木犀草素

木犀草素（共6篇）

木犀草素 篇1

木犀草素(Luteolin)是自全叶青兰以及白毛夏枯草中提取分离出来的一种黄酮化合物类有效成份,具有广泛的生理活性,如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗炎等作用,有广泛应用价值和良好开发前景[1]。目前研究发现天然资源中主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟、紫苏属、黄芩属等天然药物和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果实中,但是均存在含量低、提取率极低的缺点,不能满足临床需求。目前木犀草素的来源除了天然提取外,还有全合成与半合成法获取,现就其合成工艺路线综述如下:

1 合成方法

1.1 全合成

卢玉华等[2]以间苯三酚为原料进行了全合成研究。首先以间苯三酚为原料,按照Hoesch法制得2,4,6-三羟基苯乙酮,在甲基保护4,6-二羟基后与异香草醛缩合生成相应的查尔酮,再经二氧化硒氧化、氢碘酸或者氢溴酸脱甲基制得木犀草素。工艺路线如图1。

该方法在制备查尔酮(4)一步时,需要反应6天时间,耗时较长,且总收率只有3%～4%,产率较低。

戈夏等[3]也以间苯三酚为起始原料,使用烷氧烷基醚试剂(氯甲基甲醚)作为保护试剂于室温下反应,工艺路线如图2所示,首先对2,4,6-三羟基苯乙酮(1)和3,4-二羟基苯甲醛(2)进行酚羟基保护,合成2-羟基-4,6-二甲氧基苯乙酮(3)和3,4-二甲氧基苯甲醛(4);再将(3)、(4)在50%氢氧化钾-乙醇体系反应24 h,得到2'-羟基-3,4,4',6'-四甲氧基查尔酮(5),(5)再分别经二氧化硒氧化、稀盐酸脱保护得到木犀草素(6),总收率为22%。

综合以上两条全合成路线看,查尔酮为木犀草素全合成路线中重要的中间体,此中间体可用于合成黄酮和异黄酮,构建此中间体至关重要,研究表明用芳香醛、酮制备查尔酮之前,均须将相应醛酮上的酚羟基进行保护,方有利于反应发生。就此两条全合成工艺来讲,虽然路线2合成时间缩短,收率有所提高,但是也可以明显看到全合成方法仍然有待深入研究。

1.2 半合成

1.2.1 以橙皮甙为原料的半合成

金继曙等[4]采用图3所示路线,将橙皮甙(1)经乙酸酐得乙酰化产物(2),乙酰化物经NBS,过氧化苯甲酰无水条件下沙浴回流脱氢制得化合物3, 3再由硫酸、醋酸混合酸溶液水解制得香叶木素(4),最后以氢碘酸或者氢溴酸进行脱甲基反应,制得木犀草素(5)。

金继曙等[5]后来改变图3所示路线中由(4)生成(5)的条件,在制得香叶木素4的基础上改进原来用氢碘酸法脱除香叶木素甲基制备木犀草素的办法,采用吡啶盐酸盐进行脱甲基实验,结果新方法的效果与氢碘酸相近,且避免了氢碘酸不易储存、使用不便及价格昂贵的缺点,使成本大大降低,工序简化。脱甲基反应式如图4。

邢有权等[6]以橙皮苷为原料,采用图5所示工艺,第一步不保护酚羟基而直接脱氢、第二步苷水解、最后脱除甲基,经三步合成木犀草素,总收率35%。该路线在脱氢时采用I2/pyr代替NBS/过氧化苯甲酰,使反应安全性提高,游离羟基不需要乙酰化保护,操作简化;在苷水解制备香叶木素步骤中,以乙二醇/H2SO4混合液在85～90 ℃时使苷水解,工艺简单,本路线各步收率都有所提高。单杨等[7]也以橙皮苷为原料,使用该合成路线,经三步反应制得木犀草素,总收率为39%。

孙志忠等[8]对路线5进行改进,使橙皮苷先水解制备橙皮素、橙皮素脱甲基制得圣草酚、最后圣草酚经脱氢合成木犀草素,总收率达到45.9%,新工艺较路线5收率得到一定提高。如图6所示。

在橙皮苷水解时,以甲醇/H2SO4混合液水解,反应时间为7.5 h较好。在反应结束后,利用橙皮苷在甲醇中溶解度小,而橙皮素在甲醇中溶解度大的差异,使反应由混浊变澄清,并使最终的产物纯化,操作简单,收率高达99%。在由橙皮素合成圣草酚的过程中,以无水吡啶/无水AlCl3进行脱甲基化反应。由于该反应放热,如果无水AlCl3一次加入量太大,反应急剧放热,使反应温度难以控制。实验中发现采用分批加入无水AlCl3,并控制反应温度在70～115 ℃,反应平稳,温度易于控制,收率高。实验中还发现当反应温度过低,反应时间将延长,而且反应不完全,收率较低。在由圣草酚合成木犀草素的过程中,改NBS/过氧化苯甲酰为I2/吡啶做脱氢剂一步即可合成木犀草素。反应在均相中进行,比较温和,而且游离羟基不需保护,操作简单,收率较高。产物经溶剂重结晶后,纯度较高,不需再利用柱色谱进行分离纯化。

1.2.2 以芦丁为原料的半合成

王超[9]公开了以芦丁为原料制备木犀草素的专利,在碱性条件下溶解芦丁,并加入保险粉(连二亚硫酸钠),100 ℃下加热回流12 h进行水解还原,制得纯度大于95%的木犀草素,收率约56%,如图7所示。

自俊青等[10,11]也以芦丁为原料制备木犀草素,在合成条件上,改变传统的普通加热回流法,采用微波技术,使反应时间大大减少(普通加热回流至少12 h,微波约1 h)。微波技术的使用,令反应操作更为简单,易于控制,且收率提高到60%～70%。

彭彬[12]采用芦丁为原料利用图8工艺路线进行微波合成,在300W微波功率下回流1.5h制得95%木犀草素,收率高达83.9%。重结晶后得99.4%产品。

2 结 语

木犀草素良好的生理活性,因其天然来源稀少,几十年来研究人员不断的寻找其全合成和半合成方法,以期满足临床需要。通过本文可以看到,全合成法制备木犀草素存在反应时间长,操作繁琐,收率低等缺点,相关工艺路线优化仍需要深入研究。半合成制备工艺中,以橙皮甙做起始原料的工艺步骤多,反应时间长,收率有待提高;而芦丁法制备工艺,仅一步反应,特别引入微波技术后收率大大提高,但该技术的工业化生产有待进一步研究。

摘要：木犀草素具有重要的生理活性,应用广泛。文章根据合成工艺所用起始原料的不同,将合成路线分为全合成和半合成两大类,分别介绍了各合成路线。其中半合成路线具有收率高、步骤简单等优点,具有生产开发价值,值得进一步深入研究。

关键词：木犀草素,全合成,半合成

杜虹花中木犀草素提取工艺研究 篇2

1 仪器与材料

安捷伦1100高效液相色谱仪 (G1314A VWD检测器;Agilent 1100 LC化学工作站, 自动进样器, 柱温箱, 美国安捷伦公司) ;Mettler Toledo AL104电子分析天平 (瑞士梅特勒公司) 。KQ-300DV超声波清洗仪 (昆山超声仪器有限公司) 。

木犀草素对照品购至中国药品生物制品检定所, 批号:111520-200504;杜虹花药材采至广东, 经湖南中医药大学中药鉴定学教研室鉴定。乙腈为色谱纯 (TEDIA) , 水为哇哈哈纯净水, 其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 木犀草素的测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱为:Inertsil ODS-2 C18柱 (4.6×250 mm, 5μm) , 流动相为甲醇-水-磷酸 (45∶55∶0.2) , 流速为1.0 m L/min, 检测波长为350 nm, 柱温为30℃, 进样量:10μL。理论塔板数按木犀草素峰计算应不低于2 000。

2.1.2 溶液配制

对照品溶液的制备:精密称取木犀草素对照品10.17 mg, 置100 m L容量瓶中, 加甲醇适量超声溶解并稀释至刻度, 摇匀, 得储备液 (浓度为0.1017 mg/m L) ;精密量取储备液2.5 m L置25 m L容量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 制成含木犀草素10.1μg/m L的对照品溶液。

供试品溶液的制备:取杜虹花药材粉末 (过2号筛) 约1 g, 共3份, 精密称定, 置50 m L容量瓶中, 分别加70%的乙醇30 m L, 超声处理 (250 W, 33 k Hz) 30 min, 放冷, 加溶剂稀释至刻度, 摇匀, 过滤, 取续滤液, 既得。

2.1.3 系统适应性试验

分别取对照品溶液、供试品溶液各10μL, 注入高效液相色谱仪, 在“2.1”色谱条件下检测, 记录色谱图 (见图1、2) , 木犀草素峰和样品中其它组的峰可达基线分离, 且与其它相邻峰分离度大于1.5;按木犀草素峰计算, 理论板数在2 000以上。

2.1.4 线性关系试验

精密称取木犀草素对照品15.24 mg, 置50 m L量瓶中。用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 精密量1、2、3、4及5 m L、分别置100 m L棕色量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 分别精密吸取10μL, 注入高效液相色谱仪, 记录峰面积, 以木犀草素对照品浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线, 其回归方程为:Y=1.09327X-0.07665, 相关系数r=0.9998, 结果表明, 木犀草素对照品的进样量在0.0305μg~0.1524μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

精密吸取木犀草素对照品溶液10μL, 注入液相色谱仪中, 连续进样6次, 分别记录各次进样的峰面积, 计算RSD为1.06% (n=6) 。

2.1.6稳定性试验

取同一供试品溶液, 分别于0、2、4、6、8及12 h进样, 进样量为10μL, 记录木犀草素的峰面积, 计算RSD为1.12%, 表明溶液在室温下12 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

称取杜虹花药材粉末约1 g, 按供试品方法制备6份供试品溶液, 分别进样, 记录木犀草素的峰面积, 结果RSD=1.85% (n=6) 。

2.1.8 加样回收率试验

称取杜虹花药材粉末约1 g, 精密称定, 共6份, 每份加入1.5282 mg/m L的木犀草素对照品溶液1 m L, 按供试品方法制备, 于上述色谱条件测定, 平均回收率99.85%, RSD=1.39。

2.2 正交实验设计

根据生产实际情况选取乙醇浓度、乙醇用量、提取时间为3个因素, 每个因素3个水平, 根据L9 (33) 正交表进行试验, 其因素水平见表1。

正交试验结果表明各因素对木犀草素提取率的影响程度依次C>B>A, 即提取时间>乙醇用量>乙醇浓度。最佳工艺为A2B3C3, 即加入10倍量70%的乙醇提取3 h (见表2) 。方差分析见表3。

2.3 工艺条件验证

按照正交结果最佳工艺, 称取杜虹花药材500 g进行提取、测定, 结果见表4。3次平行实验结果相近, 证明所确定的提取工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

工业化生产常用提取溶剂为水和乙醇, 对比水提和醇提后药渣中木犀草素含量, 水提药渣含木犀草素较高, 醇提药渣仅含少量木犀草素, 故选择醇提法。

3.2 提取次数选择

分别比较提取1、2及3次后药渣中木犀草素的剩余量, 发现提取2次能提取绝大部分木犀草素, 虽然提2次后药渣还剩余少量木犀草素, 但从能耗角度考虑, 提取次数确定为2次。

3.3 总结

本文通过正交试验, 确定醇提杜虹花中木犀草素的最佳参数, 该法稳定可行, 可用于工业化大生产。

摘要：目的 研究杜虹花中木犀草素提取工艺。方法 采用正交试验进行优选, 考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间等因素的影响, 优化提取条件;采用高效液相色谱法测定木犀草素含量, 来比较提取效果。结果 最佳工艺为加入10倍量70%的乙醇提取3 h。结论 该工艺稳定可行, 可用于工业化大生产。

关键词：杜虹花,木犀草素,提取

参考文献

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木犀草素 篇3

1 仪器及试药

仪器:Agilent 1100series高效液相色谱仪, PERKINE LMB-DA 3B紫外分光光度计。

试药:苦碟子胶囊 (哈药集团中药二厂) ;木犀草素 (中国药品生物制品检定所) ;

试剂:乙腈 (色谱纯) , 其余试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 最大吸收波长的选择:

木犀草素 (甲醇为溶剂) 的紫外扫描图谱显示[1,2], 其最大吸收峰位于350±1nm处, 因此将检测波长定位350nm。

2.2 流动相:乙腈-0.4%磷酸水 (29:71)

2.3 阴性干扰试验:

在处方中去除苦碟子药材, 按方中比例和制备工艺方法制成阴性制剂, 用供试品溶液制备的方法, 制成阴性对照溶液, 用以上选定的测定条件进行吸收曲线绘制, 观察在与木犀草素相同的保留时间处是否存在吸收峰, 结果表明:在选定条件下测得的阴性液吸收曲线, 在与木犀草素相同保留时间处不存在吸收峰, 因此说明选定的条件测定木犀草素无干扰, 具有较强的专属性。

2.4 供试品溶液制备:取苦碟子胶囊内容物0.03g, 加50ml甲醇-25%盐酸 (4:1) , 回流2小时, 过滤即得。

2.5 含量测定的方法学考察

2.5.1 对照品的线性关系考察:

取木犀草素对照品8.01mg, 加甲醇使溶解, 定容至50ml, 对照品溶液浓度:0.1602mg/ml。从中取10ml置50ml量瓶中加甲醇定容至50ml, 摇匀, 再从中取1.0、2.5、4.0、5.5、7.0、8.5ml置10ml量瓶中加甲醇至刻度, 摇匀, 进样10μl, 按含量测定方法测定峰面积, 并以峰面积的积分值为横坐标, 对照品进样量为纵坐标建立标准曲线, 计算回归方程。回归方程为:y=3767.785294X+0.050707984 (r=0.9999) , 木犀草素在0.0320μg~0.2723μg范围内呈良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验:取Cs=0.00801mg/ml对照品溶液, 每次进样量为10μl, 重复进样6次, RSD小于1.27%, 精密度良好。

2.5.3 稳定性试验:取供试品溶液, 室温、密闭放置, 于0、4、

8、12、16、20、24小时, 分别进样10μl, 测定吸收峰面积。RSD=1.94%, 此含量测定方法的稳定性良好, 样品供试品溶液在室温、密闭放置24小时之内较稳定。

2.5.4 重复性试验:

分别称取同一批号苦碟子胶囊6份, 测定苦碟子胶囊中木犀草素的含量。RSD=1.88%, 此含量测定方法的重现性良好。

2.5.5 准确度试验:

分别精密称取已知含量 (含量为14.48mg/g) 的样品6份, 每份约0.015g, 加入木犀草素对照品溶液1ml (含木犀草素0.1602mg) , 按含量测定项下供试品溶液制备方法, 制备供试品溶液, 测定含量。回收率100.9%, RSD=1.71%, 本方法具有较好的回收率。

2.6 含量限度的确定:按上述测定方法, 测定了5批样品, 结果见表1。

3 讨论

3.1 支气管炎是冬季中老年人的常见病。

多因急性支气管炎未及时治愈转变而成。此病的发生是由于感染、理化刺激、过敏及气候变化等多种因素长期相互作用的结果。据统计, 我国50岁以上中老年人发病率为15%~30%左右。临床上常表现为咳嗽、咳痰, 或伴有气短、喘息等, 严重者可并发肺气肿、肺心病等。冬季气候干燥而寒冷, 容易发生呼吸道感染, 导致“老慢支”复发。我厂研发的苦碟子胶囊对支气管炎有良好的疗效, 具有较好的市场前景。该方法简便、快速, 专属性强, 重现性好, 可用于苦碟子胶囊的含量测定, 对指导临床用药具有积极意义。

3.2 在流动相选择方面曾采用过乙腈-水 (30:

70) , 但杂质峰较多, 干扰大, 后采用乙腈-0.4%磷酸水 (29:71) 峰分离效果较好, 干扰小。

参考文献

[1]国家药典委员会, 中华人民共和国药典.一部[S].北京:化学工业出版社, 2000, 10.

木犀草素 篇4

1 仪器及试药

仪器:Agilent 1100series高效液相色谱仪(安捷伦化学工作站);KQ250型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂生厂);METTLER AE240电子分析天平;PERKINE LMBDA 3B紫外分光光度计。色谱柱:Thermouest 250mm×4.6mm 5µm BDS C18。

试药:筋骨草胶囊(哈药集团中药二厂,批号:111520-200201);化学对照品:木犀草素(中国药品生物制品检定所)。试剂:乙腈,色谱纯(山东禹王实业有限公司),其余试剂为市售分析纯。

2 方法及结果

2.1 最大吸收波长的选择

木犀草素(甲醇为溶剂)的紫外扫描图谱显示[1,2,3],其最大吸收峰位于(350±1)nm处,因此将检测波长定位350nm。

2.2 流动相的选择

曾选用甲醇-水-磷酸(48∶52∶0.2),样品峰分离不完全,对照品峰拖尾,后采用乙腈-0.4%磷酸水(29∶71)系统为流动相,通过预实验认为乙腈-0.4%磷酸水(29∶71)可以将筋骨草胶囊中木犀草素较好的分离。

2.3 阴性干扰试验

在处方中去除筋骨草药材,按方中比例和制备工艺方法制成阴性制剂,用供试品溶液制备的方法,制成阴性对照溶液,用以上选定的测定条件进行吸收曲线绘制,观察在与木犀草素相同的保留时间处是否存在吸收峰,结果表明:在选定条件下测得的阴性液吸收曲线,在与木犀草素相同保留时间处不存在吸收峰,因此说明选定的条件测定木犀草素无干扰,具有较强的专属性(图1～3)。

2.4 提取纯化方法确定

2.4.1 提取方法的选择

取筋骨草胶囊4份,分别加50mL甲醇超声30min后,从中取出30mL加浓盐酸10mL回流2h、加50mL甲醇超声30min后,从中取出30mL加浓盐酸20mL回流2h、加50mL甲醇超声30min后,从中取出30mL加浓盐酸30mL回流2h、加40mL甲醇,再加25%盐酸10mL回流2h。

结果表明:提取方法采用加40mL甲醇,再加25%盐酸10mL回流2h效果较好。

2.4.2 提取溶媒的选择

分别称取筋骨草胶囊5份,用不同比例的溶媒测定峰面积。

结果表明:提取溶媒比例采用甲醇-25%盐酸(4∶1),回流2h效果较好。

2.4.3 提取时间的选择

取筋骨草胶囊样品,回流时间分别为1、1.5、2h,依次制备供试品溶液。

结果表明:回流提取时间对木犀草素的含量影响不明显,回流时间确定为1.5h。

2.5 含量测定的方法学考察

2.5.1 对照品的线性关系考察

取木犀草素对照品8.01mg,加甲醇使溶解,定容至50m L,对照品溶液浓度为0.1602mg/m L。从中取10m L置50m L量瓶中加甲醇定容至50m L,摇匀,再从中取1.0、2.5、4.0、5.5、7.0、8.5m L置10m L量瓶中加甲醇至刻度,摇匀,进样10μL,按含量测定方法测定峰面积,并以峰面积的积分值为横坐标,对照品进样量为纵坐标建立标准曲线,计算回归方程。回归方程为:y=3767.785294X+0.050707984(r=0.9999),木犀草素在0.0320～0.2723μg范围内呈良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验

取Cs=0.00801mg/mL对照品溶液,每次进样量为10μL,重复进样6次,RSD<1.27%,精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

取供试品溶液,室温、密闭放置,于0、4、8、12、16、20、24h,分别进样10μL,测定吸收峰面积。RSD=1.94%,此含量测定方法的稳定性良好,样品供试品溶液在室温、密闭放置24h之内较稳定。

2.5.4 重复性试验

分别称取同一批号筋骨草胶囊6份,测定筋骨草胶囊中木犀草素的含量。RSD=1.88%,此含量测定方法的重现性良好。

2.5.5 准确度试验

分别精密称取已知含量为0.1448mg/g的样品6份,每份约1.5g,加入木犀草素对照品溶液1mL(含木犀草素0.1602mg),按含量测定项下供试品溶液制备方法,制备供试品溶液,测定含量。回收率100.9%,RSD=1.71%,本方法具有较好的回收率。

2.6 含量限度的确定

按上述测定方法,测定了10批样品,结果见表1。

3 讨论

支气管炎是冬季中老年人的常见病。多因急性支气管炎未及时治愈转变而成。此病的发生是由于感染、理化刺激、过敏及气候变化等多种因素长期相互作用的结果。据统计,我国50岁以上中老年人发病率为15%～30%。临床上常表现为咳嗽、咳痰,或伴有气短、喘息等,严重者可并发肺气肿、肺心病等。冬季气候干燥而寒冷,容易发生呼吸道感染,导致“老慢支”复发。哈药集团中药二厂研发的筋骨草胶囊对支气管炎有良好的疗效,具有较好的市场前景。该方法简便、快速,专属性强,重现性好,可用于筋骨草胶囊的含量测定,对指导临床用药具有积极意义。

摘要：目的建立筋骨草胶囊中木犀草素含量测定方法。方法采用HPLC法测定,色谱柱:Thermouest 250mm×4.6mm 5μm BDSC18。流动相:乙腈-0.4%磷酸水(29∶71)。结果木犀草素在0.0320～0.2723μg范围内呈良好的线性关系,r=0.9999,精密度RSD<1.27%,稳定性、重现性较好,回收率为100.9%,RSD=1.71%。结论该方法简便、快速,专属性强,重现性好,可用于筋骨草胶囊的含量测定。

关键词：筋骨草胶囊,木犀草素,含量测定,HPLC法

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2000.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.筋骨草胶囊.卫生部药品标准中药成方制剂第十九册[S].WS3-B-3704-98.

木犀草素 篇5

关键词：木犀草素,锌配合物,DPPH自由基,HPLC

木犀草素 (Luteolin) 是3′, 4′, 5, 7-四羟基黄酮类化物, 主要存在于菊花、透骨草、络石藤、金银花、羊乳等植物中[1]。其生物化学及药理作用具有多样性, 近年来研究表明其具有抗炎、抗肿瘤[2]、心脏保护作用[3]、呼吸系统影响[4]、免疫调节等活性。其金属配合物可增强原配体的生物活性[5], 而微量元素Zn具有许多药理、生物功能活性也是众所周知的。为此, 本文以木犀草素为原料, 合成木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物, 并利用高效液相色谱法对木犀草素及木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物抗DPPH自由基的活性进行研究。有关木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的抗氧化活性的研究鲜见文献报道。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

79-1磁力加热搅拌器 (山东鄄城华鲁电热仪器有限公司) ;SARTORIUS PB-S型酸度计 (Sartorius公司) ;DZF-6030A型真空干燥箱 (上海一恒科技有限公司) ; UV7501型紫外可见分光光度计 (无锡分析仪器有限公司) ;VERTEX70傅里叶变换红外光谱仪 (Bruker公司) ;Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国Agilent) ;Vario El元素分析仪 (德国, Elementar公司) 。

木犀草素98% (南京苏朗医药有限公司) ;1, 1-苯基-2-苦味苯肼DPPH (Sigma公司产品) ;除甲醇为色谱级外, 其他均为分析纯。

1.2 木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的合成及其结构表征

在30mL无水乙醇溶剂中加入0.5mmol木犀草素和0.5mmolZn (Ac) 2固体, 在60℃下搅拌溶解至溶液完全澄清时, 用1mol·L-1的NaOH溶液调节pH值为9.76, 再升高温度至80℃, 水浴回流磁力搅拌4h, 使其产生沉淀, 静置后离心, 沉淀用少量的乙醇及水分别洗涤数次, 将沉淀物于40℃真空干燥, 得到相应的配合物, 再称重并计算其产率。

产率 (%) =W/W0×100% (1)

式中:W—配合物的实际重量;W0—配合物重量的理论值

对所合成的木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物, 通过紫外光谱分析、红外光谱分析、热重差热分析及元素分析进行表征, 并确定其结构。

1.3 溶液的配制

样品溶液的配制:分别准确称取4.0mg木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物, 碱水溶解后, 将pH值调至7左右, 并用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中, 得浓度为0.04g·L-1的样品溶液, 分别将其配制成0.04、0.03、0.02、0.008、0.004、0.002g·L-1系列浓度的溶液。

对照液的配制:准确称取4.0mg木犀草素标准品, 用甲醇溶解后, 定溶于100mL的容量瓶中, 得浓度为0.04g·L-1的木犀草素甲醇溶液, 再将其配制成0.04、0.03、0.02、0.008、0.004、0.002g·L-1系列浓度的溶液。

DPPH溶液的配制:精密称取DPPH自由基7.8864g, 用甲醇溶解, 并定容在100mL容量瓶中, 摇匀得浓度为0.2mol·L-1的DPPH储备液, 冷藏备用, 使用前用甲醇稀释至浓度为0.02mol·L-1。

1.4 UV法测定DPPH自由基的清除率

准确吸取浓度为0.02mol·L-1 DPPH甲醇溶液2mL置于试管中, 再取对照品溶液、甲醇 (空白溶剂) 和不同浓度的样品溶液2mL, 并迅速混匀, 于37℃避光反应30min, 在波长517nm处测定各溶液中吸光度, 按下列公式计算清除率。

清除率:undefined

式中:Ai—加样液时DPPH溶液的吸光度;Aj—样液与空白溶剂的吸光度;A0—DPPH溶液与空白溶剂的吸光度。

1.5 HPLC法测定DPPH自由基的清除率

1.5.1 HPLC色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250mm×4.6mm id;流动相:甲醇-水=80∶20;柱温:25℃;流速:1.0mL·min-1;检测波长:517nm。

1.5.2 标准曲线的线性关系

以甲醇作为溶剂, 准确称取适量的DPPH, 将其分别配制成2mmol·L-1, 4mmol·L-1, 8mmol·L-1, 20mmol·L-1, 40mmol·L-1不同浓度的甲醇溶液, 在色谱条件下, 每个浓度平行进样3次, 以DPPH的浓度 (mmol·L-1) 对平均峰面积进行线性回归。

1.5.3 重复性和稳定性试验

准确吸取DPPH甲醇溶液, 重复进样5次, 测定DPPH峰的峰面积, 计算其 RSD%;每隔2h进样, 检测8h内DPPH峰的峰面积, 计算其RSD%。

1.5.4 DPPH自由基的清除作用

准确吸取浓度为0.02mol·L-1DPPH甲醇溶液2mL置于试管中, 再取不同浓度的样品溶液2mL, 并迅速混匀, 于37℃下避光反应30min, 立刻用0.45μm有机滤膜过滤, 20μL进样, 检测DPPH的峰面积, 空白组不加样品溶液, 按下列公式计算其清除率, 并计算木犀草素及其配合物的IC50值。

清除率:undefined

式中:

A0—体系中DPPH自由基的原始浓度

Aj—加入试样溶液后的DPPH自由基浓度

2 结果与讨论

2.1 木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的产率及表征结果

按公式 (1) 计算, 所合成木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的产率为68.76%;通过一系列的表征手段确定了该配合物的组成为:C15H9O6Zn (COOCH3) (H2O) ·H2O, 结构见图1。

2.2 UV法测定DPPH自由基清除率的结果

按公式 (2) 计算, 利用UV法测得木犀草素及其锌配合物对DPPH自由基的清除率, 见图2。

2.3 HPLC法检测对DPPH自由基的清除能力

2.3.1 三种化合物的HPLC检测图谱

在该色谱条件下DPPH自由基有色谱峰, 而木犀草素及其配合物则无色谱峰, 见图3。

2.3.2 标准曲线的线性关系考察结果

回归方程:Y=0.0587X+0.054;相关系数r=0.9996, 线性范围:2～40mmol·L-1。见图4。

2.3.3 重复性和稳定性试验结果

重复进样5次, 检测DPPH峰的峰面积, 求得RSD%为0.92%;每隔2h进样, 检测8h内DPPH峰的峰面积, 求得其RSD%为0.87%。结果说明该分析方法在8h内很稳定, 方法的重复性也很好。

2.3.4 HPLC法测得DPPH自由基的清除率

按公式 (3) 计算, 利用HPLC法测得木犀草素及其锌配合物对DPPH自由基的清除率, 见图5。

2.4 UV法与HPLC法的结果比较

两种方法对DPPH自由基的清除率结果见表, 比较两种方法所测的结果不难发现, UV法检测的结果要比HPLC法检测的结果偏高, 其主要原因是由于UV法在一定的波长下对反应体系进行检测, 检测的是吸光物质的总吸收, 而HPLC法则具有分离及分析两种功能, 能较好地避免体系中其他吸光物质的干扰, 准确地测定体系中真实的DPPH自由基的浓度。

2.5 抗DPPH自由基的测定结果分析

木犀草素及木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物对DPPH均有清除作用, 且随着浓度的增大清除作用也随之增加, 当浓度达到一定程度时, 清除率也趋于平衡状态, 木犀草素及其锌配合物的最大清除率分别为62.51%、79.01%, 其IC50值分别为0.014g·L-1、0.003g·L-1, 说明锌配合物对DPPH的清除作用要强于配体本身。

2.6 结构与抗DPPH自由基的关系

木犀草素及其配合物均以供氢的方式来终止自由基链式反应, 故木犀草素与其配合物在与DPPH自由基反应后所形成的苯氧自由基的稳定性决定了其抗氧化活性的大小。木犀草素与Zn2+配合后, 其分子的电子云分布发生离域, 更有利于B环上羟基的供氢, 从而使得配合物与DPPH自由基作用后, 形成了更加稳定的自由基中间体, 因此木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物抗DPPH自由基的活性要比配体木犀草素本身高。

3 结论

HPLC法比UV法能够更为准确地评价物质对DPPH自由基的清除能力;根据HPLC法的测定结果可知, 木犀草素及其锌配合物对DPPH自由基均有较强的清除能力, 但所合成的木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物对DPPH自由基的清除能力要强于其配体木犀草素本身。因此, 木犀草素与Zn2+进行络合后, 增强了配体本身抗DPPH的生物活性。

参考文献

[1]韩炜, 邢燕, 康廷国.木犀草素生物活性研究进展[J].云南中医中药杂志, 2010, 31 (4) :60-61

[2]肖大凯, 覃燕梅, 莫丽儿, 等.木犀草素对卵巢癌细胞株转移能力的影响[J].中国病理生理杂志, 2006, 22 (6) :1199-1202

[3]祝德秋, 刘康, 宋军娜, 等.木樨草素通过抑制血管内膜炎性反应改善溶血性磷脂酰胆碱所致大鼠主动脉内膜依赖性血管舒张功能性紊乱[J].中国新药与临床杂志, 2011, 30 (2) :141-150

[4]魏敏, 王君, 宋旭艳, 等.卷烟烟气中木犀草素和黄芩苷混合物对呼吸系统作用的研究[J].中国现代应用药学, 2011, 28 (3) :197-200

木犀草素 篇6

1资料与方法

1.1临床资料选用2012年1月—2014年3月河北省民政总医院神经内科收治的2型糖尿病合并脑梗死患者80例。全部病例在结合病史的基础上检测空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG),行脑CT或磁共振成像(MRI)检查,均符合2型糖尿病和急性脑梗死的诊断标准[3,4]。全部病例随机分为两组:常规用药治疗组(对照组)、木犀草素治疗组(观察组),每组40例。对照组男24例,女16例;年龄68.35岁 ±3.02岁;病程9.0年±5.1年;空腹血糖8.4mmol/L±1.46 mmol/L。观察组男22例,女18例;年龄69.86岁 ± 2.92岁;病程9.0年±4.3年;空腹血糖8.5mmol/L± 1.65mmol/L。两组患者在性别、年龄、病程、空腹血糖等方面差异无统计学意义(P >0.05)。治疗前,两组日常生活活动量表(ADL)评级差异无统计学意义(P >0.05),详见表1。

例

1.2治疗方法对照组给予脑梗死常规治疗及西药降糖,观察组在脑梗死常规治疗及西药降糖的基础上给予木犀草素制剂(脉舒胶囊,浙江康恩贝制药,批号: Z20033200),每次2粒,每日3次口服。每颗胶囊含木犀草素不少于5mg。两组均以15d为1个疗程。

1.3检测指标两组病例在治疗前和治疗1个疗程后进行神经功能检测。应用南京建成生物工程研究所的MDA测定试剂 盒 (TBA法 )、SOD测定试剂 盒 (WST-1法)、NO测定试剂盒(硝酸还原酶法)测定患者血清SOD、MDA和NO水平。

1.4疗效评定标准参照中华医学会(CMA)1995年第四届全国脑血管病学术会议通过的疗效评定标准[5]。

1.5统计学处理应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,治疗前后组内比较采用自身配对t检验,组间比较采用独立样本t检验,计数资料采用秩和检验。

2结果

2.1两组治疗前后神经功能缺损评分比较两组治疗后改良爱丁堡-斯堪的那维亚量表(MSSS)评分较治疗前明显降低(P <0.05),观察组MSSS评分降低更为明显(P <0.05)。详见表2。

分

2.2两组临床疗效比较(见表3)

2.3两组治疗前后血清SOD 、 MDA和NO的变化治疗前 , 两组血清SOD 、 MDA和NO差异无统计学意义 ( P >0.05 )。 治疗1个疗程后 , 两组SOD活力显著提高 ( P <0.01 ), MDA 、 NO含量显著下 降 ( P <0. 05 ), 且观察组SOD活力高于 对照组 ( P <0.01 ), MDA 、 NO含量低于对照组 ( P <0.05 )。 详见表4 。

3讨论

糖尿病患者患脑梗死的危险性为正常人群的1.5倍~3倍[6],并且致残率及病死率较高,其预后较非糖尿病脑梗死患者更差。活性氧基团(reactive oxygen species,ROS)产物的增加及抗氧化剂的减少在糖尿病血管损伤中起着至关重要的作用[7]。研究发现,脑梗死后在坏死和缺血区域,氧自由基增多,SOD、谷胱甘肽过氧化 物酶 (GSH-Px)等抗氧化 酶活性显 著下降[8]。生理情况下,NO参与调节脑血管基础张力,维持血管的舒张状态,保持正常脑血流量,而过量NO的产生和释放,则通过自由基或其他途径,促进脑梗死的进一步发展[9]。SOD能清除氧自由基,降低NO,从而增强NO的保护作用。

木犀草素是一种天然黄酮类化合物,多以糖苷的形式存在于多种植物中,具有多种药理活性如抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗过敏等,且能够通过血脑屏障。已有研究报道,木犀草素对糖尿病大鼠的肾脏具有一定的保护作用[10]。本研究结果表明,观察组患者MSSS评分低于对照组(P <0.05),治疗总有效率高于对照组(P <0.05),提示木犀草素可提高2型糖尿病合并脑梗死患者的临床疗效。通过对患者血清的检测,发现木犀草素可以使患者血清SOD水平显著升高(P < 0.01),明显高于常规治疗组(P <0.01)。SOD是作用最强的抗氧化物酶,通过歧化反应清除氧自由基,可缓解氧化应激反应导致的血管损伤,也可缓解坏死和缺血区域的氧自由基对脑组织的进一步损伤。MDA是脂质过氧化反应产生的有毒的脂质过氧化物,既能直接反映机体脂质过氧化反应的程度和水平,又能间接反映机体清除自由基的能力[11]。本研究中观察组患者血清MDA显著降低(P <0.05),并明显低于对照组(P <0.05)。已有的研究证明,在脑缺血后增加SOD等抗氧化物活性,以及减少MDA的含量可以保护脑组织,这可能是木犀草素发挥脑组织保护作用的机制之一。

脑内NO的作用是双重性的,低浓度NO对脑组织有保护作用,过量NO的合成与释放又有神经毒性作用。本研究发现木犀草素可使NO产生减少,显著降低患者血清NO。因此木犀草素可以减轻NO明显增高引起的脑组织损伤,从而起到对脑的保护作用。