酶水解法论文

酶水解法论文（共5篇）

酶水解法论文 篇1

中国是世界文明的养蚕大国, 蚕蛹是蚕丝工业的大宗副产品, 含有丰富的蛋白质、脂肪、氨基酸等营养物质, 其中蛋白质含量高达50%, 蚕蛹蛋白质降解后生成的氨基酸种类齐全, 必需氨基酸的比例接近于WHO/FAO制定的理想蛋白质组成的模谱, 是优质蛋白质及氨基酸来源, 有着广阔的开发利用价值。湖南洞庭湖地区自古以来蚕业发达, 蚕蛹资源丰富。但数千年来人们基本上只是以缫丝制绸为目的, 蚕蛹作为丝厂缫丝后的下脚料, 目前多用于制作肥料和饲料, 面对如此巨大的蚕蛹资源如何进一步加以利用, 变废为宝, 提高蚕业生产效益, 是蚕业界亟待解决的问题。

本文采用中性蛋白酶与碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白制备复合氨基酸, 以水解液中氨基氮总量与总氮的比值为指标, 通过单因子试验和正交试验考察酶解温度、时间、底物浓度及加酶量诸因素对酶解反应的影响, 确定了蚕蛹蛋白单酶水解的最适酶解条件。所制备的氨基酸可望直接应用于食品、医用工业, 为蚕蛹蛋白产业化开发, 解决丝厂副产品出路问题提供了一条崭新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

1.1.1 原料

干桑蚕蛹, 购于湖州宝锌生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

中性蛋白酶:由淀粉液化芽孢杆菌生产。食品级, 主要参数为:活力>100, 000WU/g, 外观为淡黄色粉末状固体 (精制中性蛋白酶的活力以WU来表示, 一个WU指在p H7.5、温度30℃的条件下, 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量) ;碱性蛋白酶:由地衣芽孢杆菌生产。食品级, 主要参数为:酶活力58, 000DU/g, 在p H8.5、温度40℃的条件下, 1ml2%的酶溶液生成0.400消光度差时, 表示酶制剂有1000DU;两种酶均购买于中国无锡杰能科技生物工程有限公司。

本试验使用的其它化学试剂:浓硫酸、Cu SO4、K2SO4、硼沙 (Na2B4O7·10H2O) 等均为分析纯, Na OH溶液 (40%、0.1N) 、0.1N的HCl溶液、2%硼酸溶液、50%乙醇溶液、40%的中性甲醛溶液、混合指示剂 (0.2%溴甲酚绿-乙醇溶液与0.2%甲基红-乙醇溶液按5:1比例混合) 、0.1%百里酚酞乙醇溶液、0.1%中性红。

1.1.3 主要仪器和设备

日立 (Hitachi) 835-50型氨基酸自动分析仪;电热恒温干燥箱, 上海跃进医疗器械厂;LD4-2A型离心机, 北京医用离心机厂;AB204型电子天平, 上海市实验仪器总厂;SHH-W-420恒温振荡水浴箱, 河北省黄骅市渤海电器厂;磁力搅拌器, 法国制造;p H-2型酸度计由上海第二分析仪器厂生产;LNK-801B型远红外消煮炉, 四平市电子仪器厂;改良式凯氏定氮仪, 中草药粉碎机, 电炉;滴定装置, 定量瓶、移液管、三角瓶、烧杯等。

1.2 方法

1.2.1 蚕蛹蛋白质含量的测定

1.2.1. 1 干蚕蛹粉的制备

用中草药粉碎机将干蚕蛹粉碎, 过80目筛, 装入干净的三角瓶备用。

1.2.1. 2 蚕蛹粗蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法[1], 按照GB5009.5-85测定, 将含氮量乘以6.25即为蛋白质的含量。

1.2.2 蚕蛹蛋白酶解的工艺流程

称量干蛹粉样品→按固液比加蒸馏水→搅拌调p H值→封口→巴氏灭菌→蛋白质熟化→冷却至恒温→加酶摇匀→水解→水解液加热灭酶→离心分离→测定上清液氨基氮含量、氨基酸组成。

游离氨基酸分析:采用LC-8800全自动氨基酸分析仪分析, 色谱条件:钠型阳离子交换树脂4.6×60, 流动相为柠檬酸三钠缓冲液;四元梯度洗脱, p H3.2~4.9;检测波长为:510nm, 流速为0.4ml/min, 柱温为50℃;柱的衍生条件为:反应液A:390g茚三酮/L丙二醇甲醚;反应液B:醋酸钠/醋酸:丙二醇甲醚为60:40;反应温度为135℃;流速为0.35 ml/min。

1.2.3 蚕蛹蛋白酶不同条件下的水解

试验

1.2.3. 1 水解温度

取自制干蚕蛹粉6份, 在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃6个水平下进行酶解。底物浓度10%, 即固液比1:9 (每份10g, 加入90ml蒸馏水) ;粗蛹蛋白经过85℃处理20min熟化变性;分别加入中性蛋白酶或碱性蛋白酶, 加酶量为2.0g/100g干基;中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解时, p H值分别恒定为7.0、8.0, 以40%Na OH溶液或1:4盐酸调节, 每隔1小时调1次。酶解6h后, 煮沸5mim, 灭酶并除去未水解的蛋白质, 冷却后用3000r·min-1离心分离5min, 取上清液。沉淀用适量蒸馏水洗涤1次, 合并上清液, 并记录体积。采用甲醛滴定法测定氨基氮含量, 取两次平行实验结果的平均值, 确定最适温度。

1.2.3. 2 水解时间

取自制蛹蛋白粉4份, 每份10g, 分别在50℃进行酶解, 其它处理同上, 到达设定时间后, 取上清液用甲醛滴定法测定其氨基氮含量, 并计算氨基总量/总氮值, 取两次平行实验结果的平均值, 确定最适水解时间。

1.2.3. 3 底物浓度

取自制干蚕蛹粉4g、6g、8g、10g、12g, 分别按4%、6%、8%、10%、12%加入蒸馏水96ml、94ml、92ml、90ml、88ml, 在50℃酶解6h, 其它处理同上, 确定最适酶解底物浓度。

1.2.4 蛋白酶水解蚕蛹蛋白的正交试验设计

本试验采用L16 (45) 表[2]正交设计法, 对水解时间、酶解温度、底物浓度、加酶量 (中性蛋白酶或碱性蛋白酶) 等4个条件进行优化试验, 设计了4因素4水平正交试验, 见表1。

1.2.5 氨基氮含量的测定

采用甲醛法测定水解液中氨基氮的含量。

1.2.6 水解率的计算

水解率= (氨基氮总量/总氮量) ×100%。

氨基氮总量/总氮量= (水解液体积×氨基氮的含量) / (样品重量×总氮含量) 。

1.2.7 氨基酸组成的测定

采用氨基酸自动分析仪测定水解液中游离氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 蚕蛹粗蛋白含量

采用凯氏定氮法测定实验室制备的干蚕蛹粉, 其粗蛋白含量为50.6%。

2.2 蚕蛹蛋白在不同条件下的酶解结果

2.2.1 温度对蚕蛹蛋白酶解结果的影响

从表2可见, 温度对酶水解蚕蛹蛋白的影响十分显著。随着温度不断升高, 氨基氮含量和氨基氮总量/总氮量的值逐渐增大, 中性蛋白酶在酶解温度为60℃、碱性蛋白酶酶解温度为50℃时达到最大值, 其后如温度继续升高反而下降。主要是因为温度升高使酶蛋白变性, 活力减弱, 氨基酸因为发生美拉德反应而损失。因此, 水解蚕蛹蛋白时, 采用中性蛋白酶的最佳酶解温度为60℃, 碱性蛋白酶酶解温度以50℃为宜。

从温度对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图1可见, 碱性蛋白酶的水解高峰要早于中性蛋白酶, 在30℃~60℃条件下, 水解率明显高于中性蛋白酶, 而60℃以上酶基本失活, 水解率下降。

2.2.2 时间对蚕蛹蛋白酶解结果的影响

由表3可看出, 随着水解时间的延长, 蚕蛹蛋白水解液中的氨基氮含量和氨基氮总量/总氮量的值有所增加, 但8h后水解速度增幅下降, 10h与8h比较仅增加0.005、0.006 (中性蛋白酶水解) 及0.004、0.005 (碱性蛋白酶水解) 。说明随着时间延长, 氨基氮含量增加, 酶的活力受到抑制, 水解效率下降。因此, 两种蛋白酶水解时间8h较为适宜。

时间对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图2表明, 碱性蛋白酶氨基氮总量/总氮量的值 (水解率) 增幅大于中性蛋白酶, 延长水解时间可适当提高碱性蛋白酶的水解率。

2.2.3 底物浓度对蚕蛹蛋白酶解结果的影响

由表4可见, 随着底物浓度的增加, 水解液中氨基氮含量不断升高, 氨基氮总量/总氮量的值逐渐下降。底物浓度较低时, 酶与底物形成一对一的络合物酶活力最强, 水解率最高;一旦底物浓度超过酶的“饱和”值, 酶的稳定性下降, 且随着水解产物的增加, 酶活力受到抑制, 故底物浓度不宜太高。而底物浓度太低时, 氨基酸得率少, 水解效率低;适当增加底物浓度可提高氨基氮得率。本试验底物浓度以4%时水解率最高, 12%时其氨基氮含量最大。

由底物浓度对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图3可见, 碱性蛋白酶氨基氮总量/总氮量的值 (水解率) 随着底物浓度的增加降幅小于中性蛋白酶, 表明在同样底物浓度下水解效率要高于中性蛋白酶, 为增加氨基氮得率, 碱性蛋白酶水解时可适当提高底物浓度。

2.3 蚕蛹蛋白酶解条件正交试验优化确定

为了进一步确定中性或碱性蛋白酶单酶水解蚕蛹蛋白的最佳条件, 根据单因素试验结果开展正交试验, 结果见表5。

2.3.1 中性蛋白酶最佳水解条件确定

见表6, 对中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白的氨基氮总量/总氮量的值进行级差分析表明:水解时间 (A) 、酶解温度 (B) 、底物浓度 (C) 、加酶量 (D) 对水解结果的影响, 各因素的主次顺序为C>B>D>A, 即底物浓度>酶解温度>加酶量>水解时间, 底物浓度影响最大, 是重要影响因素, 水解时间影响最小。最佳条件组合为A3B3C1D2或A3B3C1D3, 为降低成本、减少用酶量, 宜选择前者, 即在16个处理中最优处理组合11号。在水解时间8h、酶解温度60℃、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基时, 水解效果最佳, 在此条件下水解率为34%。考虑操作方便及经济实惠, 水解时间控制在6~8h范围便可。

单位:h, ℃, %, g/100ml。

2.3.2 碱性蛋白酶最佳水解条件确定

对碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白正交试验所得氨基氮总量/总氮量的值进行极差分析, 结果见表7, 最优水平组合为A3B3C1D2, 与中性蛋白酶水解条件一致, 在16个处理中最优处理组合为11号。即水解时间8h、酶解温度60℃、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基, 水解率为43%。各因素的主次顺序为C>A>B>D, , 即底物浓度影响最大, 加酶量影响最小, 在生产中原料充裕情况下, 为降低成本, 可适当减少酶的使用量。

2.4 中性蛋白酶最佳水解结果

中性蛋白酶按优化试验条件水解蚕蛹蛋白, 水解液经离心和过滤后, 取上清液用氨基酸分析仪测定其游离氨基酸含量, 结果如表8所示, 水解液中17种氨基酸 (色氨酸未检测) 总含量为91.636mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量0.768~13.701mg/100ml之间, 占氨基酸总量的36.982%。其氨基酸组成均衡, 水解产品可作为食品营养添加剂, 分离提纯后可作为医疗保健用品, 有广阔的应用前景。

注:检测单位为中国农科院热带农业生态研究所重点实验室。

2.5 碱性蛋白酶最佳水解结果

碱性蛋白酶在优化条件组合下水解蚕蛹蛋白, 用氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸含量, 结果如表9所示, 色氨酸未检测, 水解液中含有17种氨基酸, 总含量为120.583mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量在1.380~13.735mg/100ml之间, 占氨基酸总量的33.967%。必需氨基酸的比例接近于WHO/FAO制定的理想蛋白质组成标准, 该法是一种较为理想的蚕蛹蛋白水解方法。

注:检测单位为中国农科院热带农业生态研究所重点实验室。

3 小结

3.1

中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在p H=7时, 最佳酶解条件为:酶解温度60℃、水解时间8h、、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基, 增加底物浓度可提高水解效率, 水解时间不宜太长。

3.2

碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在p H=8时, 最佳酶解条件与中性蛋白酶相近, 延长水解时间, 酌情减少加酶量, 可降低水解成本。

3.3

利用蛋白酶单酶按正交试验优化条件组合水解蚕蛹蛋白, 用氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸含量, 中性蛋白酶及碱性蛋白酶水解液中17种氨基酸 (色氨酸未检测) 总含量为91.636mg/100ml、120.583mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量分别在0.768～13.701mg/100ml、1.380～13.735mg/100ml之间, 分别占氨基酸总量的36.982%、33.967%。

3.4

蛋白酶水解蚕蛹蛋白是开发蚕蛹蛋白资源的有效途经, 且碱性蛋白酶优于中性蛋白酶。据报道, 蚕蛹蛋白质含有18种氨基酸, 组成合理, 比例均衡, 其中必需氨基酸含量之和超过40%, 非常符合FAO/WHO提出的氨基酸模式, 本试验酶解结果与其基本一致。表明酶解蚕蛹蛋白有利于保存其营养成分, 水解产物氨基酸组成合理, 可作为食品营养添加剂或分离提纯后可作为医疗保健用品, 如进一步制成氨基酸衍生物其应用领域将更为广阔。

3.5

本试验水解蚕蛹蛋白所得氨基酸含量偏低, 有待于进一步改进其工艺流程, 以提高蚕蛹蛋白的利用率。

参考文献

[1].徐秀兰主编.生物化学实验与指导[M].北京:中国医药科技出版社, 1994.17～21

[2].王钦德, 杨坚主编.食品试验设计与统计分析[M].北京:中国农业出版社, 2003.506

[3].北京师范大学生物系化学教研室编.基础生物化学实验[M].北京:高等教育出版社, 1990.121～123

酶水解法论文 篇2

在蛋白质水解过程中，蛋白质分子发生很大变化，即可离解的基团（-COOH、NH4+）数目的增多；亲水性及净电荷数的增加；分子内部的疏水性残基暴露；功能性质如溶解性、乳化作用、起泡性、胶凝性及风味等发生变化。蛋白质酶水解物在较大范围的pH、温度、氮浓度和离子强度条件下具有较好的溶解性能。蛋白质酶水解物的乳化性可通过控制水解度得以改善，但高度水解的蛋白质的乳化能力急剧下降，乳化稳定性差。蛋白质酶水解物的粘度和蛋白质比较明显下降，在受热情况下不发生胶凝变性，热稳定性好。但是蛋白质在水解达到一定程度时产生苦味肽。苦味肽都含有一些长链烷基侧链或芳香侧链，疏水性较强，通过控制水解度可以降低苦味肽的产生量。

1、溶解性质

蛋白质酶水解物最重要的性质之一是它在一定的pH、温度、氮浓度和离子强度情况下的溶解性，酶水解提高了高原蛋白质的溶解性。这种溶解性的增加的性质对低过敏性婴儿食品和含水解物营养食品的加工是非常重要的，常用于水果饮料（低pH）的蛋白质强化。富含蛋白水解物的营养食品在加工过程中要经过杀菌处理，这要求蛋白水解物受热不凝集、不沉淀，热稳定性好。同时，蛋白水解物营养食品经常要强化钙铁磷硫等矿质元素，故蛋白水解物应在一定离子强度下保持稳定。

2、乳化性质

蛋白水解物的乳化性质可通过水解度得以改善。许多研究表明，当蛋白质被酶水解后，在一定pH、离子强度和温度的条件下，水解物的分子量是决定乳化能力的主要因素。当水解度较低时，肽的分子量较大，能增加乳化力；但当水解度较高时，分子量的降低使肽分子不能像完整蛋白质分子一样在界面展开和定向，无法减小界面张力，因此乳化能力下降，通常认为具有20个以上氨基酸簇的肽类只有良好的乳化性，而小肽分子的乳化稳定性较差。

3、起泡性质

搅打蛋清蛋白质的水分散系，形成泡沫，卵黏蛋白对泡沫有稳定作用。当卵清蛋白被酶水解后，在水解度较低或中等情况下，蛋清蛋白水解物的起泡性将增加，但随着水解度的进一步升高，起泡性有所降低，且泡沫稳定性下降。

蛋白质酶水解物的消化吸收

甲基对硫磷水解酶纯化与保存 篇3

1 实 验

1.1 菌株、试剂和培养基

菌株:E.coli BL21(DE3)-pET28a-MPH-LC,本实验室构建。

Ni Sepharose,GE Healthcare公司;甲基对硫磷(纯度为99%),由武汉大学合成;BCA蛋白质浓度测定试剂盒,Beyotime 公司;BSA为sigma公司产品;其余试剂均为分析纯。

LB+Kana液体培养基:NaCl 10 g/L ,蛋白胨10 g/L ,酵母膏5 g/L ,硫酸卡那霉素50 μg/L;固体LB+Kana培养基:NaCl 10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,琼脂粉15 g/L,冷却至45 ℃加入50 μg/L硫酸卡那霉素。

1.2 目的蛋白的诱导表达

将保存在-80 ℃甘油管中的菌种放入4 ℃冰箱解冻,然后接种至5 mL 带有抗性的LB液体培养基中,37 ℃、180 r·min-1过夜培养,活化菌种。再将活化的菌种在带有抗性的LB平板上划线,37 ℃恒温培养16 h。挑取平板上的单菌落接种到5 mL新鲜的含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃、180 r·min-1过夜培养,再以1%的比例接种到带有抗性的LB培养基中,37 ℃、180 r·min-1振荡培养2.5 h至对数生长期(OD600≈0.5～0.6),加入终浓度1 mmol·L-1的IPTG ,37 ℃,180 r·min-1诱导表达5 h。

1.3 目的蛋白的收集

将诱导表达后的菌液于冷冻离心机中4 ℃,10000 r·min-1下离心10 min,弃去上清液,收集菌体。用适量含有20 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)重悬沉淀,同样条件下冷冻离心一次,洗涤沉淀除去残余培养基。再用含20 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)重悬沉淀(每500 mL菌液沉淀用40 mL咪唑重悬,依此类推),在冰水浴条件下,用超声波细胞破碎仪破碎30 min,每超声3 s,间隔5 s,功率200 W。将超声破碎后的溶液在4 ℃,10000 r·min-1,冷冻离心30 min,取上清液,将上清液在冰水浴中用0.45 μm滤膜过滤,放于4 ℃冰箱中待过柱纯化。

1.4 目的蛋白的纯化的梯度洗脱条件确定

由于重组蛋白表达中带有6个组氨酸(His),形成特殊的“组氨酸标签”。所以用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化。上柱前先用约5倍柱体积含有20 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)平衡柱子,流速为1 mL·min-1。然后将粗酶液上柱,流速为0.3 mL· min-1,由于6组氨酸与Ni-NTA层析柱上Ni2+特异性结合,使得带有His-Tag的蛋白被吸附在层析柱上,而非特异性结合的蛋白质却随着溶液流走。再用含有20 mmol·L-1咪唑、0.5 mol·L-1 NaCl,20 mM Tris-HCl的缓冲溶液(pH 8.0)平衡柱子。待平衡后用含有150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液将柱子中目的蛋白洗下来,流速为0.4 mL·min-1。使用核酸蛋白检测仪连续检测流动液在280 nm处紫外吸收,发现含150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液可以很好的将目的蛋白清洗下来。根据核酸蛋白检测仪检测蛋白出峰情况收集蛋白进行SDS-PAGE电泳。根据蛋白条带情况,改进使用含40 mmol·L-1,60 mmol·L-1,150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液进行梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1。然后将目的蛋白液放置于20 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)中,在4 ℃条件下透析48 h,每12 h换一次透析液。

1.5 SDS-PAGE电泳检测

将纯化的蛋白样品制样跑蛋白质电泳,分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度7%,染色剂为考马斯亮蓝R250(甲醇45%,乙酸10%)。脱色液为10%甲醇,10%乙酸。

1.6 蛋白质浓度测定

用BSA作为标准蛋白,配置标准曲线,采用BCA法检测蛋白浓度[11]。

1.7 酶活检测

甲基对硫磷水解酶可以催化甲基对硫磷水解产生黄色的对硝基苯酚[12],产物对硝基苯酚在405 nm处有特征吸收峰,根据这一性质,通过酶标仪检测蛋白酶活,检测体系体积200 μL。取若干酶液,2 μL浓度为50 mmol·L-1的甲基对硫磷(溶于甲醇),用50 mmol·L-1 pH 8的Tris-HCl缓冲溶液补充体积到200 μL,加入96孔板中,酶标仪检测反应体系1 min内在405 nm处吸光度变化,消光系数为17700 M-1·cm-1,光程为0.53 cm。

1.8 甲基对硫磷水解酶动力学检测

取不同体积的5 mM甲基对硫磷(溶于甲醇),2 μL浓度为0.05 mg/mL的酶液,以Tris-HCl(50 mM,pH 8.8)补充至终反应体积为200 μL,使甲基对硫磷终浓度梯度为:30.0,40.0,50.0,60.0,70.0 μmol·L-1,室温下反应。用酶标仪测定1 min内OD405值的变化

1.9 蛋白酶冷冻干燥保存

将透析后的酶收集分装到样品瓶中,使用冷冻真空干燥,制成冻干粉,放入-20 ℃冰箱保存。

1.10 冻干粉酶活检测

将制成冻干粉的酶重新溶解后,检测酶活。对比液体酶在放入-20 ℃和4 ℃环境下与冻干粉-20 ℃保存对酶活影响。

2 结果与讨论

2.1 目的蛋白纯化条件确定

1 The purified enzyme; 2 The rest nonsepecfic protein; 3 The crude extract of MPH; 4 Protein Marker

蛋白表达中除了目的蛋白外还有许多杂蛋白,使用Ni-NTA亲和层析分离纯化目的蛋白,是利用目的蛋白上的六组氨酸标签与柱子上的Ni2+有较强的配位作用而被留在柱子上,而杂蛋白因为与Ni螯合层析柱的作用力较弱,无法在柱上保留而随着流动相流走,从而将目的蛋白与杂蛋白分离开,再用高浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下来。但是在蛋白质挂柱过程中还是有一些杂蛋白留在柱子上。如图1所示,目的蛋白分子量为35 kD,从粗酶液和杂蛋白条带来看,目的蛋白得到了很好的表达,而且目的蛋白的挂住效果明显,使用含150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液可以很好的将层析柱中目的蛋白洗下来,但是洗脱下来的蛋白却含有少量的杂蛋白。利用杂蛋白与目的蛋白与Ni柱结合能力的不同,使用梯度洗脱的方法去除杂蛋白。使用60 mmol·L-1,100 mmol·L-1,150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液梯度洗脱条件,SDS-PAGE电泳发现60 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液洗能将杂蛋白全部洗脱下来,却洗不下来目的蛋白,而100 mmol·L-1和150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液均能洗脱部分目的蛋白,这说明100 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液并不能将目标蛋白完全洗下来。经对纯化目的蛋白浓度和纯度的综合考察,将洗脱梯度调整为含40 mmol·L-1,60 mmol·L-1,150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液,纯化蛋白后蛋白质电泳条带如图2,很好的去除了杂蛋白,得到较高浓度的单体目的蛋白。

2.2 梯度洗脱蛋白酶活检测

由表1可知,直接用150 mmol·L-1咪唑的Tris-HCl缓冲溶液洗下来的MPH蛋白因为含有其余杂蛋白而影响酶活性。使用梯度洗脱后酶活性得到了提高,证明这个洗脱条件是很适合MPH纯化的。

2.3 甲基对硫磷水解酶动力学检测

甲基对硫磷水解酶水解不同浓度的甲基对硫磷,反应速度随着底物浓度的变化如图3所示。使用双倒数法作图,求出甲基对硫磷水解酶酶动力学常数Km=54.61 μM, Vmax=0.833 μM·L-1·S-1,Kcat=54.75 S-1。

2.4 酶活稳定性检测

通常的酶制剂都是保存在0～4 ℃,一些较稳定的酶可以直接保存在常温下。对MPH在不同保存条件下的酶活稳定性考察,由图4可知,MPH比较稳定,在4 ℃中24 h酶活变化不大,但是放置3天,酶活下降到75%,放置30天酶活降低到20%。而将液体酶直接放入-20 ℃冷冻保存,酶活性降低较慢。放置一周降低到90%,放置一个月后酶活下降到70%左右。而制成冻干粉后重新溶解,酶活并未发生较大改变。而且冻干粉冷冻保存酶活降低明显较慢,实验室需要较长时间的保存该酶,使用真空冷冻干燥方法将该酶制成冻干粉后放入-20 ℃保存是比较适当的。

3 结 论

MPH可以催化甲基对硫磷水解,并产生有颜色的产物对硝基苯酚,反应迅速灵敏,现象明显。本室基因改造后的重组MPH因带有His-tag,可以使用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化。确定MPH梯度洗脱条件,很好的提高了MPH的纯度和浓度,对该酶后期酶活和动力学检测有着重要意义。同时根据MPH酶活的稳定性,采用真空冷冻干燥方法将酶制成冻干粉后冷冻保藏,这也说明了该酶很可能发展成为一种新的酶制剂。该酶的热稳定性和保存稳定性良好、具有较高的催化能力,MPH催化甲基对硫磷水解产生黄色的对硝基苯酚易于检测,反应灵敏,也将会是一种很好的标记用酶。

摘要：对带有重组表达质粒E.coli菌种进行了扩大培养,在IPTG的诱导下大量表达,获得了C-末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶。经Ni-NTA亲和层析获得了具有较高生物活性的甲基对硫磷水解酶。本文对该酶纯化的梯度洗脱条件和酶动力学进行了考察,并通过环境对酶活性的影响检测,确定了将酶制备成冻干粉,更利于保存。

酶水解法论文 篇4

水解酸化-SBR-接触氧化法处理制药废水

摘要：采用水解酸化-SBR-接触氧化工艺处理制药厂生产过程中产生的.丁提废水和虫草废水,处理水量 m3/d,进水CODCr约4000 mg/L.监测结果表明,处理后BOD5、CODCr和SS的去除率分别为98.5%、93%和80%,出水BOD5、CODCr和SS分别为28.3～30 mg/L、145.6～285.7mg/L和23.6～27.2 mg/L,出水各项指标符合<污水综合排放标准>(GB 8978-)二级标准.实际运行显示,该工艺处理效果稳定,耐冲击负荷性强.作 者：万金保 侯得印 Wan Jin-Bao Hou De-yin 作者单位：南昌大学环境科学与工程学院,南昌,330029期 刊：给水排水 ISTICPKU Journal：WATER & WASTEWATER ENGINEERING年，卷(期)：2006,32(9)分类号：X7关键词：制药废水 水解酸化 SBR 接触氧化

环葡聚糖水解酶的应用研究 篇5

1 材料与仪器

1.1 材料

环葡聚糖水解酶 (本实验室提供) 、可溶性淀粉、环糊精等。

1.2 主要仪器

HX-201恒温循环水槽、高效液相色谱、101-1电热恒温鼓风干燥箱等。

2 实验方法

2.1 生产高麦芽糖浆的工艺流程[2,3,4,5]

原料→调p H为5.5, 温度为90℃→加酶→水解产物→超滤膜→滤液→过树脂柱→交换液→真空浓缩→成品 (高麦芽糖浆)

2.2 酶活力定义

以1 m L酶液在90℃, p H 5.5条件下降解底物, 每分钟产生1μmol的麦芽糖为一个酶活力单位 (U) 。

2.3 葡萄糖、麦芽糖含量的测定[6]

2.4 麦芽糖的定性测定[7]

3 结果与分析

3.1 γ-环糊精生产高麦芽糖浆酶用量对产量的影响

将γ-CD用p H 5.5的醋酸钠缓冲液配制成浓度为1%的溶液, 放置于90℃下保温5min, 添加环葡聚糖水解酶, 用量分别为2、4、6、8 U/mg (γ-环糊精) , 反应10 h, 测定麦芽糖、葡萄糖含量, 结果麦芽糖的含量分别为58.75%, 67.44%, 71.03%, 71.23%;葡萄糖含量分别为0.47%, 0.52%, 0.53%, 0.78%。为了达到酶用量最少、麦芽糖含量较高、葡萄糖含量较低的目的, 选择6 U/mg (γ-环糊精) 作为环葡聚糖水解酶的添加量, 进行高麦芽糖浆的生产。

3.2 γ-CD生产高麦芽糖浆反应时间对产量的影响

取环葡聚糖水解酶用量6 U/mg (γ-环糊精) , 并分别在0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h和10 h, 取样, 测定麦芽糖含量, 结果分别为34.32%, 43.76%, 57.94%, 69.98%, 70.15%, 70.43%, 71.08%。当反应3 h时, 麦芽糖含量已达到69.98%, 已达到高麦芽糖浆的要求。因此, 我们在用环糊精生产高麦芽糖时, 选择3 h作为反应时间。

3.3 淀粉生产高麦芽糖浆酶用量对产量的影响

将可溶性淀粉用p H 5.5的醋酸钠缓冲液配制成浓度为5%的溶液, 放置于90℃下保温5min, 添加环葡聚糖水解酶, 用量分别为10、20、30、40、50、60 U/mg淀粉, 反应20 h, 测得麦芽糖含量。结果麦芽糖含量分别为53.57%, 56.53%, 62.44%, 70.03%, 71.21%, 71.89%;葡萄糖含量分别为0.47%, 0.56%, 0.63%, 0.65%, 0.85%, 0.97%。为了使麦芽糖含量尽量地多生成, 而葡萄糖尽量地少生成, 选择80 U/mg淀粉作为环葡聚糖水解酶的添加量, 进行高麦芽糖浆的生产。

3.4 淀粉生产高麦芽糖浆反应时间对产量的影响

取环葡聚糖水解酶用量80 U/mg淀粉, 并分别在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14h、16 h、18 h和20 h取样, 测定麦芽糖含量, 结果分别为23.48%, 33.84%, 47.27%, 58.70%, 62.35%, 66.10%, 71.19%, 71.22%, 71.28%, 71.40%, 71.47%, 71.60%。按照反应时间短, 麦芽糖产率高的原则, 因此, 我们在用淀粉生产高麦芽糖时选择10 h作为反应时间。

3.5 环葡聚糖水解酶在其他方面的应用

以1%环糊精为原料, 在p H 5.5, 90℃条件下, 保温5 min, 添加用50m M p H7.5 Tris-HCl适当稀释的环葡聚糖水解酶液, 反应10 min、20 min和30 min, 反应液经硅胶板薄层色谱法进行定性测定。结果表明, 水解α-CD的反应液反应显色结果为只生成G6, 同时还有少量α-CD存在;水解β-CD的反应液反应显色结果为仅生成G7, 同时还有少量β-CD存在;水解γ-CD的反应液反应显色结果为仅生成G8, 同时还有少量γ-CD存在;因此, 我们可以利用环葡聚糖水解酶的这一反应特性来生产高纯度的G6、G7和G8。如延长反应时间, 显色结果表明, 还可以生成G1-G8, 利用这一特性, 我们还可以用它来生产低聚麦芽糖或G3等产品。利用它可以降解环糊精为麦芽寡糖这一特性, 我们可以将其加入到食品的面包的原料中, 来改善面包的品质, 延长面包的货架期等。在医药业中, 我们可以利用它降解淀粉或环糊精来生产高麦芽浆, 经分离纯化, 制得超高麦芽糖或无水结晶麦芽糖, 为医用麦芽糖注射剂产品的生产提供原料。

4 结论

以淀粉和环糊精为原料生产高麦芽糖浆, 最终确定其合理工艺参数, 达到了高麦芽糖生产要求。与以往生产高麦芽糖浆不同之处在于, 减少了液化过程, 整个过程只用到一种酶, 只需在加酶前调整一次p H值, 操作更加方便, 而且在较短的时间内即可得到麦芽糖含量很高的产品, 提高了生产效率。随着我们对环葡聚糖水解酶的特性的不断地认识和深入地研究, 它必将为食品、医药、制糖等行业的发展作出更大的贡献。

摘要：以环糊精和淀粉为原料, 采用环葡聚糖水解酶为酶制剂, 进行了高麦芽糖生产的研究。考察了环葡聚糖水解酶加入量及反应时间对高麦芽糖生成的影响。结果表明:在pH5.5, 90℃下, 以1%γ-环糊精为原料, 环葡聚糖水解酶加入量为6U/mg (γ-环糊精) , 反应时间为3h;以5%淀粉为原料, 环葡聚糖水解酶加入量为80U/mg淀粉, 反应时间为10h, 麦芽糖的产量均达到高麦芽糖生产要求。

关键词：环葡聚糖水解酶,环糊精,高麦芽糖浆

参考文献

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