释液。本研究采用以往文献中较为成功的几种稀释液配方[2-4]，通过试验，筛选出最适合用于兴国红鲤精液超低温保存的冷冻稀释液—Ringer液。
不同的冷冻保护剂被成功用于不同鱼类精子的超低温冷冻保存。DMSO常被用于大菱鲆[5-6]、海鲈鱼[7]、黑石斑鱼[8]、美洲黄盖鲽[9]等精子的冷冻保存，本试验比较了DMSO、甘油、甲醇对兴国红鲤精子的冷冻保护效果，结果显示，DMSO比甘油、甲醇更适合兴国红鲤精子的冷冻保存。DMSO对精子有毒性但又有较好防冻效果的双重特性，在本研究中8% DMSO既能起到良好的抗冻作用，且不会导致精子损伤。
鱼类精液经过冷冻保存及解冻后的激活方式对于获得高的精子活力具有重要意义。陈松林等研究表明，在冷冻过程中，在DMSO的作用下，鱼类精子的渗透压升高，先前用于鲜精的激活方式已经不再适合冻精。如果用水直接激活，会导致冻精内外渗透压过大，精子吸水膨胀、活力降低、寿命缩短。而用有一定渗透压的溶液去激活冻精，效果要好得多[10]。本研究激活冻精所用的SM试剂即能获得较好的激活效果。
鱼类精液经过超低温冷冻后，活力都有一定降低。本次试验用曙红染色冻精，在显微镜40倍物镜下观察发现经过冷冻/解冻后的精子中有部分精子的形态结构发生变化，主要表现在：（1）精子的细胞膜变得疏松、膨胀甚至破裂、脱落；（2）精子尾部的鞭毛断裂，有基部断裂和中部断裂2种；（3）精子鞭毛非正常缠绕、扭曲。精子在冷冻/解冻过程中发生冻存损伤是难免的[11-12]。在冻存过程中，一方面由于温度的不断下降，精子不耐低温可能导致结构及功能发生变化，另一方面由于加入的抗冻剂本身对精子有毒性，以及精细胞中水分不断渗出导致精子内外渗透压变化也会导致精子的冻存损伤。
虽然目前在冷冻稀释液、抗冻剂、降温速率以及激动方法等方面还没有统一标准，但随着精液超低温保存技术的不断发展，使得精子冻存后的损伤大大减小，这项技术会更加完善。
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低温冷冻 篇3
1参试树种
该试验参试树种5种, 分别为:经济林小灌木西伯利亚白刺, 枸杞优良品种-宁杞一号、大麻叶, 内蒙种源沙枣, 沙棘。
2试验法及试验材料
2.1试验材料
取5个耐盐碱经济树种 (西伯利亚白刺、宁杞一号、大麻叶、内蒙种源沙枣和沙棘) 当年生枝条中部为试验材料。
2.2试验方法
每样品称重0.50 g, 放入50 m L三角瓶中加入40 m L蒸馏水, 于室内静置10 h, 测得的电导值为煮沸前电导值。然后沸水浴15 min, 静置2 h, 测得的电导值为煮沸后电导值, 计算出相对单导率。在不同低温处理下, 得出各树种的相对电导率曲线呈“S”型, 应用电导法配合Logistic方程求出“S”型曲线的拐点温度能较准确地估计出植物组织的低温半致死温度。
3试验结果与分析
3.1相对电导率的计算
相对电导率= (煮前电导率-煮后电导率) ×100%, 结果见表1。
在不同低温处理下, 得出植物的相对电导率曲线, 通过曲线拐点温度较准确地估计出植物组织的低温半致死温度 (LT50) , 其计算结果见表2。
从表2中可以看出, 5个测试树种抗寒性均较强, 其中西伯利亚白刺最抗寒, 半致死温度达-43.7℃;枸杞优良品种宁杞一号和大麻叶抗寒性较抗寒, 半致死温度分别达到-40.08℃和-40.04℃;沙棘抗寒性次之, 半致死温度为-39.4℃;内蒙古种源沙枣的抗寒性稍低;半致死温度为-38.0℃。
4结语
试验可知:参试的5个耐盐碱经济树种半致死温度分别为:西伯利亚白刺-43.7℃, 枸杞优良品种-宁杞一号和大麻叶为-40.08℃和-40.04℃, 沙棘为-39.4℃, 内蒙古种源沙枣为-38.0℃。由此可推断出5个耐盐碱经济树种的抗寒性顺序为:西伯利亚白刺抗寒最强, 枸杞优良品种-宁杞一号和大麻叶仅次之, 沙棘排位第四, 内蒙古种源沙枣抗寒性在5种树种中最低。而5个耐盐碱经济树种的半致死温度均低于-38.0℃, 说明均具有较强的抗寒性, 都可以在吉林省西部地区以及年最低温度在-38.0℃以上地区的盐碱地上大面积推广。
摘要：吉林西部是吉林省生态建设的重点地区, 而目前吉林西部的生态建设的重心正在由单一的生态型向生态经济型转变, 为了给吉林西部中、重度盐碱地治理的生态经济型发展提供科技支撑, 该试验选择了生态作用大、经济价值高、产业化前景广阔的珍贵耐盐碱经济树种-西伯利亚白刺、枸杞、沙枣、沙棘等, 开展了低温冷冻试验, 试验通过蒸煮前后电导率的测定, 配合Logistic方程求出“S”型曲线的拐点温度, 即致死温度, 从而测定几种耐盐碱珍贵经济树种的抗寒性, 以便在适宜区域的盐碱地上进行产业化推广应用。
关键词：耐盐碱经济树种,低温冷冻试验,抗寒性
参考文献
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低温冷冻 篇4
关键词：麻疯树,柳州,冷害,冻害,调查
麻疯树 (Jatropha curcas L.) 原产于热带及亚热带地区, 是世界公认的可再生生物能源植物。麻疯树也是低温敏感植物, 0℃以下的低温对麻疯树有致命伤害, 而对0℃以上低温具有一定的耐受性[1]。随着国内麻疯树栽培的北移和向高海拔山区的拓展, 低温冷害成为限制麻疯树产业发展的主要环境因素[2]。为此, 前人基于Worldclim气候数据, 利用Diva-gis软件中整合的Bioclim模型和Domain模型预测了麻疯树在我国境内的适生区为北纬18°~30°, 东经97°~120°的地区, 最适生区为川滇交界地区、云南中部及滇黔桂边界的条带状地区 (北纬21°~27°, 东经98°~107°) [3]。柳州位于广西中部, 地处北纬23°54′~26°03′, 东经108°32′~110°28′之间, 部分县区具备麻疯树生长的基本气候条件[1]。近年来, 在相关科技部门的科研立项支持下, 柳州进行了麻疯树引种试验[4,5]。本研究为“生物能源树种麻疯树引种试验研究”课题的一部分, 报道柳州引种麻疯树遇到的低温冷冻灾害情况, 以为麻疯树引种、驯化和推广种植提供参考。
1 调查地点与方法
1.1 调查时间与地点
2011年1~4月, 对种植于柳州市沙塘镇 (北纬24°44′, 东经109°37′) 的麻疯树进行冷害调查;2013年1~4月, 对种植于柳州市区 (北纬24°33′, 东经109°43′) 的麻疯树进行冷害调查;2014年1~4月, 对种植于柳州市鹿寨县江口乡 (北纬24°25′, 109°61′) 、柳州市区 (北纬24°33′, 109°43′) 及柳州市柳城县太平镇 (北纬24°65′, 109°24′) 的麻疯树进行冷冻害调查。同时, 对麻疯树发生冷冻害的气象条件进行观测, 观测点位于柳州市农业气象试验站 (北纬24°44′, 东经109°37′) , 观测点与麻疯树各种植点间距在40 km内, 期间气温和降雨条件分别见图1、图2。
1.2 调查项目与统计
冷害或冻害发生后, 于当年1月对各种植点麻疯树的叶片受害率、花序受害率及幼果受害率进行调查;于当年4月初 (存活麻疯树已长出新叶) 对各种植点麻疯树的植株受害率、茎枝顶端受害率、茎枝受害率、植株死亡率进行调查。计算公式分别为:叶片受害率 (%) =受害叶片数×100/调查叶片数, 花序受害率 (%) =受害花序数×100/调查花序数, 幼果受害率 (%) =受害幼果数×100/调查幼果数, 植株受害率 (%) =受害植株数×100/调查植株数, 茎枝顶端受害率 (%) =受害茎枝数×100/调查茎枝数, 茎枝受害率 (%) =受害茎枝长度×100/调查茎枝总长度, 植株死亡率 (%) =死亡植株数×100/调查植株数。应用Excel2007软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 2011年、2013年柳州麻疯树冷害情况
2011年1月2~8日柳州气象观测点出现日平均气温为3.1℃~5.8℃、日最低气温为1.8℃~4.4℃、日降雨量为0.1~2.3 mm的低温小雨天气后, 种植于沙塘镇的4年生麻疯树叶片出现烫伤、萎蔫及干枯症状, 茎枝顶端也变得柔软、萎蔫;随后出现长达26 d的日平均气温为2.0℃~8.9℃、日最低气温为-0.4℃~6.8℃的低温阴雨寡照天气, 麻疯树植株进一步受害;至2011年4月, 麻疯树植株因冷害而全部死亡 (见表1) 。
2013年1月3~7日气象观测点出现日平均气温为1.5℃~6.2℃、日最低气温为0.9℃~3.7℃、日降雨量为0~2.1 mm的低温阴雨天气后, 种植于柳州市区的4月生麻疯树叶片和茎顶端出现烫伤和萎蔫症状;随后气温呈间歇式上升, 植株萎蔫向茎中下部蔓延, 受害部位逐渐出现干枯、腐烂症状, 受害严重的植株因此而死亡;至2013年4月, 超过90%的植株受害, 近60%的植株死亡。可见, 低温阴雨天气会造成麻疯树严重冷害和植株大量死亡。
2.2 2014年柳州麻疯树冷冻害情况
2014年1月柳州气象观测点未出现类似2011年1月和2013年1月的低温阴雨寡照天气, 但14日、15日及22日、23日夜间出现了霜冻 (其中江口乡种植点出现了当地农民俗称的“白头霜”严重霜冻) , 各种植点麻疯树叶片全部受冻害, 茎枝顶端也不同程度受害, 太平镇种植点16月生麻疯树的花序和幼果也全部受害;至1月29日, 各种植点的麻疯树叶片、花序或幼果果柄全部干枯, 茎顶端也不同程度变软、干枯或腐烂, 茎枝髓部出现中空或隔断 (见表2) 。可见, 持续霜冻会造成麻疯树叶片、茎顶端、花序及幼果等幼嫩部位严重冻害。
注:表中“-”为低温冻害发生前该部位尚未形成或已脱落。
2014年2月6日后, 柳州气象观测点出现了持续14 d的日平均气温为3.6~7.8℃、日最低气温为-1~7.2℃的低温阴雨寡照天气, 麻疯树植株进一步受害;至2014年4月, 各种植点麻疯树植株呈现不同程度的干枯或死亡, 但不同品种、不同种植点或不同树龄间麻疯树植株的受害程度有一定差异 (见表2) 。其中, 不同品种间, 昆明种源4月生麻疯树在柳州市区和太平镇种植点的植株受害率、茎枝顶端受害率较南宁种源的低, 但昆明种源4月生麻疯树在3个种植点的茎枝受害率和植株死亡率较南宁种源的高。不同种植点间, 麻疯树植株死亡率为8.45%~32.25%, 且种植于江口乡的麻疯树植株受害率、茎枝顶端受害率、茎枝受害率及植株死亡率最高, 其次是种植于太平镇的, 而种植于柳州市区的麻疯树受害相对较轻。不同树龄间, 南宁种源麻疯树受害的规律不尽相同, 其中种植于江口乡的麻疯树受害程度随树龄的增加而增加, 且种植于野外坡地的16月生麻疯树全部死亡;种植于柳州市区的麻疯树则是8月生的受害最为严重, 其次是4月生的, 而16月生的受害相对较轻;种植于太平镇的4月生麻疯树的茎枝顶端受害率、茎枝受害率及植株死亡率较16月生麻疯树的高, 但4月生麻疯树的植株受害率较16月生麻疯树的低。可见, 麻疯树的低温冷冻灾害不仅与霜冻和低温阴雨天气直接相关, 还与麻疯树的品种特性、植株性状及立地环境密切相关。
3 小结与讨论
麻疯树对低温敏感, 要求年极端最低气温不低于-2℃, 在干热河谷特殊地形条件下年极端最低气温不得低于-4℃才能保证其越冬安全[1]。低温或霜冻直接影响到麻疯树的存活。据报道, 在温度低于8℃条件下, 随着时间的延长和温度的降低, 麻疯树幼苗受冷伤害愈加严重[6];2008年特大雨雪冰冻低温气候给贵州麻疯树1~3年生幼林和苗木造成了很大灾害, 海拔600 m以上的幼林和苗木受害率达100%[7];2011年初, 贵州低热河谷地区出现突发冰冻雨雪天气, 持续时间长, 平均气温仅有5.5℃~13.2℃, 当地2县5个乡 (镇) 的8个村组麻疯树受到不同程度冻害, 部分种植点的麻疯树死亡率达80%以上[8]。本研究发现, 持续低温阴雨寡照天气、霜冻或霜冻与低温阴雨寡照天气叠加作用会造成柳州引种麻疯树不同程度的冷害或冻害, 其中2011年和2013年个别种植点麻疯树的死亡率达100%。可见, 在目前的种植品种和栽培技术条件下, 麻疯树难以抵御持续雨雪冰冻天气、低温阴雨天气或严重霜冻天气的为害。因此, 在冬季频繁出现持续低温天气的柳州及气候条件相似地区, 引种或发展麻疯树种植应慎重。
麻疯树出现低温冷冻灾害不仅与地区大气候条件有关, 还与品种、树龄、苗木形状及种植地的小气候条件相关。其中, 云南永胜种源的抗冷性较云南红河县及四川攀枝花市的强[6];攀枝花会理、云南绿春、广西西林种源的耐寒能力较其他地区的强[9];贵州树龄较长的麻疯树当地品种比引进品种有较强的抗冻能力[8]。本研究发现, 昆明种源麻疯树的植株受害率、茎枝顶端受害率较南宁种源的低, 但茎枝受害率和植株死亡率较南宁种源的高。可见, 不同种源的耐低温能力有一定差异。因此, 在麻疯树引种时, 可根据气候条件选择适宜的耐寒品种。陈波涛等[7]研究贵州麻疯树雨雪冰冻低温灾害发现, 高海拔麻疯树幼林和苗木受害率较低海拔的高, 阳坡和半阳坡的麻疯树为害程度比阴坡和半阴坡低, 同一坡向的中下部受害程度明显低于中上部, 迎风面受害程度最为严重;韦冬萍等[5]研究发现, 种植于露地的麻疯树冬季冷害程度较种植于林间地或遮雨棚的严重。本研究发现, 2014年江口乡种植点麻疯树的受害程度较太平镇和柳州市区种植点的严重;江口乡种植点野外坡地麻疯树的受害程度较村庄菜地的严重。究其原因, 可能是各种植点的霜冻差异和种植点气温、土温、空气湿度、土壤湿度、土壤温度、风速等差异的缘故, 但具体机理需要进一步研究。研究还发现, 不同树龄间麻疯树的受害规律不一致, 与王晓敏等[8]研究结果也不尽相同, 其原因可能是不同种植点同一树龄的树体形态、苗木质量、植株生理活性、落叶时间以及立地微气候条件差异的缘故。可见, 麻疯树的低温冷冻灾害受遗传因素、环境条件及植株形态特征共同影响, 其中立地小气候条件对麻疯树低温冷冻灾害的影响尤为明显。因此, 在引种、驯化或推广种植麻疯树时, 可根据麻疯树在当地越冬气候条件的优劣, 因势利导, 选择耐寒品种和适宜地段栽培, 并通过提高植株质量[10]、入冬前覆盖[5,8]及灾后适时剪除受害茎枝[8,9]等措施减轻低温冷冻天气对麻疯树的为害。
参考文献
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低温冷冻 篇5
混凝土抗冻性能是混凝土长期性能和耐久性能的一个重要指标, 国标GB/T82-85对普通混凝土抗冻性能的试验规定了两种方法:慢冻法和快冻法, 并指出快冻法特别适用于抗冻性要求较高的混凝土。近年来, 由于对混凝土长期性能和耐久性能的要求不断提高, 快冻法越来越多的被使用。
快冻法试验需要混凝土快速冻融试验机来完成, 市售的混凝土快速冻融试验机价格国产的一般都在十几二十万元, 进口的在三四十万, 这对实验室来说是一笔不小的投资。
一般的材料实验室都会有低温冷冻试验箱, 考虑用低温冷冻试验箱通过改造来实现混凝土快速冻融, 满足混凝土快速冻融试验机的要求不失为一个好的思路, 这样可以达到一机多用, 节省投资。
2 现有基础
低温冷冻试验箱1台, 容积1m3, 水冷, 最低温度可以到-30℃。
3 达到的目的
国标GB/T82-85对混凝土快速冻融的冻融循环过程的要求:
(1) 每次冻融循环应在2~4小时内完成, 其中用于融化的时间不得小于整个冻融时间的1/4。
(2) 在冻结和融化终了时, 试件中心温度应分别控制在-17±2℃和8±2℃。
(3) 试件从6℃降至-15℃所用的时间不得少于冻结时间的1/2。试件从-15℃升至6℃所用的时间不得少于整个融化时间的1/2, 试件内外的温差不宜超过28℃。
(4) 冻和融之间的转换时间不宜超过10分钟。
(5) 能在20~-20℃范围内测定试件中心温度。温度精度不低于±0.5℃。
(6) 满载运转时冻融箱内各点温度的极差不得超过2℃。
工作的目的就是要使改造后的设备完全满足上述要求, 不但能用于快速冻融试验, 而且不影响用于常规冷冻。
4 实施方案
4.1 试验箱的改造
原设备只有制冷功能, 蒸发器的冷量靠自然对流传递, 蒸发器设置在试验箱的顶部。试验箱空间分为两层, 中部有试样托架。原设备是自然对流, 换热速度较慢, 不能实现速冻速融的要求, 为了加速冻融速度, 我们在试验箱内同一侧平行装置两台Φ100mm轴流风机, 使箱内的空气强制流动。轴流分机与水平面有一定的仰角, 以使风能直接吹向蒸发器并形成循环风。在试验箱的下部两侧装置4个500W的电加热管, 用于融化时加热。试验箱内的布置见图1。
4.2 试件盒制作
标准要求
试件尺寸为100mm×100mm×400mm,
试件盒由1mm~2mm厚的钢板制成。其净截面尺寸应为110mm×110mm, 高度应比试件高出50mm~100mm。试样要求完全浸入水中, 试件底部垫起后盒内水面应至少能高出试件顶面5mm。为保证经久耐用, 采用1mm不锈钢板加工, 下部和四侧面有5mm厚橡胶定位块。考虑到制冷量的大小和试验箱的容积, 我们加工了10个试样盒, 9个用于试验试样, 1个用于中心试样, 可以同时完成3组试样的试验。
4.3 控制器的设计
控制器要求达到能实现温度显示、温度控制、冻融过程的转化、冻融循环次数自动记录等功能。为了达到这些功能, 我们选用的主要元器件有:
(1) XSR30八通道无纸记录仪1台, 铜电阻作为温度传感器。该记录仪有可组态8点上下限报警功能, 每个通道最多可用4个报警点, 且有报警回差设置, 报警继电器原始状态为常开, 可直接或转换为常闭状态用于实现控制功能。零点修正和满度修正功能, 用于修正由于传感器、引线、仪表本身或其它原因引起的测量误差, 以提高测量和显示精度。各通道的温度可以自动记录、储存并以曲线的形式显示, 方便即时查看冻融过程。
通道1为PID输出控制, 用来控制加热时试验箱内的加热温度。PID变送输出电压0~5v可调, 便于实现加热温度的精确控制和加热功率的调节。通过最高温度和加热功率的控制, 达到速融过程的控制。通道2测量中心试样的中心温度, 用于判断冻和融的结束和控制冻融转换。其它通道用于测量试样的表面温度和布置在试验箱的上中下等不同位置, 用于测量和观察试验箱的温度均匀度。
(2) ZSGJ单设定数显计数控制器两台, 该计数控制器可用开关量、电平脉冲作为输入信号来计数, 带有控制继电器, 计数断电有储存。我们用于冻融循环次数的统计。其中一个用于统计每一个冻融单元 (比如冻融25次测量一次动弹性模量) 的冻融次数, 达到设定值自动停机并报警, 测量完动弹性模量后清零就可重新启动设备, 另一个用于总的冻融循环次数的统计。ZSGJ单设定数显计数控制器线柱图见图2。
(3) JGXH2调压型调压模块一块, 用于驱动电加热管工作。该模块由控制端0~5v电压的变化, 实现对输出电压的无极调节, 能保证温度的精确控制。控制端0~5v电压由无纸记录仪通道1的PID输出控制提供, 因为无纸记录仪的PID输出电压上下限可以设定, 比如上限设定为4v时, 输出电压是220 v的80%左右, 因此可以实现加热功率的无极调节, 通过改变加热功率, 可以实现对速融时间的控制。
一次冻融循环时间的长短取决于速冻过程的长短, 所以速冻的时间不需要控制, 应在比较快的时间内完成, 速冻过程受压缩机的制冷量、热交换过程的效果、试样箱内试样的多少的影响, 应根据具体情况以使过程满足试验要求。电器控制原理图见图3。
J1、J2反向继电器J3压缩机驱动继电器K1冷冻冻融转换开关K2计数器电源开关RL1、RL2、RL3记录仪低限报警、高限报警、高高限报警 (图中省略总电源开关和XSR30记录仪)
5 工作原理
XSR30记录仪通道1是加热时试验箱内温度控制, 设定通道1温度控制点为35℃ (以达到融化要求的条件为准, 根据试验确定) 。报警继电器RL1、RL2、RL3定义在通道2上, 同时定义RL1为低限报警, 设置报警温度为-15℃, RL2、RL3为高限和高高限报警, 设置报警温度都为6℃。RL1是制冷控制点, RL2是加热控制点, RL3提供冻融次数计数信号。
常规冷冻过程:
K1、K2断开, 开总电源开关, XSR30记录仪上电准备, K1的12点接通, 当温度高于记录仪设定的低限报警温度时, RL1常开, J3导通, 制冷压缩机工作;当达到或低于设定的低限报警温度时, RL1闭合, 反向继电器J1通电, J1常闭触点断开, 制冷电路断开, 停止制冷;当温度升高到记录仪回差控制点外, RL1断开, 反向继电器J1断电, J1常闭触点闭合, 制冷电路导通, 压缩机工作, 这样就达到常规制冷控制要求。
冻融循环过程:K1、K2断开, 开总电源开关, XSR30记录仪上电准备, K1的13、1/3/触点接通;当温度高于记录仪设定的低限报警温度时, RL1常开, J3导通, 制冷压缩机工作;在温度降低到XSR30记录仪高限报警温度 (6℃) 以下后, 闭合K2, 计数器上电工作;当达到或低于设定的低限报警温度时, RL1闭合, 反向继电器J1通电, J1常闭触点断开, 制冷电路断开, 停止制冷, 同时加热电路中J1常开触点闭合, 加热电路导通, 开始加热;当加热到XSR30记录仪高限报警温度时, RL3闭合, 计数器计数一次;RL2闭合, 反向继电器J2上电, J2常闭触点断开, 停止加热, 同时制冷电路中J2常闭触点断开, 反向继电器J1断电, 制冷电路导通, 开始制冷;过程会周而复始, 当计数器计数达到设定的值时, 计数器常闭触点断开, 停机并触发报警电路, 提示工作人员进行后续工作, 计数器清零后可继续开始。
6 具体操作
为保证箱内空气的流动, 试样的放置应沿轴流分机的风向放置, 10个试样盒在试验箱内分两层放置, 每层放置5个, 保证一定的水平。试验时应定期观察试样盒的水量并及时加水 (最好在融化环节) , 以使水面应至少能高出试件顶面5mm。
通道2的温度传感器预埋入中心试样的中心, 用于测定试样的中心温度, 要正确定义通道2的报警温度值。常规制冷低限报警RL1设置为所需要的制冷温度, 冻融循环时RL1低限报警设置为-15℃, RL2、RL3高限报警和高高限报警设置为6℃。
常规制冷时不用开计数器电源开关K2。冻融循环时在每次开机前都需要断开计数器电源开关K2, 当中心试样的中心温度降低到通道2的高限报警温度之下时再打开K2, 因为当温度越过高限报警温度一次, 计数器会计数一次, 从高温向低温转化越过高限报警是一次误计数, 只有从低温向高温转化越过高限报警时才表示一个冻融过程的完成, 才应该计数一次。
7 结论
1) 通过试验, 证明此次改造完全满足标准和实验要求, 通过了计量部门的实验设备校验, 投入运行。
2) 实现了一机多用, 节约了设备投入费用, 在较小投入的情况下, 满足了实验室对设备的需求。
3) 整个改造投入不足1万元, 真正体现了经济实用。
摘要：混凝土快速冻融试验机是混凝土耐久性实验必备的试验设备, 将实验室低温冷冻试验箱改造为混凝土快速冻融试验机, 能够一机多用, 可以在保证完成实验任务的基础上, 减少设备投入, 节约资金。本文就改造的具体方法做了较为详细的说明。
低温冷冻 篇6
1材料
1. 1试验动物及处理
雄性健康德国牧羊犬6只( 四川农业大学实习牧场提供) ,用手握按摩法采集精液,每只获得精液量2 ~5 mL,精液色泽乳白,略有腥味,密度在2. 0 × 108个/mL以上,pH值为6. 2 ~ 7. 0,活率大于80%, 顶体完整率大于80%。
1. 2试剂和仪器
醋酸、醋酸钠、甲苯胺兰、透明质酸钠、明胶、甲醛,均由四川农业大学动物医学院临床实验室提供; 精子顶体酶活性检测试剂盒和精子酸性磷酸酶测定试剂盒,购自瑞爱金生物科技有限公司; Varioskan酶标仪,购自Thermo公司。
洗涤液( 葡萄糖2 g,柠檬酸1. 2 g,三羟甲基氨基甲烷2. 4 g,卵黄20 mL,甘油4 mL,青链霉素各1 g,加双蒸水到100 mL) ,自制。
稀释液Ⅰ: 将洗涤液甘油浓度改为2 mL。
稀释液Ⅱ:将洗涤液甘油浓度改为6 mL。
2方法
2. 1冻精的制备和解冻
将鲜精离心( 1 000 r/min,10 min) 、稀释( 稀释液 Ⅰ按1∶1进行稀释) ,4 ℃ 平衡1. 5 h; 再加入4 ℃ 的稀释液Ⅱ按1∶1比例进行稀释,将稀释平衡后的精液,在距离氮面1 ~ 2 cm冷冻漂浮器上,制成精液颗粒,熏蒸5 min; 再放入液氮中保存。使用时采用干解冻法( 38 ℃,30 s) 对冻精进行解冻。
2. 2顶体酶类活性的测定
2. 2. 1HYD活性的测定方法采用改良明胶底膜法。在0. 2 mol/L醋酸- 醋酸钠缓冲液( pH值为4. 5) 中校正基质膜的pH值,20 min后取出,自然晾干; 将稀释好的精液直接均匀涂于玻片基质膜上,置恒温湿盒( 37 ℃) 内温孵3 h; 取出后,在0. 02% 甲苯胺兰染液中染色5 min; 丙酮分色3 ~5 s; 晾干后用相差显微镜观察。HYD阳性反应率: 观察精子头部周围是否有圆形蛋白光轮出现( 随机观察6个以上视野) ,至少计算200个精子中的HYD阳性反应率。 HYD活性强度: 用测微器测量反应区光轮直径的大小( 随机选择6个以上视野) ,测得平均光轮直径,作为判断HYD活性强度的指标。
2. 2. 2 ACE活性的测定方法采用改良Na - 苯甲酰- DL - 精氨酸P - 硝酰基苯胺( BNPNA) 法( 按检测试剂盒说明操作) 测定。采用1 cm光径比色杯,测定波长为410 nm的OD值。ACE活性计算: 以在24 ℃ 水解1. 0 μmol BAPNA / min的底物量定为1 IU ACE活性。ACE活性[1 × 10- 6μIU]=[测定管吸光度- 空白管吸光度) ×106]/247. 5 ×10。
2. 2. 3ACP活性的测定方法采用磷酸苯二钠法( 按检测试剂盒说明操作) 测定。采用1 cm光径比色杯,测定波长为510 nm的OD值。ACP活性计算: 以每毫升精液在37 ℃与磷酸苯二钠作用15 min,产生10 mg酚为一个酶活力单位。 酸性磷酸酶( U/mL) =[测定管吸光度/标准管吸光度] × 0. 005 mg × 100 mL。
2. 2. 4犬鲜精顶体酶类的测定将6只德国牧羊犬鲜精分别进行顶体酶类( HYD、ACE和ACE) 活性检测并记录数据。试验重复5次。
2. 2. 5超低温冷冻后犬精子顶体酶类的测定取冻存的德国牧羊犬精液分别进行解冻( 38 ℃,30 s) ,然后分别进行顶体酶类( HYD、ACP和ACE) 活性检测并记录数据。试验重复5次。
2. 3顶体酶类活性与精子活率、顶体完整率和畸形率的相关性
将测得的每份冻精的活率、顶体完整率、畸形率、 HYD活性、ACE活性及ACP活性分别两两进行相关性分析,相关性系数用r表示,显著性用P值表示。
2. 4统计分析
采用Excel( 2003) 软件整理数据,用SPSS13. 0软件进行方差分析,检验其差异显著性和相关性,所得数据均用平均数 ± 标准误表示。
3结果
3. 1超低温冷冻对德国牧羊犬精子顶体酶类活性的影响
精子顶体酶类存在于精子顶体内,与精子获能和发生顶体反应有关。超低温冷冻对精子顶体膜结构产生损伤,可能会引起顶体内各种酶的流失,从而影响顶体酶类的活性。与鲜精组相比,冻精组3种顶体酶活性均极显著降低( P <0. 01) ,见表1。说明超低温冷冻会使德国牧羊犬精子顶体酶类活性降低。
注: 同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著( P <0.01) 。
3. 2顶体酶类活性与精子活率、顶体完整率和畸形率的相关性
超低温冷冻后精子3种顶体酶类活性分别与精子顶体完整率和活率呈正相关,其中ACE活性与顶体完整率呈极显著正相关,相关系数r为0. 487( P < 0. 01) ; 3种顶体酶类活性与畸形率均呈显著负相关( P <0. 05) 。ACE活性与精子顶体完整率的相关系数r为0. 487,相关度大于HYD( 0. 439和0. 459) 和ACP( 0. 440) ,而HYD活性与精子活率的相关系数r为0. 404和0. 423,相关度大于ACE( 0. 377) 和ACP ( 0. 369) ,见表2。
注: ** 表示极显著相关( P < 0. 01) ,* 表示显著相关( P < 0. 05) 。
4讨论
4. 1 HYD、ACE和ACP的重要性及超低温冷冻对其活性的影响
HYD存在于顶体内,是精子受精过程中第一个起作用的顶体酶类[5]。M. Abdul - Aziz等[6]的研究证实,HYD活性较低的精子人工授精成功率低,但如果通过细胞浆内单精子注射治疗,精子受精能力会明显增高,进一步说明精子HYD在受精过程中的重要作用。C. Barthelemy等[7]发现在冻存后精子膜结构( 质膜和顶体) 受到不同程度的损伤,主要表现为质膜( 或顶体) 肿胀、破裂,顶体内各种酶大量流失。苏昀等[8]认为甘油浓度越高,冻精HYD活性下降越明显,呈负相关,说明冷冻保护剂对精子HYD活性有一定影响。本试验制作德国牧羊犬冻精时所用的稀释液配方是甘油- 卵黄- 柠檬酸,分两次添加含有不同浓度的甘油( 2%、6%) 稀释液,减少甘油浓度对冻后HYD活性的影响,但HYD的阳性率和活性明显下降。笔者通过对超微结构的观察发现,冻存后精子质膜和顶体肿胀、破裂等,使得顶体内各种酶大量流失, 从而引起HYD的阳性率和活性明显下降,与刘睿智等[9]的研究结果相同。
ACE在发生顶体反应过程中起着关键作用,当精子头部进入卵透明带发生顶体反应时,顶体酶原被激活成ACE并被释放出来,水解透明带糖蛋白,通过精子强烈的活动力及楔样作用协助精子穿过卵丘再穿过透明带,使精子与卵子完成受精过程[10 -11]。当ACE活性较低时,精子分解卵丘和穿过透明带的能力会受到明显影响,导致精子无法顺利受精。因此, 精子ACE活性可作为判断精子质量和生育力的一项重要指标[12]。ACE活性与正常形态精子率呈显著正相关; 检测ACE活性对精子的功能病症的诊断具有重要意义[13 -14]。ACE活性的变化与顶体反应有直接关系,M. I. Rosatti等[15]通过研究牛精子获能和顶体反应时顶体酶原/顶体酶活性,发现精子获能后,精子ACE活性明显升高。许多学者认为,ACE活性低下可能是导致不明原因不育的重要原因[16]。因此, 精子ACE活性不仅可以作为检测冻精顶体完整率的一项指标,而且可以用于临床上检测雄性不育[17 -18]。
精浆中ACP含量可反映前列腺的分泌功能,对前列腺疾病诊断有重要意义[19]。犬的副性腺中只有前列腺,因此ACP检测对犬的繁育能力评估具有极其重要意义。ACP主要是通过磷酸化来水解精液, 使精液中的磷酸胆碱、磷酸甘油及核苷酸等物质被分解,从而影响精子的活力和代谢[20]。王瑞等[21]对不育男性精浆ACP和锌与精液参数分析后,发现ACP水平下降可导致精子活力降低,认为ACP可以作为诊断男性不育的一项指标。潘云等[22]对精浆中ACP含量与精子密度、活率和黏度的关系进行研究时,认为精浆ACP含量与精子质量密切相关。ACP不同于其他顶体酶,在顶体不同发育期间均可检测出其活性,其含量和活性检测既可用于评价精子获能和顶体反应,又可作为雄性不育的实验诊断指标[23]。ACP检测法与其他评价精子顶体反应的方法相比具有三大优势: 一是ACP检测法可以检测精子获能和顶体反应介质中ACP含量,其结果可反映整个精子群体的功能状态。二是ACP检测法不仅操作简便、快捷、 耗时少,不需要特殊仪器设备,而且可同时检测多份样本。三是ACP检测法检测结果相对于其他评估精子顶体反应的方法而言,更为客观和稳定,避免了直接评估精子顶体反应的主观性。ACP检测法评价和分析精子顶体反应虽然简便易行、耗时少,且能较为客观地反映精子群体顶体反应状态,但不能忽视蛋白酶的潜在影响[24]。本试验结果显示,超低温冷冻后德国牧羊犬精子HYD、ACE和ACP活性显著降低, 这可能是引起冻精受胎率较低的重要原因。研究超低温冷冻对德国牧羊犬精子顶体酶类活性的影响,可为犬精液冷冻保护剂和稀释剂的研制提供理论数据支撑,不仅有助于冷冻后精液品质的检查,还有助于其精液冷冻保护剂的改进和稀释液配方的优化和创新。
4. 2顶体酶类活性与顶体完整率、活率和畸形率的相关性
低温冷冻 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2012年1月—2013年5月行纤维支气管镜冷冻治疗的72例支气管内膜结核病人, 其中男28例, 女44例;年龄18岁~62岁;均有不同程度的咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状;左主支气管+气管15例, 左主支气管23例, 左主支气管+左上叶支气管9例, 左上叶支气管8例, 左下叶支气管4例, 右主支气管6例, 右上叶支气管4例, 右主支气管+右中叶支气管3例;均进行2HRZE/6HR[异烟肼 (H) 、利福平 (R) 、吡嗪酰胺 (Z) 、乙胺丁醇 (E) ]全身抗结核治疗。将72例病人随机分为观察组和对照组各36例。两组病人性别、年龄、文化程度、职业、病情轻重等比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 设备仪器
本组支气管镜为Olympus BF-T240, 冷冻气源为二氧化碳, 北京库兰K500型冷冻治疗仪及软性可弯曲冷冻探头, 探头直径1.9mm, 长度90cm, 探针末端长度5mm。
1.2.2干预方法
对照组采用常规护理, 观察组术前、术中、术后给予护理干预, 具体内容如下。
1.2.2. 1 术前准备
保持环境温度、湿度适宜。做好术前心理护理, 让病人了解检查的基本过程, 做到心中有数, 给病人解释放松情绪配合治疗能提前完成操作。告知病人操作时感觉难受不能忍受时举手示意, 头不要过度摆动。同时了解病人既往史, 排除严重心肺疾病、血友病等。术前禁食、禁饮6h。检查出凝血时间、血气分析、胸部X线片、肺部CT、心电图结果是否带齐全。常规雾化吸入麻醉, 给病人解释口腔有苦感及麻木感为正常现象。准备2%利多卡因、0.1%肾上腺素、生理盐水及治疗抢救用药摆放在治疗车上, 方便操作, 检查仪器性能是否完好。协助操作者调试好支气管镜, 并在支气管镜远端涂抹硅油润滑。给予病人吸氧3L/min, 用一次性口罩盖住病人双眼, 以减轻其恐惧感, 置病人于舒适体位, 头尽量后仰, 肩下垫高15cm~25cm, 以利于支气管镜顺利插入[3]。
1.2.2. 2 术中护理
操作中护士可握住病人一手行穴位按摩, 及时清理病人口腔分泌物。不断和病人交流, 以分散其注意力, 同时用赞扬等语言使其配合治疗。经2%利多卡因表面麻醉后插入支气管镜, 对气管、支气管进行检查确定病变部位, 并用活检钳对病灶表面的坏死组织等进行清理, 然后将支气管镜插入距离病灶0.5cm处, 由操作孔置入冷冻探头, 冷冻探头应伸出支气管镜至少3mm, 冷冻头插入病灶内或侧壁紧贴病灶, 踩下冷冻踏板, 冷冻持续30s~50s, 此时可见病灶发白并冷冻结在一起, 松开踏板后让其融化, 融化约需60s, 此过程称冷冻融, 完成一次冷冻融循环为2.5min~3.0min。选取另一个冷冻点, 重复上述过程。3个~5个冻融过程后组织可有少量渗血, 多可自行缓解, 必要时可局部用少量肾上腺素止血。术中严密观察病人心率、血氧饱和度及血压变化。血氧饱和度下降严重时及时提醒操作者退出支气管镜休息片刻, 并加大氧流量。病人呛咳剧烈嘱其行深呼吸、张嘴呼吸以缓解不适, 正确留取标本行化验检查。
1.2.2. 3 术后护理
操作毕帮助病人清理口腔、鼻腔及眼角分泌物, 保持病人外表整洁以增加自尊心, 嘱病人术后需禁水、禁饮2h。同时让病人在休息室休息半个小时, 无不适后方可离开。告知病人下次复查时间, 冷冻后1周左右复查支气管镜, 对冷冻治疗效果进行评估的同时还可清理冷冻后坏死组织, 或再次进行冷冻, 1周后再进行再次评估, 每例病人治疗2次~8次, 一般1个月~1.5个月。
1.2.3 观察指标
观察两组病人术中主动配合程度, 术后询问病人的舒适程度 (包括恐惧感、咽喉不适、气促感、因病情需要愿意接受再次治疗) 。
1.2.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行数据分析, 计量资料采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
例
3 讨论
冷冻治疗又称冷刀治疗, 是近几年发展起来的一种非接触式气管内消融新技术[4]。为寻找制冷效果, Au等[5]利用猪作为研究对象, 结果发现经支气管镜给予-196℃超低温可导致气道黏膜富含水分较多的上皮细胞坏死脱落, 黏膜下层及结缔组织层水肿, 中性粒细胞浸润, 随着喷射冷冻时间延长及冻融周期增加, 冷冻深度可波及到但不超过气道软骨层。经研究证实, 冷冻治疗支气管内膜结核有较好的中长期疗效[6]。由于冷冻治疗需反复多次治疗效果才显著, 对于初次接受治疗的病人, 第一次治疗的感觉会直接影响病人能否下次继续接受治疗, 护理干预后病人的舒适度和配合程度得到提高, 愿意主动继续接受治疗, 提示护理工作者必须主动、耐心地做好各种解释, 全程为病人服务, 以减轻病人痛苦, 达到治疗目的。
参考文献
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[2]李鸿雁, 肖欣荣, 任和芬.支气管内膜结核的诊断治疗进展[J].西南国防医药, 2010, 20 (8) :908-910.
[3]赵茜, 白冲, 李强.纤维支气管镜微波治疗气道肿瘤的临床应用与护理555例[J].中国实用护理杂志, 2004, 20 (7) :4-5.
[4]张咏.经纤维支气管镜冷冻治疗大气道狭窄患者的护理[J].中国实用护理杂志, 2009, 25 (7) :60-61.
[5]Au JT, Carson J, Monette S, et al.Spray cryotherapy is effective for Bronchoscopic, endoscopic and open ablation of thoracic tissues[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg, 2012, 15 (4) :580-584.