藤梨根多糖论文（共4篇）
藤梨根多糖论文 篇1
藤梨根是猕猴桃科植物的根部,研究发现其对肿瘤有一定的抑制作用[1,2,3]。进一步的研究发现,其的主要成分之一藤梨根多糖是一种有效的免疫调节剂,在抗肿瘤、自由基的清除以及抗病毒方面有比较强的作用[4,5,6]。
目前多糖提取的最常用方法主要有水提取法、酸提法、碱提法等[7]。近些年多采用混合或辅助手段提高提取效率,降低溶剂用量[8]。但水提法往往需要进行高温水煮,时间比较长提取率也不太高,而酸提法和碱提法对糖苷键和糖链具有一定的损伤作用。超声可以有效地破坏细胞结构,促进有效成分释放。超声辅助提取可以减少溶剂用量,并降低提取温度。目前这方面的报导较少,本文就超声提取藤梨根多糖做一些初步的研究。
1材料和仪器
1.1材料
藤梨根: 购自绵阳中药材市场,60 ℃ 干燥至恒重,超微粉碎,过100目药筛,得到藤梨根粉末,置于冰箱 - 20 ℃ 冷冻保藏。其它试剂均为分析纯。
1.2仪器
1997SM - DTD功率可调超声波清洗机,南京舜玛仪器设备有限公司; WFZ UV - 2000型紫外分光光度计,上海合利仪器有限公司。
2方法
2.1样品预处理
取干燥好的粉末250 g,置于2000 m L大烧杯中,加入三倍体积的95% 乙醇,在超声功率60 W下处理脱脂2 h,收集残渣,加入一倍体积的95% 乙醇超声脱脂2 h。乙醇提取液用旋转蒸发仪回收乙醇,离心后残渣放置于95 ℃ 下鼓风干燥2. 5 h, 得干燥粉末,装入干燥的容器中备用。
2.2多糖提取
将已经烘干的粉末,分成9份,每份25 g,置于500 m L烧杯中,编号为1 ~ 9号。按照相应的实验条件放入超声仪里提取,分两次提取,第一次加入300 m L水,第二次加入100 m L水。提取结束后,4000 r/min离心2 min收集上清液,弃去沉淀。收集上清液后,置于500 m L烧杯中,加热浓缩至100 m L。 取浓缩液50 m L,按照正交实验,相应的加入不同体积的乙醇。出现白色浑浊沉淀,静置24 h,取出静置24 h后的浑浊液, 5000 r / min离心4 min,收集沉淀,冷冻干燥,得到的藤梨根粗多糖。
2.3葡萄糖标准曲线的制定
精密移取0. 1 mg/m L的葡萄糖 标准液0. 0 m L 0. 1 m L 0. 2 m L 0. 3 m L 0. 4 m L 0. 5 m L 0. 6m L于25 m L具塞试管中,编号1 ~ 7,加蒸馏水至2 m L,再加6% α - 萘酚溶液1 m L,摇匀,迅速加入5 m L浓硫酸,震荡后静置10 min,沸水浴20 min。取出冷却至室温后,置比色皿中,在490 nm处测定吸光度,试剂为空白参比。
2.4样品含量测定
待测藤梨根粗多糖粉末用蒸馏水稀释到一定浓度后,分别取供试品溶液0. 5 m L,加蒸馏水至2 m L,再精密移取1 m L 0. 5% α - 萘酚溶液,分别加入试管,震荡,迅速加入5 m L浓硫酸,震荡后静置10 min,沸水浴20 min,取出冷却至室温, 置比色皿中,490 nm下测定吸光度,对照管,不加供试品。测定吸光度后,通过标准曲线上查算得藤梨根多糖浓度,并进一步计算出样品中的藤梨根多糖的含量,并计算提取率。
参照前期的工作以及相关文献[9,10,11],发现提取时间,提取超声功率,沉淀乙醇比例对提取率有较大影响,因此确定提取时间,超声功率,沉淀乙醇比例三个因素来进行正交实验,参看表1。
3结果分析
3.1标准曲线测定结果
从图1中可以看出,回归方程为C = 0. 0657A + 0. 0009,而且R2= 0. 9991,这表明实验所作的标准曲线的线性关系非常好,而且标准品的分光光度值均匀分布在0. 1 ~ 0. 8之间,所有这些结果表明,所作的标准曲线可以用来对实验中所得的藤梨根多糖含量进行定量测定。
3.2正交实验结果
由表2中的R值,可以发现藤梨根粗多糖提取工艺的影响因素的主次关系为A > B > C,也就是说,超声的时间对藤梨根粗多糖提取率的影响最大,基次是超声功率,乙醇比例影响最小。从k值大小可知,最优工艺组合是A3B1C3。即正交实验的第7组实验,其次提取率为7. 7% 。因此藤梨根粗多糖的最佳提取工艺为: 超声时间为3 h,超声功率为120 W,沉淀时乙醇的体积比为5∶1。
3.3验证实验
通过正交实验结果分析,确定藤梨根粗多糖提取工艺的最优条件为: 超声时间为3 h,超声功率为120 W,沉淀时乙醇的体积比为5∶1。按照所得的最优工艺条件,做重复实验3次, 得到的提取率分别为7. 59% 、7. 75% 、7. 68% ,提取率平均值为7. 67% ,RSD为1. 04% 。三次实验的提取率都比较高,而且提取率非常接近,这表明正交实验所得到的最佳提取工艺非常稳定,重现性好,而且提取率较高。
4结论
采用超声辅助提取藤梨根粗多糖的最佳工艺条件为: 超声时间为3 h,超声功率为120 W,沉淀时乙醇的体积比为5∶1。 在此条件下其次提取率为7. 7% 。本文中所用的小型可调功率超声仪的功率非常低,所需的能耗要求也比较低,这为藤梨根粗多糖产业化应用提供了一个新的思路,也为藤梨根的综合开发提供了较好的前景。
藤梨根多糖论文 篇2
1 材 料
日立UV3010分光光度计,日本日立公司;十万分之一电子分析天平,梅特勒公司;501型超级恒温水浴器,上海实验仪器厂。葡萄糖,天津市广成化学试剂有限公司(批号:200508218);所用试剂均为分析纯。藤梨根药材购自于济南建联中药店,经山东中医药大学中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为猕猴桃科软枣猕猴桃Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch的根。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制
精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖0.051 g,加水溶解并定容250 mL量瓶中,制成每毫升含0.204 mg的溶液,作为对照品溶液。分别精密吸取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL至25 mL试管中,分别加水至3 mL,加入6%的苯酚溶液1mL,摇匀,再加入浓硫酸5 mL,振摇,静置10 min,摇匀,室温放置20 min后于紫外可见分光光度计490 nm波长处测其吸收度,以水为空白,同样显色操作制备空白对照。以葡萄糖毫克数为横坐标,以吸收度为纵坐标,得回归方程 Y =3.1887X-0.0102,r=0.9982。葡萄糖在0.0816～0.2448 mg范围内与吸收度呈良好线性关系。
2.2 总多糖提取工艺的正交试验优化
采用正交试验对藤梨根中总多糖的水提取工艺进行优化,选择L9(34)正交实验设计对影响提取效率的加液量、浸泡时间、提取时间、提取次数等因素进行考察。实验设计表见表1。
称取藤梨根30 g,按L9(34)试验列号各条件提取,滤过,合并各提取液,定容至1000 mL,作为样品溶液。
(1)供试品溶液的制备
分别精密量取样品溶液各10 mL,加乙醇使含醇量达85%,静置,滤过,滤渣分别用无水乙醇,丙酮洗涤,干燥,加水溶解并定容至25 mL,作为供试品溶液。
(2)总固体得率测定:
分别精密量取样品液各100 mL,置干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,置烘箱中105 ℃烘5 h,移至干燥器中,冷却30 min,精密称定重量,再在105 ℃干燥1 h,冷却,称重,至恒重,计算总固体得率。结果见表2,方差分析结果见表3。
(3)总多糖含量测定
精密量取各供试品溶液1 mL,置25 mL 试管中,照2.1项下方法依法测定吸收度,计算总多糖含量。结果见表2,方差分析结果见表3。
由极差分析结果可以看出,各因素对提取效率影响的大小顺序为D>C>A>B,较优的提取工艺为A2B3C2D3, 因素B各水平相差无几,由方差分析结果可知因素B对提取效果的影响没有显著性影响,故确定采用一水平。进一步通过验证试验考察工艺的可行性。
注:综合评分=(总固体得率/最大总固体得率)×2+(总多糖得率/最大总多糖得率)×8
注:F0.05(2,2)=19;F0.01(2,2)=99。
2.3 验证实验
按藤梨根30 g,置圆底烧瓶中,加水8倍量,回流提取3次,每次1 h,滤过,滤液定容至1000 mL,作为样品溶液。精密量取样品溶液,依次按2.2.2项下,2.1项下方法操作,测定总固体得率和总多糖的含量。测定结果为总固体得率为22.53%,总多糖含量为2.881%。最终确定藤梨根水提取工艺为A2B1C2D3 ,即加水8倍量,回流提取3次,每次1 h。
3 结 语
总多糖含量测定的方法主要有硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法,本实验通过对两种含量测定方法的方法学考察发现硫酸-苯酚法的稳定性、重现性较硫酸-蒽酮法要好。故采用硫酸-苯酚法对藤梨根中总多糖的含量进行测定。
目前研究表明,藤梨根提取液具有明显的抗肿瘤活性[4],其主要的有效成分除了多糖类成分外,还含有黄酮类成分、生物碱类成分及三萜酸类成分。对于其有效成分的明确还有待进一步研究。
参考文献
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[3]吴瑾瑾,叶丽美,邬云霞,等.猕猴桃根多糖的提取工艺研究[J].中华中医药学刊,2012,30(2):301-303.
藤梨根多糖论文 篇3
关键词：藤梨根,人胃癌BGC细胞,Bax蛋白
胃癌是我国最常见的肿瘤之一, 其死亡人数在我国居恶性肿瘤的首位[1]。藤梨根为猕猴桃科 (Actinidiaceae) 猕猴桃属 (Actinidialindi) 软枣猕猴桃 (Actinidiaarguta (Sieb.et Zucc.) Planch的根[2]。现代药理研究表明:藤梨根具有抗肿瘤、调节免疫等作用, 可用于治疗消化系统癌症等症[3,4]。本实验采用藤梨根乙酸乙酯提取物, 经初步实验, 对人胃腺癌SGC-7901细胞有较好的抗瘤效果。为了进一步验证藤梨根提取物的抗胃癌效果, 本实验研究藤梨根提取物对人胃癌BGC-823细胞凋亡及其部分作用机制, 为临床应用研究提供相关实验依据。
1材料
人胃癌BGC-823细胞株 (陕西中医学院病理学实验室) , RPMI 1640培养基 (购自GIBCO公司) , 小牛血清 (Hyclone公司) , Bax一抗 (北京中杉金桥生物技术有限公司提供) , SABC试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司提供) , DAB试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司提供) 。Ep-ics XL流式细胞仪 (美国Beckmon-Coulter公司) 。荧光酶标仪 (TECAN公司) , 低温高速离心机 (TGL-16G型上海医用分析仪器厂) 。
2 方法
2.1 细胞培养
胃癌细胞株BGC-823培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液, 置37℃、5%CO2培养箱中培养, 每天换液。待细胞生长密度80%以上时, 以0.25%胰蛋白酶消化, 传代。
2.2 MTT法检测细胞增殖水平
取对数增长的BGC-823细胞制成1×105个/mL的细胞悬液, 每孔加入150μL, 给不同浓度 (8, 16, 32mg/mL) 的药物30μL/孔, 每个浓度重复3个孔, 置CO2培养箱内培养, 分别在24h、48h、72h测一次指标, 检测前4h加入5mg/mL MTT贮存液25μL/孔, 于37℃、5%CO2培养箱中孵育。用自动酶标读数仪在570nm波长处测定每孔吸光度 (A) 值。计算细胞生长抑制率 (GI) , GI= (1-实验组A值/对照组A值) ×100%。重复实验5次。
2.3 流式细胞术检测细胞凋亡水平
取6孔板, 接种培养细胞, 置37℃、5%CO2温箱培养, 培养至细胞生长密度为80%以上, 加无血清培养基, 置37℃、5%CO2温箱继续培养24h, 加入药物, 使各组藤梨根提取物的浓度为0、16、32mg/mL。置37℃、5%CO2温箱继续培养24h。PBS液洗涤, 调整细胞浓度约为1×105个/mL。每个浓度药物各取1mL细胞置于EP管中, 每管1mL细胞, 离心5min, 弃上清液, 每管加入1mL PBS, 使细胞悬浮, 离心5min, 弃上清液;重复步骤, PBS弃净, 将细胞重悬于200μL Buffer, 每管加入10μL Annexin V-FITC混匀, 避光反应15min, 每管加入300μL Buffer。上机前5min加入10μL碘化乙啶 (PI) 染色, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。
2.4 Bax蛋白表达水平检测
将对数生长期BGC-823细胞接种于12孔板内, 按组加入相应浓度的药物24h后取出, 按照试剂盒使用说明检测Bax蛋白表达水平。
3 结果
MTT法检测细胞增殖的影响。不同浓度的藤梨根提取物作用于人胃癌BGC-823细胞12h后, 对细胞增殖均有不同程度抑制。MTT法检测结果显示, 当藤梨根提取物浓度为8mg/mL时, 对胃癌细胞增殖的抑制率为20.95%;浓度为16mg/mL, 对胃癌细胞增殖的抑制率明显增强, 为25.63%;当浓度为32mg/mL时, 对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制率达到53.19%。
对人胃癌BGC-823细胞凋亡水平的影响。本实验设空白对照和3个藤梨根提取物组, 结果表明, 藤梨根提取物浓度在16mg/mL、32mg/mL时能够显著诱导胃癌细胞的凋亡。浓度为16mg/mL时, 凋亡细胞最多, 浓度为32mg/mL时, 死亡细胞迅速增多。见表1。
16mg/mL藤梨根提取物处理12h后, 免疫组化检测胃癌BGC-823细胞Bax的蛋白表达水平, 与对照组相比, 藤梨根提取物预处理可明显增加细胞内Bax蛋白表达水平。见表2。
注:与空白对照组比较, **P<0.01。
注:与阴性对照组比较, **P<0.01。
3 讨论
本实验中, 我们通过免疫组化的方法证实了藤梨根预处理可以有效增加Bax表达水平, 与此同时降低胃癌SGC-7901细胞中P53和Bcl-2的表达[5,6], 这些结果表明, 藤梨根促进胃癌细胞凋亡的细胞机制可能与Bax、P53和Bcl-2的表达密切相关, 为了进一步探索藤梨根提取物的抗肿瘤作用及其机理, 我们还需进一步研究, 确定其抑制肿瘤生长的有效剂量。本研究的开展有利于指导今后藤梨根的临床用药。
参考文献
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藤梨根多糖论文 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
BALB/c-nu/nu裸鼠24只,鼠龄(51.5±0.5)周,体重21.5~25.5 g,全部雄性。
1.1.2 细胞株
经裸鼠皮下传代至第8代的人胃癌SGC-7901细胞株。
以上两者由浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.1.3 实验用药
复方藤梨根制剂(FFTLG):由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、白术、党参、茯苓、薏苡仁等组成。由浙江省中医院提供。上述药材按比例加水煎煮,并浓缩至0.5、1.0、2.0 g/m L,分装于消毒后的玻璃瓶中,储存于4℃冰箱内备用。裸鼠中药给药剂量按药理学实验动物给药方法马氏定理计算,以成人剂量/体重30.0、15.0、7.5倍灌胃给药。
1.1.4 主要试剂
NF-κB p65鼠抗人免疫组化染色试剂盒(二步法)、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RMPI-1640细胞培养液由浙江大学实验动物中心惠赠。
1.2 方法
1.2.1 人胃癌裸鼠腹腔种植模型的建立
取第8代裸鼠皮下移植瘤,切成小块,与细胞培养液混合,无菌条件下研磨,制成细胞悬液,过200目尼龙丝网,镜下调整浓度至约1×107/m L,抽取细胞悬液注入裸鼠腹腔(0.2 m L/只)。入选裸鼠24只,将其笼于无特定病原的条件下饲养。
1.2.2 实验分组及给药
将造模后裸鼠随机分为4组,6只/组。接种后18 d开始给药,所有裸鼠按照组别不同每天灌服相同体积生理盐水、低、中或高浓度复方藤梨根制剂0.6 m L,连续21 d后停止给药。
1.2.3 观察指标
1.2.3.1 裸鼠肠系膜种植瘤瘤量
末次灌药后50 d应用引颈脱臼法处死裸鼠并解剖腹腔,自根部将肠系膜连同上面的移植瘤一起剪下称重。
1.2.3.2 抑瘤率
抑瘤率(%)=(对照组瘤重-用药组瘤重)/对照组瘤重×100%。
1.2.3.3 免疫组化法测定NF-κB p65基因的表达
将移植瘤常规石蜡包埋,切片,SP法免疫组化染色,采用免疫组化二步法。阳性细胞计数:镜下观察,以细胞核或细胞浆中出现清晰棕黄色颗粒为阳性反应。每张切片选5个高倍视野,计算阳性细胞数占同类细胞的百分比并记录。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件包进行统计。计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验情况
所有入组裸鼠造模成功,腹腔接种胃癌细胞后均有肿瘤生长,接种后13 d可触摸到裸鼠腹腔内出现肿瘤结节,大小不等,进行性增大;19 d始可观察到裸鼠腹围增大。实验过程中,肿瘤持续生长,裸鼠腹围持续增大,生理盐水组增长最快,未出现不生长或肿瘤自发消退现象。
解剖裸鼠肉眼可观察到大多数裸鼠腹腔内有血性腹水生成,量多少不等,横膈、腹膜、肠系膜、肝周、网膜、盆腔等多处见肿瘤结节、肿块,呈灰白色,质地偏硬,与周围组织粘连,部分有坏死,直径从0.1~3.0 cm大小不等。提示移植瘤未被排斥,肿瘤移植成功。见图1、2。
2.2 抑瘤作用
移植瘤重量方面,各组比较结果相同:FFTLG中、高剂量组与生理盐水组比较、FFTLG高剂量组与低剂量组比较,差异均有高度统计学意义(P<0.01);中剂量组与低剂量组比较,差异有统计学意义(P<0.05);FFTLG高剂量组与中剂量组比较、低剂量组与生理盐水组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。NF-κB p65表达量方面,FFTLG高、中剂量组与生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05);FFTLG低剂量组与生理盐水组比较,差异无统计学意义(P>0.05);FFTLG高、中、低剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。NF-κB p65表达结果显示,所有切片镜下均可见细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒,多少不等。见图3、4。
注:与生理盐水组比较,★P<0.01,◆P<0.05;与FFTLG低剂量组比较,●P<0.01,▲P<0.05
3 讨论
恶性肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤患者以虚实夹杂、正虚邪实居多,故中医肿瘤治疗大法一般在扶正基础上兼顾攻邪。笔者在本实验中所用的复方藤梨根制剂由浙江省中医院肿瘤科于20世纪70年代形成的“三根糖浆”发展而来,是浙江省中医院肿瘤科临床治疗消化道恶性肿瘤的常用方,由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、党参、茯苓、白术、薏苡仁等组成,其中藤梨根、虎杖根、水杨梅根具有清热解毒作用,虎杖根、水杨梅根兼具活血化瘀作用,党参、茯苓、白术具有补气健脾作用,薏苡仁具有健脾、利水渗湿作用。诸药合用,共奏清热解毒、活血化瘀、补气健脾等功效。从药理成分分析,藤梨根含有猕猴桃碱、熊果酸等,虎杖根含有白藜芦醇等成分,水杨梅根含有水杨梅甲素及生物碱等化合物,均为有效的抗癌成分;薏苡仁的主要成分为薏苡仁油、薏苡仁酯、甾醇、氨基酸等,对癌细胞有抑制作用。益气健脾药党参、白术、茯苓有增强宿主免疫功能的作用[3,4,5],可全面调节身体内环境的平衡,重建机体抗癌能力。
本实验中测定移植瘤瘤重及抑瘤率结果显示,FFTLG高剂量组瘤重最小,抑瘤率最高,FFTLG中、低剂量组效果相对较差,生理盐水组瘤重最大,FFTLG低剂量组与生理盐水组比较无统计学意义(P>0.05),提示FFTLG制剂可抑制胃癌腹腔种植瘤生长,呈剂量相关性。
NF-κB是一种转录因子,对肿瘤的发生、发展过程起重要作用,NF-κB p65是NF-κB的活化成分。近些年,以Van[6]和Karin[7]为代表的很多研究证实了NF-κB所调控的基因在癌细胞增殖、浸润、新生血管形成、耐药、转移等多个方面都起到了重要的作用。在胃癌细胞和组织中表达激活与胃癌的形成、发展、浸润转移密切相关,并在某种程度上决定着患者的预后[8,9]。
就腹腔瘤组织NF-κB p65的表达而言,本次实验中FFTLG高、中剂量组与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05);FFTLG低剂量组与生理盐水组比较,FFTLG高、中、低剂量组之间比较均无统计学意义(P>0.05)。分析认为,FFTLG制剂可抑制荷瘤裸鼠肿瘤组织NF-κB p65的表达,且随剂量增大而作用增强,FFTLG高、中剂量组效果显著。提示FFTLG制剂可降低胃癌裸鼠腹腔种植瘤组织NF-κB p65的表达且呈剂量相关,其抑制SGC-7901人胃癌细胞腹腔转移的途径之一可能是通过下调NF-κB p65的表达。
摘要：目的 研究复方藤梨根制剂(FFTLG)对人胃癌裸鼠腹腔移植瘤的抑制效应及其与瘤组织核转录因子(NF-κBp65)表达的关系。方法 建立人胃癌裸鼠腹腔移植模型。24只裸鼠随机分为4组:FFTLG高、中、低剂量组和生理盐水组,分别观察荷瘤裸鼠腹腔移植瘤的生长情况,检测NF-κB p65的表达。结果 生理盐水组、FFTLG低、中、高剂量组的抑瘤率分别为0、7.8%、30.0%和33.3%,FFTLG各组与生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);腹腔瘤组织中NF-κB p65阳性表达细胞百分比分别为(39.67±19.82)%、(33.00±19.94)%、(29.20±17.68)%、(27.17±15.75)%。FFTLG组的中、高剂量组与生理盐水组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 FFTLG对裸鼠腹腔移植瘤生长具有抑制作用,且随着剂量的增加其作用增强,其作用途径之一可能是通过下调NF-κB p65的表达。
关键词：复方藤梨根制剂,胃肿瘤,移植瘤,裸鼠,核转录因子
参考文献
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