白花蛇舌草的临床妙用（精选5篇）
白花蛇舌草的临床妙用 篇1
痤疮是一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病, 好发于皮脂溢出部位, 表现为粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿及瘢痕等皮损。
本院自2010年1月应用红蓝光治疗仪[1]配合自制中药颗粒剂“白花蛇舌草颗粒”治疗痤疮, 避免了西药的不良反应, 突出了物理疗法和中医治疗痤疮的特色。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2010年1月至2012年1月本院皮肤病门诊诊断明确的痤疮患者93例。入选标准:知情同意。无剔除标准的情况。剔除标准: (1) 年龄<18岁, >30岁; (2) 孕妇、哺乳期妇女; (3) 患有精神病患者; (4) 近半年拟怀孕生育者; (5) 患有糖尿病、光过敏、有出血性和凝血性疾病患者; (6) 不合作者。
随机分为三组: (1) 联合组52例; (2) 红蓝光治疗组18例; (3) 白花蛇舌草颗粒治疗组23例。三组在年龄、性别、病程、病情轻重程度差异无统计学意义。
1.2 治疗方法
1.2.1 联合组52例;
红蓝光治疗仪 (carnation-88光子治疗仪, 深圳普门科技有限公司) , 白花蛇舌草颗粒 (自制剂批准文号:鲁药制字再z07080143) 30 g, b.i.d., p.o.。
1.2.2 红蓝光治疗组18例;
治疗时嘱患者戴好眼罩, 平卧治疗床上, 将红蓝光治疗仪机头垂直放置在距患者面部15~20 cm, 照射时间蓝光为15 min, 红光为20 min, 每周2次, 先蓝光, 照射4次改红光4次, 8次为一疗程。
1.2.3 白花蛇舌草颗粒治疗组23例:
30 g, b.i.d., p.o.。
1.3 疗效判定标准
疗程8周, 每周随访一次, 共随访8次, 评定疗效及记录不良反应。痊愈:皮疹消退90%以上, 无新发皮疹出现;显效:皮损消退>60%、<89%, 偶有新发疹;有效:皮疹消退>20%、<59%, 有新发皮疹;无效:皮疹消退<20%。总有效率以治愈加显效计。
2 结果
不良反应:所选病例治疗中, 面部照射红蓝光治疗痤疮未发现有严重的不良反应, 少见且较轻微的反应包括:面部灼热感、面部红斑、面部干燥、紧绷感等;口服自制剂白花蛇舌草冲剂, 未发现不良反应。
3 讨论
痤疮发病原因比较复杂, 主要与雄激素、皮脂分泌增多、毛囊皮脂腺导管异常角化、痤疮丙酸杆菌增殖及遗传因素有关[2]。治疗上常以口服抗生素及外用维A酸类制剂导致疗效不佳, 易反复发作。该研究项目, 主要是采用红蓝光治疗仪照射, 配合内服本院中草药自制剂“白花蛇舌草颗粒”治疗痤疮的疗效观察, 总结该种治疗方法的疗效及评价分析其不良反应, 为痤疮患者提供一种疗效高、复发率低的治疗方法。
参考文献
[1]柳眉, 李远宏, 吴严, 等.高强度窄谱蓝光治疗面部寻常痤疮临床观察.中国美容医学, 2007, 16 (10) :1400-1403.
[2]张玲.辨证论治痤疮的体会.光明中医, 2011, 26 (2) :346-347.
[3]王太发.排毒清脂片治疗痤疮62例.中国中医急症, 2010, 19 (5) :806.
白花蛇舌草的临床妙用 篇2
1 临床应用
白花蛇舌草可治湿热蕴久成毒、结于肝胆的各种肝炎。如病毒性肝炎、慢性乙肝、丙型肝炎、黄疸型肝炎等。肝经湿热是其主要病因病机, 所以治疗以清热利湿为主, 再配伍其他清热、利湿、解毒的药物。
1.1 对乙型肝炎病毒 (HBV) 携带者的作用
杨环[3]自拟二仙转阴汤 (白花蛇舌草、仙鹤草、薏苡仁等) , 以复方树舌片作对照治疗HBV携带者, 临床疗效显示, 治疗组表面抗原 (HbsAg) 转阴率以及e抗原 (HbeAg) 转阴率与对照组相比较, 两组疗效有显著性差异。何泽民[4]认为本品有直接抗HBV的作用, 自拟龙蛇汤 (白花蛇舌草、龙胆草等) 、虎蛇汤 (白花蛇舌草、虎杖等) 辨证治疗HBV携带者, 经4～6个月的治疗, 临床疗效满意。刘兰香[5]采用自拟的清毒扶正汤 (白花蛇舌草、黄芩、甘草等) 治疗乙肝表面抗原阳性患者, 对照组用西药常规治疗, 结果治疗组HBsAg转阴率为36.75%, 对照组仅10%, 疗效有显著性差异。雍履平[6]研究证明肝硬化腹水是肝功能损害的结果, 而肝功能损害又是HBV损害的结果, 依据病史, HBV感染者肝功能异常, 可辨证选用有较强抑制HBsAg作用的白花蛇舌草。
1.2 对急性病毒性肝炎、慢性乙型肝炎的治疗作用
夏正飞等[7]采用清热利湿汤 (白花蛇舌草、茵陈、垂盆草等) 治疗急性病毒性肝炎45例, 总有效率达100%。周建新等[8]运用乙肝冲剂 (以白花蛇舌草、黄芪等为主药) 治疗病毒性乙型肝炎患者662例, 总有效率为84.59%。肖典军[9]在中药协定处方中辨证用药, 加用白花蛇舌草治疗慢性乙型肝炎, 结果表明, 用大剂量 (30g) 临床疗效优于用低剂量 (15g) , 且优于未加药的对照组。李明德[10]以白花蛇舌草为主自拟清肝解毒汤治疗乙型病毒型肝炎, 总有效率为96.6%。莫激勤[11]对68例乙型肝炎采用自拟蛇参虎溪汤 (白花蛇舌草、虎杖等) 进行治疗, 总有效率达83.8%。邱根全[12]自拟乙肝饮 (白花蛇舌草、板蓝根、茵陈等) 治疗慢性乙型肝炎50例, 总有效率92.0%, 显示该方具较好的抗乙肝作用。
1.3 对肝癌及肝硬化的治疗作用
陶文琪[13]以家传白花蛇舌草汤药液内服, 汤渣外敷肝区, 治疗肝癌, 疗效满意。刘俊保等[14]应用白花蛇舌草注射液治疗肝癌40例, 治疗过程中无不良反应发生, 有效率为17.5%, 半年生存率为60.0%, 1年生存率为27.5%。姜初明等[15]应用以白花蛇舌草为君药的医院制剂中肝合剂, 在治疗中晚期原发性肝癌的临床疗效显示, 中肝合剂能显著提高Ⅲ期原发性肝癌患者的生活质量, 延长生存时间。刘敏等[16]重用白花蛇舌草组方治疗慢性肝纤维化40例, 临床疗效满意。
1.4 治疗其它肝病
程为平等[17]采用自拟丙肝灵 (本品配伍蒲公英、虎杖、苦参等中药组成) 治疗丙型病毒性肝炎13例, 其中8例HCV抗原转阴性。王俊图[18]以白花蛇舌草为主药, 随证加减, 治疗急性黄疸型肝炎30例, 总有效率为96.7%。张子臻等[19]辨证重用白花蛇舌草, 治疗脂肪肝伴发肝损害、高尿酸血症, 临床疗效满意。
2 机制研究
2.1 抗乙型肝炎病毒作用
孔祥廉等[20]通过体外细胞培养实验, 观察蛇黄肝炎合剂 (以白花蛇舌草、田基黄等为主药) 体外对HBV基因转染的人肝癌细胞系2215细胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用。结果表明, 蛇黄肝炎合剂在无毒浓度1:32倍稀释下能显著抑制2215细胞分泌HBeAg和HBsAg。这提示蛇黄肝炎合剂抗HBV作用明显, 可进一步研发使之成为临床抗HBV的有效用药。
2.2 调节免疫功能
病毒性肝炎患者机体免疫功能低下, 尤其是细胞免疫功能低下, 是导致发病和使病情趋向慢性化的重要原因。因此, 调节机体的免疫功能, 尤其是增强细胞免疫功能, 是治疗病毒性肝炎的重要原则之一[21]。有实验研究表明, 用白花蛇舌草水煎液给小鼠连续灌胃15d, 观察其对小鼠抗体产生能力、淋巴细胞增殖和IL-2产生的影响, 结果白花蛇舌草对以上免疫学指标均有明显增强作用, 与对照组比较有非常显著性差异[22]。另有药理实验观察研究白花蛇舌草总黄酮的免疫调节作用。结果表明, 白花蛇舌草总黄酮能促进由环磷酰胺或阿糖胞苷诱导的免疫功能低下小鼠脾淋巴细胞的增殖反应, 并提高小鼠血清IL-2和IFN-γ的含量, 且高剂量白花蛇舌草总黄酮能促进小鼠脾脏IgM抗体形成, 同时能升高抗肿瘤药物所致的小鼠白细胞减少[23]。
2.3 护肝作用
有研究表明, 白花蛇舌草水提取物对CCl4所致小鼠肝损伤有保护作用, 能显著减轻肝组织病理损伤程度, 并能提高外周血CD4+T细胞的百分比和降低CD8+T细胞的百分比, 提高CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值, 降低血浆中TNF-α和IL-6的水平, 提示可能是其治疗肝损伤的机理之一[24]。
2.4 抑制肝癌细胞生长作用
张硕等[25]通过实验观察白花蛇舌草总黄酮对肝癌的体内、体外抑制作用, 从细胞周期调控、细胞凋亡、免疫调节等角度, 探讨其抗癌机制。研究表明, 白花蛇舌草总黄酮对肝癌细胞SMMC-7721, BEL-7402的生长有显著抑制作用, 且呈剂量和时间依赖性。体内实验表明, 白花蛇舌草总黄酮显著抑制小鼠移植性肝癌H22的生长, 且亦呈剂量依赖性。另有实验从基因调控角度探讨白花蛇舌草总黄酮抗肝癌的作用机制, 提示其抗癌作用是通过调控多个靶基因、多种与肿瘤生长增殖密切相关的信号转导分子及细胞因子IL-1的表达、显著上调多个抑癌基因的表达[26]。王春涛等[27]通过MTT法体外细胞毒实验, 琼脂糖凝胶电泳法检测白花蛇舌草对人肝癌HEPG2细胞增殖的抑制作用, 结果表明, 白花蛇舌草能抑制人肝癌HEPG2细胞生长, 且随剂量的增加抑制作用增强。
3 小结与展望
美国肝病权威汉斯· 玻柏教授曾预言:“肝炎根治的希望在中医药。”[28]白花蛇舌草现已广泛应用于治疗肝脏疾病, 并取得了较好的临床疗效。本品药源丰富、价格低廉, 且经动物毒性实验提示, 白花蛇舌草的浸膏半数致死量, 小鼠腹腔注射为104g生药/kg, 表明其毒副作用轻微[29], 能为患者长期服用。但目前对该药的临床应用尚缺乏大量的临床研究, 且对其作用机理研究还不够深入, 还需进一步进行规范化的药物化学、药理学、毒理学、药物动力学和临床疗效观察, 开发出一批以白花蛇舌草为主药的治疗肝病的新药, 以满足广大肝病患者的需求。
摘要：对近年来有关白花蛇舌草在治疗肝病中的临床应用及机制研究结果进行概述, 以期对白花蛇舌草的进一步临床应用及研究提供帮助。
白花蛇舌草的临床妙用 篇3
1 白花蛇舌草的有效化学成分
药理学研究发现, 白花蛇舌草全草含车叶草甙、车叶草甙酸、鸡屎藤次甙、鸡屎藤次甙甲酯、2-甲基-3-甲氧基蒽醌, 以及熊果酸、β-谷甾醇、β-谷甾醇-β-葡萄糖甙、对-香豆酸, 以及某些微量元素、氨基酸、挥发油等[5]。在20世纪七八十年代, 首先从白花蛇舌草中提取出2-甲基-3-羟基蒽醌、2-甲基-3-甲氧基蒽醌等蒽醌类化合物, 在其后的数年中又陆续分离出2-羟基-1-甲氧基蒽醌、2-羟基-1, 3-二甲氧基蒽醌、2-羟基-1-甲氧基-3-甲基蒽醌等。在其它研究中, 研究人员意外分离提取出芦丁、槲皮素、山奈酚、穗花双黄酮等, 发现其具有较强的DNA裂解活性[6]。萜类化合物主要为三萜与环烯醚萜类化合物, 其在酸性环境下不稳定。甾醇类主要包括β-谷甾醇、β-谷甾醇-D-葡萄糖苷, 但是其是否为白花蛇舌草的有效成分尚有争议[7]。多糖约占15.10%, 主要为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等。另外还包括其他一些有效成分, 如脂肪酸、生物碱、氨基酸、强心苷等。
2 白花蛇舌草的药理作用
截至目前, 研究发现白花蛇舌草的药理作用主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗化学诱变、抗炎抗菌以及一些其它作用。体外试验研究发现, 该药物对急慢性淋巴细胞型、急性粒细胞型、急性单核细胞型肿瘤细胞具有较强的抑制作用[8]。体外抗菌研究发现, 该药物只对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等有比较微弱的抑制作用, 对其他病原体几乎没有抑制作用[9]。动物试验表明, 白花蛇舌草对实验性阑尾炎兔具有刺激网状内皮细胞增生、增加细胞吞噬能力, 因而可以发挥抗炎的作用[10]。由于白花蛇舌草在体外对多种肿瘤细胞株具有一定的增殖抑制作用, 显示出一定的抗肿瘤活性, 因而成为目前研究的热点方向和内容之一, 综合基础与临床研究, 以及文献[7,8], 白花蛇舌草抗肿瘤的机制可能包括:增强免疫功能、影响癌细胞中与能量代谢有关的酶的活性、诱导癌细胞凋亡、影响Ca2+信号转导途径、断裂癌细胞DNA、诱导癌细胞凋亡的其他途径。另外, 该药物对中枢神经系统具有一定的保护作用, 具有保肝利胆的活性以及止血利尿排石作用, 基础研究发现其对实验动物的造血功能具有一定调节作用, 对毒蛇咬伤具有解毒功效等。
3 临床应用
根据临床经验, 结合文献[9,10], 白花蛇舌草临床应用比较广泛, 在妇科主要用于治疗盆腔炎、附件炎、乳腺小叶增生、子宫肌瘤;在消化系统, 主要用于治疗黄疸型肝炎、乙型肝炎;在泌尿系统, 主要用于治疗输精管结扎术后副睾郁积症、尿路感染、肾积水、前列腺肿大;在小儿, 常用于治疗小儿肺炎、阑尾炎、急性扁桃体炎;另外还应用于各种癌症、毒蛇咬伤、湿疹等疾病的治疗。
4 结语
中草药是中华民族传统医学的重要瑰宝, 白花蛇舌草在我国资源比较丰富, 有效成分比较明确, 作用比较广泛, 毒副作用轻微, 价格低廉。目前, 白花蛇舌草的抗肿瘤机制研究已成为分析化学、药理学、动物实验和临床医学等研究的热点。随着对分子生物学研究的不断深入, 许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌效应的这一观点已基本达成共识, 因此探索药物诱导肿瘤细胞凋亡成为当今肿瘤治疗的热点, 植物中寻找副作用小的抗肿瘤药, 已成为研究热点。目前, 白花蛇舌草的临床应用剂型多为注射剂, 但其精确的有效成分和明晰的作用机理研究尚有待继续深入, 尤其是分子生物学机制尚需进一步阐明。
参考文献
[1]徐闷防, 马郑.杜前衍生化HPLC分析白花蛇舌草多糖中单糖组成[J].中成药, 2008, 31 (3) :406-408.
[2]侯桂兰, 芦柏震, 王春雷.白花蛇舌草的化学成分、药理作用及临床运用[J].海峡药学, 2010, 22 (3) :78-81.
[3]刘建璇, 李会影, 苗光新, 等.白花蛇舌草注射液抗肿瘤和免疫调节作用实验研究[J].中国中医药信息杂志, 2008, 15 (12S) :22-23.
[4]卢灿辉, 卢永兵.草药白花蛇舌草的临床应用[J].光明中医, 2010, 25 (7) :1296.
[5]梅全喜.现代中药药理与临床应用手册[M].北京:中国中医药出版社, 2008:946.
[6]钱韵旭, 刘裴, 李莉, 等.白花蛇舌草多糖的分离纯化及PMP柱前衍生高效液相分析[J].云南中医学院学报, 2010, 33 (3) :43-46.
[7]张培影, 王业桥, 徐侠.白花蛇舌草对裸鼠宫颈癌细胞增殖和凋亡的实验研究[J].中国当代医药, 2010, 17 (30) :5-8.
[8]张焱, 邢细红, 谢蕊繁, 等.白花蛇舌草对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响及其机制[J].中华实验外科杂志, 2010, 27 (11) :1693-1695.
[9]张永勇, 罗佳波.白花蛇舌草化学成分研究[J].中药材, 2008, 31 (4) :522-524.
白花蛇舌草的临床妙用 篇4
关键词：中草药,汤剂,制备,质量控制,疗效观察
复方白花蛇舌草口服液是我院在多年临床应用汤剂的基础上, 对处方经过进一步加减、筛选确定的, 用水提醇沉法分离精制而成的中药制剂, 具有清热解毒利湿, 理气化瘀止带的功效。用于治疗慢性盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎, 热毒湿互结, 气滞血瘀下焦;慢性阑尾炎, 属热毒湿瘀互结, 取得良好的疗效, 是我院妇科病门诊治疗慢性妇科炎症的首选药物。现将其制备工艺、质量控制与治疗盆腔炎的疗效观察结果报道如下。
1药品与仪器
甘草次酸对照品 (中国药品生物制品检定所) , 丹参酮ⅡA对照品 (中国药品生物制品检定所) , 氯仿 (天津市化学试剂六厂, 批号030922) , 硅胶G (青岛海洋化工厂, 批号021015) , 硫酸、乙醇 (山东泰安市九龙化工总厂, 批号031209、031021) , 盐酸 (济南试剂总厂, 批号041202) , 苯 (齐鲁石化公司研究院试剂厂, 批号031103) , 石油醚 (天津市津东天正精细化工试剂厂, 批号040402) , 乙酸乙酯 (天津基准化学试剂有限公司, 批号040226) , 冰醋酸 (蚌埠化学试剂厂, 批号031209) , 磷钼酸 (浙江湖州菱湖化工试剂厂, 批号060719) 。
2处方与制备工艺
2.1 处方
白花蛇舌草333.3g, 茯苓、炒枳壳、地丁各222.2g, 丹参、炒桃仁、厚朴各133.3g, 甘草、大黄炭各111.1g, 煅牡蛎166.7g。
2.2 制备工艺
以上10味, 加水适量煎煮2次, 第1次2h, 第2次1.5h, 合并煎液, 滤过, 加热浓缩至适量, 静置冷藏, 加乙醇使含醇量为40%, 搅匀, 静置。取上清液回收乙醇, 浓缩液过滤后, 加入矫味剂, 加水至1 000ml, 搅匀, 静置, 灌装, 灭菌。
3质量标准
3.1 性状
本品为深褐色液体, 味苦。
3.2 鉴别
3.2.1 甘草的鉴别:
取本品20ml, 加盐酸3ml, 加热回流1h, 放冷, 加氯仿振摇提取2次, 每次15ml, 合并氯仿提取液, 蒸干, 残渣加乙醇1ml使溶解, 作为供试品溶液。另取甘草次酸对照品, 加无水乙醇制成每1ml各含1mg的混合溶液, 作为对照品溶液。照薄层色谱法试验, 吸取上述两种溶液各15μl, 分别点于同一硅胶G薄层板上, 以石油醚 (30～60℃) -苯-乙酸乙酯-冰醋酸 (比例为10∶20∶7∶0.5) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 喷以10%磷钼酸乙醇溶液, 在105℃加热约5min。供试品色谱中, 在与对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点。
3.2.2 丹参中丹参酮ⅡA的鉴别:
取本品20ml, 加乙醚10ml并放置5min, 滤过, 滤液挥干, 残渣加乙酸乙酯2ml使溶解, 作为供试品溶液。另取丹参酮ⅡA对照品, 加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液, 作为对照品溶液。照薄层色谱法试验, 吸取上述溶液5μl, 点于硅胶G薄层板上, 以苯-乙酸乙酯 (19∶1) 为展开剂, 展开, 取出, 晾干, 供试品色谱中, 在与丹参酮ⅡA对照品色谱相应的位置上, 显相同颜色的斑点。
3.3 pH值
应为3.5～5.5 (中国药典2005年版一部附录Ⅶ G) 。
3.4 相对密度
应为1.01～1.10 (中国药典2005年版一部附录Ⅶ A) 。
3.5 其他
应符合合剂项下有关的各项规定 (中国药典2005年版一部附录Ⅰ J) 。
4稳定性试验
将复方白花蛇舌草口服液置室温下作留样观察, 每隔1个月按上述质量标准进行检查, 观察12个月。结果表明其各项检查均符合规定。
5临床观察
5.1 病例选择
232例为本院门诊25～50岁女性患者, 均经本院妇科门诊根据临床症状和体征检查确诊为慢性盆腔炎, 具有以下临床症状:下腹及腰骶部疼痛, 有时伴肛门坠胀, 劳累、性交及月经前后加重。发热起伏, 带下色黄, 经行腹中刺疼, 经量少, 有淤块。体征检查:子宫多后位, 活动受限或粘连固定, 有触压痛, 或输卵管增粗压痛。
5.2 治疗方法
复方白花蛇舌草口服液口服, 每次20ml, 每日3次。15d为1个疗程, 连续治疗3个疗程。
5.3 疗效评定
痊愈:上述不适症状完全消失, 体征检查恢复正常;有效:不适症状部分改善, 体征检查趋于正常;无效:不适症状无明显改善, 体征检查无好转。
5.4 治疗结果
服药3个疗程后, 痊愈212例, 有效17例, 无效3例, 总有效率98.7%, 无不良反应发生。
6讨论
白花蛇舌草的临床妙用 篇5
关键词：白花蛇舌草,混伪品,ITS2,分子鉴定
白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草(Oldenlandia diffusa)的全草,具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛的功效[1]。由于白花蛇舌草在癌症的治疗中效果确切[2],需求剧增,使其生药资源日见贫乏,而出现较多混伪品。常见混伪品伞房花耳草、纤花耳草、松叶耳草等与白花蛇舌草同科属,仅根据植物外在特点难以鉴别,经常会被当成是白花蛇舌草用于临床[3,4,5,6,7]。还有商家为了增加利益,掺杂其他不同科属的漆姑草(石竹科漆姑草属)、舌雀草(石竹科繁缕属)在白花蛇舌草中,导致白花蛇舌草的质量下降[8,9]。为保证白花蛇舌草的用药安全和疗效确切,它的准确鉴别是目前一项十分紧迫的任务。近年来,DNA条形码研究在物种鉴定和植物分类领域体现出较高的准确率,成为热点研究方向[10,11]。此项技术的核心在于通过比较一段通用DNA序列,对物种在基因水平进行鉴定和高效识别,同传统的显微鉴别、理化鉴别、色谱鉴别相比较,DNA条形码技术重复性好、稳定、快速、准确,更为重要的是它深入到分子水平,反映了物种的遗传特性,这种鉴别方式更加可靠[12,13]。有学者对多种植物样本进行研究后,提出将DNA条形码之一的ITS2序列用于植物鉴定的标准序列[14,15,16]。ITS2因其长度较短,扩增效率高,不同的物种突变位点多,表现出较高的物种分辨率,很适合用于植物鉴定[17,18]。
本研究以白花蛇舌草药材及纤花耳草、松叶耳草、伞房花耳草、漆姑草、雀舌草等混伪品作为研究对象获得ITS2序列,稳定、准确地鉴别白花蛇舌草药材及其混伪品,为保障该药材品种的临床疗效提供了新的鉴定技术手段。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
植物基因组DNA提取试剂盒(CW0531,北京康为世纪生物科技有限公司);2×Es Taq Master Mix(康为世纪生物科技有限公司);引物(华大基因科技有限公司合成);VeritiTM96 PCR仪(杭州博日科技有限公司);电泳仪(DYY-8C,北京白晶生物科技有限公司);核酸/蛋白质凝胶图像分析管理系统(GSG-2000,中国珠海黑马医学仪器有限公司);DNA分析仪(3730xl,Applied Biosystems)。
1.2 植物材料
材料信息见表1,包括实验样品及Gen Bank下载序列,其中,白花蛇舌草和混伪品实验样品采自海南、苏州、广东等地,由解放军总医院刘萍主任药师鉴定,凭证标本保存于解放军总医院海南分院药剂科中药标本室。
注:“-”表示无内容
1.3 植物DNA提取、PCR扩增和测序
将白花蛇舌草和3种混伪品的干燥植物分别用研钵碾成粉末,各取30 mg置离心管中,按照试剂盒说明书提取DNA。收集DNA溶液,-20℃冰箱保存。正向引物为ITS2F:5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3',反向引物为ITS3R:5'-GACGCTTCTCCAGACTA-CAAT-3'[19]。PCR反应体系包括25μL 2×ES Taq Master Mix,2μL正向引物ITS2F,2μL反向引物ITS3R,9μL超纯水,12μL模板(基因组DNA),体系配制共为50μL。使用PCR仪进行扩增,扩增程序:Step1:94℃变性5 min;Step2:94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s(进行40个循环);Step3:72℃延伸10 min。PCR产物在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳跑胶,获得单一条带后,将PCR产物送至华大基因贸易有限公司利用DNA分析仪进行双向测序。
1.4 数据处理
运用Codon Code Aligner 6.02(Condon Code Co.,USA)对测序峰图进行校对拼接,除去序列两侧低质量区和切除引物。对Gen Bank下载的和拼接后得到的ITS2序列用HMMer注释法切5.8 S和28 S端,保留ITS2的全长[20]。然后用软件MEGA 5.1比较序列变异,计算遗传距离和构建邻接(NJ)树。采用Koetschan等[21]建立的ITS2数据库预测ITS2二级结构。
2 结果
2.1 序列峰图
白花蛇舌草(凭证标本号BHS15101)的ITS2序列测序峰见图1,序列长度为214 bp,其中质量为QV≥20的碱基为214 bp,质量较好,没有含Poly A(≥5个单碱基重复)和Poly T结构,CG含量为65.9%。
A:白花蛇舌草ITS2序列碱基1~53测序峰图;B:白花蛇舌草ITS2序列碱基54~106测序峰图;C:白花蛇舌草ITS2序列碱基107~159测序峰图;D:白花蛇舌草ITS2序列碱基160~214测序峰图
2.2 白花蛇舌草种内序列比对
3条白花蛇舌草ITS2序列,比对后序列长度均为214 bp,GC含量为65.9%~66.8%,均值为66.37%。有2处单碱基变异,为73位点处T-C变异和173位点处T-G变异,白花蛇舌草种内ITS2序列的平均K2P距离为0.0063,最大的K2P距离为0.0094。
2.3 白花蛇舌草与其混淆品序列比对
本实验白花蛇舌草与其混淆品共15个样品的ITS2序列的长度范围为213~223 bp,GC含量范围为57.7%~69.0%。所有样品ITS2序列比对后长度为251 bp,其中变异位点为131个,信息位点为107个。白花蛇舌草种内及种间K2P距离见表2。
从表中可以看出白花蛇舌草与同科属的伞房花耳草、纤花耳草和松叶耳草的种间K2P距离平均值为0.2110,最大K2P距离为0.2784,变异相对较小,其中白花蛇舌草与纤花耳草的遗传距离最近,最大K2P距离为0.1453;而白花蛇舌草与不同科属的混伪品雀舌草和漆姑草种间K2P距离平均值为0.6127,最小K2P距离为0.5506,变异较大。
2.4 白花蛇舌草与其混伪品的邻接树
从构建的NJ树可以看出,来自不同序列的白花蛇舌草聚为一支。同一科属的白花蛇舌草、伞房花耳草、纤花耳草、松叶耳草聚在一起,其中白花蛇舌草与纤花耳草、松叶耳草亲缘关系比较近,与纤花耳草最近,与遗传距离的计算结果相一致,伞房花耳草独立为一支。不同科属的石竹科雀舌草和漆姑草独立聚为一支。见图2。
2.5 ITS2序列二级结构分析
白花蛇舌草与其混淆品的二级结构见图3,可以看出,白花蛇舌草与其5个混淆品在二级结构上有明显的差异。主要差异存在于螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ,还有基部的角度不同。白花蛇舌草二级结构螺旋Ⅰ区存在5个环,其中间有个大颈环。白花蛇舌草二级结构螺旋Ⅰ区、Ⅲ区茎环数量、大小和位置与其他混淆品也存在明显不同。白花蛇舌草二级结构螺旋Ⅲ和螺旋Ⅳ区的夹角与伞房花耳草、松叶耳草、漆姑草、雀舌草的夹角也不同。纵观在这种结构差异上,伞房花耳草、漆姑草、雀舌草比松叶耳草、纤花耳草表现更明显,这种亲缘关系的远近与NJ树的结果一致。说明白花蛇舌草与混伪品在ITS2序列二级结构上存在差异。
3 讨论
本实验研究了正品的白花蛇舌草与外形相似的混淆品伞房花耳草、纤花耳草、松叶耳草、雀舌草、漆姑草在ITS2序列上的差异,结果显示这种差异不仅体现在ITS2序列碱基种类、数量上,更体现在ITS2序列科属差异大小和二级结构上。
白花蛇舌草的种内变异位点和遗传距离明显少于种间变异位点和遗传距离。而在种间遗传距离中,白花蛇舌草与同科属混淆品的遗传距离小于与不同科属的遗传距离。同样在构建的NJ树中,同科属的白花蛇舌草、纤花耳草、伞房花耳草、松叶耳草聚在一起,不同科属的漆姑草、雀舌草独立聚为一支。这些结果表明,利用ITS2序列不仅能成功地将白花蛇舌草与其混伪品区分开,还证明了ITS2序列在同科属植物间的差异是明显小于不同科属植物间差异的。耿超等[22]的建泽泻鉴定研究中也有类似发现,通过遗传距离和构建的NJ树发现建泽泻与泽泻科泽泻属物种距离较近,与泽泻科其他属及其混伪品之间遗传距离较远。这些研究进一步力证了ITS2序列在物种间突变位点多,表现出较高的分辨率。
本文还进行了ITS2序列二级结构分析,结果显示白花蛇舌草与伞房花耳草、漆姑草、雀舌草ITS2序列结构上的差异比与松叶耳草、纤花耳草结构差异表现更明显,且这种亲缘关系的远近与NJ树的结果一致。说明ITS2序列二级结构的差异也可成为白花蛇舌草鉴别点之一。虽然高婷等[23]的藤梨根分子鉴定证明了藤梨根与其常见混伪品的ITS2二级结构也存在明显差异,但未就科属间的细致差异进行深入探索。
从遗传距离、构建的NJ树以及ITS2序列二级结构的结果发现,纤花耳草和白花蛇舌草的亲缘关系最近,这就表明白花蛇舌草中很容易掺杂纤花耳草,二者有效成分和功效上的差异还有待研究。