玻璃化冷冻（精选6篇）
玻璃化冷冻 篇1
卵巢作为雌性哺乳动物生殖系统的重要组成部分,在自然繁衍后代过程中不可或缺。随着低温生物学技术及生殖医学的发展,卵巢组织冷冻保存在畜禽育种与繁殖、物种保存、人类生殖医学等方面已突显其重要意义。利用深低温冻存技术,可以对突然死亡的珍惜物种或稀有突变体动物的卵巢进行及时的冷冻保存,需要时通过将解冻的卵巢移植入动物体内获得成熟卵泡,并通过试管动物技术获得该物种,从而在保持生物多样性方面发挥作用。在人类生殖医学方面,对患有卵巢功能早衰或其他卵巢疾病的女性, 卵巢组织的冷冻可谓是保存女性生殖能力最具潜力的选择[1]。
早在20世纪50年代,R. Deanesly[2]对兔卵巢进行冷冻试验,证实卵巢组织经冷冻解冻移植后,存活的卵泡能够产生雌激素并能使阴道上皮角化[3 - 4],但是之后的几十年卵巢冷冻技术并未得到很好的发展。 直到20世纪90年代,随着低温生物学及生殖医学的发展,人们重新燃起了对卵巢冷冻技术研究的热情。 但卵巢组织中因具有数目、大小、水含量和水渗透性各不相同的多种细胞及存在的血管系统与胚胎的冷冻保存相比其体系还不稳定。研究就小鼠卵巢冷冻过程中的平衡时间及不同浓度的冷冻保护剂DMSO进行比较试验,旨在探索小鼠卵巢冷冻的条件,为其他动物及人类卵巢冷冻的研究提供有价值的参考资料。
1材料
1. 1试验动物
2月龄雌性昆明小白鼠36只,由天津农学院动物分子育种与转基因创新中心提供,体重为18 ~ 22 g,自由采食专用颗粒饲料,自由饮水。
1. 2主要试剂
M199液、胎牛血清( FCS) ,Gibco公司生产; 乙二醇( EG) 、二甲基亚砜( DMSO) ,Solarbio公司生产; 0. 5 mol / L蔗糖液、m PBS、青霉素、链霉素、台盼蓝, Sigma公司生产; 促卵泡素( FSH) 、人绒毛膜促性腺激素( h CG) ,宁波市三生药业有限公司生产。
1. 3液体配置
操作液为M199液+ 20% FCS,平衡液为操作液+ 10% EG + 10% DMSO,冷冻液为操作液+ 15% EG + 不同浓度( 15% 、20% 、25% ) DMSO,解冻液为0. 5 mol / L蔗糖液,冲洗液为m PBS + 5% FCS + 0. 01 g /100 m L青霉素+ 0. 01 g /100 m L链霉素,卵母细胞成熟培养液为M199液+ 10% FCS + 1 IU/m L FSH + 2 IU h CG + 0. 01 g /100 m L青霉素+ 0. 01 g / 100 m L链霉素,染色液为0. 4% 台盼蓝溶液。
2方法
2. 1卵巢的采集、平衡、冷冻及解冻
颈椎脱臼法处死小鼠,用75% 乙醇棉球将腹部消毒后,剪开腹部暴露腹腔,迅速取出小鼠的双侧卵巢,剪净卵巢周围脂肪组织,并投入操作液中洗涤2次,转入平衡液中,在4 ℃条件下,依试验设计进行不同时间( 10 min、15 min、20 min) 的平衡。将平衡后的卵巢组织转入含冷冻液的冻存管中,直接投入液氮罐中冷冻。1周后,将液氮中冷冻保存的卵巢取出,迅速放入37 ℃ 水浴中至冷冻液融化后,转移至37 ℃、0. 5 mol / L蔗糖液中处理5 min。
2. 2卵母细胞的采集、染色及体外成熟培养
解冻后的卵巢组织用冲洗液洗涤2次,然后转入含有冲洗液的培养皿中,置于体视显微镜( 日本O- LYMPUS公司生产) 下,解剖法采集卵母细胞,并用冲洗液洗涤卵母细胞2次。随机选取一部分洗涤好的卵母细胞置于0. 4% 台盼蓝溶液中染色2 ~ 3 min,判断卵母细胞的存活情况,若卵母细胞被染成蓝色判定为死亡。将洗涤好的另一部分卵母细胞置于上覆矿物油的100 μL成熟培养液微滴中,于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱( 日本SANYO生产) 中培养24 h,以卵母细胞排出第一极体作为卵母细胞成熟的标志。
2. 3统计分析
采用SPSS统计软件对试验数据进行方差分析。
3结果与分析
3. 1不同平衡时间对小鼠卵巢冷冻保存的影响( 结果见表1)
%
注: 同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著( P < 0. 01) ,小写字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,大写字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) 。
由表1可知,卵母细胞的存活率随平衡时间的增加而升高,依次为50. 0% 、55. 6% 、65. 0% ,平衡10 min与平衡15 min相比差异显著( P < 0. 05) ,平衡10 min、平衡15 min与平衡20 min相比差异极显著( P < 0. 01) 。卵母细胞的成熟率以平衡20 min时最高,为27. 4% ; 平衡10 min时次之,为20. 9% ; 平衡15 min时最低,为15. 2% 。虽然卵母细胞成熟率的趋势与卵母细胞的存活率趋势不一致,但统计学分析显著性差异与卵母细胞存活率一致。
3. 2不同浓度的DMSO对小鼠卵巢冷冻保存的影响( 结果见表2)
%
注: 同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著( P < 0. 01) ,小写字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,大写字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) 。
由表2可知,不同浓度的DMSO对冷冻解冻后卵巢卵母细胞的存活率及成熟率有显著影响( P < 0. 05) ,其中含20% DMSO的冷冻液对小鼠卵巢的冷冻效果较好,解冻后卵巢内的卵母细胞存活率和成熟率均达到最高,分别为66. 7% 、38. 3% ,并与含15% 、 25% DMSO试验组的卵母细胞存活率和卵母细胞成熟率相比差异均极显著( P < 0. 01) ,含15% 、25% DMSO的试验组间差异显著( P < 0. 05) 。
4讨论
与胚胎和细胞相同,组织冷冻前必须在冷冻保护剂中预先渗透平衡一段时间,以达到更好的冷冻保存效果,可是不论何种冷冻保护剂对于细胞及组织均有不同程度的毒性作用,故选择合适的渗透平衡时间及合适的冷冻保护剂浓度对于深低温冷冻保存的组织及细胞等至关重要。陈薪等[5]采用乙二醇和蔗糖两步法,预平衡10 min对小鼠卵巢组织进行玻璃化冷冻发现,没有造成细胞DNA的损伤。以5,10,20 min 3种不同的平衡时间对人的卵巢组织进行处理后冷冻保存,研究表明,10 min的预平衡时间保存效果最佳[6]。研究发现,对小鼠卵巢组织预平衡20 min的冷冻效果较好,其解冻后卵母细胞的存活率和体外成熟率分别为65. 0% 、27. 4% ,本试验结果与上述研究结果不一致,其原因可能与选用的冷冻保护剂种类或冷冻保护剂的浓度不同有关。
冷冻保护剂的浓度在溶液的渗透压、黏度大小和冰点的下降中起关键作用,因此选用适宜的冷冻保护剂及其适宜的浓度是小鼠卵巢组织冷冻保存的又一重要因素。因乙二醇具有低毒性并能很快渗透到细胞内的特性,现已被广泛用于细胞及组织的冷冻保存,但乙二醇形成玻璃化的效果较差,因此常与其他冷冻保护剂联合应用,DMSO是与乙二醇最常联合应用的冷冻保护剂。刘爱华等[7]指出,DMSO对于卵巢组织冻融后卵泡的损伤最小,最适浓度为1. 5 ~ 2. 0 mol / L。晁岚等[8]联合应用乙二醇和DMSO对兔卵巢进行玻璃化冷冻,得到形态正常的卵泡比率为87. 72% 。M. Sheikhi等[9]将乙二醇、DMSO和丙二醇联合应用作为冷冻保护剂对人卵巢组织进行玻璃化冷冻,得到形态正常的卵泡比率为92. 31% 。研究借鉴前人的经验,选择固定浓度的乙二醇及不同浓度的DMSO联合应用作为冷冻保护剂进行小鼠卵巢组织的冷冻保存研究,结果表明,选用含20% 的DMSO作为冷冻保护剂对小鼠卵巢组织进行冷冻的效果较好, 解冻后卵巢内卵母细胞的存活率为66. 7% ,成熟率达38. 3% 。
5结论
选用平衡时间为20 min,DMSO为20. 0% 浓度对小鼠卵巢组织冷冻的效果较好。冷冻解冻后卵巢内卵母细胞存活率分别为65. 0% 、66. 7% ,卵母细胞体外成熟率分别为27. 4% 、38. 3% 。
摘要：为了探讨小鼠卵巢组织玻璃化冷冻时适宜的平衡时间和冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)的适宜浓度,试验采用不同平衡时间(10 min、15 min、20 min)及不同浓度(15%、20%、25%)的DMSO作为冷冻保护剂对2月龄昆明小白鼠的卵巢组织进行处理,处理后的卵巢组织采用玻璃化冷冻法进行冷冻,用解剖法采集冷冻解冻后的卵巢卵母细胞,通过对卵母细胞染色及体外成熟培养判定卵巢的冷冻效果。结果表明:以平衡时间为20 min的试验组小鼠卵巢冷冻效果较好,其卵母细胞存活率为65.0%,卵母细胞成熟率为27.4%;DMSO浓度则以20.0%为宜,冷冻解冻后卵巢内卵母细胞染色后存活率为66.7%,体外培养后卵母细胞成熟率为38.3%。
关键词：小鼠,卵巢组织,玻璃化冷冻,二甲基亚砜(DMSO),体外成熟
玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究 篇2
关键词：玻璃化冷冻,山羊,卵母细胞
卵母细胞冷冻保存不但可以使卵母细胞的供给不受时间和空间的限制,而且对品种资源保护、体外胚胎生产技术的商业化等也具有重要意义。自1985年W.F.Rall等[1]发明玻璃化冷冻方法并冷冻保存小鼠胚胎成功后,又有许多研究表明,玻璃化冷冻法在冷冻保存卵母细胞方面的效果优于传统冷冻方法,但目前玻璃化冷冻保存卵母细胞的存活率和发育能力仍然不能达到实际应用的水平。分析其原因,这与玻璃化冷冻方法含有较高浓度的抗冻保护剂有关。玻璃化冷冻液中的抗冻保护剂浓度高达6～8 mol/L,而传统冷冻方法的抗冻保护剂浓度则低于2 mol/L,说明玻璃化冷冻可以更有效地保护细胞在冷冻过程中冰晶形成所造成的物理性损伤。因此玻璃化冷冻法在冷冻保存卵母细胞方面的效果优于传统冷冻方法。由于玻璃化冷冻液中含有较高浓度的抗冻保护剂,其对细胞也具有较强的化学毒性,因此在一定程度上损伤了经玻璃化冷冻保存卵母细胞的存活率及发育能力。可见,研究开发低毒、高效的玻璃化冷冻液,将是提高玻璃化冷冻保存卵母细胞效果的有效途径之一。
目前,二甲其亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)是配制玻璃化冷冻液最常用的2种渗透性抗冻保护剂。EG的优点是毒性低、渗透性高,但形成玻璃化态的能力较DMSO弱;虽然DMSO与EG相比形成玻璃态能力强[2],但其化学毒性较EG大,且渗透性相对较差[3]。如果将2种抗冻保护剂联合应用于配制玻璃化冷冻液,可显著降低各种抗冻保护剂的浓度,因此能够降低玻璃化冷冻液中抗冻保护剂的化学毒性,同时仍可以保证玻璃化冷冻液具有较好的形成玻璃化态的能力。
在采用含有高浓度抗冻保护剂的玻璃化冷冻液保存卵母细胞过程中,其毒性作用之一是增加了卵母细胞质内Ca2+游离浓度,孤雌激活卵母细胞[4,5]。有研究证实:玻璃化冷冻液中的Ca2+和DMSO、EG均可以使卵母细胞质内Ca2+浓度瞬时升高,并孤雌激活卵母细胞;但在不含Ca2+的玻璃化冷冻液中的EG并不引起显著性的Ca2+浓度增加;而无论玻璃化冷冻液中是否含Ca2+,DMSO都会引起细胞内Ca2+浓度增加[4,5]。据此推断,采用不含Ca2+的玻璃化冷冻液,并将DMSO在玻璃化冷冻液中的浓度控制在较低水平,将有助于提高玻璃化冷冻保存卵母细胞的效果。
因此,研究以山羊卵母细胞为材料,研究在不含Ca2+的玻璃化冷冻液中,不同浓度配比的DMSO和EG这二种抗冻保护剂对冷冻保存山羊体外成熟卵母细胞效果的影响,旨在探索适宜的玻璃化冷冻液配方,以提高卵母细胞冷冻保存后的存活率及发育能力。
1 材料
1.1 OPS管的制备
参照朱士恩等[6]的方法制备OPS管,用自制的小酒精灯明火加热0.25 mL的塑料管,变软后拉成OPS管。OPS管的内径为0.02～0.03 mm,管壁为0.02 mm,待冷却后用刀片将其切断,得到2支OPS管,细端长度为2～3 cm。
1.2 溶液的配制
FS液的配制:30%聚庶糖(Fico1170)+0.5 mol/L蔗糖+3.0 g/L牛血清白蛋白(BSA),溶液为无Ca2+的DPBS。预平衡液:以无Ca2+的DPBS为基础液,3种预平衡液的组成见表1。玻璃化冷冻液以FS液为基础液,3种玻璃化冷冻液组成见表1。0.5 mol/L解冻液:将0.5 mol/L的蔗糖溶于1 L无Ca2+的DPBS。0.25 mol/L解冻液:将0.25 mol/L的蔗糖溶于1 L无Ca2+的DPBS。
1.3 卵母细胞的采集及体外成熟培养
从河北省唐县定点屠宰场收集山羊卵巢,保存于30 ℃左右盛有生理盐水的保温瓶中,1～4 h内运回实验室。用生理盐水洗涤3次后,用刀片划破(切剖法)卵巢上直径为2～6 mm的卵泡,在放有采卵液的培养皿中洗刷几次,将卵丘卵母细胞复合体(COCs)冲洗下来,在实体显微镜下用口吸管挑选形态正常、胞质均匀、颗粒细胞不少于3层的COCs移入100 μL成熟培养液[M199液+100 μL/L 半脘氨酸+10 μg/mL卵泡刺激素(FSH)+10 μg/mL黄体生成素(LH)+1 μg/mL雌二醇(E2)+10%FCS]微滴中,微滴上覆盖矿物油,每个微滴放入20枚COCs,在38.5 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中成熟培养22 h。用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,以卵母细胞周围保留2～3层颗粒细胞为宜。洗净后供冷冻试验用。
2 方法
将体外成熟培养22 h的山羊卵母细胞按3种方法进行处理:1)卵母细胞在玻璃化冷冻液中进行暴露处理,但不投入液氮中进行冷冻保存(毒性处理);2)卵母细胞利用玻璃化冷冻液进行冷冻保存(冷冻保存);3)卵母细胞既不进行毒性处理,又不进行冷冻保存(对照)。将经过处理的卵母细胞,分别进行体外受精及体外胚胎发育培养,统计相关指标。
2.1 卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻
调节室温至25 ℃,卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻均在37 ℃的恒温板上完成。成熟培养22 h的卵母细胞用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,在预平衡液中平衡30 s,移入玻璃化冷冻液中平衡25 s,将5～6枚卵母细胞吸入OPS管中,直接投入液氮中冷冻保存。解冻时,从液氮中取出OPS管后,将含有卵母细胞的部分直接浸入盛有0.5 mol/L解冻溶液的表面皿中,解冻后将卵母细胞用口吸管轻轻吹出,将回收的卵母细胞立即移入新鲜的解冻溶液中平衡3 min,移入0.25 mol/L解冻溶液中平衡2 min,脱出反抗冻保护剂后用成熟培养液洗3次,移入成熟液,于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中恢复培养2 h。在显微镜下观察统计各组卵母细胞的正常形态数。
2.2 体外受精
将成熟培养24 h的COCs用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,在受精液(SOF 液+20%热灭活发性羊血清+5 U/mL肝素钠)中洗涤3次,移入30 μL的受精液微滴中,每个微滴放入约10枚卵母细胞。通过上游法制备体外受精(IVF)精子,方法是将解冻的500 μL冻精放入盛有2 mL预平衡受精液的底层,1 h后移出含有活精子的上层液约800 μL,并测定精子密度。每个受精滴中加入精子的密度为1×106/mL。精子和卵母细胞在CO2培养箱中培养24 h。
2 3 胚胎发育
体外受精24 h后,将假定受精卵从受精液移入发育液,用口吸管吹打除去颗粒细胞,在发育液中洗涤3次,移入30 μL发育液微滴中(预先在培养箱中平衡4 h),每个微滴放入15～20枚受精卵,置于含有混合气(5% CO2、5% O2、90% N2)、38.5 ℃饱和湿度的CO2培养箱中进行体外发育培养,每48 h半量换液1次。受精当天计为第0天,第48小时观察卵裂数,第120小时观察桑葚胚数,第192小时观察囊胚数。
2.4 地衣红(Orcein)染色液法测定卵母细胞核相
将卵母细胞/受精卵从培养液中取出,用PBS液洗3次,放在载玻片上,排成一条直线,盖上盖玻片,不要将卵母细胞/受精卵压碎,在4 ℃固定液中固定48 h,再用Orcein染色液染色9 min,用脱色液脱去染色液,用指甲油封片。在相差显微镜下观察卵母细胞核相,判定卵母细胞是否被孤雌激活。
2.5 统计分析
采用SPSS 11.5中的配对样本t检验对试验数据进行统计分析,P<0.05表示差异显著。
3 结果与分析
3.1 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其正常形态数和孤雌激活数的影响(结果见表2)
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),括号内数据均为百分率(%)。
由表2可知:在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露后,卵母细胞的形态正常率分别为97.1%、97.3%、97.3%,与对照组的形态正常率(100%)相比差异不显著(P>0.05),说明卵母细胞仅在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露处理不会对其形态造成损伤。在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露后,卵母细胞的孤雌激活率分别为1.0%、2.7%、3.5%,与对照组孤雌激活率(0)相比差异不显著(P>0.05),说明玻璃化冷冻液1,2,3的化学成分对卵母细胞没有造成明显的毒害作用。可见,玻璃化冷冻液1,2,3对卵母细胞不具有明显的化学毒性。
3.2 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其体外受精及胚胎发育能力的影响(结果见表3)
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05),括号内数据均为百分率(%)。
由表3可知:采用玻璃化冷冻液1,2,3保存卵母细胞,卵裂率及囊胚率均显著低于对照组(P<0.05),说明玻璃化冷冻保存卵母细胞均会在一定程度上损伤其受精及胚胎发育能力。对玻璃化冷冻液1,2,3冷冻保存山羊卵母细胞的效果进行比较,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05),说明玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞的效果优于玻璃化冷冻液1,3。
4 讨论与小结
山羊卵母细胞在玻璃化冷冻液1,2,3中进行暴露处理,卵母细胞并未表现出异常孤雌激活现象,原因之一是玻璃化冷冻液中不含Ca2+。Ca2+作为卵母细胞激活的中间调节物,其在细胞内瞬时升高是引起第2次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞被孤雌激活的重要原因[7],卵母细胞在含Ca2+玻璃化冷冻液暴露过程中,容易导致胞质内Ca2+浓度瞬时升高,从而引起卵母细胞孤雌激活。这与田树军等[8]发现,含Ca2+的玻璃化冷冻液对体外成熟绵羊卵母细胞的孤雌激活具有增强作用的结果一致。S.Succu等[9]采用以Ca2+为基础液配制的玻璃化冷冻液冷冻保存绵羊卵母细胞,孤雌激活率高达54.5%。 引起卵母细胞孤雌激活的另一原因可能是玻璃化冷冻液中含有较高浓度的DMSO。以往的研究发现:DMSO可以引起多种细胞内Ca2+浓度的瞬时升高[10]。M.G.Larman等[4]发现,小鼠MⅡ期卵母细胞暴露于以DMSO和EG作为抗冻保护剂的玻璃液中可能引起细胞内Ca2+浓度升高,并且无论冷冻液中是否含Ca2+,DMSO都会引起细胞内Ca2+浓度升高,而不含Ca2+的玻璃化冷冻液中EG并不引起显著性的Ca2+浓度增加。田树军等[11]研究发现:玻璃化冷冻液中的DMSO对体外成熟绵羊卵母细胞具有孤雌激活作用的研究结论支持了这一观点,并进一步证实卵母细胞被孤雌激活后引起卵母细胞皮质层部分皮质颗粒提前释放到卵周隙,导致透明带变硬,从而降低精子穿透卵子的能力。通常玻璃化冷冻液中DMSO所占体积浓度在15%以上,试验中玻璃化冷冻液中DMSO体积浓度分别降低,为5%、2.5%、0,然而试验组卵母细胞的受精率仍然低于对照组,说明含有低浓度DMSO抗冻保护剂的玻璃化冷冻液依然对山羊卵母细胞的体外受精能力具有一定程度的损伤。但这种损伤是由玻璃化冷冻液中抗冻保护剂的化学毒性所致,还是冷冻过程所造成的物理性损伤,还有待于进一步研究。
尽管采用玻璃化冷冻液1,2,3保存山羊卵母细胞,囊胚率与对照组相比显著降低,但玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞的囊胚率达到13.8%,显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%),说明玻璃化冷冻液2更适合于山羊卵母细胞的冷冻保存。研究的效果好于S.Succu等[9]采用玻璃化冷冻液保存绵羊卵母细胞囊胚率为0的结果,以及田树军等[8]采用玻璃化冷冻液保存绵羊卵细胞囊胚率为7.1%的结果。
综上所述,玻璃化冷冻液2(27.5%EG+5%DMSO) 不产生引起山羊卵母细胞被孤雌激活的化学毒性作用,用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的胚胎发育效果。
参考文献
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玻璃化冷冻 篇3
1 资料与方法
1.1 研究对象
2010年10月至2012年12月在安徽省立医院生殖中心接受卵母细胞冻融的32例不孕症患者共34个周期。女方年龄22~44岁, 女方平均年龄30.35±5.23岁, 女方平均不孕年限4.71±2.72年。不孕原因包括女方输卵管因素、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、男方少弱精症及非梗阻性无精症。冻卵的原因为:①23例患者因获卵日男方取精失败, 其中包含因心理性因素取精失败并拒绝附睾穿刺19例, 非梗阻性无精症 (nonobstructive azoospermia, NOV) 睾丸穿刺取精失败4例。②9例患者因新鲜周期促排卵后获卵数多 (≥20枚) , 自主要求冷冻保存部分卵母细胞。全部患者均签署了冷冻卵母细胞的知情同意书。
1.2 分组
为了明确分析冻卵对于妊娠结局的影响, 在34个玻璃化冻卵周期中去除其他疾病因素, 仅保留由于男方因素行卵细胞浆内单精子注射-胚胎移植 (ICSI-ET) 的21个周期为研究组, 以同期在本中心以ICSI方式受精的78个新鲜卵周期为对照组。纳入标准:①同期使用同批次培养液, 因男方因素 (少弱精症、非梗阻性无精症) 行ICSI治疗, 均采用常规长方案超促排卵;②男女双方染色体正常, 女方年龄<38岁, 排除女方多囊卵巢综合征、卵巢低反应、子宫内膜异位症、输卵管积水等病因。两组患者的女方平均年龄、平均不孕年限比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
1.3 方法
1.3.1 试剂与耗材
①玻璃化冷冻试剂盒 (Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka, 日本) 包含有:平衡液:7.5%乙二醇+7.5%二甲亚砜;玻璃化液:15%乙二醇+15%二甲亚砜+0.5 mol蔗糖;②解冻试剂盒 (Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka, 日本) , 包含有:解冻液、稀释液、洗液Ⅰ、洗液Ⅱ;③冷冻载体为Cryotop (KitazatoBiophamaCo.Ltd.Shizuoka, 日本) ;④配子处理液 (gamete buffer, Cook, 澳大利亚) ;⑤体外受精培养液 (fertilization medium, Cook, 澳大利亚) ;⑥胚胎培养液 (cleavage medium, Cook, 澳大利亚) 。
1.3.2 卵母细胞的收集及预处理
所有患者均采用常规长方案促排卵, 促排卵后期经阴道超声监测卵泡发育及结合激素测定, 来确定注射绒促性素 (HCG) 时机, 并于注射后35~36小时内经阴道超声引导下取卵, 将取得的卵丘复合物收到配子处理液中清洗两次后, 转移至平衡过的体外受精培养液中, 放置在37℃, 6%CO2培养箱中孵育2小时左右, 把需要玻璃化冷冻的卵母细胞在40 U/ml透明质酸酶中消化20~30秒后, 用直径150μm的拉细巴斯特吸管去除卵母细胞周围颗粒细胞。
1.3.3 卵母细胞的玻璃化冷冻
在室温下, 首先把去除颗粒细胞的卵母细胞放入平衡液中平衡8分钟, 同时在Falcon 1006培养皿中做3个玻璃化液液滴, 每液滴约100μl, 平衡后用拉细的巴斯德滴管将卵母细胞依次转移到3个玻璃化液液滴中, 卵母细胞在每个液滴中平衡时间不超过20秒, 在玻璃化液中总时间不超过1分钟, 然后将2~3枚卵母细胞 (含2μl左右的玻璃化液) 转移至玻璃化冷冻载杆 (Cryotop) 叶片上并迅速放入液氮中。卵母细胞冷冻的整个操作在室温下完成。
1.3.4 卵母细胞的复苏
首先将解冻液、稀释液、洗液Ⅰ和洗液Ⅱ从冰箱中取出, 解冻液置于37℃中预温10分钟, 稀释液、洗液Ⅰ和洗液Ⅱ在室温下平衡, 取37℃平衡好的解冻液1 ml于Falcon 3653培养皿中, 放置在体视显微镜的37℃加热载物台上, 把拟解冻的载有卵母细胞的冷冻载杆 (Cryotop) 从液氮中取出, 迅速将载杆顶端置于解冻液中1分钟, 使得卵母细胞直接脱落于解冻液中, 然后用拉细的巴斯德滴管将卵母细胞依次转入稀释液﹑洗液Ⅰ和洗液Ⅱ中分别放置2、2、4分钟, 最后将卵母细胞移入平衡过的体外受精培养液中, 置于37℃, 6%CO2的培养箱中培养3小时后取出, 在倒置显微镜下进行形态学检查, 当卵母细胞形态正常、结构完整、透亮, 没有胞质变色及透明带断裂时, 即认为卵子存活, 筛选出MⅡ期卵母细胞行体外受精。
1.3.5 受精、胚胎培养及移植
MⅡ卵母细胞在ICSI受精后移入体外受精培养液中, 在37℃, 6%CO2的饱和湿度培养箱中培养, 16~18小时后观察受精情况, 以卵母细胞的胞浆中出现双原核为正常受精, 转移至胚胎培养液中继续培养48小时, 参照Moayeri等[3]的胚胎分级方法, 挑选出优质胚胎进行移植。黄体支持药物包括黄体酮和戊酸雌二醇, 移植后14天测血β-HCG, 当血β-HCG>5.3 U/L时为生化妊娠, 移植后35天进行阴道超声检查, 当看到孕囊及胎心搏动时为临床妊娠, 如发现妊娠, 黄体支持用药至妊娠50~60天后逐渐减量。正常受精率=正常受精卵数/总卵数×100%, 卵裂率=卵裂数/正常受精卵数×100%, 优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂数×100%, 种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%, 活婴分娩=妊娠人数/移植人数×100%, 活产率=抱婴人数/移植人数×100%, 流产率=流产人数/妊娠人数×100%。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0软件处理, 计量数据以 (±s) 表示, 组间均数比较用t检验, 率的比较用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 32例患者 (34个周期, 其中2例患者的卵母细胞各分2次解冻) 共298枚玻璃化冻存的卵母细胞在复苏后存活278枚 (93.29%, 278/298) , 对其中成熟的234枚卵母细胞进行ICSI受精后, 受精182枚 (77.78%, 182/234) , 卵裂173枚 (95.05%, 173/182) 形成优质胚胎82枚 (47.40%, 82/173) , 2个周期因形成的胚胎质量差放弃移植, 共移植32个周期70枚胚胎, 最终11例患者获得成功分娩 (10例单胎, 1例双胎) , 移植周期活产率为34.38%, 目前所有婴幼儿经检查, 染色体及发育均正常。
2.2 研究组与对照组临床结局比较 见表2。两组患者的卵裂率、临床妊娠率、种植率、活产率、流产率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。而研究组的受精率、优质胚胎率则显著低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
冷冻卵母细胞是人类辅助生殖技术的重要组成部分, 其应用大大丰富了临床治疗的方案, 尤其为青少年和尚未结婚的女性保存生殖能力提供了极大的可能。本次报道的玻璃化冷冻卵母细胞的34个周期中, 最终11例患者成功抱婴, 说明玻璃化冷冻卵母细胞的技术是可行的, 可获得较好的临床结局。同时通过对筛选出的因男方因素不孕的21个玻璃化冷冻周期与同期相同病因的78个新鲜周期的数据比较, 我们发现玻璃化冷冻卵母细胞组的受精率、优质胚胎率明显低于新鲜卵母细胞组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 并值得关注的是, 两组流产率差异虽无统计学意义 (可能与样本数量较少有关) , 但玻璃化冷冻组流产率相对于新鲜卵组有增高的趋势, 分析上述情况, 我们认为这主要是因卵母细胞在玻璃化冷冻过程中受到的冷冻损伤所导致。研究已证实, 纺锤体在卵子成熟、受精、卵裂及胚胎发育过程中发挥重要作用[4], MⅡ期卵母细胞处在减数分裂中期, 纺锤体已形成, 染色体附着在纺锤体微管上, 而此期的纺锤体对外界理化性质变化极其敏感, 可因低温出现微管解聚, 纺锤体受损, 染色体弥散等现象, 虽然复温后的纺锤体可以重新聚集[5], 但部分受损的纺锤体可出现功能障碍并导致部分染色体丢失或不能正确排列, 这些均使得卵母细胞的正常受精率及后继发育潜能下降或使得非整倍体的发生率增大, 目前无论是慢速冷冻还是玻璃化冷冻对纺锤体的冷冻损伤都不能完全避免, 有学者建议应用偏振光显微镜 (Poiscope) 观察选择解冻后具有正常纺锤体的卵子用于受精[6], 这可能有助于改善临床结局。同时冻融过程也会改变为卵子的功能活动提供能量的线粒体的超微结构, 使其氧化磷酸化功能下降, 导致三磷酸腺苷 (ATP) 产生减少, 使卵子正常的染色体分离, 有丝分裂等功能活动受抑, 从而引发卵子和胚胎的发育阻滞。现有报道显示, 复温后的人卵线粒体同纺锤体一样, 在一定时间内具有一定的自我恢复能力[7], 故鉴于卵子超微结构特性, 在冻融过程中, 为降低卵子的冷冻损伤及提高复苏后卵子的受精率和发育潜能, 我们认为应适当把握两个时机:①冷冻时机, 选择在获卵后2小时左右, 此时卵子的超微结构功能尚未达到最佳状态, 冷冻损伤可能较小[8]。②ICSI时机, 选择在冻卵融解后3小时左右, 给复苏后卵子的孵育以充分的时间, 使其超微结构功能能较好的恢复以获得优质的卵母细胞及胚胎[9]。但由于目前辅助生殖领域对冻融过程中卵母细胞发生的变化缺乏全面的了解, 其对冷冻及ICSI最佳时机的选择还需进一步的探讨。
虽然目前卵子冷冻尚未纳入辅助生殖治疗常规, 但在体外受精-胚胎移植日常工作中常会遇到因各种原因而需要冻卵的患者, 比如部分性功能正常的男性在获卵日可能会因一些心理性因素而导致取精失败[10], 同时符合睾丸穿刺的非梗阻性无精症患者在获卵日, 其睾丸穿刺成功获取精子率也只有大约60%[11], 当这两部分取精失败的患者中, 前者拒绝附睾穿刺, 后者拒绝使用供精时, 则面临着已取出的卵母细胞因无法受精而将被废弃的局面, 在这种情况下, 无疑, 玻璃化冷冻卵母细胞的技术可为这些卵子提供最佳的出路。且随着辅助生殖超促排卵技术的发展, 部分患者一次促排卵可以获得较多的卵母细胞, 如果全部卵母细胞都用于受精则会形成大量的胚胎, 而治疗往往可能只需要用几枚, 剩余的胚胎除了自愿捐献用于医学研究外则最终会被废弃, 这造成了巨大的生物资源浪费, 通过本中心对玻璃化冷冻卵母细胞临床应用的经验及国内外其他中心的报道[12,13], 我们认为在玻璃化冷冻卵母细胞技术发展成熟的条件下, 对一次促排卵获得较多卵子的患者, 可以行部分卵子冷冻保存, 其主要的意义在于如果患者在新鲜周期成功妊娠, 则多余的卵母细胞可捐赠给其他不孕患者, 这将极大地促进卵子库的建设。而如果患者新鲜周期妊娠失败, 则复苏冻存的卵子后仍旧可获得妊娠的机会。
综上所述, 玻璃化冷冻卵母细胞的技术可以在有临床适应证的患者中应用, 随着其技术不断的改进及在基础冷冻生物学﹑遗传学﹑分子生物学等学科的共同发展下, 可以预见它的应用将会越来越广泛。
摘要：目的:探讨玻璃化冷冻卵母细胞的临床应用可行性。方法:回顾性分析玻璃化冷冻卵母细胞34个周期, 对其复苏率、受精率、卵裂率、临床妊娠率等进行统计分析, 并筛选出因男方因素不孕的21个周期 (研究组) 和同期因男方因素进行新鲜卵细胞浆内单精子注射-胚胎移植 (ICSI-ET) 的78个周期 (对照组) 进行比较。结果:298枚玻璃化冻存的卵母细胞复苏后存活278枚, 对其中成熟的234枚卵母细胞进行ICSI受精后, 受精182枚, 形成优质胚胎82枚, 移植70枚胚胎, 11例患者获得成功分娩 (10例单胎, 1例双胎) 。研究组受精率﹑优质胚胎率比对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 卵裂率、临床妊娠率、种植率、活产率和流产率差异均无统计学意义 (P>0.05) 。结论:玻璃化冻融卵母细胞的技术可以在有适应证的患者中应用, 可获得较好的临床结局。
玻璃化冷冻 篇4
卵巢颗粒细胞是十分重要的与生殖相关的体细胞,在培养过程中添加颗粒细胞可以提高卵母细胞的质量及促进胚胎的进一步发育[6,7]。玻璃化冷冻技术作为一项经济、简便和高效的冷冻技术在卵巢颗粒细胞冷冻研究领域内的应用日渐增多[8],但不同玻璃化预处理方法对细胞培养影响的研究报道很少,对解冻后细胞生长潜能和预处理方法之间缺乏关联性的分析研究。本试验采用玻璃化冷冻法保存牛卵巢颗粒细胞,比较不同玻璃化冷冻处理方法对卵巢颗粒细胞活力和传代周期的影响,以期找到一种最优的玻璃化冷冻预处理方法,进一步提高细胞玻璃化冷冻保存的效率。
1 材料与方法
1.1 牛卵巢颗粒细胞的制备
从屠宰场收集黄牛卵巢,装入加有100 IU /mL 链霉素(HyClone公司生产)和100 IU/mL 青霉素(HyClone公司生产)的30 ℃的杜氏磷酸缓冲液(DPBS,HyClone公司生产)中,于4 h内运回实验室;以DPBS清洗2次,从卵巢表面抽取2 mL卵泡液,用等量的0.2%透明质酸酶(HyClone公司生产)消化3 min;用DMEM高糖液体培养基(HyClone公司生产)离心洗涤2次(1 500 r/min离心6 min),然后用DMEM调整颗粒细胞的密度为1×106/mL,将颗粒细胞移入加有10%胎牛血清(FCS)、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和链霉素的DMEM中进行培养,待细胞长至80%～90%汇合时进行细胞消化传代培养。用含0.1%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液于37.5 ℃消化细胞。
1.2 牛卵巢颗粒细胞的玻璃化冷冻预处理
细胞冷冻保存液是含有20%FCS和5%二甲基亚砜(DMSO)的DMEM。收集消化传代培养的牛卵巢颗粒细胞,混合均匀,用细胞冷冻保存液调整颗粒细胞的密度为1×106/mL,分装于事先准备好的冷冻保存管中,每管1 mL。冷冻保存方法:①将冷冻保存管直接投入液氮罐中;②将冷冻保存管先置于4 ℃冰箱15 min,然后投入液氮罐中;③将冷冻保存管先置于-20 ℃冰箱10 min,然后投入液氮罐中;④将冷冻保存管先置于4 ℃冰箱15 min,再置于-20 ℃冰箱10 min,然后投入液氮罐中。
1.3 牛卵巢颗粒细胞的解冻培养
牛卵巢颗粒细胞冷冻保存24 h后,自液氮中取出冷冻保存管,立即将其放入37 ℃水浴锅中快速解冻,轻摇冷冻保存管使其在30 s内全部融化;以70%乙醇擦拭冷冻保存管外部,移入无菌操作台内,移出冷冻保存管内的细胞悬液,缓缓加入DMEM培养基进行稀释(比例为1∶1.5),使其混合均匀,然后离心洗涤2次(1 500 r/min离心6 min);用加有10%FCS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和链霉素的DMEM调整颗粒细胞的密度为1×106/mL,将颗粒细胞移入38.5 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。
1.4 牛卵巢颗粒细胞活力的检测
采用台盼蓝染色法检测牛卵巢颗粒细胞的活力。配制0.4%台盼蓝水溶液,按照1∶9的比例加入细胞悬液中混匀,将细胞悬液加入计数板中,在倒置显微镜下分别计数未染色的细胞数(活细胞)和染色的细胞数(死细胞),最后计算细胞活率:细胞活率(%)=活细胞数/(死细胞+活细胞数)×100%。
1.5 牛卵巢颗粒细胞传代时间的测定
从细胞转入培养皿中培养开始计时,观察细胞的贴壁汇合情况,待细胞贴壁汇合范围达到整个培养皿底部85%～90%时为细胞汇合,计算细胞传代时间。
1.6 试验设计
试验1:探讨不同玻璃化冷冻预处理方法对牛卵巢颗粒细胞活力的影响。采用1.2中所述4种方法对牛卵巢颗粒细胞进行预处理,解冻后对4种方法处理的细胞活力进行检测和统计。
试验2: 探讨不同玻璃化冷冻预处理方法对牛卵巢颗粒细胞传代时间的影响。牛卵巢颗粒细胞经不同玻璃化冷冻预处理方法处理后,分别统计各试验组细胞复苏后的传代时间(细胞贴壁汇合达85%～90%)。
1.7 数据分析
利用SPSS(Version 11.5)处理试验数据,P<0.05时为差异显著。
2 结果与分析
2.1 不同玻璃化冷冻预处理方法对牛卵巢颗粒细胞活力的影响(见表1)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。
4种不同玻璃化冷冻预处理方法冷冻保存细胞24 h后细胞活率分别为72%、74%、79%、86%,细胞活率逐渐上升,方法③细胞的活力显著高于方法①和②(P<0.05),方法④细胞的活力显著高于其他3种方法(P<0.05)。
2.2 不同玻璃化冷冻预处理方法对牛卵巢颗粒细胞传代时间的影响(见表2)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。
不同玻璃化冷冻预处理方法冷冻的细胞解冻后传代时间分别为76 h、73 h、67 h、62 h,细胞传代时间逐渐缩短,方法③细胞的传代时间显著低于方法①和②(P<0.05),方法④细胞的传代时间显著低于其他3种方法(P<0.05)。方法③和④细胞生长状态较好。
3 讨论
自1985年W.F.Rall和G.M.Fahy[9]首次应用玻璃化冷冻法对小鼠胚胎保存成功以来,玻璃化冷冻保存细胞技术便成为低温生物学领域的研究热点。此后,经过科学工作者的不断努力,多种玻璃化冷冻方法应运而生,细管法、微滴法、固体表面玻璃化法、开放式拉长麦管法、冷冻环法、玻璃微细管法和封闭式拉长塑料细管法等都取得了一定的冷冻保护效果[9]。玻璃化冷冻方法既便于操作又节省时间,已先后在小鼠、绵羊、山羊、兔、牛、猪等动物胚胎及体细胞的保存上获得成功。在提高玻璃化冷冻效率的研究中,人们逐渐认识了细胞冷冻损伤机制,大多通过降低抗冻保护剂的毒性及抗冻保护剂的不同组合来提高冷冻保存的效率[10,11]。但对于细胞在冷冻保存前的预处理过程对冷冻保存效率的影响研究很少,虽然在一些玻璃化冷冻保存的研究中进行了预处理[12],也取得了较好的保存效率,但没有对保存前的预处理因素进行单一分析,不能从根本上确认预处理对保存效率的影响。
在本试验中,将冷冻保存管事先置于-20 ℃维持10 min,然后再投入液氮罐(方法③和④),有效地提高了细胞复苏后的活力及细胞增殖的能力。虽然置于4 ℃维持15 min的预处理(方法④)并没有明显提高复苏后细胞的活率及细胞增殖的能力,但相比直接投入液氮的方法③也有增强的趋势。说明-20 ℃的预处理更有利于提高细胞冷冻保存的效率,这可能是由于-20 ℃更接近细胞玻璃化冷冻的缓冲温度。但在卵母细胞及早期胚胎的冷冻保存研究中,前期的预处理报道更少[13,14],这主要是因为卵子比体细胞对环境的适应性较差,更脆弱,对温度的变化更敏感,更易受到温度变化影响而造成损伤。当然,影响细胞冷冻保存的因素很多,在本研究中除了预处理温度、处理时间及冷冻保护液中血清浓度、培养基浓度外,还有冷冻保护剂的添加浓度。细胞与最终浓度的冷冻保护剂接触的时间到底要多长,才能保证细胞达到玻璃化而又使冷冻保护剂对细胞的毒性作用降到最低,目前很难确定。从理论上来说,采用不同的冷冻保护剂,玻璃化冷冻时间应该有所差异。
综上所述,对牛卵巢颗粒细胞进行不同温度和不同时间的预处理,可以提高复苏后细胞的活力及细胞增殖潜能,进一步提高细胞玻璃化冷冻保存的效率。
摘要：为了研究不同玻璃化冷冻预处理对牛卵巢颗粒细胞培养的影响,试验采用4种不同的玻璃化冷冻预处理方法(①将冷冻保存管直接投入液氮罐中;②将冷冻保存管先置于4℃冰箱15 min,然后投入液氮罐中;③将冷冻保存管先置于-20℃冰箱10 min,然后投入液氮罐中;④将冷冻保存管先置于4℃冰箱15 min,再置于-20℃冰箱10 min,然后投入液氮罐中)处理牛卵巢颗粒细胞,解冻后检测细胞活力和传代时间。结果表明:解冻后4种方法的细胞活力分别为72%、74%、79%和86%;传代时间分别为76 h、73 h、67 h和62 h;方法④的细胞活力和传代时间与其他组比较差异显著(P<0.05)。说明玻璃化冷冻预处理方法有利于复苏后的牛卵巢颗粒细胞的进一步培养。
玻璃化冷冻 篇5
患者, 女, 38岁, 因“婚后同居, 性生活正常, 未避孕未孕1年”于2004年1月8日来诊。患者平素月经规律, 周期为28~30 d, 基础内分泌正常, 双侧卵巢窦卵泡数20个左右。于本院行输卵管造影检查, 双侧输卵管阻塞, 行2次输卵管扩通术 (X光下COOK导丝插管) , 左侧插管顺利, 注药无阻力, 右侧插管顺利, 但注药阻力大, 无药液注入。之后给予6个月中药治疗。男方精液正常。在指导同房3个周期未能自然妊娠的治疗期间, 监测到3个自然周期均为右侧排卵, 6个枸橼酸氯米芬促排周期中仅有3个周期左侧卵巢有优势卵泡排卵。于2007年在本院行丈夫精液人工授精 (artificial insemination-husband, AIH) , 未孕。2009年患者再次来本中心要求人工助孕。治疗周期:末次月经2009年7月21日, 于月经第5 d给予人尿促性腺激素75 IU/d, 肌内注射, 经7 d促排后因双侧卵巢大于18 mm的卵泡4个, 大于14 mm的卵泡总计16个, 当日给予人绒毛膜促性腺激素10 000 IU, 肌内注射, 准备行AIH。为避免多胎妊娠, AIH当日经签署“刺破卵泡AIH”、“经阴道取卵术”和“卵母细胞冷冻”等知情同意书后, 行阴道B超引导下经阴道卵泡刺破及取卵术。共刺破左右两侧卵巢卵泡4个, 其余12个卵泡在100mm Hg负压下穿刺抽吸取卵9个。术后嘱丈夫取精, 精液经密度梯度离心法处理后行AIH。取出的卵冠丘复合体培养4 h后, 放入80 IU/m L透明质酸酶中20~30 s, 配合细玻璃管吹打脱去颗粒细胞, 以清楚分辨极体为准, 9个卵母细胞中有6个为MⅡ期, 3个为GⅤ期。进行卵母细胞冷冻操作, 冷冻及复苏保护剂均为日本KITAZATO公司试剂。在室温下将MⅡ卵母细胞转移到20μL基础液 (BS) 中, 然后将20μL稀释液 (ES) 缓慢加入BS中, 平衡3 min, 再将20μL ES缓慢加入BS中平衡3 min, 最后将240μL ES缓慢加入BS中平衡9 min。平衡结束后将卵母细胞转移到玻璃化冷冻液 (VS1、VS2) 中清洗, 之后迅速将卵母细胞放在Cryotop上面, 并将残液吸净后快速放入液氮进行玻璃化, 整个过程需在1 min内完成。然后将Cryotop套好管帽放入支架, 投入液氮中储存。患者AIH周期于2009年8月18日失败。下一周期的月经第10天开始行B超监测, 第13天优势卵泡平均直径达18 mm时, 测尿和血LH值。LH峰出现48 h后行冷冻卵母细胞复苏, 从液氮保存罐中取出存放卵母细胞的支架, 将Cryotop去掉管帽后迅速放入到经过37℃平衡的解冻培养液中平衡1 min, 待卵母细胞与Cryotop分离后, 将卵母细胞转移到稀释培养液中, 平衡3 min, 然后将卵母细胞转移到冲洗培养基 (WS1、WS2) 中, 分别平衡5min和1 min。最后将卵母细胞移入受精用培养液中, 放入37℃5%二氧化碳培养箱中培养2 h后, 观察卵母细胞存活情况。6枚卵母细胞均存活, 即行卵胞浆内单精子注射 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 。16 h后观察发现正常受精4个, 异常受精1个。卵子复苏后第3天有4个胚胎形成, 其中3个为优质胚胎, 全部移植。之后常规黄体支持, 于移植后15 d, 尿及血检查HCG提示生化妊娠;于胚胎移植后35 d, B超检查发现宫内一个妊娠囊, 其内可见胎芽及胎心。于妊娠35周胎膜早破, 于2010年4月25日顺利分娩一女活婴, 体格发育正常, 体重2 700g。
2 讨论
1986年CHEN[1]报道首例采用慢速冷冻卵子的婴儿出生, 1999年KULESHOVA[2]采用玻璃化冷冻卵子的婴儿出生。随着卵子冷冻技术的成熟, 国内也有相应的报道。2006年陈子江等[3]采用玻璃化冷冻技术获得国内第1例冷冻卵母细胞妊娠。陈贵安等[4]复苏冷冻的卵母细胞, 经解冻精液ICSI受精, 又经胚胎冻融后及移植, 取得成功妊娠。
荟萃分析玻璃化冷冻以其操作简单、高效且不需要昂贵的设备, 与慢速冷冻相比显现其优势, 同时临床资料表明, 与慢速冷冻相比, 在卵子存活率、受精率、卵裂率、优质胚胎形成率、妊娠率和种植率方面也具有优势[5,6]。Cryotop为载体的玻璃化冷冻是一种高效、快捷的人卵母细胞冷冻保存的方法, 并具有良好的临床效果[7]。虽然卵母细胞由于其生物学特征在冷冻过程中所受的损伤及安全性一直是大家讨论的问题, 然而在临床工作中往往会碰到因为各种原因而有卵子冷冻需求的患者。本例患者是在AIH促排周期中出现大量发育卵泡, 为避免AIH促排周期多胎妊娠[8]和浪费卵子, 而采取冷冻卵子的方式。一旦AIH周期失败, 可以在以后的周期中利用冷冻卵子获得妊娠机会, 这样既减少了卵巢过度刺激综合征的机会及多胎妊娠的几率, 同时也减少了患者日后手术的痛苦和经济负担。随着人类卵母细胞冷冻技术的逐步成熟, 该技术在临床工作中得到了广泛的应用, 如卵子捐赠[9]及取卵当日不能获得用于受精的精子, 尤其是在对肿瘤患者放疗和化疗前生育能力的保存、甚至建立卵子银行[10]方面更是具有广阔的应用前景。
参考文献
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[2]KULESHOVA L, GIANAROLI L, MAGLI C, et al.Birth follow-ing vitrification of a small number of human oocytes[J].HumReprod, 1999, 14 (12) :3077-3079.
[3]陈子江, 李嫒, 胡京美, 等.人卵母细胞玻璃化冷冻的临床应用及成功分娩[J].中华医学杂志, 2006, 86 (29) :2037-2040.[3]CHEN ZJ, LI Y, HU JM, et al.Successful clinical pregnancy ofcryopreserved human oocytes after vitrification[J].National MedicalJournal of China, 2006, 86 (29) :2037-2040.Chinese
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玻璃化冷冻 篇6
关键词：人卵巢组织,玻璃化冷冻,载体,固相表面玻璃化,体外培养
卵巢组织冷冻可以为卵巢早衰或癌症需要放化疗的患者提供恢复生育能力及内分泌功能的可能性[1]。玻璃化冷冻是近年来出现的一种新的冷冻方法，该技术将冷冻对象直接投入液氮中快速降温，避免冰晶形成，可以绕开组织内不同细胞成分对慢速冷冻参数要求不同的技术障碍，从而提高冷冻保存效果。玻璃化冷冻的降温速度直接决定冷冻保护剂能否形成玻璃态，而使用的载体是影响降温速度的最重要因素。虽然目前应用玻璃化方法冻存人卵巢组织已有陆续报道，其中采用的载体包括冷冻管[2]、开放式麦管[3]、最小微滴法[4]以及不锈钢网筛[5]等，然而究竟何种载体更适合人卵巢组织玻璃化冷冻，需进一步研究。固相表面玻璃化技术（solid-surface vitrification,SSV）是近年新出现的一种简便有效的玻璃化方法，笔者前期曾成功将其用于玻璃化冷冻人卵巢组织片，并取得了与慢速程序化冷冻相当的效果[6]。本研究的目的是比较固相表面玻璃化冷冻和其他载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果。
1 材料与方法
1.1 人卵巢组织标本的收集与预处理
卵巢标本取自2011年11月～2012年6月就诊于中山大学孙逸仙纪念医院妇产科、需经腹或行腹腔镜手术的16例患者，年龄21～40岁，平均（32.7±5.9）岁；有规律的月经史，无内分泌紊乱，无放化疗史，半年内无激素服用史，且卵巢囊肿直径<7 cm。其中，良性卵巢囊肿8例，子宫肌瘤5例，宫颈癌3例。所有患者均签署知情同意书，本研究得到了中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准。
新鲜卵巢组织浸泡于含10%人血白蛋白+青链双抗的L-15培养液（Gibco公司）中，于体式显微镜下去除多余髓质后，切成约5 mm×1 mm×1 mm大小的皮质小条，随机分配到不同的实验组：新鲜组（F组）、冷冻管玻璃化组（TV组）、最小微滴玻璃化组（MDS组）、不锈钢网筛玻璃化组（SLV组）和固相表面玻璃化组（SSV组）。新鲜组直接以4%多聚甲醛液固定。
1.2 玻璃化冷冻和复苏过程
采用含有20%乙二醇（ethylene glycol,EG）+20%二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide,DMSO）的L-15溶液为玻璃化冷冻液。将卵巢组织依次浸泡于4℃25%、50%、75%和100%浓度的玻璃化冷冻液中逐步导入冷冻保护剂后，采用不同载体行玻璃化冷冻：(1)TV组将卵巢置于含有1 mL 4℃100%玻璃化冷冻液的无菌冷冻管中投入液氮；(2)MDS组用无菌的巴氏管将卵巢组织直接滴入液氮中；(3)SLV组将卵巢组织置不锈钢网筛上投入液氮中；(4)SSV组将卵巢组织置于已在液氮中预冷的铝箔上投入液氮中，在液氮面之下将卵巢组织收集入冷冻管中液氮保存。
复苏时将冷冻管从液氮中取出，静置10 s，除TV组将冷冻管置于37℃水浴中2～3 min取出卵巢组织外，MDS组、SLV组和SSV组打开冷冻管取出卵巢组织，将其依次转移到0.5、0.25和0.125 mol/L蔗糖溶液中，洗涤后于37℃培养箱中静置备用。
1.3 人卵巢皮质片的体外培养
卵巢组织体外培养体系参考文献[7]。将复苏的卵巢组织置于嵌入式培养皿Millicell-ORG(Millipore公司）上培养。培养液成分：α-MEM液，2.5%人白蛋白，1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠ITS（含有胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠），500 mIU/mL重组人促卵泡生成素（rhFSH）以及青链双抗。培养10 d，每2天更换新鲜培养液，吸出的培养液用于激素测定。培养结束后所有的卵巢组织用于组织学检测。
1.4 组织学分析
卵巢组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后4μm连续切片，行HE染色，每10个切片在光镜下观察计数一次。原始卵泡和初级卵泡计数以卵母细胞核作为标记，盲法计数每个标本中形态正常的原始卵泡和初级卵泡。参照Gougeon标准[8]进行卵泡分级和卵泡形态评价。
1.5 雌孕激素的测定
将更换的培养液收集于无菌EP管中，置于-20℃冰箱保存，培养结束后统一采用美国全自动化学发光免疫分析系统ACS:180SE测定雌孕激素水平。
1.6 统计学方法
使用SPSS 11.0统计分析软件，计量资料数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析和χ2检验进行统计学分析组织学结果，对培养液中雌二醇和孕酮的测定采用GLM中重复测量的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 卵巢皮质组织学分析结果
冷冻前后的组织切片在光镜下均可见到形态正常和闭锁的卵泡（图1）。冻融后各组卵巢组织中卵泡形态正常率低于F组（P<0.05）。其中，SSV组原始和初级卵泡正常形态率最高（P<0.05），其次为MDS组和SLV组，后两组之间差异无统计学意义（P>0.05）,TV组卵泡正常形态率最低（P<0.05）（表1）。
A:冻融后形态正常的原始卵泡;B:冻融前形态正常的次级卵泡和闭锁的原始卵泡
注：F组为新鲜组；TV组为冷冻管组；MDS组为最小微滴组；SLV组为不锈钢网筛组；SSV组为固相表面玻璃化组；与F组比较，*P<0.05；与TV组比较，#P<0.05；与SSV组比较，▲P<0.05
2.2 卵巢组织的体外培养
经过体外10 d培养后，各组卵巢皮质的边缘变圆滑。光镜下各组卵巢皮质培养后均可见到存活卵泡，见图2。如图2所示，与新鲜未培养卵巢组织相比，培养后的各组卵巢组织中原始卵泡所占的比例均下降（P<0.05），生长卵泡（包括初级和次级卵泡）比例均上升（P<0.05）。新鲜未培养组原始卵泡和生长卵泡的比例分别为85.96%和14.04%；TV组培养后为60.66%和33.34%；MDS组培养后为56.24%和43.76%；SLV组培养后分别为54.79%和45.21%；SSV组培养后为46.0%和54.0%。SSV组冻融组织体外培养后初级卵泡比例明显高于其他冷冻组（P<0.05），同时原始卵泡所占比例明显低于其他冷冻组（P<0.05）。TV组培养后两类卵泡比例与其他各组之间比较，差异均有统计学意义（均P<0.05），培养后MDS组和SLV组的两级卵泡所占比例组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
注:与F组比较,*P<0.05;与MDS、SLV、SSV组,#P<0.05;与SSV组比较,△P<0.05
2.3 培养液中激素的测定结果
体外培养的10 d中，与新鲜培养液相比，复苏后卵巢组织培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随着培养时间逐渐升高（图3A、3B）。SSV组雌二醇和孕酮平均浓度明显高于其他组（P<0.05）。TV组的两种激素水平均显著低于其他各组（P<0.05）。MDS组与SLV组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
注:Fresh medium:新鲜培养液;E2:雌二醇;P:孕酮
3 讨论
玻璃化冷冻过程需要一个特殊的载体承载冷冻保护液和组织细胞，对于卵巢组织而言，载体需要一定的容积同时要尽量减少所需冷冻液的体积以提高降温速度。此外，当组织被浸入液氮中时，沸腾的氮气包裹在组织周围，由于其低导热性形成有效的绝热区从而减缓了降温速度[9]。由此可见，载体的选择要考虑上述多种影响因素。目前已有多种载体被实验性地应用于玻璃化冷冻过程，如冷冻管（cryovial）、开放式拉长麦管[10]、最小微滴法和不锈钢网筛等。
冷冻管被应用于卵巢组织的程序化冷冻，但因管壁较厚和所需较多冷冻液，导致降温速度慢，不能满足玻璃化形成的需要。在本研究中，冷冻管玻璃化组的正常形态原始卵泡仅为64.57%，冻存效果显著低于其他组。Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷冻猴子的卵巢组织，复温后约70.4%的卵泡保存正常形态。本研究中也使用了该方法玻璃化冷冻人卵巢组织，复温后形态学检测可见约78.36%的原始卵泡保存了正常形态，低于新鲜组和SSV组；体外培养后，生长卵泡比例增加，但仍低于新鲜组和SSV组，提示直接微滴玻璃化对卵巢组织中原始卵泡的形态及发育潜能存在一定影响。
固相表面玻璃化法是近年新出现的一种有效、简便的玻璃化技术，曾成功用于玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞[11]和羊卵巢组织[12]。与前述各载体相比，SSV法具有其独特的优势：首先，由于该方案是直接将组织置于已经在液氮中半悬预冷至-150～-180℃的固相表面，因而可以避免液氮蒸发产生气泡导致的热传导阻滞[13]；其次，SSV技术与液氮接触的相对面积更大，而且可以将冷冻组织所需的冷冻保护剂减至最少，从而提高降温速度，促进玻璃化的形成[12]。第三，应用此方法可以冷冻较大体积的卵巢组织，能在较短时间内完成大量卵巢皮质的冷冻保存。第四，在SSV方法中，因直接将载有组织的玻璃态微滴浸入37℃复温溶液中，可以很快复温，避免冰晶再形成的发生从而减少对组织细胞的损伤。目前在SSV方法中使用的预冷的固相表面材料多报道为铝箔，主要原因是铝箔兼具优良的导热性和延展性，且价格便宜，便于操作。