紫锥菊多糖论文

紫锥菊多糖论文（共3篇）

紫锥菊多糖论文 篇1

多糖是一种新型免疫增强剂，且具有天然、低毒、无药物残留的优点。有研究发现，多数多糖成分与疫苗共用能显著提高血清抗体效价，促进淋巴细胞转化。国外研究发现，紫锥菊(Echinacea Purpurea)可以通过激活免疫细胞来提高机体自身免疫系统功能而用来治疗和预防疾病。紫锥菊多糖(Echinacea Purpurea Polysaccharide, EPPS)可作为免疫调节剂及免疫刺激素，且具有抗病毒、抗真菌、抗肿瘤及消炎的作用。试验比较了4个不同浓度紫锥菊多糖成分对T淋巴细胞转化的影响，结果证实了紫锥菊多糖为诱导淋巴细胞转化的主要有效成分，也为研制新型免疫增强剂提供了重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

EPPS由河南农业职业学院中兽医实验室提取保存备用。分别用三蒸水稀释成4种质量浓度，分别为400, 200, 100, 50μg/m L，灭菌后4℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

RPMI 1640培养基由Gibco公司生产，按其说明用三蒸水配制后过滤除菌，分装后4℃保存，临用前加10%的小牛血清(杭州四季青生物制品厂)和常规量的双抗制成完全1640液备用;伴刀豆素球蛋白(ConA)和细菌脂多糖(LPS), Sigma公司产品，分别用无血清的RPMI 1640培养液配成0.25 mg/m L，调pH值至7.4, 0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装备用;四甲基偶氮唑蓝(MTT), Sigma公司生产，用pH值7.4的PBS液配成5 mg/m L的溶液，如上过滤除菌，避光保存;淋巴细胞分离液，上海华精生物高科技有限公司生产，批号20071106;裂解液二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，莱阳化工实验厂生产。

1.1.3 主要仪器

Mk3型酶联免疫检测仪(芬兰Thermo Labsystems公司);CO2培养箱(美国Revco公司);TS100型倒置显微镜(日本Nikon公司);BM-2型微量振荡器(江苏医疗器械厂);96孔细胞培养板和24孔细胞培养板(美国Scienceproducts公司)。

1.2 试验方法

取60日龄蛋公鸡，颈静脉放血处死，无菌取脾脏，用灭菌生理盐水冲洗3次，放入含Hank’s液的平皿中剪碎，装入100目网孔的尼龙网袋中，用弯针头挤压过滤，收集细胞液，加入淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸取中间云雾状白细胞层，用Hank’s液洗2次，用RPMI 1640营养液稀释成1×107/m L的细胞悬液。分别向细胞悬液中加入ConA(终浓度为5μg/m L)或LPS(终浓度为10μg/m L)，然后加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，再分别加入各浓度的EPPS 100μL，每种浓度重复4孔。另设EPPS和ConA、LPS的对照孔，细胞调零孔。将细胞板放入5%CO2、37.5℃培养箱中培养44 h，每孔中加入20μL MTT液，继续培养4 h取出，各孔吸出上清液，加入100μL裂解液，在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清，用酶联免疫仪检测570 nm处的吸光度，作为淋巴细胞增殖的指标。

1.3 数据处理

试验数据均采用SPSS 13.0统计软件进行单因子方差分析，并用邓肯氏(Duncan’s)法进行多重比较。

2 试验结果

结果显示：EPPS+ConA组在100μg/m L时的OD值达到最大值，且大于ConA对照组的OD值。EPPS浓度在大于100μg/m L时的OD值随浓度的升高而降低，在50～100μg/m L范围内OD值随着浓度的升高而增加;EPPS+LPS组4个浓度的OD值均高于LPS组的OD值，在低于100μg/m L时，OD值随浓度的升高而增加且差异均显著(P<0.05);EPPS对照组OD值均大于细胞对照组OD值，在100μg/m L浓度时达最大值，且差异显著(P<0.05)，见表1。

3 讨论

3.1 EPPS可提高细胞免疫水平

试验结果表明，EPPS在50～100μg/m L低浓度范围内能协助ConA提高鸡脾T淋巴细胞转化率，促进T淋巴细胞增殖。据倪耀娣等2010年报道，紫锥菊对鸡传染性法氏囊病疫苗具有免疫调节作用，应用紫锥菊提取物后肉鸡外周血中IL-2含量明显增高，淋巴细胞数量增加，活力增强，表明紫锥菊提取物能显著提高细胞免疫水平。

注： (1) ConA对照组; (2) LPS对照组， (3) 细胞对照组。标*的为差异显著(P<0.05)。

3.2 EPPS可提高动物体液免疫功能

试验结果表明，EPPS能够协同LPS促进体外培养鸡脾脏淋巴细胞的增殖，且在100μg/m L时达到峰值，高于100μg/m L浓度时随浓度增加而降低。结果表明EPPS体外能够提高鸡脾脏B淋巴细胞转化率，增强家禽体液免疫功能。大量研究也证实紫锥菊可提高动物的体液免疫功能，据张传清2011年报道，紫锥菊疫毒清配合ND、IBD疫苗免疫使用，对免疫后的体液抗体水平有明显的增强作用，而且安全性好，说明该制剂能增强鸡体的免疫功能，提高鸡体抗感染能力。另据倪耀娣等2010年报道，紫锥菊提取物中含有多糖和糖蛋白，提高了肉鸡血液中的IBDV抗体水平，并且不同的剂量均效果明显。

3.3 EPPS对细胞分裂有抑制作用

由试验结果可知，EPPS协同ConA或LPS促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用与浓度有关，随着多糖浓度的增加呈钟罩型(先升后降)变化，尤其低浓度50～100μg/m L作用最为明显。而在400μg/m L、200μg/m L这两个高浓度出现对鸡脾淋巴细胞增殖有抑制作用，可能EPPS高浓度时对细胞分裂起了一定的抑制作用。

总之，EPPS对T、B淋巴细胞免疫功能均有促进作用，这些结果可以作为筛选效果较好的新型禽用免疫增强剂的依据。试验研究的是EPPS对体外培养的鸡脾淋巴细胞的影响，在家禽体内是否也具有促进淋巴细胞增殖的作用，有待进一步研究。

紫锥菊药材的炮制工艺研究 篇2

1 材料

1. 1 样品

紫锥菊药材地上部分,采收于青州朱良镇段村鲁光药材基地,经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为松果菊属植物紫锥菊的地上部分; 菊苣酸对照品( 批号为111752 - 200601) ,购自中国药品生物制品检定所; 色谱测定用水为超纯水,乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

1. 2 主要仪器

高效液相色谱仪( 型号为Agilent 1100) ,购自美国安捷伦有限公司; 电子天平( 型号为AL204) ,购自梅特勒- 托利多仪器( 上海) 有限公司; 电子分析天平( 型号为CPA225D) ,购自赛多利斯科学仪器( 北京) 有限公司; 纯水系统( 型号为classic UV + option S15 + 40L) ,购自英国ELGA有限公司。

2 方法与结果

2. 1 菊苣酸含量的测定

2.1.1色谱条件

色谱柱为Zorbax SB C18( 4.6 mm ×150. 0 mm,5 μm) ; 流动相为乙腈- 0. 1% 磷酸溶液( 25∶75) ; 流速为1. 0 m L/min; 柱温为35 ℃; 检测波长为330 nm; 进样量为10 μL。

2.1.2对照品溶液的制备

精密称取菊苣酸对照品适量,加70% 乙醇制成每毫升含50 μg的溶液,即得对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

称取紫锥菊药材地上部分2 kg,洗净,切段,按照确定的工艺炮制后进行粉碎,精密称取粉碎后的药材10 g,加入70% 乙醇100 m L,加热回流提取30 min,冷却后以提取溶剂补足减失重量,过滤得续滤液,即为供试品溶液。

2.1.4线性关系的考察

精密称取菊苣酸对照品适量,加入70% 乙醇制成50 μg /m L菊苣酸对照品溶液。精密量取上述溶液各1,2,5,10,25 m L,加到25 m L容量瓶中定容,进样测定峰面积。以菊苣酸峰面积值为纵坐标、进样量为横坐标绘制标准曲线,回归方程Y = 7. 880 8X - 60. 652,r = 0. 999 8,结果0. 002 ~ 1. 25 mg范围内线性关系良好。

2.1.5精密度试验

取菊苣酸对照品溶液,分次进样,各6 次,记录峰面积,结果RSD = 0. 64% ( n = 6) 。

2.1.6稳定性试验

取供试品溶液6 份,每隔2 h进样,分别测定峰面积,结果RSD = 0. 71% ( n = 6) ,说明样品在12 h内稳定。

2.1.7重复性试验

取同一批次紫锥菊药材制备6 份供试品溶液,按照2. 1. 1 项下的色谱条件独立测定6 次,结果菊苣酸含量分别为92. 97,92. 23,93. 04,92. 29,92. 55,92. 86 μg / m L,RSD = 0. 38% 。

2.1.8回收率试验

精密称取同一批次已知含量的紫锥菊药材6份,分别加入一定量的菊苣酸对照品,制备供试品溶液,按照2.1.1项下的色谱条件测定,计算加样回收率,结果平均加样回收率为99.51%,RSD为1.01%。

2.1.9样品测定

取供试品溶液,按照2. 1. 1 项下的色谱条件进样测定峰面积,采用外标法计算菊苣酸的含量,结果见表1。

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2. 2 炮制工艺的优选

2.2.1不同炮制工艺的比较

为了确定紫锥菊药材常压蒸制炮制工艺的炮制效果,试验采用了以下两种炮制工艺,并对其进行比较。炮制工艺1: 取2 kg紫锥菊鲜药材,洗净,切段,不经蒸气熏蒸直接晒干后粉碎,按照2. 1. 3 项下进行含量测定。炮制工艺2: 另取2 kg紫锥菊鲜药材,洗净,切段,进行蒸气熏蒸炮制,然后于90 ℃烘干、粉碎,按照2. 1. 3 项下进行含量测定。两种炮制工艺的菊苣酸含量测定结果见表2。

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由表2 可知,通过对紫锥菊鲜药材进行常压蒸制,炮制后其菊苣酸的含量提高了104% 。由此可以得出,采用常压蒸制的炮制方法能很大程度上提高紫锥菊药材中菊苣酸的含量。

2.2.2炮制时间的选择

取紫锥菊鲜药材,洗净,切段,为了确定最佳的蒸制时间,选择蒸制5,10,15,20,25,30 min,样品量为2 kg / 批,蒸制后的样品烘干,粉碎,按照2. 1. 3 项下进行含量测定。不同蒸制时间对菊苣酸含量的影响见表3。

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由表3 可知,蒸制20 min药材中菊苣酸的含量最高,因此结合本试验结果选择紫锥菊常压蒸制时间为20 min。

2.2.3烘干温度的选择

对蒸制后的药材进行烘干温度考察,分别设定烘干温度为60,70,80,90,100 ℃ ,烘干后粉碎进行含量测定,结果见表4。

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由表4 可知,烘干温度为90 ℃ 时菊苣酸含量最高,因此试验选择紫锥菊烘干温度为90 ℃。

2.2.4验证试验

取紫锥菊鲜药材,洗净,切段,样品量为2 kg /批,各取3 批次蒸制20 min,90 ℃ 烘干,粉碎,按照2. 1. 3 项下进行含量测定,结果见表5。

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由表5 可知: 菊苣酸含量较高且数值均匀,说明最佳蒸制工艺稳定可行。

3 小结与讨论

由以上试验结果可以看出,通过对紫锥菊鲜药材进行常压蒸制,紫锥菊药材中菊苣酸的含量比不经过蒸制直接晒干时提高了104% ,很大程度上提高了紫锥菊药材中菊苣酸的含量。因此,对紫锥菊鲜药材采用常压蒸制的炮制方法是有必要的。分析原因可能是在紫锥菊鲜品的蒸制炮制工艺中,蒸制时间对紫锥菊中菊苣酸的含量影响较大,这正与紫锥菊中存在的多酚氧化酶有关,多酚氧化酶能很快地降解菊苣酸,从而使其含量降低。60 ~ 90 ℃ 时,多酚氧化酶在十几分钟到几分钟之内即失活,从而丧失了降解紫锥菊药材中菊苣酸的能力。因此,本试验采用蒸制炮制工艺对紫锥菊鲜药材进行炮制加工,利用蒸气超强的穿透性使其快速渗透到紫锥菊药材中,从而使多酚氧化酶尽快失活,达到保护紫锥菊药材中菊苣酸的目的。本试验结果表明,采用常压蒸制的炮制方法能提高紫锥菊新鲜药材中菊苣酸的含量,有利于提高紫锥菊药材的品质,为紫锥菊药材的开发利用提供依据。

摘要：为了研究紫锥菊鲜药材的炮制工艺,使鲜药材最大程度地保留其有效成分,经长期摸索研究,试验采用常压蒸制法对紫锥菊鲜药材进行炮制处理,以菊苣酸含量为考察指标,通过对不同蒸制时间、烘干温度等因素的比较,确定紫锥菊鲜药材的最佳炮制工艺。结果表明:紫锥菊鲜药材洗净、切段后常压蒸制20 min及90℃烘干,与直接晒干相比,菊苣酸的含量提高了104%。说明该炮制方法适用于紫锥菊鲜药材。

关键词：紫锥菊,炮制工艺,常压蒸制法,菊苣酸,蒸制时间,烘干温度

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紫锥菊多糖论文 篇3

1 材料

1.1 鸡胚

SPF种蛋, 购自中国兽药监察所, 由天津生机集团股份有限公司实验室自行孵化至9～10 日龄, 备用。

1.2 病毒

鸡新城疫病毒标准毒株F48E9, 购自中国兽药监察所, 鸡胚尿囊液病毒的HA效价为9 lb。

1.3 药品

采用水提醇沉法[6], 将紫锥菊提取物制成含生药2 g/mL的浓度, 由天津生机集团股份有限公司技术部研制。盐酸金刚烷胺由江苏倍康药业公司提供, 配成0.2 mg/mL 备用。

1.4 鸡红细胞悬液

参照《动物病毒学》中红细胞悬液的制备方法, 配成体积分数为0.8%的红细胞悬液, 现配现用。

2 方法

2.1 NDV的传代

将新城疫标准毒株F48E9按常规方法接种传代。

2.2 半数致死量 (EID50) 的测定

将新城疫病毒尿囊液稀释成不同倍数, 接种非免疫鸡胚得出鸡胚半数致死量。经测定, 鸡胚病毒尿囊液半数致死量的稀释度为1∶10 000, 正式试验时接种稀释度为1∶5 000的尿囊液。

2.3 药物毒性试验

用生理盐水对紫锥菊提取物进行倍比稀释, 再将原药液及不同浓度的药液分别接种到5 枚10 日龄鸡胚的尿囊腔中, 0.2 mL/胚, 置37 ℃恒温箱孵育72 h, 每天观察存活情况, 将鸡胚全部存活的最高药物浓度作为正式试验的起始浓度。

2.4 试验分组

将64 枚10 日龄鸡胚随机分为4 组:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组接种稀释浓度为1∶5 000的尿囊液, 每枚鸡胚接种0.1 mL。取紫锥菊提取物 (2 g/mL) 、盐酸金刚烷胺 (0.2 mg/mL) 、生理盐水各0.2 mL以及病毒稀释液0.1 mL, 接种鸡胚;第Ⅳ组 (空白对照组) 不接种鸡胚尿囊液, 不给药。具体分组情况及处理方法见表1。

2.5 紫锥菊提取物对鸡新城疫病毒增殖的抑制作用

将64枚鸡胚在37 ℃恒温箱中孵育, 每天照蛋2～3 次, 弃去24 h内死胚。收取72 h内活胚和24～72 h死胚尿囊液, 4 ℃保存, 备用。以血凝抑制试验检测每组鸡胚尿囊液的病毒效价。

3 结果与分析

3.1 NDV在鸡胚上的半数致死量的测定结果

NDV在鸡胚上的EID50为8.64/0.2 mL。

3.2 药物毒性试验

经过3次重复试验, 紫锥菊提取物及其不同稀释度均对鸡胚无明显致死作用, 其存活情况见表2。故将原液浓度作为正式试验的起始浓度。

3.3 紫锥菊提取物对鸡新城疫病毒增殖的抑制作用

第Ⅰ组鸡胚在24～72 h死亡6 枚, 72 h内存活10 枚, 收集6 枚死亡鸡胚与10枚存活鸡胚的尿囊液, HA效价为0;第Ⅱ组鸡胚在24 h内死亡2 枚 (弃去) , 24～72 h死亡8 枚, 72 h内存活6 枚, 收集8 枚死胚与6 枚活胚的尿囊液, HA效价为3 lb;第Ⅲ组鸡胚在24 h内死亡3 枚 (弃去) , 24～72 h死亡13 枚, 收集13 枚尿囊液, HA效价为8 lb;第Ⅳ组在72 h内无鸡胚死亡, 收集所有活胚尿囊液, HA效价为0。结果见表3。

注:分母为接种胚数, 分子为存活胚数。

注:与第Ⅲ组相比, **表示差异极显著 (P<0.01) 。

4 讨论

鸡新城疫是由鸡新城疫病毒感染引起的传染病, 由于疫苗的广泛应用, 该病的特点多为慢性或散发, 目前还无有效疗法。用中药治疗畜禽病毒性传染病, 已有很多成功经验。因此, 从中草药中筛选抗病毒药并探讨其机理具有重要的理论和实际意义。在兽医临床免疫方面关于紫锥菊的报道较少, 试验进行了紫锥菊提取物对新城疫病毒的血凝抑制试验, 为临床治疗鸡新城疫提供了理论依据。

紫锥菊含有羟基酰胺、多糖、倍半萜、多炔类、咖啡酸衍生物、黄酮等多种活性成分, 对免疫功能有促进作用。从此次试验结果看, 紫锥菊提取物能明显抑制鸡新城疫病毒的增殖, 降低鸡胚病死率, 且效果明显高于盐酸金刚烷胺。此外, 试验还对紫锥菊提取物在鸡胚内抗鸡新城疫病毒的效果进行了观察, 但临床应用效果如何以及作用机理还有待进一步探讨。

参考文献

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