双突变体

双突变体（共7篇）

双突变体 篇1

1、试验材料

本试验所用材料有四种, 分别是拟南芥野生型植株Col、拟南芥野生型植株Ws、拟南芥G蛋白突变体植株gpa1-4、拟南芥ATHK1蛋白突变体植株athk1。其中, gpa1-4和athk1都是T-DNA插入的功能缺失型突变体, 且均为隐性突变, 其野生型分别为Col和Ws。

2、单突变体的鉴定

拟南芥单突变体的鉴定结合了PCR扩增和凝胶电泳检测。PCR扩增过程中所涉及到的基因引物有两种, 一种是基因特异性引物, 本实验所用基因特异性引物包括ATHK1基因引物和GPA1基因引物, 其序列见表1;另一种是T-DNA左端序列引物 (LBb1) , 其序列为5’gcgtggaccgcttgctgcaact 3’。凝胶电泳检测是采用1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定。

鉴定的过程为两次PCR和两次电泳检测。第一次PCR反应所用引物为基因特异性引物, 对野生型和突变体DNA分别进行PCR扩增后电泳检测扩增产物。野生型DNA的PCR扩增产物电泳后可得一条条带, 长度与基因长度一致。突变体DNA的PCR扩增产物电泳后无任何条带。第二次PCR反应所用引物为基因特异性引物加LBb1, 对野生型和突变体DNA分别进行PCR扩增后电泳检测扩增产物。野生型DNA的PCR扩增产物电泳后仍只可得一条条带, 长度与基因长度一致。突变体DNA的PCR扩增产物电泳后可能会出现两种情况, 其一是电泳后只得到一条条带, 且长度小于基因长度, 则说明该突变体是纯合的;其二是电泳后得到两条条带, 一条长度小于基因长度, 另一条长度与基因长度一致, 则说明该突变体是杂合的。

本实验中, 各样品基因组DNA均采用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取得到。athk1和gpa1-4单突变体的鉴定都采用25μl PCR反应体系, 反应条件为:94℃5min, 94℃1min, 退火1min, 72℃2min, 35个循环, 72℃10min。PCR扩增产物的电泳鉴定结果见图1, 说明athk1和gpa1-4单突变体都是纯合的。

(图A为athk1电泳鉴定图。第1和第3泳道样品PCR引物是ATHK1基因特异性引物, 第2和第4泳道样品PCR引物是ATHK1基因特异性引物加LBb1。图B为gpa1-4电泳鉴定图。第1和第3泳道样品PCR引物是GPA1基因特异性引物, 第2和第4泳道样品PCR引物是GPA1基因特异性引物加LBb1。)

3、双突变体的鉴定

3.1 杂交野生型的鉴定

由于athk1突变体的野生型为Ws生态型, gpa1-4突变体的野生型为Col生态型, 在杂交F2代中选择纯合的Ws与Col的杂交体作为本实验的野生型 (WT) 。

3.2 纯合双突变体的鉴定

纯合的双突变体是在杂交F2代中进行鉴定的。从理论上讲, F2代中出现纯合双突变体的几率是1/16, 为了达到95%的得到该基因型的可能性, 实际鉴定的样品量应为预测量的3倍, 即必须鉴定至少48个样品。

双突变体的鉴定本质上就是利用两种不同的基因特异性引物对同一个样品DNA进行两次单突变体鉴定, 能同时满足两个纯合的单突变体鉴定条件的样品就是纯合的双突变体。

具体实验过程中, 在鉴定athk1gpa1-4双突变体的同时鉴定得到了所需的杂交野生型WT (图2) 。

(图Ⅰ各泳道PCR引物为ATHK1基因特异性引物, 图Ⅱ各泳道PCR引物为ATHK1基因上游引物加LBb1, 图Ⅲ各泳道PCR引物为GPA1基因特异性引物, 图Ⅳ各泳道PCR引物为GPA1基因上游引物加LBb1。第1泳道为杂交野生型, 第4泳道为为纯合的双突变体。)

摘要：双突变体在研究信号转导和代谢途径的过程中是一项极为有用的工具。本文以两种具有不同生态型的拟南芥单突变体为材料, 介绍了拟南芥单突变体与双突变体的鉴定方法。

关键词：拟南芥,双突变体,鉴定

参考文献

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水稻叶色突变体基因定位研究进展 篇2

叶色突变体是指水稻叶片表型颜色发生了变异, 通常认为是由于叶绿体发育异常或者是叶绿素合成和降解过程发生变异所引起。自1965年日本学者Sekiguchi发现了第一个自然突变的水稻斑点叶突变体sl以来[2], 随着分子生物学的快速发展, 叶色突变体的利用价值越来越受到研究者的广泛关注。目前有关水稻叶色突变体的研究已屡见不鲜, 研究者利用叶色突变体来研究叶片的光合作用机制、叶绿体的发育和遗传调控机理以及叶绿素生物合成和代谢途径, 并发掘和克隆许多新的控制水稻叶色突变的相关基因, 为了解水稻光合系统遗传调控机理, 开展水稻高光效育种提供了理论基础[3,4,5]。该文综述了近年来水稻叶色突变体的分类、来源、遗传机理以及基因定位克隆进展, 并根据当前的研究结果总结了水稻叶色突变的分子调控机制, 以期为今后深入开展水稻叶色突变体的研究和利用提供参考。

1 水稻叶色突变体的表型分类及来源

1.1 水稻叶色突变体的表型分类

叶色突变体其叶片颜色表现为不正常的绿色, 主要表型为叶色变异, 是一种极为常见的突变体。通常田间叶色突变多发生在苗期, 分蘖盛期以前 (见图1) , 随着生育进程的发展, 也有部分突变体是在生育中期表现出不正常叶色, 但后期又逐渐恢复正常。

根据苗期叶色的不同表现, 可以将叶色突变体分为5种常见的类型, 即白化、黄化、浅绿、条纹和斑点[6]。然而不同研究者的研究目的和划分标准不同, 其划分结果又略有不同。Awan等[7]根据叶片叶色表型将水稻叶色突变体划分为黄化、黄绿、绿黄、浅绿、绿白、白化、白翠和条纹8种类型。Kusumi等[8]基于光对水稻突变体的发育调控的影响, 将叶色突变体分为2类, 即光诱导型和非光诱导型。Falbel等[9]则根据叶绿色变异的生理机制将水稻叶色突变体分为缺总叶绿素型、总叶绿素增加型、缺叶绿素a型以及缺叶绿素b型4种类型。随着叶色突变体来源和种类的增多, 许多新的叶色突变体逐渐被人们发现, 根据苗期突变体的叶色变异来初步确定突变体的类型依旧是直观、简单、行之有效的方法。

1.2 叶色突变体的来源

突变体是功能基因组学研究的重要资源, 对遗传学家来说具有重要的理论意义和研究价值。通常, 突变体主要有两种来源, 即自然突变和人工诱变。

自然突变是指在自然条件下产生的突变体, 不需要复杂的人为因素诱导, 一般突变概率比较低。近年来, 有关叶色自然突变体的研究常有报道, 张毅等[10]从籼稻G46B与意大利粳稻Sirio杂交后代中发现了白化转绿突变体gra。刘胜等[11]从粳稻品种Asominori组培后代中获得一个稳定遗传的黄绿相间叶色突变体 (Zebra leaf, zl2) 。李育红等[12]在水稻品种淮稻7号中发现了一个自然突变材料, 且突变性状经多代自交后依旧稳定遗传。

人工诱变是指新种质创造的主要手段, 主要是通过物理因素和化学因素诱导生物体遗传性状发生变异, 其中物理诱变因素包括离子流、电子束以及粒子射线等;化学诱变由于所使用诱变剂的不同分为多种, 目前应用较多且效果较好的化学试剂包括烷化剂和叠氮化物两类[13], 其中前者包括甲基磺酸乙脂 (EMS) 、乙基磺酸乙脂 (EES) 以及甲基磺酸丙脂 (PMS) 等, 后者包括叠氮化钠 (NaN3) 等。同时还有一些简单有机类化合物和生物碱等也可以起到良好的诱变作用。近年来, 随着分子生物技术的快速发展以及对DNA结构的深入认识, 通过基因操作技术诱发的突变也丰富了人工诱变途径, 如插入/缺失突变、基因沉默技术等为新的突变体材料的获得提供了保障。

2 水稻叶色突变体遗传规律及基因定位进展

2.1 水稻叶色突变体遗传规律

水稻叶色变异突变体的种类繁多且表型各异。不同突变体材料的遗传机理也存在极大差异, 它们有可能是受细胞核基因控制, 也有可能受细胞质基因控制。对叶色突变体进行遗传分析, 通常是利用突变体与野生型进行杂交 (正交和反交) , 并对杂交后代的F1和F2表型进行鉴定, 从而确定叶色突变体的遗传方式。目前为止, 已报道的水稻叶色突变体大多受隐性单核基因控制[14,15,16,17,18,19], 而由显性单核基因或多基因控制以及细胞质基因调控的叶色突变体报道相对较少[20,21,22]。

2.2 叶色基因定位和克隆进展

叶色突变体是一类较常见的变异性状, 且变异类型较多。迄今为止, 国内外有关叶色突变体的研究很多, 据不完全统计, 在GRAMENE (http//:www.gramene.org) 网站上已公布的与水稻叶绿素含量相关基因超过130个, 它们广泛分布在第1~11号染色体上 (见表1) , 这些基因的定位和克隆为深入阐释叶绿体功能分析奠定基础。

注:数据来源于http://www.gramene.org。Note:The datas come from http://www.gramene.org.

3 叶色突变体的分子机理

叶色突变涉及到叶绿素的合成与代谢, 受生理和遗传两方面因素共同影响, 其调控机理较为复杂。通常认为, 叶色突变表型变异是由相关基因发生变异所决定, 突变体相关基因的变异使光合色素代谢系统中相关酶的活性发生改变、叶绿体发育受阻以及相关基因的表达水平发生变化, 从而致使突变体光合色素形成受阻或降解缓慢, 最终导致叶色变异。根据目前有关水稻叶色突变的研究结果, 总结了叶色突变的发生机制及调控途径。

3.1 叶绿素合成途径与分解代谢途径受阻

高等植物叶绿素的合成是一个十分复杂的过程。对禾本科作物水稻而言, 其叶绿素合成与叶绿体发育相关代谢途径已基本明确[23,24,25], 参与这些代谢途径中任何一个酶基因发生突变都会导致叶色改变。目前, 已知的叶色突变大多属于叶绿素合成途径受阻突变, 只有少数为叶绿素降解代谢途径受阻突变, 且在叶绿素合成途径受阻突变中, 不同的突变材料其叶绿素合成途径受阻的部位也有所不同。

叶绿素分子的合成从L-谷氨酰-tRNA开始, 在不同酶的作用下最终合成叶绿素a和叶绿素b, 整个合成过程涉及到的任何一个步骤出现问题, 都会导致叶色的变异 (见图2) 。Wang等[26]研究表明, 叶片白化是由于叶绿素合成卟啉原形成部位受阻导致的。何瑞锋等[27]研究认为叶绿素合成过程中, 镁的螯合过程受阻导致斑马叶表型。叶绿素合成酶主要参与叶绿素a合成的最后一步, 该基因的突变体ygl1导致叶绿素合成受阻, 表现为淡黄叶[28]。

叶绿素的分解过程与合成过程一样, 对叶色变异有着重要的影响。目前, 研究表明叶绿素代谢过程存在2种突变途径, 一种是功能性的滞绿, 能够保持光合作用的功能, 有可能提高作物产量;另一种类型是非功能性的滞绿, 叶绿体的光合作用能力丧失[12]。相关研究表明, 叶绿素在分解代谢过程中, 先被降解为pFCC, pFCC经过修饰后被转移到液泡中, 并在液泡中的酸性pH条件下发生非酶学异构形成NCCs, 最终转化形成单吡咯降解产物[30,31] (见图3) 。

Park等[32]基于图位克隆技术, 克隆了1个控制水稻常绿叶突变体基因sgr, 功能分析表明sgr编码1个新的叶绿体蛋白, 通过参与调节脱镁叶绿酸加氧酶的活性参与到叶绿素降解过程, 最终使得突变体表现为叶片滞绿。Cha等[33]克隆了另外一个控制水稻常绿叶突变体基因Nyc1, 并认为该基因编码叶绿素降解过程中的一个关键酶 (短链脱氢酶/还原酶) , 从而调控叶片衰老过程中叶绿素的降解过程。此外, 还有一些参与水稻叶绿素降解过程的基因被克隆, 如NOL[34]、NYC1[35]以及NYG3[36]等。

3.2 叶绿素发育途径受阻

叶绿体是植物细胞所独有的细胞器, 是进行光合作用合成有机物的主要场所。尽管叶绿体自身具有遗传物质, 但其发育仍是一个复杂的相互协调过程, 尤其是需要编码叶绿体蛋白的核基因与叶绿体基因之间的相互协调。Ken suke等[37]研究表明, v1基因在调控叶片发育早期编码质体转录或翻译元件基因的表达时间上起重要作用。v1突变体中编码的OsRpoTp蛋白急剧减少, 是叶绿体发育不良导致叶片早期白化的主要原因。Suginoto等[24]通过对一个温度敏感型的叶色突变体进行定位研究, 克隆了编码质体和线粒体上的新类型鸟苷酸激酶 (pt/mtGK) 基因v2, 它是影响叶绿体分化的关键因素之一。Yoo等[39]研究表明, 受温度调控的淡绿色基因v3和条纹基因st1分别编码核苷酸还原酶 (RNR) 的大、小亚基 (RNRL1和RNRS1) , 参与调节DNA合成与修复。同时发现, 当RNR的活性不足时, 正在进行发育的叶片中质体DNA合成将被阻止。

4 水稻叶色突变体的应用前景

目前, 水稻叶色突变体已被广泛应用到理论研究和生产实践中, 具有良好的应用前景。叶色突变体是功能基因组学研究的理想材料, 对于深入阐明水稻叶绿素合成和分解代谢途径以及叶绿体发育分化的遗传机理具有重要意义。随着许多新水稻叶色突变体的发掘, 控制叶色相关基因的分子机理将日趋丰富和完善。叶片是植物进行光合作用的主要器官, 光合效率的高低直接影响着水稻产量。由于功能型常绿突变体在水稻生育后期依旧保持着较高的叶绿素含量和光合能力, 因此对其进行研究, 能够有助于延缓叶片衰老, 提高水稻的生产能力。同时, 叶色变异一般发生在苗期, 易于鉴别, 可将叶色变异作为表型标记性状用于良种繁育和杂交制种, 有利于实现早期去杂, 确保良种的纯度及质量, 解决杂交水稻育种中的杂交稻种子纯度低的问题。另外, 由于叶色变异多种多样, 还可以利用这些“五颜六色”的水稻材料作为观赏植物, 绘制“稻田画”和开展“稻田艺术”等活动, 以丰富稻田文化。

摘要：水稻叶色突变体是一类较易观察和获得的突变体, 研究水稻叶色突变体基因进行定位有助于深入阐明叶色基因的调控机理, 对水稻叶片光合遗传改良和产量提高具有重要的指导意义。因此, 对于近年来有关水稻叶色突变体的分类来源、遗传机理以及基因定位等研究进展进行综述, 并介绍了叶色突变体的分子机理及其在水稻中的应用, 旨在为水稻叶色突变体的研究和利用奠定基础。

双突变体 篇3

关键词：重组人角质细胞生长因子,突变体

角质细胞生长因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通过与受体（KGFR）的结合，特异性地刺激上皮细胞的增殖，对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用，能减少放化疗所带来的副作用。KGF能特异性作用于上皮细胞，而不作用于成纤维细胞和内皮细胞。试验表明，KGF能加速伤口的重新上皮化[1]、促进角膜上皮损伤修复[2,3,4,5,6]细胞的损伤[7]，且在烧伤、溃疡以及切割伤的修复和再生方面有显著作用[8,9]。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF (KGFdes1-23）具有更高的稳定性和活性。KGF是成纤维细胞生长因子-7的肝素结合性家族的一员[10]。

本试验中重组人角质细胞生长因子（rhKGF），是一种通过DNA重组技术在大肠杆菌生产的重组人源蛋白。为了增加蛋白质的稳定性，在去除了内源性角质细胞生长因子N-端的前23个氨基酸，但不影响KGF对上皮细胞的促有丝分裂活性基础上，对40位游离的半胱氨酸进行丝氨酸突变，以期获得稳定性更好，表达量更高的40位丝氨酸突变截短型角质细胞生长因子[Ser40]rhKGFdest-23突变体蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶，DNA连接试剂盒，质粒小提试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，DNA Marker均购自Takara公司；Yeast Extract, Typton均购自OXOID;Pyrobest DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶NdeⅠ、BamHⅠ，T4DNA连接酶，Agarose购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；表达载体pET-22b, hKGF由暨南大学医药生物技术研究开发中心提供。

1.2 方法

1.2.1 rhKGF1dest23基因片段的合成

设计[Ser40]rh KGF1dest23的两端物，上游引物：5’-GGAATTCCATA TGAGCTATGATTAT-3’（划线部分为NdeⅠ酶切位点）；下游引物：5’-CGGGGATCCTTATCACGTAATGGCC-3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）。以pET22b-[Ser40]rhKGF1为模板扩增[Ser40]rhKGF1dest-23，经94℃变性3min进入循环，然后72℃延伸5min，反应产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。把回收产物命名为[Ser40]rhKGFdest-23。它的5’端有N d eⅠ酶切位点，3’端有B a m HⅠ酶切位点。

1.2.2 重组表达制粒p ET22b-[Ser40]rhKGFdest-23的构建

重组表达质粒pET22b-[Ser40]rhKGF1dest-23用NdeⅠ和BamHⅠ37℃双酶切4h，切胶回收后，在SolutionⅠ连接酶的作用下，16℃连接3h后转入感受态DH5α细胞中，转化菌涂布在含100mg/L Amp平板上，菌落PCR为阳性的克隆菌，测序。

1.2.3 阳性菌落的鉴定

酶切完毕后，用PCR Product Purification Kit V3.0进行回收。挑选几个经菌落PCR鉴定呈阳性的转化子，接种到5mL含100µg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养，50%甘油保种。取适量甘油菌测序，序列测定由上海生物工程有限公司完成。

2 结果

2.1[Ser40]hKGF1dest23 DNA片段的合成，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约为440 bp的DNA片段 (图1) ，与预期DNA片段大小一致，表明已经成功获得[Ser40]rhKGF1dest23基因。

2.2 转化子的阳性鉴定

通过42℃热激法将pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23重组质粒的构建和序列分析，连接产物转入感受态DH5α中，进行菌落PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约440 bp见[Ser40]rhKGF1dest23目地条带，与理论预期值大小基本一致（图2），表明已成功构建重组表达载体，重组表达质粒经北京三博远志生物工程有限公司测序，DNA序列分析确证已成功引入突变，结果与预期相符（图3）。

3 讨论

FGF家族对内皮细胞，成纤维细胞与上皮细胞具有促细胞增殖与分化的功能，而KGF专一性的与上皮细胞的FGFRIIIb型受体特异结合，所以安全性较好。根据《Protein Science》上的基因结构分析，知h-KGF的40位Cys暴露在分子的表面，易氧化，从而引起h-KGF蛋白质结构的不稳定。本实验通过将重组角质细胞生长因子-1暴露在分子表面，易引起蛋白不稳定的第40位半胱氨酸突变为丝氨酸，使其蛋白结构稳定。为下一步的突变体蛋白的稳定性研究奠定基础。

参考文献

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双突变体 篇4

刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii) 为人兽共患弓形虫病的病原体。对于美国和法国来说, 弓形虫已成为继沙门菌 (Salmonella) 和李斯特菌 (Listeria) 后的第三大食源性致死性病原体[1]。弓形虫入侵宿主细胞的机制至今还未完全阐明。研究发现弓形虫微线体蛋白 (microneme protein, MICs) 在虫体入侵过程中发挥识别、粘附宿主细胞的作用。MIC6通过醛缩酶、肌动蛋白和肌浆球蛋白等蛋白作用链, 参与虫体的入侵[2,3,4,5]。为深入揭示MIC6的功能及虫体的入侵机制, 本研究利用定点突变技术 (site-directed mutagenesis) 制备了MIC6突变体, GST沉降技术 (GST pull-down) 分析了突变体的特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1虫株及质粒:弓形虫强毒株 (RH株) 为中山大学寄生虫学研究室长期传代保种, 原核表达系统 (p GEX-4T-1/BL21) 购自Amersham Biosciences公司, 作者研究室传代保种。

1.1.2试剂:限制性内切酶为NEB公司产品;GST融合蛋白纯化柱和GST沉降实验用sepharose购自Amersham Biosciences公司;免疫印迹增强化学发光法 (ECL) 试剂盒 (兔Ig G) 购自Promege公司;抗醛缩酶多克隆抗体 (anti-aldolase) 为作者研究室自制保存。

1.2 方法

1.2.1 MIC6C W/V基因的PCR扩增

根据弓形虫RH株MIC6的基因序列 (AF110270) [6]设计并合成一对特异性引物, 其中将MIC6蛋白羧基端 (C端) 的348位色氨酸 (W348) 的密码子碱基突变为缬氨酸 (V) 的碱基 (上游引物:5’-CAGGATCCATGGTTGCATACATGAG-3’, 下游引物:5’-GGCTCGAGTTAATCCACTGTTTTGC-3’, 下划线部分为Bam H I和Xho I酶切位点) 。MIC6C W/V基因的PCR扩增及MIC6C W/V/p GEX-4T-1重组原核表达系统的构建具体操作参照文献[3, 7]。

1.2.2 GST-MIC6C W/V突变体蛋白的制备

具体操作参照文献[3, 7]。

1.2.3 GST沉降实验分析突变体蛋白的特性

制备弓形虫速殖子裂解液[3]。以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白 (对照蛋白) 为探针蛋白, 分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验, SDS-PAGE和Western blot分析[5,6]。

2 结果与分析

2.1 MIC6C W/V突变体基因片段的PCR结果

以弓形虫c DNA第1链为模板, PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段, 琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

M:DNA分子质量标准 (100bp) ;1~3:MIC6C W/V基因片段PCR产物。M:DNA Marker (100bp) ;1-3:PCR products of MIC6C W/V gene fragment.

2.2 GST-MIC6C W/V突变体蛋白的制备

37℃、0.8 mmol/L IPTG的条件下诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白, 蛋白电泳分析。结果显示在25~35k Da之间有一明显蛋白条带 (目的蛋白分子量约为30k Da) , 在3~6h时表达量达到峰值 (图2) 。GST融合蛋白纯化柱纯化蛋白, 蛋白核酸分析仪分析蛋白的浓度为1.78 mg/ml。

2.3 MIC6C W/V突变体蛋白的特性分析结果

GST-MIC6C W/V突变体蛋白、GST-MIC6C蛋白分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验, 蛋白电泳及印迹分析实验产物。结果显示GST-MIC6C W/V蛋白的沉降产物中未见蛋白条带, 而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中有一蛋白条带, 分子量约35~45k Da (醛缩酶的分子量为39 k Da) , 可以被醛缩酶抗体 (anti-aldolase) 特异地识别 (图3) 。

M:蛋白分子质量标准;1~6:重组菌株诱导6~1h;7:重组菌株诱导前;8:空质粒菌株诱导6h;9:BL21空菌诱导6h。M:Protein molecular weight marker;1-6:The products of recombinant MIC6C W/V induced on different time (6-1h) ;7:The products of recombinant MIC6C W/V without induced;8:The products of p GEX-4T-1 induced 6h;9:The products of BL21 induced 6h.

M:蛋白分子质量标准;1:弓形虫速殖子裂解液;2:以GST-MIC6C蛋白为探针蛋白的GST沉降产物 (*示醛缩酶) ;3:GST-MIC6C蛋白 (**) ;4:以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白的GST沉降产物;5:GST-MIC6C W/V突变体蛋白 (***) 。M:Protein molecular weight marker;1:T.gondii lysate;2:The pull-down products of GST-MIC6C protein (*indicates aldolase) ;3:GST-MIC6C protein (**) ;4:The pull-down products of GST-MIC6C W/Vprotein;5:GST-MIC6C W/V protein (***) .

3 讨论

弓形虫的MIC常以复合体 (MIC6-MIC1-MIC4、MIC2-M2AP和MIC3-MIC8) 的形式参与虫体的入侵过程, 其中MIC2、MIC6和MIC8皆为Ⅰ型跨膜蛋白, 蛋白位于胞外区的氨基端 (N端) 与相应的蛋白结合, 发挥识别、粘附功能, 蛋白的跨膜区负责将复合体固定在虫体的胞膜上, 位于胞内区的蛋白C端通过蛋白作用或其他机制将识别、粘附宿主细胞的信息传递至虫体内[6,8]。MIC2通过其C端与醛缩酶作用, 再与虫体的肌动蛋白连接, 推动虫体侵入宿主细胞。MIC2 C端的色氨酸突变后, 蛋白与醛缩酶的结合明显减少, 进而中断与肌动蛋白的连接[9]。MIC8参与入侵的分子机制尚未见报道。研究已发现MIC6的C端与醛缩酶的相互作用, 但蛋白之间的作用位点未知。MIC6与顶复门生物的几种功能相似 (具有黏附宿主细胞功能并参与入侵过程) 的跨膜蛋白的C端氨基酸序列对比分析提示蛋白C端的色氨酸 (W) 为保守的氨基酸残基, 由此推测MIC6 C端的色氨酸很可能为该蛋白与醛缩酶的作用位点。利用点突变技术将此色氨酸碱基突变, 以鉴定该色氨酸的作用。突变体蛋白特性分析中, 未突变蛋白 (GST-MIC6C) 与弓形虫裂解液中的醛缩酶作用, 并使其出现在沉降产物中;而GST-MIC6C W/V突变体蛋白则不能与弓形虫裂解液中的蛋白作用, 即当W变为V时, MIC6C与醛缩酶之间的相互作用消失。

4 结论

在体外构建并制备了弓形虫MIC6突变体, MIC6 C端的色氨酸突变后, MIC6突变体不能与醛缩酶相互作用。

参考文献

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双突变体 篇5

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型拟南芥种子;基本培养基:1/2 MS培养基;含盐培养基:分别含有170、180、190、200 mmo L/L Na Cl浓度的1/2MS培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 播种与培养。

将经过10 h氯气熏蒸灭菌的野生型拟南芥种子水平排列播种于基本培养基上, 置于4℃冰箱放置2 d, 以确保种子发芽时间基本一致。2 d后, 从冰箱中移出, 置于22~23℃组培室中竖直培养, 每天给予14 h充足光照和10 h黑暗。

1.2.2 转移与培养。

待根生长至1.5~2.0 cm时, 挑选根长度基本相同且较为健壮的幼苗分别移入含有170、180、190、200 mmo L/L的Na Cl培养基, 并在培养皿上标记好根生长的初始位置, 倒立竖直培养, 培养条件与前相同。

1.3 观察与记录

每天观察不同盐浓度下根的生长情况、弯曲程度以及幼苗的生理状态, 每隔一定时间在培养皿上对根的生长位置进行标记, 并做好记录。

2 结果与分析

将幼苗移入含有不同盐浓度的培养基后, 都表现出一定程度的生长抑制, 可能由于不同盐浓度对根的生长都造成了一定的延迟。经过生长延迟后, 幼苗适应了相应盐浓度, 在部分浓度下根出现了弯曲生长 (图1) :在170 mmo L/L浓度下, 根经过短暂的迟延开始弯曲生长, 且弯曲的程度较大, 生长较快。在180 mmo L/L浓度下, 根的生长状况与170mmo L/L浓度下几乎相同, 生长较快, 弯曲程度较大。在190mmo L/L浓度下, 根的生长受到了短暂的抑制, 但随后出现弯曲生长。在200 mmo L/L浓度下, 根的生长完全受到了抑制, 没有出现弯曲现象, 且很快萎蔫, 白化死亡。

3 结论与讨论

试验结果表明, 在170、180、190 mmo L/L的Na Cl浓度下, 根的生长虽然都表现出一定的延迟, 生长速度不太一致, 但最终还是能够生长, 出现了一定程度的弯曲, 而在200mmo L/L的Na Cl浓度下, 根的生长完全受到了抑制, 没有出现任何程度的弯曲, 经过一定时间后萎蔫, 因此确定200mmo L/L Na Cl为筛选浓度。该盐浓度经过多次反复验证, 可作为拟南芥抗盐突变体的筛选条件[5,6]。

摘要：将拟南芥种子播种于1/2 MS培养基上, 竖直培养, 待根生长至1.5~2.0 cm时, 转入含有不同NaCl浓度的1/2 MS培养基上, 倒置培养, 观察各个盐浓度下根的生长情况。试验结果表明, 在170、180、190 mmoL/L的NaCl浓度下, 拟南芥的根生长虽然都表现出一定的延迟, 但最终还能够生长;而在200 mmoL/L时, 根生长完全受到抑制, 最终白化死亡, 由此确定其生长的临界盐浓度为200 mmoL/L。

关键词：拟南芥,突变体筛选,盐浓度

参考文献

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双突变体 篇6

1 T-DNA插入突变简介

T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列, 它能整合到植物基因组中并稳定地表达。T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入, 多为单拷贝。单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中, 就会表现出孟德尔遗传特性, 在后代中长期稳定表达, 且插入后不再移动, 便于保存。早期研究认为, T-DNA在基因组中的整合是一个随机过程, 没有明显的偏爱性。以T-DNA作为插入元件, 不但能破坏插入位点基因的功能, 而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化, 为该基因的研究提供有用的线索。由于插入的T-DNA序列是已知的, 因此可以通过已知的外源基因序列, 利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析, 并对比突变的表型研究基因的功能。还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列, 建立侧翼序列数据库, 对基因进行更全面的分析。由此可见, T-DNA插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

2 T—DNA标签的应用

2.1 大规模的植物基因功能分析

大规模的植物基因功能分析目前使用最多的是插入突变的策略。由于农杆菌介导的T-DNA转化方法具有高效、重复性好、简便易行和表达稳定等优点[8], 而且技术已经非常成熟, 大多数植物都可以使用。此外T—DNA插入随机比, 插入的位点可以贯穿整个基因组, 甚至达到饱和, 尤其像拟南芥这样的基因组很小的植物几乎可以标签到所有的基因。因此使用T—DNA作为插入突变源进行突变体的筛选并进行基因功能的研究在许多植物中应用并取得成功。现在拟南芥已经有几个大规模的T—DNA插入突变体库供人们进行研究, 美国Salk基因组分析实验中心的Salk T—DNA库就是其中之一。这些大规模的T—DNA插入库为拟南芥基因功能的进一步研究提供了有利的工具。

2.2 时空特异性启动子和表达基因的分离

如果在插入T—DNA的一端安置一个报告基因, 该报告基因没有启动子或只带有弱小的启动子, 本身不表达或表达量极低。当这样的结构整合到宿主基因组时, 如果报告基因位于内源启动子之下或者增强子附近, 或者与内源的基因进行融合就被激活表达, 并反映出正常内源基因的表达模式。利用该项技术 (trapping vector) 可以较方便地分离到一些特异性启动子和特异时空表达的基因, 而不必一定要产生突变表型。这种方法已经被成功地应用于植物启动子和基因的克隆中。

Puzio利用启动子标签法标记到一个与线虫取食有关的基因pyk20, 对该基因在各种外源激素处理和逆境胁迫反应中的基因表达模式进行研究发现, 生长素、细胞分裂素和线虫取食处理植物可提高该基因的转录水平, 而温度胁迫和外源ABA处理降低该基因的转录水平, 分析携带gus基因的转基因系和野生型的序列, 结果显示外源T—DNA插入到了该基因的启动子处。

2.3 T—DNA插入突变体库及侧翼序列库的构建

T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库, 在此基础上构建侧翼序列库;目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的T—DNA插入突变体库, 该突变体库包含超过225000个独立的T—DNA插入株系, 在预测的29454个基因中有21700个基因发生了插入突变[11]。含T~DNA激活标签的拟南芥群体已经获得, 并且在这些群体中已经获得大量的异常突变体和被标记基因。Sessiens等采用Tail—PCR的方法分离了拟南芥插入突变体库85108条T—DNA侧翼序列。结果表明, 平均约1000个拟南芥激活标签转化子能发现一个形态学突变。水稻中已建立了具有一定规模的突变体库, 但远没有达到饱和的程度。水稻上大约获得了47932个T—DNA插入株系和3290个水稻激活标签转化子, 同时扩增出27621个侧翼序列。An等从6749个水稻标签系中分离了3793条T—DNA侧翼序列, 并建立了侧翼序列数据库

3 T—DNA插入突变技术存在的问题及发展方向

随着大量基因序列的获得, 基因功能的研究变得日益重要。T-DNA插入由于其自身的优越性已成为研究基因功能的重要工具。T-DNA插入突变已被广泛应用于拟南芥、水稻等模式植物的突变体库构建, 并逐渐被用于番茄、矮牵牛、香蕉、豆类的研究。但是该方法仍有一定的局限性。T—DNA插入突变的研究还主要局限于少数模式植物。究其原因, 一方面是由于植物本身的生物学特性和遗传特性所致。另一方面, T—DNA标签载体也在很大程度上影响着研究进程与研究结果。目前的标签载体大多采用Ca MV35S增强子元件, 而Ca MV 35S增强子具有组织特异性。再就是T-DNA转移和整合机制迄今尚不完全清楚, 有时会出现多拷贝插入, 且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失, 而且在组织培养过程中也会产生突变, 这些都增加了突变基因的分析难度, 给研究工作带来很大困难。

双突变体 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

研究组58 份食管癌组织标本来源于河南大学第一附属医院2013 年6 月-2013 年12 月经食管-胃- 十二指肠镜活检标本,并经组织病理学证实为食管鳞状细胞癌。其中,男性38 例,女性20 例;年龄37~83 岁,中位年龄64 岁。所有病例术前均未经放疗、化疗和免疫治疗。另外取20 份正常食管黏膜组织标本(来源于同时期接受内镜检查活检的非食管癌病例)作为对照组。

1.2 试剂

Rabbit Anti-EGFR(浓缩型)、Rabbit Anti-EGFRvⅢ(浓缩型)均购自北京博奥森生物技术有限公司,即用型快捷免疫组织化学MaxvisionTM2 检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

组织标本经10%中性甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋后,连续切片3 张,厚4μm,1 份作HE染色,1 份作EGFRvⅢ免疫组织化学染色,1 份作EGFR免疫组织化学染色。免疫组织化学采用MaxvisionTM二步方法,所有标本在同一条件下染色、DAB显色(滴加一抗浓度为1∶600),选用公司提供的已知EGFRvⅢ、EGFR阳性表达的食管癌切片在同一条件下染色作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。

免疫组织化学MaxvisionTM二步方法:①65℃烤片4 h。②石蜡切片脱蜡和水化。③PBS液冲洗3 次,每次3 min。④抗原修复:浸泡于枸橼酸盐缓冲液(p H 6.0)中,高压锅中煮沸2 min,放至室温后用蒸馏水冲洗2 min。⑤室温下浸泡于3%H2O2中10min,以消除内源性过氧化物酶活性。⑥PBS冲洗,3min×3 次。⑦每张切片滴加1 滴适当浓度的一抗Rabbit Anti-EGFR或一抗Rabbit Anti-EGFRvⅢ试剂,室温下孵育2 h。⑧PBS冲洗,2 min×3 次。⑨每张切片滴加1 滴即用型MaxvisionTM2 试剂,室温下孵育30 min。⑩PBS冲洗,3 min×3 次。11除去PBS液,每张切片滴加2 滴配置后的DAB显色液,室温25℃显色,显微镜下观察3~5 min,蒸馏水洗涤。12自来水充分冲洗,苏木素复染,PBS冲洗返蓝。13脱水,透明,封片。

1.4 结果判定

光学显微镜观察染色结果观察,采用双盲法,由2 位病理科医生在不知临床资料的情况下读片,在全切片的上、下、左、右中随机选取一个400 倍视野,观察5 个视野中阳性细胞的染色强度并计算阳性细胞数,计算细胞总数不少于1 000 个,按阳性细胞所占百分数分为:阳性细胞百分率<5%为阴性(-);5%~24%为弱阳性(+);25%~50%为中度阳性(++);>50%为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析,组间分析用 χ2检验或Fisher确切概率法,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、EGFRvⅢ在食管癌和正常组织的阳性表达

正常食管黏膜组织的EGFRvⅢ无阳性染色(见图1),EGFR的阳性染色主要位于基底膜,呈棕色或棕褐色沉淀,点片状分布(见图2);食管癌组织的EGFR表达和EGFRvⅢ阳性染色主要位于细胞膜,呈棕色或棕褐色沉淀,点片状分布,胞浆也可见阳性表达,细胞核无染色(见图3、4)。食管癌组织EGFR表达的阳性率为65.6%(38/58),正常组织EGFR阳性率30.0%(6/20),两组比较差异有统计学意(P <0.05)。食管癌组织EGFRvⅢ阳性率为58.5%(34/58),正常组织阳性率为0%(0/20),两组比较差异有统计学意义(P <0.01)(见表1)。

2.2 EGFR、EGFRvⅢ与临床病理特征的关系

EGFR和EGFRv III在食管癌组织的表达与性别、年龄、肿瘤大小和生长部位均无相关(P >0.05),与胃癌的分化程度、淋巴结转移、远隔器官转移及临床分期相关(P <0.05)(见表2)。

3 讨论

EGFR是原癌基因c-erb B-1(HE-1) 的表达产物,是相对分子量为170×103的跨膜受体蛋白。研究表明EGFR在与其配体结合后可以引起细胞生长、增殖和分化,在正常的细胞生理过程中发挥十分重要的调控作用。EGFR的活化可促进肿瘤细胞增殖、血管生成、浸润和转移,以及抑制细胞凋亡。

目前已知EGFRvⅢ有3 种突变体,即EGFRvⅠ、EGFRv、EGFRvⅢ,其中,EGFRvⅢ是EGFR最常见的删除突变型EGF受体。相对于EGFR而言,EGFRv III基因中有801 个碱基对被删除,导致胞外区6~273 位氨基的缺失,而在融合交点新产生一个甘氨酸,导致受体不依赖于配体的组成性激活[1],从而诱发细胞的异常增殖、肿瘤的发生。

本研究中作者发现,EGFR和EGFRvⅢ在食管癌的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、生长部位无相关(P >0.05)。随着细胞分化程度的降低,EGFR和EGFRvⅢ的阳性表达率明显增高,表明肿瘤细胞恶性程度越高,EGFR和EGFRvⅢ表达也越强;伴有淋巴结转移的食管癌组织中EGFR和EGFRvⅢ阳性表达率明显高于未发生淋巴结转移者(P <0.05);伴有远隔器官转移的食管癌的EGFR及EGFRvⅢ表达明显高于无远隔器官转移者(P <0.05);临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期食癌患者的EGFR、EGFRvⅢ阳性表达率明显高于临床分期Ⅰ期和Ⅱ期者(P <0.05)。这表明EGFR和EGFRvⅢ被激活并参与食管癌的浸润及淋巴结转移,并随着肿瘤的浸润、转移能力的增强和病情的进展,EGFR和EGFRvⅢ表达也越强;随着浸润、转移能力的增强和病情的进展,EGFR表达也增强,且EGFR过度表达组的食管癌患者预后明显较对照组为差;Zhang等[2]研究发现EGFR高表达的食管癌,其生存率低于低表达,EGFR可以作为食管癌预后的预测指标;王建正等[3]研究也发现EGFR的高表达可能参与了食管癌的发生、发展过程,在食管癌的侵袭和转移过程中发挥了重要作用,可作为预测食管癌预后的重要指标;王玉峰等[4]、Wang[5]等研究发现EGFR过表达与食管癌发生、发展及预后密切相关。刘敏等[6]研究发现EGFRvⅢ在食管癌特异性表达,EGFR与EGFRvⅢ与食管癌发生、发展密切相关。这与该研究结果一致。另外在其他一些肿瘤的研究中,如杨永滨等[7]在乳腺癌的研究中认为EGFRvⅢ可能参与乳腺癌的发生,可能在乳腺癌的浸润过程中起重要作用;蒋艳霞等[8]在肝癌的研究中发现EGFR可以作为新的预测原发性肝癌浸润、转移、判断预后和指导临床靶向治疗的重要因子,为肝癌的基因治疗提供理论依据。可以推测,EGFR、EGFRvⅢ的表达是食管癌细胞逃避机体免疫监视和杀伤,建立食管癌发生、发展及复发转移的重要机制之一,可作为手术切除后预测食管癌复发、转移的参考指标。

EGFRvⅢ很早就被认为是一种肿瘤特异性表达EGFR突变体,在胚胎、神经等正常组织中不能检出。目前已有很多研究提示在人类肿瘤细胞中检测到EGFRvⅢ,如人肾透明细胞癌[9]、乳腺癌[6]及胃癌[10]等。本研究中作者发现,EGFRvⅢ在正常组织阳性染色率为0%,而在食管癌组织中阳性染色率为58.6%,提示EGFRvⅢ在正常组织中不表达,而在食管癌组织中特异性表达。这与刘敏等[11]在食管癌中的研究及樊平等[12]在胃癌的研究结果相类似。EGFRvⅢ在正常组织不表达,而在肿瘤组织中特异表达,这可能使其成为抗癌治疗的理想靶点。

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