外显子4

外显子4（共7篇）

外显子4 篇1

0 引言

MHC(major histocompatibility complex)，即主要组织相容性复合体，作为动物抗病力的遗传标记，在辅助抗病性选择上发挥着重要的作用[1,2]。猪的MHC称为SLA(swine leukocyte antigen)复合体，按其结构、分布和功能主要有三大类基因，其中Ⅱ类基因控制着机体的免疫应答与免疫调节，主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DPB、DPA、DZA和DOB等。近年来，SLA-DQB基因的多态性及相关研究成为国内外的热点[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。引进猪种在这方面的研究报道很少，中国马身猪还尚未有报道。本研究拟采用PCR-RFLP法对大白猪、长白猪、杜洛克猪和马身猪SLA-DQB基因外显子2进行多态性研究，了解这些品种在该位点的遗传变异，为研究SLA与抗病育种、经济性状的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

实验猪选自山西省大同市种猪场。大白猪36头、杜洛克猪26头、长白猪36头和马身猪52头。实验所用的引物(Forward:5'-cggaattccccgcagaggatttcgtgtacc-3';Reverse:5'-ccgtcgtgccttcctctat-3')是参照文献[13]设计的，扩增片段长度为273 bp，由大连宝生物工程有限公司合成。

1.1.2 试剂

乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、d NTPs、Tris饱和酚、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴酚蓝、二甲苯青、RNA酶(RNase A)、蛋白酶K(Proteinase K)、DL 1000 Marker、50 bp Marker购自北京鼎国生物技术发展中心;琼脂糖(Agrose)由北京邦定泰克公司Promega分装;甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸胺等购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Taq DNA聚合酶、限制性内切酶HaeⅢ购自大连宝生物工程有限公司;EB为Sigma公司分装。

1.1.3 仪器设备

FA1604型电子天平(上海天平仪器厂);MCS-3020型高温全自动蒸汽灭菌器(日本SANYO电子有限公司);MAXIMA型超纯净水系统(英国ELGA);SIM-F124型制冰机(日本SANYO电子有限公司);003430型超低温冰箱(丹麦Heto);凝胶成像系统(美国UVP);PHS-3C型酸度计(厦门分析仪器厂);TGL-16G-A型台式高速冷冻离心机(上海安庆科学仪器厂);SBD50型恒温水浴摇床(丹麦Heto);Gene Amp PCR System PTC200型基因扩增仪(MJR,USA);SKFG-01B型电热恒温鼓风干燥箱(湖北省黄石市医疗机械厂);DYY-Ⅲ-12B型三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂);DY-W1型电泳仪(北京试验设备厂);QL-901旋涡混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂);电泳槽(北京六一仪器厂);KD21B-D型微波炉(中国Midea)。

1.2 方法

1.2.1 SLA-DQB基因的PCR扩增

PCR扩增的反应体系为20μl，其中10×buffer(Mg2+)2.0μl,250μmol/L的d NTPs,10 pmol的引物，基因组DNA约50ng,1.0 U Taq酶。

PCR扩增的条件:94℃变性5 min→94℃30 s→56.8℃30 s→72℃30 s→循环30次→72℃伸长8 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。

1.2.2 SLA-DQB基因的PCR-RFLP

利用限制性内切酶HaeⅢ对所扩增的产物进行酶切消化处理。酶切反应总体积12μl，包括PCR产物10μl,HaeⅢ0.3μl(10 U/μl),10×Buffer 1.2μl,dd H2O 0.5μl,37℃反应过夜。酶切反应完成后，用14%PAGE检测酶切结果，并判断基因型。

1.2.3 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行基因频率和基因型频率计算及Hardy-Weinberg平衡的χ2适合性检验。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增的结果

用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所有实验猪的SLA-DQB基因的外显子2的PCR扩增产物，均显示一条如图1的特异性条带，长度为273bp，符合预期的扩增片段的长度，可进行RFLP分析。

注解:泳道1～5:PCR产物;泳道6:DL 1000 Marker。

Note:Lanes 1-5:PCR products;Lanes 6:DL 1000 Marker.

2.2 PCR扩增产物的酶切结果

所有试验猪的SLA-DQB基因的外显子2的PCR扩增产物经过HaeⅢ酶切后，共检测出4个等位基因:A(167bp/23bp/29bp/54bp)、B(84bp/83bp/23bp/29bp/54bp)、C(167bp/4bp/102bp)和E(106bp/84bp/54bp/29bp);5种基因型(图2)，分别为AA(167bp/23bp/29bp/54bp)、BB(84bp/83bp/23bp/29bp/54bp)、AB(167bp/84bp/83bp/23bp/29bp/54bp)、AC(167bp/4bp/102bp/23bp/29bp/54bp)和AE(167bp/106bp/84bp/23bp/29bp/54bp)。

χ20.05(1)=3.84，χ20.01(1)=6.63。

在图2中，低于83bp的带型均未显示，这是因为在电泳的过程中，较短片段的带型发生了弥散，还有83bp和84bp仅仅相差一个碱基，造成这两条带型无法分开而显示出一条带。

注解:泳道1～3:BB、AB、AA;泳道4:M(50 bp Marker);泳道5～9:AC、AE、AB、AC、AA。

Note:Lanes 1-3:BB,AB,AA;Lanes 4:M(50 bp Marker);Lanes 5-9:AC,AE,AB,AC,AA.

2.3 SLA-DQB基因外显子2的PCR-RFLPs的基因型及等位基因频率分布

由表1可知，在HaeⅢ-RFLP位点上，被检测的猪群除杜洛克猪外均表现多态性。在大白猪和马身猪中，检测到A、B、C和E等4个等位基因，A等位基因频率较高，分别为0.528和0.587;在长白猪中，检测到A、B和E等3个等位基因，频率分别为0.611、0.278和0.111;就基因型频率分布来看，在大白猪和长白猪群体中，AB型占优势，频率分别为0.444和0.556;在马身猪中，AC型个体占优势，频率为0.731;杜洛克猪在该位点均表现为BB型。适合性检验表明，大白猪和杜洛克猪在该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，而长白猪和马身猪在该位点不处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。

3 讨论

长期的进化过程可使生物种群内某些个体的基因发生突变，并产生复等位基因，从而导致合成不同类型的蛋白质。MHC的变异可反映基因组水平的变异[14]。董高华等(2012)[8]研究表明野猪SLA-DQB基因外显子2具有丰富的核苷酸多态性;杨涛等(2011)[15]研究表明藏猪MHC-DQB1第4内含子有遗传多态性。本研究采用PCR-RFLP法对大白猪、长白猪、杜洛克猪和马身猪等4个猪种SLA-DQB基因外显子2的多态性进行探讨，研究结果显示，该基因的外显子2经HaeⅢ酶切后，共检测出A(167bp/23bp/29bp/54bp)、B(84bp/83bp/23bp/29bp/54bp)、C(167bp/4bp/102bp)和E(106bp/84bp/54bp/29bp)等4个等位基因，5种基因型:分别为AA(167bp/23bp/29bp/54bp)、BB(84bp/83bp/23bp/29bp/54bp)、AB(167bp/84bp/83bp/23bp/29bp/54bp)、AC(167bp/4bp/102bp/23bp/29bp/54bp)和AE(167bp/106bp/84bp/23bp/29bp/54bp)，显示有丰富的多态性，且为多碱基突变，与SLA-DQB基因已被证明存在丰富的多态性相一致[16,17]。

本研究检测到的B、C基因与包文斌等(2007)[18]研究苏太猪、吴圣龙等(2007)[19]研究三个江西省地方猪种发现的B、C基因相一致。陈江伟等(2010)[20]对广西巴马小型猪的研究发现SLA-DQB基因外显子2无多态性位点，可能与长期封闭选育导致基因座纯合及采集的样本数量较少有关。包文斌等(2009)[21]对19个猪种进行检测，其中杜洛克中仅检测到BB基因型，本实验检测结果与其相同，说明杜洛克猪SLA-DQB第2外显子比较保守，未发生突变。本实验检测到的A和E基因还没有报道。

纵观前人和本实验研究结果，SLA-DQB基因外显子2多态性非常丰富，且在不同的猪种产生不同的等位基因，这可能受生态环境和遗传纯度影响。SLA基因与生长、胴体品质、肉质以及繁殖性状均存在一定的关联性[22]。本研究中，长白猪未检测到C基因，杜洛克猪只检测到B基因，大白猪和马身猪分别以A、B基因和A、C基因为优势基因，这些是否与猪种的特有特性有关还需进一步研究。从基因型频率分布来看，大白猪和长白猪AB型占优势，马身猪AC型个体占优势，杜洛克猪在该位点仅表现为BB型。不同的基因型对猪重要经济性状及抗病力产生何种影响有待于更深入的研究。因此，要想利用SLA-DQB基因多态性为抗病育种及标记辅助选择提供指导，今后还需要对SLA-DQB基因有更加全面的了解。

本研究中，大白猪、杜洛克猪、长白猪和马身猪等4个猪种SLA-DQB基因外显子2多态性具有明显差别。

致谢:衷心感谢大同市种猪场的领导和饲养员在实验猪耳组织的采样过程中给予的大力支持!

外显子4 篇2

猪的主要组织相容性复合体又称为猪白细胞抗原( Swine lymphocyte antigen,SLA) ,是一个高度多态紧密连锁的基因家族［1］。SLA基因编码白细胞抗原,与机体抗病力有密切的关系［2］。猪SLA定位于7号染色体上,由SLAⅠ、SLAⅡ和SLAⅢ三个基因簇共同组成［3］,其中SLAⅡ类基因一直是国内外研究的热点,它主要包含 α 链上的DRA和DQA基因以及 β 链上的DRB和DQB基因,α 链基因由4个外显子组成,外显子1编码前导序列,外显子2和3分别编码 α1和 α2功能区,外显子4编码跨膜区和胞内区［4］。现已证实SLA Ⅱ 类分子具有丰富的多态性［5］,这种多态性与猪的免疫能力等生物学特性有密切的联系［6］。前人对猪的SLA基因研究主要集中在多态性比较丰富的SLAⅡ类分子的DQA、DRB和DQB上,研究发现其多态性与生长性能、初生重和30日龄体重、繁殖性能密切相关［7 － 9］。对DRA基因的研究报道较少,仅见杨巧丽等［10］对3个引进品种的DRA基因4个外显子进行了全面分析并发现其外显子4的多态性可能与仔猪的腹泻抗性相关。对于我国地方猪种DRA基因第4外显子的研究还未见报道。

互助八眉猪是在青海特定高原生态环境条件下,经过长期自然和人工选择而形成的地方特色纯种猪。该品种猪具有适应性强、抗逆性好、产仔数多、肉质好、遗传性状稳定、对近交有抗力等特性［11］。八眉猪与引进猪种长白和大白的二元、三元杂交中表现出明显的杂种优势［12 － 14］,是培育高原特色瘦肉型猪新品系的基础猪种［15］。Fang M Y［16］对八眉猪SLA - DQB基因多态性进行研究,共检测到3个等位基因。刘丽霞等［17］对八眉猪DQA基因编码区的多态性及生物信息学分析发现该基因可能对八眉猪的免疫力和生产力起到较高的调节能力。本研究选取互助八眉猪为研究对象,采用PCR - SSCP和克隆测序方法对SLA - DRA基因第4外显子的多态性进行分析,旨在丰富八眉猪MHC基因库,并为八眉猪的抗病性基因的筛选提供分子理论资料。

1材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1实验材料

实验材料采自青海省互助八眉猪保种厂的203头哺乳期仔猪,采取出生1 w内的仔猪耳组织。采样前对每头仔猪的耳组织进行酒精消毒,然后剪取其耳组织约5g,置于盛有75 % 酒精的5 m L Eppend- off管中冷冻保存,采样结束后带回实验室于- 20℃ 冰箱保存备用。

引物根据Gen Bank公布的SLA - DRA基因全序列( 登录号AY303990) ,利用Primer 5. 0软件进行设计。SLA - DRA exon 4引物序列分别为F: 5’- TC- CCGTAATACATCGTTC - 3’,R: 5’- TTCCTTTCCTT- GGCTCAT - 3’。预期扩增的目的片段长度约为357 bp,包含完整的第4外显子和部分第3、4内含子,引物由大连宝生物有限公司合成。

1. 1. 2试剂

三羟甲基氨基甲烷( Tris) 、十二烷基磺酸钠( SDS) 、乙二胺四乙酸二钠( EDTA) 、EDTA - Na2、 Tris平衡酚采购自北京索莱宝科技有限公司; 琼脂糖( 西班牙Biowest公司) ; 丙烯酰胺( Acr) 和N,N - 亚甲基双丙烯酰胺( Bis) ( 美国Amersco公司) ,去离子甲酰胺采购自上海生工生物工程技术服务有限公司; N,N,N',N’- 四甲基乙二胺( TEMED) 采购自上海捷瑞生物工程有限公司; 氨苄青霉素采购自北京索莱宝科技有限公司; 蛋白酶K、X - gal、PTG、基因组DNA提取试剂盒、Taq酶、d NTP、DNA Marker、 p MDTM19 - T载体和E. coli JM109感受态细胞均采购自大连宝生物有限公司。

1. 1. 3仪器设备

移液器( 德国Eppendorf公司) ; 超纯水系统Ari- um 611( 德国Sartorius公司) ; 层析柜MPR - 720和低温冰箱MDF - U541 ( 日本SANYO电子有限公司) ; 自动平衡离心机Labofuge 200和高速冷冻离心机D - 37520( 德国Eppendorf公司) ; 紫外可见分光光度计SP - 1900UV( 上海光谱仪器有限公司) ; 梯度PCR仪Tgradient、电泳系统P25 + Agagel和普通PCR仪T1( 德国Biometra公司) ; 凝胶数字成像系统Bi O - BEST 140E( 美国西蒙公司) ; 三恒多用电泳仪DYY - 12和双垂AB204 - S直电泳槽DYY - 24A ( 北京六一仪器厂) ; SBD50型恒温水浴摇床( 丹麦Heto公司) 。

1. 2方法

1. 2. 1基因组DNA提取

采用酚氯法提取基因组DNA,琼脂糖电泳检测条带清晰且无明显拖尾现象的DNA样品置于- 20 ℃ 保存备用。

1. 2. 2引物设计及PCR扩增

PCR反应总体系为25 μL,各成分用量为: 10 × PCR Buffer 2. 5 μL,d NTP ( 2. 5 mmol / L) 2 μL,上下游引物各0. 5 μL ( 10 pmol/μL) ,Taq酶0. 5 μL ( 5 U/μL) ,DNA模板1 μL( 50 ~ 100 ng /μL) ,灭菌dd H2O 18 μL。 PCR体系反应条件: 94℃ 预变性8 min→94℃ 变性30 s→53. 8℃ 退火30 s→72℃ 延伸90 s→ 35个循环 →72℃ 延伸5 min,4℃ 保存。将PCR产物用2% 琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1. 2. 3 PCR产物的SSCP检测

取6 μL变性剂与2 μL PCR产物均匀混合, 98℃ 变性10 min,迅速冰浴10 min。随后将冰浴好的混合液经10% 非变性聚丙烯酰胺( Acr∶ Bis =29∶1) 凝胶,10℃条件下进行电泳,300 V 30 min,然后200 V 20 h。电泳结束后对凝胶进行银染观察结果。

1. 2. 4克隆测序

经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析后,选取不同基因型的纯合子个体的PCR产物进行双向测序。 杂合子个体的PCR产物纯化后连接并转化大肠杆菌DH5α 菌株,阳性菌落菌液经SSCP鉴定后进行测序,测序由上海生工完成。

1. 2. 5数据统计分析

通过Popgene 32软件对八眉猪基因的纯合度( Ho) 、杂合度( He) 、有效等位基因数Ne和多态信息含量( PIC) 进行处理计算,进行Hardy - Weinberg平衡检验,并对第4外显子的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对研究分析。

2结果与分析

2. 1八眉猪DRA基因第4外显子PCR扩增

对203头八眉仔猪的DNA样品进行扩增后,检测后均得到一条如图1所示的特异性好、条带清晰、 长度约为357 bp的PCR产物,且与预期的目的片段大小一致。

图 1 DＲA 基因第 4 外显子扩增产物电泳图注解: M: marker; 1 ～ 12: PCＲ 产物。Figure 1 PCＲ products of DＲA gene exon 4Note: M: marker; 1 － 12: PCＲ products．

2. 2八眉猪DRA基因第4外显子SSCP检测

对八眉猪DRA基因第4外显子的扩增产物进行SSCP检测分析,共检测到3种等位基因,分别标记为A、B和C,共形成3种基因型( 图2) : AA、 BB、BC。

2. 3八眉猪DRA基因第4外显子的不同等位基因的核苷酸序列和氨基酸序列比对

将发现的3个等位基因序列提交到Gen Bank数据库,并获得登录号分别为: KP324810、KP324811和KP324812,与太湖猪DRA基因序列( 登录号AY303990) 进行对比,结果如图3所示。等位基因A与AY303990序列完全相同,等位基因B共有3个变异位点,分别为c. 4167A > G、c. 4246A > G和c. 4282C > T。等位基因C仅有1个变异位点( c. 4246A > G) 。经过氨基酸序列对比分析可知,仅有等位基因B的c. 4167A > G为错义突变,导致谷氨酰胺( Q) 突变为精氨酸( R) ( 图4) 。

图 3 八眉猪和太湖猪 DＲA 基因第 4 外显子等位基因序列比对注解: 圆点代表碱基相同，字母代表碱基发生改变。Figure 3 Alignment of the DＲA Allelic sequences in exon4 in Bamei pig breeds and Taihu pigsNote: Dots indicate identity with the nucleotides in AY303990，and letters show substitutions and transversion．

图 4 八眉猪和太湖猪 DＲA 基因第 4 外显子氨基酸序列比对注解: 圆点代表氨基酸相同，字母代表氨基酸发生改变。Figure 4 Alignment of the DＲA Anino acid sequences in exon 4 in Bamei pig breeds and Taihu pigsNote: Dots indicate the same amino acid as AY303990，and letters show substitutions of amino acid．

2. 4八眉猪DRA第4外显子的基因型频率和等位基因频率

八眉猪DRA第4外显子的基因频率和等位基因频率见表1。DRA外显子4的3种基因型中,BC的频率为0. 7241,为优势基因型; 3种等位基因即A、B、C中,B为优势等位基因( 0. 4803) 。

2. 5八眉猪DRA基因第4外显子的多态性分析

遗传杂合度( He) 的高低体现遗传多样性的丰富度,同时反映遗传的变异程度高低,而多态信息含量( PIC) 越高则基因的多态性越高。八眉猪群体遗传学参数和卡方检验结果见表2,研究结果显示,八眉猪DRA第4外显子的遗传杂合度( He) 较高( 0. 7241) ,多态信息含量为0. 3953 ,介于0. 25和0. 5之间,这说明八眉猪DRA第4外显子是中度多态的。八眉猪DRA第4外显子的 χ2值极显著高于0. 01的临界值( p < 0. 01) ,由此可见该群体极显著地偏离了Hardy - Weinberg平衡状态。

*Hardy Weinberg平衡检验差异极显著p<0.01.

3讨论

生物在生存环境与病原体压力驱动下会产生基因水平上的差异,发生核苷酸的替换导致基因突变, 从而体现MHC的多态性［18］。MHC分子的高度多态性主要是由长期的自然选择与进化过程中等位基因的积累和融合而产生的［19］。因此,通过MHC分子的SNPs分析,可以有效地评估群体遗传多样性水平［20］。研究者对绵羊、马和林麝等的MHC - DRA基因多态性进行研究,发现绵羊属于单态,林麝属于低度多态,而马属于中度多态［21 － 23］。前人对猪SLA - DRA基因的研究结果也不尽一致,Sach D H［24］和Chardo P［25］认为SLA - DRA是一个单态基因,Niels- en V H［26］则通过酶切法证实SLA - DRA基因存在多态性,刘榜等［27］通过对3个外来猪种研究发现一个新的SLA - DRA等位基因,孙俊丽等［28］在五指山猪上也发现SLA - DRA基因的等位基因,姜平等［29］通过对荷包猪序列分析发现,DRa - HB基因也具有一定的多态性,杨巧丽等［10］在3个引进品种的DRA基因第4外显子上检测到6个SNPs,并发现该基因可能影响仔猪对腹泻的抗性或易感性。

八眉猪DRA基因外显子4仅有3个SNPs,明显低于引进猪种( 10个SNPs) ,其中c. 4167A > G和c. 4246A > G在大白猪和长白猪中也存在,表明八眉猪DRA第4外显子的遗传性状较为稳定。本研究得出的3个等位基因在引进猪种中也检测到,但各等位基因在不同猪种中的分布有差异,八眉猪的B等位基因为优势基因,而引进猪种的A等位基因为优势基因,说明这3种等位基因可能存在于大多数猪种中,但在不同猪种间可能存在分子水平上种内遗传差异。DRA基因第4外显子主要编码免疫分子的跨膜区和胞内区［4］。八眉猪在4 167处发生A/G的转换使Gln突变为Arg,导致氨基酸由中性变为碱性, 这可能会影响蛋白质的理化特性和稳定性［30］,从而改变其免疫分子的功能。

对群体而言,多态信息含量( PIC) 、杂合度( He) 和有效等位基因数( Ne) 值的高低均可反映群体内个体间差异,其值越大,则遗传变异性就越大,适应环境的能力就越强,选择的潜力也越大,有利于遗传育种。八眉猪DRA基因第4外显子的基因型BC频率比纯合子AA和BB都高,总体杂合度( 0. 724 1) 较高,表现出杂合子优势,而八眉猪的PIC值介于0. 25和0. 5之间,仅为中度多态,这表明八眉猪DRA基因第4外显子的遗传变异性较高而其多态性较低。与3个引进品种进行比较发现,八眉猪杂合度高于引进品种,表明八眉猪具有更高的环境适应能力,而八眉猪多态信息含量低于大白和长白猪［10］, 表明八眉猪遗传性状较为稳定,这些均有利于地方品种猪的保种和杂交改良。八眉猪DRA基因第4外显子的基因型频率偏离了Hardy - Weinberg平衡状态,这可能是人工选择产生的影响而造成了八眉猪基因型的分布不平衡,也有可能是由于SLA复合体本身易产生连锁不平衡和人工选择因素叠加所致。

4结论

八眉猪DRA基因第4外显子具有一定的多态性,属于中度多态基因,具有较高的遗传变异性,且偏离了Hardy - Weinberg平衡。

摘要：[目的]研究八眉猪SLA-DRA基因第4外显子的多态性,确定其等位基因数以及核苷酸和氨基酸变异位点,探讨其遗传特性。[方法]采用PCR-SSCP和克隆测序的方法对八眉猪SLA-DRA基因第4外显子进行多态性检测。[结果]八眉猪SLA-DRA基因第4外显子共有3种等位基因(A、B、C),形成3种基因型(AA、BB、BC),其中B为优势等位基因,BC为优势基因型。序列对比结果表明,八眉猪SLA-DRA基因第4外显子共有3个核苷酸突变位点(c.4167A>G、c.4246A>G和c.4282C>T),其中4 167 bp的突变导致谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)。群体遗传学分析表明,八眉猪SLA-DRA基因第4外显子的多态信息含量为0.3953,杂合度为0.7241,且八眉猪在SLA-DRA基因第4外显子上偏离了Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)。[结论]八眉猪SLA-DRA基因的第4外显子属于中度多态,并呈现出杂合子优势。

外显子4 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取笔者所在医院2008年7月-2013年6月就诊的90例重症肌无力患者作为MG组。诊断标准:典型临床表现、新斯的明试验、重频试验、单纤维肌电图检查。经笔者所在医院伦理委员会批准, 所有患者均签署知情同意书。其中男44例, 女46例, 均为汉族, 平均发病年龄为 (37.54±16.10) 岁, 平均病程为 (35.74±49.93) 周。胸腺CT或手术提示, 胸腺瘤19例 (21.11%) , 胸腺增生15例 (16.67%) 。合并甲状腺功能亢进者10例 (11.11%) 。复发病32例 (35.56%) , 并发危象9例 (10.00%) 。根据Osserman的分型标准:Ⅰ型31例 (34.44%) ;Ⅱa型14例 (15.56%) ;Ⅱb型30例 (33.33%) ;Ⅲ型7例 (7.78%) ;Ⅳ型8例 (8.89%) ;Ⅴ型0例。另外选取同一时期在厦门大学附属中山医院进行体检的90例健康体检者或志愿者作为对照组, 无自身免疫性疾病、与患者无血缘关系、近1个月无感染病史。对照组经Hardy-Weinberg定律检验后证实无选择性偏倚。两组患者的年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

总结CTLA-4基因外显子49位点多态性与MG的发病年龄、性别、病程、有无复发、危象、胸腺瘤、合并甲亢、治疗等相关性。

1.2.1 PCR扩增

QIAGEN公司提供的DNA提取试剂盒提取DNA, +49位点的PCR引物序列 (上海生工生物技术公司合成) 、退火温度和片段长度见表1。

1.2.2 CTLA-4的外显子1区+49位点的PCR反应体系

dd H2O 17μl, 10×Buffer 2.5μl, Mg Cl2 (25 mmol/L) 1.3μl, d NTP (2.5 mmol/L) 0.5μl, 上游引物 (10μmol/L) 1.1μl, 上游引物 (10μmol/L) 1.1μl, DNA模板1.5μl。

1.2.3反应条件

BIORAD公司的PCR自动扩增仪扩增。扩增条件:95℃变性5 min, 随后35次循环为95℃持续30 s, 以相应的退火温度59℃, 退火45 s, 72℃1 min, 最后延伸时间为72℃5 min。PCR产物限制性片段长度多态性分析方法。

1.2.4 结果判定

49位点GG型存在的判定标准为146和25 bp大小的片段;AA型仅见171 bp片段;AG型可见171、146和25 bp片段, 具体见图1。

1.3 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件对所得数据进行统计分析, 分类变量用频率描述, 数值变量用 (±s) 表示, HardyWeinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律;基因型和等位基因频率用直接计数法, 差异比较采用χ2检验或Fisher确切概率法, 检验均为双侧检验, 统计学意义显著区间为P<0.05。

2 结果

2.1 MG组和对照组的CTLA-4基因+49A/G的基因型、等位基因分布差异

比较MG组和对照组CTLA-4基因的+49A/G位点的AA、AG、GG三种基因型频率的差异;两组均P>0.05, 说明MG组和对照组的49A/G位点的基因型和等位基因比较均无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。

2.2 MG组性别与CTLA-4的+49A/G多态性相关性

比较MG组中男女两组CTLA-4基因的+49A/G位点基因型频率的差异;其中χ2GG=4.41, P=0.04提示两组之间GG基因型频率差异具有统计学意义, 见图2;而其他基因型和等位基因均无统计学意义, 见表3。

注:a为Fisher确切概率法

2.3 MG组临床分型与CTLA-4的+49A/G多态性相关性

不管根据发病年龄分为早发型 (发病年龄<40岁) 和晚发型 (发病年龄>40岁) , 还是比较眼肌型组、非眼肌型, MG两组在+49A/G位点的基因型频率和等位基因的差别, 两组之间比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表4。说明两组之间MG的+49 A/G位点的基因型和等位基因的比较差异均无统计学意义。

2.4 MG组临床特征与CTLA-4的+49A/G相关性

研究胸腺异常 (胸腺瘤+胸腺增生患者) 与胸腺正常患者之间在CTLA-4的+49A/G多态性的相关性;两组之间比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 说明胸腺异常 (胸腺瘤+胸腺增生患者) 与胸腺正常之间在+49A/G位点的基因型和等位基因频率的差别无统计学意义。观察有无复发病史的MG患者在+49A/G位点的基因型和等位基因频率的比较, 两者之间比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表5。表明有无复发病史之间差别无统计学意义。

3 讨论

MG是抗乙酰胆碱受体抗体介导、细胞免疫依赖补体参与的神经肌肉接头处自身免疫病。随着分子生物学技术的进展, 逐渐证明MG是一种遗传异质性疾病, 与多基因表达和调控异常有关[1]。人们不仅已发现不同地区和种族的MG患者与相关HLA的表型的基因多态性有关;而且还发现非HLA的表型基因多态性如CTLA-4基因多态性可合并胸腺瘤[2,3,4], 也在MG的发病中发挥重要作用。其中CTLA-4在免疫反应中能与CD28竞争性结合B7-1、B7-2, 维持免疫耐受和防止产生自身免疫性疾病发挥最大效应发挥重要作用。关于CTLA-4的基因多态性在MG的作用已经引起人们的关注。

注:a为Fisher确切概率法

注:a为Fisher确切概率法

本研究发现, 福建地区MG人群的+49A/G位点基因型和等位基因频率与汉族正常对照组差异没有显著性统计学意义, 表明携带外显子+49A/G基因型尚不能认为易发MG, 提示+49A/G位点可能不是汉族MG的易感基因。其中+49A/G位点在MG组基因型、等位基因频率和正常对照组无统计学差异与Wang等[5]报道的101例瑞典人、Fernandez-Mestre等[6]的委内瑞拉人群的研究结果一致;与毛海婷等[7]报道的瑞典白人的结果相反。研究结果的不同考虑与样本大小、种族、年龄结构、性别比例和其他的环境因素有关, 这些因素中任何一种因素不一致都可能使整个实验得出完全不同的结果。

在MG中, 女性比男性更具有易感性, 男女之间也有不同的发病高峰[8]。本研究发现, 男性MG组CTLA-4的+49A/G位点的GG基因型高于女性患者, 表明携带GG基因型的男性患者比女性患者更易发生MG。说明性别不同, 易感基因和基因型不同。男女患者之间易感基因的不相同, 也可能导致男女患者之间的发病高峰不同。但是在初发年龄却没有差异。有待增加研究病例数进一步确认。

文献[5-7]的研究结果认为, 在MG合并胸腺瘤患者中+49A/G位点的AA基因型和A等位基因都是易感的等位基因。虽然MG患者胸腺瘤微环境会导致T细胞不耐受、保留较强的诱导CD4+CD8+T细胞等功能改变[9,10]。但是本研究由于样本量限制, 胸腺瘤患者较少, 故分析胸腺异常 (胸腺瘤+胸腺增生) 与胸腺正常患者之间的+49A/G位点等位基因的差异, 却没有统计学意义。为深入探讨是否不同的MG临床亚组间由CTLA-4的基因多态性导致的遗传易感性不同, 笔者比较了眼肌型、非眼肌型各亚型之间+49A/G位点基因型和等位基因频率并没有差别。在是否有危象病史方面并无相关性。但是在研究MG复发组与无复发组之间在CTLA-4的基因易感性上的差异中发现, +49A/G位点的基因型没有差别。出现矛盾结果可能原因: (1) 种族、地区差异; (2) 研究的样本数有限, 可能导致比较微弱的相关性被忽视掉; (3) 实验方法的差异。

总的来说, 福建地区MG人群的+49A/G位点基因多态性与性别有关, 但与具体发病无明显相关性。由于各研究者对取样人群遗传背景不同、各人群的遗传结构有差异、疾病的遗传异质性、使用的试验方法和统计方法的差异、样本量过小以及环境风险因素的干扰等因素使CTLA-4基因多态性与MG的相关性研究结果常常不尽一致。

参考文献

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[3]Huang D R, Zhou Y H, Xia S Q, et al.Markers in the promoter region of interleukin-10 (IL-10) gene in myasthenia gravis:implications of diverse effects of IL-10 in the pathogenesis of the disease[J].J Neuroimmunol, 1999, 94 (1-2) :82-87.

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外显子4 篇4

试验选取贵州黑山羊和黔北麻羊为样本构建DNA池,利用PCR产物直接测序法对贵州黑山羊和黔北麻羊的THRSP基因第1外显子进行SNPs检测,采用生物信息学分析软件对多态位点进行预测分析,为研究THRSP与肉质性状关联性奠定理论基础。

1 材料

1.1 试验动物

黔北麻羊(109只),均由贵州省遵义市习水县黔北麻羊中心产区提供;贵州黑山羊(103只),均由贵州省赫章县黑山羊中心产区提供。试验羊采用颈静脉取血,ACD抗凝,于-80℃冰箱内保存,备用。

1.2 主要试剂

血液基因组DNA提取试剂盒、Goldview染料、DL-2 000 Marker、2×Taq PCR Master Mix试剂、琼脂糖等,均由鼎国生物工程技术有限公司生产;TAE缓冲液、双蒸水等,均由贵州大学动物科学学院实验室自制。

1.3 主要仪器

PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、凝胶成像分析系统(Universal HoodⅡ)、电泳仪(Power PacTMHV Power Supply),均由美国Bio-Rad公司生产。

2 方法

2.1 全血基因组DNA的提取

根据全血基因组提取试剂盒的步骤从试验羊只血液中提取基因组DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度,采用紫外分光光度计测定样品浓度,试验个体的DNA样品浓度调整至100 ng/μL,各取1μL等量混合构建DNA池,于-20℃冰箱保存,备用。

2.2 引物的设计及合成

根据NCBI上公布的黑山羊THRSP基因的DNA全基因组序列(Gen Bank登录号为NC_022321),利用在线软件Primer BLAST设计引物,扩增THRSP基因外显子1序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,结果见表1。

2.3 PCR反应体系及扩增条件

结果见表2。

μL

PCR扩增程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,退火30 s(退火温度见表2),72℃延伸30 s,共35个循环;72℃再延伸5 min;4℃保存。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,用凝胶成像分析系统(Universal HoodⅡ)拍照观察其特异性。将特异性良好的PCR产物送上海英骏生物有限公司进行单向测序。

2.4 等位基因峰高测量及频率估算

用DNAStar软件中的Seq Man程序对目的片段的序列进行比对分析,用BLAST程序分析确定其SNPs。利用软件MWSnap和Chromas中的标尺测量各SNPs位点等位基因的相应峰高,并根据峰高比值利用以下公式估算等位基因频率。xi=li/(l1+l2),i=1,2。式中:xi表示该SNPs位点等位基因频率;l1和l2分别表示该SNPs位点测序峰图上2个等位基因各自峰高。

2.5 THRSP基因的生物信息学分析

利用mRNA二级结构在线预测对THRSP基因突变前后的序列进行RNA二级结构预测和分析。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增片段的检测

用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的特异性,电泳后观察到PCR扩增产物与所需目的片段大小一致,扩增特异性良好,可用于测序,结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.黔北麻羊;2.贵州黑山羊。

3.2 PCR产物序列分析

应用DNAStar中的Seq Man软件对PCR扩增产物进行序列分析,发现2个多态位点(见294页彩图2),分别为A341G、G365A(分别以THRSP基因第1外显子的第1位为+1位计)。

3.3 SNPs等位基因频率估算

对这2个山羊品种中存在的2个SNPs位点,利用MWSnap软件中的标尺分别测量其峰高,并根据等位基因频率估算公式估算各位点等位基因频率,结果见表3。

由表3可知:这2个SNPs存在于2个山羊品种中,且优势基因总体保持一致。在A341G位点,2种山羊的优势等位基因均为G,黔北麻羊的等位基因A和G的频率分别为0.28,0.72;而贵州黑山羊的等位基因A和G的频率分别为0.36,0.64。在G365A位点,2种山羊的优势等位基因均为A,黔北麻羊等位基因A的频率高达0.81,G为0.19;而贵州黑山羊等位基因G和A的频率分别为0.42,0.58。

3.4 THRSP基因的mRNA二级结构预测

将THRSP基因突变前后的序列提交到在线网站预测RNA二级结构,结果表明,突变引起了结构自由能的变化,随之其二级结构稳定性也发生了变化,结果见294页彩图3。

4 讨论

目前,已证明THRSP蛋白作为一种甲状腺激素受体调控和激活转录因子,是机体脂肪生成所必需的蛋白,能有效调节苹果酸酶、ATP-柠檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶等6种酶,从而参与调控线粒体三羧酸循环脂肪合成酶系基因的表达[10],并在甲状腺激素、胰岛素和碳水化合物等长链脂肪酸合成刺激因子的诱导下参与机体的脂肪生成过程[11]。

对THRSP基因的研究多见于人、大鼠、小鼠、鸡和鸭[12]。张小白等[13]研究秦川牛THRSP基因第1外显子184 bp处C/T错义突变与部分肉质性状的关系时,利用PCR-SSCP技术对405头相同饲养条件下无亲缘关系的18~20月龄的秦川牛THRSP基因进行个体基因型分析,推断出该位点基因型与嫩度和系水力2个性状显著相关。张小白等[14]又对秦川牛、夏南牛、南阳牛、郏县红牛和鲁西牛5个牛品种的THRSP基因257C/G突变的多态性与肉质性状关系进行了研究,初步推断该位点可能影响胴体长和眼肌面积,可作为肉牛肉质选育的候选分子标记。秦婕[15]在9个山羊品种THRSP基因第1外显子中发现G113A、A138G 2个多态位点。万方等[7]研究雪山鸡THRSP基因5'-侧翼区SNPs与肌肉品质关联性发现,在其侧翼区中发现G537A突变,其中GA个体胸肌肌内脂肪含量显著高于GG基因型和AA基因型个体,初步认为THRSP基因应是肌肉脂肪性状含量的候选标记。周倩倩等[16]对脂肪型和瘦肉型猪种THRSP基因G123A和A308G位点的多态性进行分析,证实了THRSP基因的功能和作用与猪的脂肪生成特点存在密切的关联性。以上研究均能初步推断THRSP基因与脂肪性状的关系密切,进而影响肉质性状。

基因在结构上分为编码区和非编码区两部分,原核生物编码区是连续的,而真核生物为断裂基因,不连续的编码区分为外显子和内含子,其中外显子可以最终实现表达,因此真核生物编码区内的核苷酸变异会引起蛋白质的结构改变而影响其功能[17]。试验选取THRSP基因的编码区(即第1外显子)为研究对象分析多态性,发现了2个SNPs位点,发生了2次转换,分别为A341G、G365A,均为同义突变,不影响所编码的氨基酸。近年来,随着对基因调控区、内含子等翻译区突变的研究发现,虽然同义突变不引起氨基酸序列的改变,但是基因编码区内出现的同义突变可由于同一氨基酸对简并密码子的翻译效率不同,或转录水平的差异而导致蛋白质表达量上的改变,当这种改变达到一定程度时便产生功能的变化[18]。

随后试验又对2个山羊品种的编码区中发现的SNPs突变前后的序列进行了分析,结果表明,这2个SNPs位点的突变引起了mRNA二级结构的变化,具体表现为在A341G位点的A→G突变和G365A位点的G→A突变的共同作用下,导致mRNA二级结构的自由能在-669.90~-677.88 k J/mol之间变化,随之其结构的稳定性也会发生变化,进而改变THRSP基因的表达效率。在G365A 2个位点,2个样本群体的优势等位基因均为A,但是基因频率却存在一定差异:在黔北麻羊中,等位基因A的频率高达0.81,G为0.19;在贵州黑山羊中,等位基因A和G的频率分别为0.58,0.42,可能是样本量不足或者生存条件导致的。本研究结果丰富了山羊该基因的遗传多样性,对山羊遗传基础的研究和开发利用提供了一定的理论依据,为深入研究贵州地方山羊的THRSP基因功能提供参考。

外显子4 篇5

1 材料

1.1 试验动物及样本采集

广西巴马小型猪30头,由广西大学巴马小型猪猪场提供;杜洛克猪、大约克猪、长白猪各30头,均由广西粮油屯里猪场提供。分别剪取耳组织,保存于75%乙醇中。

1.2 菌种及质粒

大肠杆菌DH5α感受态细胞,由广西大学动物遗传育种实验室保存;pMD18-T 载体,宝生物工程(大连)有限公司生产。

1.3 主要试剂

M-MLV反转录酶,Promega公司生产;琼脂糖,BIOWEST AGAROSE公司生产;胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉,德国 OXOID公司生产;PCR Taq Mix、Taq酶,广州东盛生物公司生产;rTaq DNA 聚合酶、dNTPs,杭州博日生物技术公司生产;三氯甲烷(Chloroform)A.R、异戊醇(Isopentanol)A.R等,天津化学试剂公司生产;DNA胶回收纯化试剂盒、限制性内切酶,宝生物工程(大连)有限公司生产;微量质粒抽提试剂盒、DL-2 000 Marker,杭州博日(BioFlux)生物有限公司生产。

2 方法

2.1 引物合成

参照GenBank报道的野猪MyoG基因编码区序列(登录号为FJ356697),应用Oligo 6.0软件设计2对特异性引物。第1对引物: 5′-ATGGAGCTGTATGAGACATCCC-3′,5′-TCAGTTGGGCATGGTTT

CATC-3′,由上海英骏生物技术有限公司合成。上、下游引物长度为675 bp,理论上包含了广西巴马小型猪MyoG基因编码区完整序列。第2对引物:5′-TCATCTGCTCACAGCTGACC-3′,5′-AGTCTCAGTTGGGCATGGTT-3′,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。上、下游引物长度为125 bp,包含MyoG基因外显子3序列。

2.2 猪肌肉组织总RNA提取

参照天根生化科技(北京)有限公司的快速RNA(微量)试剂盒说明提取总RNA。

2.3 MyoG基因的RT-PCR

2.3.1 cDNA的合成

cDNA的合成采用RNA PCR试剂盒(TaKaRa公司生产),以总 RNA为模板进行逆转录合成第1链。

2.3.2 PCR反应

反应体系(20 μL):反转录产物2 μL,上、下游引物各0.5 μL,5 U/μL Taq酶0.5 μL,10×PCR Buffer(Mg2+ Free) 2 μL,25 mmol/L MgCl2 1.2 μL,2 mmol/L dNTP Mixture各1 μL,加ddH2O 至20 μL。反应程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性 30 s,60 ℃退火 45 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃延伸再10 min。终产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,并观察结果。

2.4 MyoG基因的克隆

2.4.1 PCR产物的回收、提纯

参照杭州博日(BioFlux)生物有限公司生产的试剂盒说明书进行。

2.4.2 目的片段与pMD18-T

载体的连接 连接反应液:SolutionⅠ5 μL, pMD18-T 载体1 μL,纯化后产物 4 μL。用封口胶封住离心管口,于16 ℃对总体积为10 μL的连接反应液连接过夜。

2.4.3 重组质粒转化细菌的鉴定

以重组菌液为模板,反应体系及PCR程序同2.3.2。

2.4.4 重组质粒的抽提

参照杭州博日(BioFlux)生物有限公司生产的试剂盒说明书进行。

2.5 PCR扩增产物克隆片段的测序

取经PCR扩增和质粒抽提鉴定为阳性的克隆菌液1 mL,送上海英骏生物科技有限公司进行序列测定。

2.6 4个猪种耳组织基因组DNA的提取

按照常规的苯酚-氯仿抽提法对基因组DNA进行抽提。

2.7 DNA 浓度与纯度的检测

取DNA样品5 μL加入约1 μL溴酚蓝中,混匀,上样到1%琼脂糖凝胶中,在90 V电压、100 A电流条件下电泳30 min。电泳结束后,取出凝胶,置于溴化乙锭(EB)染色液中染色15 min,然后置于凝胶成像系统(UVP GDS-8000)上观察结果,检测DNA的浓度及纯度,并拍照分析。

2.8 MyoG基因的PCR扩增

反应体系(25 μL):基因组DNA 3.0 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,上、下游引物各1.0 μL,10 mmol/L dNTPs 1.0 μL,5 U/μL Taq酶 0.5 μL,ddH2O 16 μL。PCR扩增反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,36 ℃退火3 min,72 ℃延伸2 min,共30个循环;72 ℃再延伸10 min。终产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,并观察结果。

2.9 MyoG基因PCR产物的SSCP分析

PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳并银染检测观察结果,同时进行SSCP分析。

3 结果与分析

3.1 广西巴马小型猪总RNA的提取

用快速RNA(微量)试剂盒抽提广西巴马小型猪肌肉组织总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳显示3条泳带,即28S、18S、5.8S (见图1),说明试验已经成功获得较完整的广西巴马小型猪总RNA ,可用于RT-PCR。

1,2.总RNA。

3.2 广西巴马小型猪MyoG基因的RT-PCR扩增

用特异性引物以广西巴马小型猪的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,在500 bp和750 bp之间能扩增出1条明显的单一条带,与预期结果(675 bp)相符(见图2)。因此,可以初步确定试验成功获得广西巴马小型猪MyoG cDNA片段。

1,2.以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板的RT-PCR产物; M.DL-2 000 Marker。

3.3 重组质粒的鉴定

纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,获得的重组质粒经PCR扩增后电泳出现长度为675 bp的目的片段(见图3)。对重组质粒抽提产物进行电泳检测,在3 000 bp和5 000 bp之间有1条长度约为3 400 bp的片段(见图4),与MyoG cDNA编码区序列片段长度加上载体pMD18-T载体(2 692 bp)长度相符,说明目的基因片段已转入质粒中。

M.DL-2 000 Marker;1.PCR产物。

M.DL-5 000 Marker;1.质粒抽提产物。

3.4 序列测定

采用DNAStar生物软件对测定结果进行分析,再通过Meg Align软件进行比较,结果表明:该核苷酸序列与GenBank中四川野猪的MyoG基因编码区序列的同源性达99.7%,证实试验所克隆的片段为广西巴马小型猪MyoG cDNA序列。此外,序列分析结果表明:广西巴马小型猪MyoG cDNA序列与四川野猪相比,在第233位点及第642 位点发生了基因突变,其中第642位点发生同义突变,第233位点发生错义突变,导致缬氨酸突变为丙氨酸,见图5。

3.5 MyoG基因的PCR扩增结果

以广西巴马小型猪、长白猪、杜洛克猪、大约克猪的基因组DNA为模板,对MyoG基因外显子3序列进行PCR扩增,得到长度约为125 bp的片段,PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图6～9,在100～200 bp之间均有1条明显的单一条带。

M.DL-2 000 Marker;1～10.PCR产物。

M.DL-2 000 Marker;1～14.PCR产物。

M.DL-2 000 Marker;1～13.PCR产物。

M.DL-2 000 Marker;1～13.PCR产物。

3.6 MyoG基因的SSCP分析结果

MyoG基因的PCR产物经过SSCP分析表明:广西巴马小型猪只有1条带,为AA型,而外来猪种长白猪、杜洛克猪和大约克猪均有2条带,为AB型,结果见图10～13。

1～11.AA型。

1～12.AB型。

1～12.AB型。

1～11.AB型。

3.7 同源性比较及亲缘进化树分析

3.7.1 同源性比较

采用DNAStar生物软件的Meg Align程序中的Alignment Report对测序所得的广西巴马小型猪MyoG基因编码区序列与GenBank中报道的其他动物的MyoG基因编码区序列进行同源性比较,见表1。

由表1可知:克隆出的广西巴马小型猪MyoG基因编码区序列与四川野猪、奶牛、人、小鼠的同源性分别为99.7%、91.7%、93.8%、90.5%,说明该基因在不同的物种间具有较高的保守性。

3.7.2 亲缘进化树分析

对测序获得的广西巴马小型猪MyoG基因编码区全序列(675 bp)与GenBank公布的其他动物的MyoG基因编码区序列, 采用DNAStar生物分析软件的Meg Align程序中的Phylogenetic Tree构建不同动物的MyoG基因亲缘进化树(见图14), 并进行亲缘性分析。

由图14可知:广西巴马小型猪与其他4种动物相比,与四川野猪的亲缘性最近,其次是奶牛、人,与小鼠的亲缘性最远。

4 讨论

不同基因在动物体内不同组织的表达量是不同的,根据已有的报道可知:MyoG基因广泛分布于肌肉组织中,且MyoG基因是MyoD基因家族中唯一在所有骨骼肌细胞系中均可表达的基因,起关键的调节作用。所以试验选取了广西巴马小型猪的肌肉组织作为RNA提取的试验材料。

序列分析结果表明:广西巴马小型猪MyoG基因编码区序列长675 bp,与四川野猪、人、奶牛、小鼠同源序列的同源性分别为99.7%、93.8%、91.7%、90.5%,且不同物种间保守性较强。与四川野猪序列相比,克隆得到的广西巴马小型猪MyoG cDNA序列在第233位点及第642位点上发生了基因突变,其中第642位点为同义突变,第233位点为错义突变,导致缬氨酸突变为丙氨酸。改变的氨基酸是否引起广西巴马小型猪MyoG蛋白质结构及表达量的变化,进而影响广西巴马小型猪的生物形态与生产性能,还有待于进一步研究。

PCR-SSCP 是一种检测基因多态性的方法。主要是在常规方法提取DNA后,通过 PCR 扩增目的片段,变性为单链后就可以进行SSCP 电泳分析。单链 DNA片段因碱基序列不同(甚至是单个碱基的改变),电泳时其泳动速率也不同,所以不需要限制酶消化就可以灵敏地检测出已知和未知的基因突变。虽然 PCR-SSCP也受PCR效果、凝胶浓度等诸多因素的影响,但其操作简单,对 DNA 纯度的要求不高,尤其是对基因多态性的检测有非常高的灵敏度,因此对MyoG基因多态性的研究采用PCR-SSCP法较好[7,8]。PCR-SSCP结果显示:广西巴马小型猪只有1条带,为AA型,而外来猪种长白猪、杜洛克猪和大约克猪均有2条带,为AB型,说明试验所用的长白猪、杜洛克猪和大约克猪的MyoG基因均为杂合子。

摘要：为了解RT-PCR扩增广西巴马小型猪肌细胞生成素(MyoG)cDNA序列,并分析与其他物种间的聚类关系,试验采用PCR-SSCP技术分析广西巴马小型猪、长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因外显子3多态性,根据GenBank中已发表的猪MyoG基因序列设计PCR引物,以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;从4个猪种的耳组织中分别提取30个个体的基因组DNA,采用PCR的方法扩增出外显子3并进行SSCP分析。结果表明:克隆得到广西巴马小型猪MyoG基因编码区长675 bp,与四川野猪、人、奶牛、小鼠同源序列相似性分别为99.7%、93.8%、91.7%、90.5%,且不同物种间保守性较强;与四川野猪相比,克隆得到的广西巴马小型猪MyoG cDNA序列在第233位点及第642位点上发生基因突变;广西巴马小型猪MyoG基因的基因型只有AA型,而长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因的基因型只有AB型,各群体内无多态性。

关键词：广西巴马小型猪,肌细胞生成素(MyoG)基因,克隆,PCR-SSCP

参考文献

[1]EDMONDSON D,OLSON E.Helix-loop-helix proteins as regula-tors of muscle-specific transcription[J].J Biol Chem,1993,268:755-758.

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[3]刘永斌,邓凤,王峰,等.肌细胞生成素基因的研究进展[J].中国草食动物,2006(Z1):87-88.

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[6]王珊,陈宏,蔡欣,等.牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2006,34(8):12-16.

[7]何远清,储明星,王金玉.肌细胞生成素基因的研究进展[J].遗传,2004,26(2):235-238.

外显子4 篇6

1 材料

1.1 试验犬及血样

36只德国牧羊犬由公安部警犬技术学校培育, 受试犬犬龄≥1.5岁, 健康, 警用科目考核合格, 预留种犬且无生育史。用75%乙醇消毒犬的前肢头静脉外被皮肤, 用真空采血管 (EDTA抗凝) 采集静脉血2 m L, 冰盒保存带回实验室, -80℃保存, 备用。

1.2 主要试剂

Premix Taq Version 2.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、大肠杆菌JM109感受态细胞、p MD18-T, Ta KaRa公司生产;Na2EDTA·2H2O、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、硼酸、琼脂糖、琼脂, 均购自沈阳国药控股股份有限公司。

2 方法

2.1 模板DNA的提取

采用试剂盒 (Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0, Ta KaRa) 提取全血基因组DNA 100μL, 采用酶标仪 (TECAN, 瑞士) 检测DNA的浓度与纯度, 挑选OD260/OD280值在1.8~2.0之间、DNA浓度≥0.5μg/μL的样本于-80℃保存, 备用。

2.2 引物的合成和PCR扩增

利用Primer BLAST设计1对特异性引物, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 见表1。

PCR总反应体系 (25μL) :Premix 12.5μL, 10μmol/L上、下游引物各1μL, 50 ng/μL DNA模板1μL, 加超纯水补至25μL。PCR反应条件:94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共35个循环, 4℃保存。PCR产物5μL经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.3 PCR产物的纯化与T-A克隆

PCR产物70μL经1.5%琼脂糖凝胶回收, 回收产物4μL, solutionⅠ5μL, p MD18-T 1μL, 16℃连接过夜。连接产物以热激法直接转化大肠杆菌JM109感受态细胞。氨苄青霉素抗性平板筛选 (37℃、12~16 h) , 挑取阳性克隆, 提取质粒, 进行PCR鉴定。

2.4 测序

将鉴定后的阳性质粒送北京三博远志公司进行测序。

2.5 数据的统计分析

将测序结果与Gen Bank提供的序列进行BLAST比对。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增结果

电泳结果显示, 所有PCR产物均呈单一条带, 长度为236 bp, 见图1。

1, 2.引物FSHR-P1扩增产物;M.DL-2 000 Marker。

3.2 测序结果

在德国牧羊犬FSHR基因第1外显子内发现SNP位点, 其中30只受试犬FSHR基因第1外显子第89位碱基为T, 6只受试犬该位置碱基为C (见图2) , 并导致编码氨基酸由苯丙氨酸改变为丝氨酸, 且无插入缺失位点, 见表2。测序结果与Gen Bank提供的犬FSHR基因序列同源性为99.6%。

4 讨论

德国牧羊犬是当今世界上分布最广、用途最多的警用犬种;但是其繁殖力低, 大大限制了其推广应用。繁殖力是一个遗传力很低的数量性状, 受诸多因素影响, 常规的育种技术改良效果不明显[1]。因此, 研究犬高繁殖力的分子机制, 寻找产仔数的主效基因, 对繁殖性状的遗传改良具有重要意义。有人在国际上首先发现FSH与产仔数的主控基因连锁, 进一步研究发现FSH基因本身就是产仔数的主效基因[2]。由于FSH是生物大分子, 不能直接通过细胞膜, 必须通过与位于靶细胞膜上的FSHR结合, 再经过受体介导的信息传递到靶细胞内, 这样才能发挥FSH的生物学功能。因此, FSH的作用强度直接受FSHR表达数量或活性的调控, FSHR在繁殖活动中具有传递促卵泡生长发育生物学信息的作用, 如果发生基因突变能够削弱或增强转导FSH信息的作用, 对繁殖力具有深刻的影响[3]。研究表明, FSHR基因开放读码框 (ORF) 内存在SNP位点, 但是发生插入、缺失的情况较少, SNP位点将导致编码氨基酸变化, 进而引发蛋白质空间结构发生变化, 进而影响繁殖能力[4,5]。试验首次完成德国牧羊犬FSHR基因第1外显子测序发现, 1个纯合SNP位点发生有义突变。这一研究结果扩大了德国牧羊犬FSHR基因的染色体研究范围, 为进一步研究德国牧羊犬品种特异性SNP位点提供基础数据。SNP T89C位点与德国牧羊犬繁殖力的相关性还有待于进一步深入研究。

摘要：为了研究德国牧羊犬卵泡刺激素受体 (FSHR) 基因多态性, 试验以警用德国牧羊犬的基因组为模板, 根据GenBank报道的拳师犬FSHR基因第1外显子序列设计引物, 应用PCR技术, 克隆和测定FSHR基因第1外显子序列, 并进行BLAST比对分析。结果表明:30只受试犬基因遗传同源性高达100%, 6只受试犬基因遗传同源性达99.6%, 存在1处有义突变 (SNP T89C) 。

关键词：德国牧羊犬,卵泡刺激素受体 (FSHR) 基因,第1外显子,克隆,序列分析

参考文献

[1]鲁绍雄, 胡晓湘, 连林生, 等.撒坝猪ESR和FSH-β基因多态性及其与产仔数的关联分析[J].云南农业大学学报, 2009, 24 (3) :389-393.

[2]LI N, ZHAO Y F, ZHANG F J, et al.Candidate gene approach for identification of genetic loci controlling litter size in swine[C].6th WCGALP, Australia, 1998.

[3]何荆洲.荷斯坦奶牛FSHR基因5&apos;侧翼和第10外显子多态性及其与超数排卵关系的研究[D].南宁:广西大学, 2008.

[4]LESNIAK A, WALCZAK M, JEZIERSKI T, et al.Canine olfactory receptor gene polymorphism and its relation to odor detection performance by sniffer dogs[J].J Hered, 2008, 99 (5) :518-527.

外显子4 篇7

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2009年11月到2010年6月在辽宁医学院附属医院住院或者体检的人员, 病例组为经皮冠状动脉腔内血管成形术 (PTCA) 后确诊为冠状动脉狭窄〉50%患者62例, 对照组为动脉造影诊断为冠脉狭窄<50%的同期非冠心病患者88例。均签有知情同意书。排除有糖尿病, 高血压, 肺病, 肝病, 肾病。

1.2 方法

收集研究对象空腹外周静脉血5mL (EDTA抗凝) , 3000rpm离心10min分离血浆和白细胞, -80℃保存。基因组DNA的提取采用Takara DNA试剂盒提取白细胞基因组DNA, 用作PCR扩增模板。

PECAM-1基因L125V和S563A的PCR产物酶切结果:PECAM-1基因外显子3含Leu125Val突变的PCR扩增产物的长度是225bp的DNA, 经PvuⅡ酶切后分为三种基因型:分别为vv基因型, 凝胶分析为一条225bp大小的DNA带;LV基因型, 显示为三条大小分别为225bP、188bp和37bp的DNA条带;LL基因型, 显示为两条大小分别为188bp和37bp的DNA条带 (见图1) 。

PECAM-1基因外显子8含Ser563Asn突变的PCR扩增产物的长度是338bp的DNA, 经Nhe工酶切后分为三种基因型:分别为AA基因型, 凝胶分析为一条338bp大小的DNA带;AS基因型, 显示为三条大小分别为338bp、217bp和121bp的DNA条带;SS基因型, 显示为两条大小分别为217bp和121bp的DNA条带 (见图2) 。

(a) 1, 3, 6, LV杂合子基因225bP, 188bp两条带;

(b) 2, 4纯合子VV基因一条带225bp;

(c) 5是纯合子LL基因188bp一条带;

(d) M是500bp的Marker

1.3 统计学处理

基因型频率Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验, 连续型变量采用undefined, 组间基因型及等位基因频率比较用c2检验;不同基因型间均数比较用方差分析。数据处理采用SPSS16.0统计学软件包。

(a) 1, 3, AS杂合子基因338bp, 217bp, 121bp三条带;

(b) 2纯合子AA基因一条带338bp;

(c) 4是正常纯合子SS基因两条带217bp和121bp;

(d) M是500bp的Marker

2 结果

2.1 PECAM-1基因型及等位基因频率分布

经过Pearsonc2检验, 冠心病总组及对照组均达到Hardy-Weinberg平衡 (P>0.05) , 具群体代表性。CHD组和对照组中PECAM-1 Leu125Val基因型及等位基因的分布频率见表1。CHD组与对照组的等位基因V和L分布频率差异具有统计学意义 (P=0.011) 。CHD组与对照组各基因型分布也具有统计学差异 (P=0.029) , CHD组较对照组VV型比例明显增加 (30.65%:14.77%) , LL型则降低 (17.71%: 20.97%) , LV型差别甚微。

2.2 PECAM-1Ser563Asn基因型及等位基因的分布频率

CHD组和对照组中PECAM-1Ser563Asn基因型及等位基因的分布频率见表2。CHD组与对照组的S和A等位基因分布频率差异具有统计学意义 (P=0.013) 。CHD组与对照组各基因型分布也具有统计学差异 (P=0.025) , CHD组较对照组AA基因型比例明显增加 (29.03%:12.5%) , SS型则降低 (19.35%: 31.82%) , AS型差别甚微。

3 讨论

冠心病的发病机制近年来多数学者支持“内皮损伤炎症反应学说”。认为本病各种主要危险因素最终都是引起动脉内膜损伤, 动脉内膜损伤可谓功能紊乱或解剖损伤, 冠心病人一般都有脂蛋白的增高, 而氧化修饰的低密度脂蛋白和胆固醇对动脉内膜造成功能性损伤可以使内皮细胞和白细胞 (单核细胞, 淋巴细胞, 中性粒细胞) 表面特性发生变化, 从而使血小板内皮细胞粘附分子-1在血小板、单核细胞、中性粒细胞和某些T细胞亚群中大量表达。PECAM-1具有粘附功能, 通过同嗜性作用与异嗜性作用介导血小板-内皮细胞-白细胞间的粘附, 这样我们不难推测出来PECAM-1在冠心病的发生中发挥了极其重要的作用。因此本实验我们通过比较病例组和对照组的PECAM-1的L125V和S563A位点的基因多态性发现了两组之间存在明显的差异, 病人较对照组中等位基因125Leu, 563Ser出现的频率明显增高, 分析出现以上结果可能原因如下:Ser563Asn的多态性由第8个外显子区决定, 其编码胞外6个免疫球蛋白亚单位组成的同源区。这些区域的作用机制不清, 可能与钙平衡及单核细胞, 其作用是影响冠状动脉粥样斑块的稳定性[2,3]。Leu125Val在第3外显子上, 其表达的氨基酸在PECAM一1抗原的第一个工g样区, 它主要参加细胞间的同嗜性反应, 介导细胞间的粘附、白细胞跨内皮迁移[4,5]因此, PECAM-1单核苷酸多态性L125V和S563A改变, 增加了非冠心病患者罹患冠心病的风险。

本文结果显示:PECAM-1, Leu125Val和Ser563Asn与严重冠状动脉粥样硬化具有显著相关性。冠心病人中冠状动脉三支病变且狭窄>50%的患者VV基因型是对照组3.72倍, 在冠心病人中三支病变且狭窄>50%的患者AA基因型是对照组的3.89倍。通过实验我们分析认为之所以出现这样的实验结果, 可能与PECAM-1位点突变后改变了PECAM-1原有的功能例如抑制纤维蛋白原与血小板相互作用, 避免更多的血小板在纤维蛋白原上粘附聚集造成更大的粥样斑块从而使动脉完全闭塞了。

所以, PECAM-1L125V和S563A基因多态性有可能是中国辽西地区汉族人群严重冠状动脉粥样硬化的遗传易患因素之一。

参考文献

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