海马CA1区（精选5篇）
海马CA1区 篇1
铅是一种具有很强神经发育毒性的重金属,可以损害中枢神经系统的功能,铅暴露可以导致儿童严重的学习记忆能力降低和其他神经功能异常,其机制目前尚不清楚。学习和记忆是脑的高级功能之一,关键部位在海马,大量研究表明长时程增强(long-term potentiation,LTP)是学习与记忆的生物学基础[1,2]。本研究采用Morris水迷宫测试和电生理实验方法,观察铅对大鼠学习记忆功能和海马CA1区LTP的影响,以期从突触可塑性的角度解释铅影响学习和记忆功能的机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
22只健康Sprague-Dawley大鼠180-220g(由南阳医专动物实验中心提供),雌雄不拘。实验室通风良好,室温维持23℃左右,光照周期为8:00-18:00。将动物随机分为铅暴露组和对照组,每组11只。实验分Morris水迷宫实验和电生理实验两部分。
铅暴露组每天通过饮水饲以浓度为0.05g/L醋酸铅水溶液,对照组大鼠饮用蒸馏水。28天后开始进行水迷宫实验。
1.2 仪器与试剂
Morris水迷宫(自制);多道生理信号采集处理系统RM6240B型(成都仪器厂);江湾I-C型立体定向仪(第二军医大学器材处);小动物人工呼吸机(第二军医大学器材处)。氯化琥珀胆碱。
1.3 实验方法
1.3.1 Morris水迷宫实验
水迷宫为直径为130cm,高50cm的圆形水盆,加入自来水,水深30cm,水温保持(26±1)℃,水内放入适量牛奶后混匀。池壁上标有东南西北4个入水点,它们将水池等分为4个象限,,在第4象限正中离池壁33 cm处放一直径为9 cm,高29 cm的圆形透明平台,平台顶低于水面1cm。
定位航行试验(Place navigation),测试大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验共进行5天。每天训练2次,训练时随机选择一个入水点,将大鼠面向池壁放入水中,观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(潜伏期)。
空间搜索试验(Spatial probe test),用于测试大鼠对平台空间位置记忆的能力。在第6天时撤除水平台,然后任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中,测其在120s内跨过各象限平台相应位置的次数及其占总次数的百分比。
1.3.2 电生理实验
在Morris迷宫实验结束后,对动物重新称重后,腹腔注射10%氨基甲酸乙酯(1g/kg)麻醉,常规气管插管。将动物固定在立体定向仪上。颅骨钻孔,挑开硬脑膜,37℃液体石蜡保护暴露的神经组织。腹腔注射氯化琥珀胆碱(1~1.5mg/kg)保持肌肉松弛,小动物人工呼吸机维持呼吸,动物体温维持在37±0.5℃。
根据大鼠脑立体定位图谱将不锈钢双极刺激电极置于右侧海马CA3区以刺激Schaffer侧枝(AP:3.0~3.3mm,R:3.2~3.5mm,H:3.8~4.2mm)。不锈钢双极同芯记录电极(阻抗0.5~1ΜΩ,尖端直径0.1mm)插入右侧海马CA1区(AP:4.0~4.4mm,R:2~3mm,H:2.5~3mm)细胞外记录海马脑电。单方波(强度为最大反应的1/2-1/3,0.5ms,1次/min,记录30min)刺激Schaffer侧枝诱发海马CA1区场电位。强直刺激(强度同单刺激,0.5ms,100 Hz,持续1 s,间隔10 s,4次)诱导海马诱发场电位LTP。然后再给予单方波刺激2h以上。比较强直刺激前后海马CA1区诱发场电位幅度变化。
1.4 电生理实验刺激及记录部位的组织学鉴定
实验结束后,采用普鲁氏蓝法对不锈钢双极同芯电极尖端位置进行鉴定。电极记录均符合要求的实验资料纳入统计学处理。
1.5 数据分析及统计学处理
所得数据均用均数±标准误(mean±SEM)表示,采用SPSS13.0软件进行统计学分析,组内比较采用配对t检验,组间采用成组t检验,P<0.05表示差别有显著性。采用软件Sigmaplot9.0对所得数据进行作图。
2 结果
2.1 Morris水迷宫实验结果
2.1.1 定向航行试验结果
在第一天实验中,两组成绩差异无显著性(P>0.05)。从第二天开始,两组大鼠寻找平台潜伏期呈递减趋势,铅暴露组潜伏期明显长于对照组,经统计学检验二者有显著性差异(P<0.05)。试验中潜伏期变化见图1。
2.1.2 空间搜索试验结果
空间搜索试验用于测试大鼠空间位置记忆能力。在实验中,我们发现,铅暴露组大鼠穿越目标平台位置的平均次数为(8.2±1.7)次。而对照组大鼠的平均探索次数为(15.5±2.9)次,经统计学检验二者有显著性差异(P<0.05)。表明铅暴露导致大鼠出现了明显的空间位置记忆能力障碍。各组穿越原平台位置的次数占总次数的百分比见图2。
A表示穿越原平台次数占总次数百分比;B表示穿越左侧象限相应位置次数占总次数百分比;C表示穿越右侧象限相应位置次数占总次数百分比;表示穿越左侧象限相应位置次数占总次数百分比。
2.2 电生理实验结果
在本次实验中,单方波刺激Schaffer侧枝纤维,在22只大鼠的海马CA1区均记录到以正波为主的幅度稳定的群体峰电位(population spike,PS)。
在对照组11只大鼠,强直刺激后5min开始观察到PS幅度增大至(160.15±4.06)%即诱导出海马CA1区LTP,最大增幅出现在强直刺激后105min,增大到(198.59±4.51)%,LTP维持2h以上。经统计学检验,P<0.05,强直刺激前后PS幅值的差别有显著性意义。
铅暴露组强直刺激后平均PS幅值增至强直刺激前的(120.48±4.67)%,而对照组强直刺激后平均PS幅值为强直刺激前的(181.71±3.86)%。铅暴露组同对照组相比明显降低,经统计学检验,(P<0.05)差别有显著意义,铅暴露明显抑制了海马CA1区的LTP(见图3)。
3 讨论
铅是环境中广泛存在的重金属,具有很强的神经毒性。铅中毒可导致包括铅毒性脑病、听力障碍、周围神经病变和认知缺陷等一系列神经功能损伤,特别是对儿童智力发育的影响受到了各方面的广泛关注。在本次研究我们发现,对照组大鼠在Morris水迷宫定向航行实验中,寻找平台的潜伏期第二天就开始大幅度降低,搜索实验中对目标平台位置的记忆清楚。而铅暴露组大鼠虽然通过训练寻找平台的时间也逐渐缩短,但其缩短速度却明显低于对照组,在搜索实验中错误次数也明显增多。结果证明,铅暴露明显损伤了大鼠的空间学习和记忆能力。
LTP具有时程长和联合的性质,因此不少学者把LTP与学习和记忆联系起来,认为它与学习、记忆功能可能机制之一[4]。在本次实验中,铅暴露组大鼠学习记忆功能的受损的同时,测得的海马CA1区LTP幅度同对照组相比明显降低,表明铅暴露抑制了大鼠海马CA1区LTP,证明铅暴露对学习记忆功能的损伤与海马LTP抑制有关,铅对海马LTP的抑制是其损伤学习记忆功能的机制之一。
已知铅可以影响海马神经元环腺苷酸依赖性蛋白激酶(PKC)的分布,降低海马神经元细胞膜与细胞质PKC活性的比值[5]。也有报道铅离子可能抑制PKC的活性[6]。PKC是诱导LTP的重要通路之一[7,8]。抑制PKC,会使LTP降低[9,10]。铅对海马CA1区LTP及学习和记忆的抑制作用可能通过与钙离子的竞争性拮抗进入细胞内进而抑制PKC的活性而实现。
摘要：目的本研究观察铅对大鼠学习记忆功能和海马CA1区LTP的影响,探讨铅对学习记忆功能影响的可能机制。方法22只大鼠随机分为2组。铅暴露组每天通过饮水饲以浓度为0.05g/L醋酸铅水溶液,对照组大鼠饮用蒸馏水。28天后开始水迷宫实验。之后,通过电生理实验比较强直刺激前后海马CA1区PS幅度变化。结果在水迷宫实验中,铅暴露组大鼠寻找平台时间的缩短速度明显低于对照组,在搜索实验中错误次数明显增多。电生理实验中,铅暴露组强直刺激后平均PS幅值增至强直刺激前的(120.48±4.67)%,明显低于对照组(181.71±3.86)%。结论铅暴露明显损伤了大鼠的空间学习和记忆能力,并明显抑制了大鼠海马CA1区LTP,铅对海马LTP的抑制是其损伤学习记忆功能的可能机制之一。
关键词：铅,学习记忆,海马CA1区,长时程增强
参考文献
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海马CA1区 篇2
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
104只雄性Wistar大鼠 (成功模型率70%, 大鼠死亡后补充) , 体重 (280±20) g, 鼠龄2~3个月, 随机分为假手术组, MCAO组及MCAO+CYS治疗组, 其中MCAO组与MCAO+CYS治疗组各按照缺血再灌注后6h、12h、1d、3d、5d和7d随机分为6个亚组, 每个亚组8只大鼠。
1.2 试剂
Cystamine (Sigma-Aldrieh公司) , NPM多克隆抗体-鼠抗 (ABCAM公司) , DAB显色试剂盒 (武汉Boster) , SP通用型试剂盒 (北京中山金桥生物技术开发有限公司) , 细胞原位凋亡检测试剂盒 (北京中山金桥生物技术有限公司) 。
1.3 大鼠MCAO模型的制备
采用经颈内动脉线栓法制备MCAO模型, 90min后给予缺血再灌注。假手术组大鼠麻醉后经同样手术过程, 但不给予血管结扎以及线栓导入。参考ZeaLonga法进行神经功能损伤评分, 标准:无神经功能损伤症状者为0分;提尾悬空时左前肢屈曲、内收者为1分;自主运动时向左侧划圈、旋转者为2分;行走困难, 站立时向左倾斜者为3分;无自主活动, 伴神志不清者为4分。1~4分为有效的MCAO模型, 0分予以剔除。
1.4 给药方法
MCAO+CYS治疗组大鼠于相应时间点给予CYS (0.15mg/g·d) 腹腔注射;MCAO组与假手术组给予生理盐水 (1mL/d) 腹腔注射, 假手术组在第3天处死。
1.5 标本获取及染色计数
在相应时间点对MCAO组和MCAO+CYS治疗组大鼠进行灌注固定, 假手术组3d后灌注固定。固定30min后断头取脑;在视交叉后1mm及4mm处冠状切成前、中、后段, 保留包含完整海马CA1区结构的中段, 梯度脱水。自视交叉后2.2mm处用冰冻切片机 (-20℃) 向后连续冠状切片, 厚约10μm, 依次固定、浸洗、孵育、DAB显色、复染、脱水、透明、封片, 用于TUNEL染色, 免疫组织化学染色。在光镜下观察核磷蛋白阳性信号为:胞浆内细颗粒, 呈棕黄色或棕褐色。 (40×100) 高倍镜下对各切片海马CA1区进行阳性细胞数量的计算, 随机选取5个区域。利用Olympus叠加成像定位进行计数, 计算每个视野中核磷蛋白细胞阳性数, 平均细胞的密度得出平均值。
1.6 统计学分析
采用SPSS17.0软件包做数据的统计分析, 数据以均数±标准差 (±s) 表示, 方差分析比较假手术组各亚组与MCAO组和MCAO+CYS治疗组;t检验做MCAO组和MCAO+CYS治疗组相应时间点的比较;以α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 TUNEL染色
细胞形态学:海马CA1区神经干细胞呈细胞凋亡, 颗粒呈棕黄色或黄褐色, 核固缩崩解, 胞体缩小;TUNEL阳性细胞数目在MCAO组海马CA1区显著增加, 1d、3d、5d、7d四个亚组与假手术组比较有统计学差异 (P<0.05) ;MCAO+CYS治疗组TUNEL阳性细胞数目在缺血再灌注1d后少量增加, 与MCAO组比较, 1d、3d、5d、7d四个亚组明显减少, 具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
*与假手术组相比较有显著差异 (P<0.05) ;△与MCAO组各亚组缺血再灌注时间点比较有显著差异 (P<0.05) 。
2.2 免疫组织化学方法
免疫组化方法:假手术组海马CA1区核磷蛋白的表达有一定的数量。MCAO组再灌注6h NPM表达数量增加, 于1d达峰值, 3d开始表达减少, 5d与假手术组表达水平相当;与假手术组相比, MCAO组相应的6h、12h、1d、3d四个亚组的NPM表达数量均显著增加, 具有统计学意义 (P<0.01) ;MCAO+CYS治疗组相应的6h开始表达增加、1d达高峰, 与MCAO组相比, MCAO+CYS治疗组相应的1d、3d、5d、7d四个亚组的NPM表达数量明显增加, 具有统计学意义 (P<0.01) , 见表2。
*与假手术组相比较有显著差异 (P<0.05) ;△与MCAO组各亚组缺血再灌注时间点比较有显著差异 (P<0.05) 。
3 讨论
大鼠海马CA1区核磷蛋白可受大脑中动脉阻塞急性缺血缺氧的作用而表达水平增加, 产生保护神经干细胞的相应效应分子。在大脑中动脉阻塞缺血缺氧急性期, 应用胱氨酸治疗大大增加海马CA1区核磷蛋白的表达, 这是在脑缺血性损伤中, 胱氨酸抗细胞凋亡、保护缺血缺氧损害的神经干细胞的机制之一。
海马CA1区 篇3
缺血性脑血管疾病是目前高发的严重危害人类健康的主要神经系统疾病。流行病学研究表明, 绝经前女性脑梗死的发生率低于同龄男性, 绝经后其脑梗死发生率则明显升高。大量的流行病学调查及动物实验显示, 雌二醇 (E2) 具有减少脑梗死发作和削减梗死体积的作用, 近年来, 国内外学者对雌激素做了大量的实验研究, 但雌激素的脑保护机制仍未阐明。本文主要研究雌二醇对全脑缺血再灌注大鼠海马区细胞的影响以及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的变化。
1 材料与方法
1.1 材料
健康雌性Wistar大鼠, 体重200～230g, 共60只, 佳木斯大学实验动物中心提供。主要试剂:Bax兔抗鼠单克隆抗体, Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体, 二步法免疫组织化学检测试剂, DAB显色剂, (Tunel) 原位细胞凋亡检测, 以上试剂均购于北京中杉金桥生物技术公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
A组 (卵巢切除, 但不全脑缺血再灌注) 10只;B组 (卵巢切除+全脑缺血再灌注) 25只;C组 (卵巢切除+全脑缺血再灌注+17-β雌二醇治疗组) 25只。其中B组和C组又随机分为5个亚组, 每组5只大鼠, 分别为缺血15min再灌注1h、6h、12h、24h、72h组。B、C组卵巢切除后2周建立全脑缺血再灌注模型;C组切除双侧卵巢后每日给予腹腔注射17-β雌二醇 (17β-E2) 1mg/kg, 共14d, 其余各组每天给予生理盐水注射。
1.2.2 动物模型的建立
卵巢切除模型的制作:用10%水合氯醛腹腔麻醉, 待动物麻醉完毕后于下腹部剃毛、消毒、铺无菌巾。采用下腹部正中切口2.5～3cm, 无菌条件下, 用镊子探入腹腔, 夹取卵巢, 结扎输卵管, 切除双侧卵巢, 止血彻底后用庆大霉素腹腔注射, 逐层缝合切口, 放回笼中, 待其恢复。全脑缺血再灌注模型的制作:大鼠腹腔注射10%水合氯醛, 将大鼠俯卧, 备皮, 消毒。在枕骨下平行于脊柱沿颈背正中线切开皮肤和皮下肌肉直至第一颈椎, 找到后弓上的翼突孔, 按其解剖位置将烧灼的细针直接插入翼突孔, 插入时间不宜过长, 1～2s即可。缝合肌肉及皮肤。行颈部正中切口, 于双侧颈动脉鞘处分离出双侧颈总动脉, 待3h大鼠清醒后, 用无创微血管夹夹闭双侧颈总动脉, 阻断血流15min, 造成脑缺血状态, 然后放开血管夹, 使脑血液循环恢复。预定时间取材。
1.2.3 标本制备
于再灌注时间点大鼠麻醉后, 剪开腹壁, 暴露心脏。用灌注穿刺针刺入左心室至主动脉根部, 止血钳固定。右心耳处剪一小口, 用温生理盐水约100mL灌注, 再用4℃预冷的4%多聚甲醛磷酸缓冲液约200mL灌注, 断头取脑, 于视交叉和乳头体之间取2～3mm组织块, 固定于甲醛溶液中, 自来水冲洗, 酒精脱水, 石蜡包埋、切片机做连续冠状面切片。
1.2.4 免疫组化及TUNEL法检测
免疫组化法检测Bcl-2/Bax在雌性大鼠海马CA1区表达。Tunel法检测其细胞凋亡数。
1.2.5 数据收集
于400倍光镜下计数海马CA1区阳性细胞数及总细胞数, 计算阳性细胞率 (阳性细胞率=阳性细胞数/总细胞数×100%) 。每张切片计数4个不重叠视野, 取平均值。
1.3 统计学分析
数据均以均数±标准差表示。采用SPSS17.0统计软件分析, 组间比较用方差分析。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
见表1。
Bcl-2组内比较:不同时间点B组和C组与A组比较, Avs B1、B2、B3、B4、C2、C3、C4、C5 (P<0.05) 。同时间点B组与C组比较, B1 vs C1, B2 vs C2, B5 vs C5 (P<0.05) 。Bax组内比较:不同时间点B组和C组与A组比较, A vs B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4、C5 (P<0.05) 。同时间点B组与C组比较, B4 vs C4, B5 vs c5 (P<0.05) 。Tunel组内比较:不同时间点B组和C组与A组比较, Avs B1、B2、B3、B4、B5、C1、C2 (P<0.05) 。同时间点B组与C组比较, B1 vs C1, B2 vs C2, B3 vs C3, B4 vs C4, B5 vs C5 (P<0.05) 。
3 讨论
凋亡是脑缺血后细胞死亡的主要形式。Bcl-2通过形成同源或异源二聚体与Bax结合, 抑制cyto C的释放及Caspase3、9的活化, 从而拮抗凋亡。尽管细胞内Bcl-2/Bax的比例是固定的, 但在外界刺激或生理状况异常时, 同源或异源二聚体的量会发生变化。Bcl-2大量表达时, 形成Bcl-2同源二聚体, 凋亡受到抑制;Bax大量表达时, 则形成Bax同源二聚体, 细胞趋向凋亡。而当Bcl-2与Bax形成异源二聚体时, Bcl-2也可以发挥其抗凋亡活性。本实验中雌二醇治疗组在缺血再灌注1h、6h、72h点与对照组及脑缺血再灌注组相比Bcl-2表达明显增高。Bax在雌二醇治疗组再灌注时间点24h、72h表达明显降低。其中雌二醇治疗组每个时间点的细胞凋亡数都低于同时间点缺血再灌注组。通过以上数据表明雌二醇很有可能是通过调节Bcl-2/Bax来抑制全脑缺血再灌注细胞凋亡, 从而对脑细胞发挥保护作用。雌激素预处理能减轻脑缺血再灌注损伤的程度, 但其作用机制还不十分清楚, 可能是多因素的, 与脑损伤部位、严重程度及循环中雌激素浓度等有关涉及基因和非基因因素血流和非血流调节机制、受体和非受体介导的机制。部分学者[1,2]认为通过非依赖的血流机制如抗过氧化作用、减少细胞内钙蓄积、抑制NMDA介导的神经兴奋毒性损伤、提高神经营养因子受体表达、活化细胞分裂素活化蛋白激酶信号途径、上凋抗凋亡基因Bcl-2表达等发挥积极作用。还与抗炎、调节蛋白质合成、抑制细胞凋亡、维持局部缺血区的微血管血流供应有关, 可能是雌激素与特定的雌激素受体结合后调节基因表达, 对血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经元及神经胶质细胞产生了远期效应[3]。但雌二醇保护脑细胞免受损害的具体机制有待进一步研究。
参考文献
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[2]Alkayed NJ, Murphy SJ, Traystman RJ, et al.Neuroprotectiveeffects of female gonadal steroids in reproductively senescent femalerats[J].Stroke, 2000, 31 (1) :161-168
海马CA1区 篇4
1 材料与方法
1.1 动物
健康清洁级雄性SD大鼠60只, 体重250 g～300 g, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.2 药物
软脉灵口服液由人参、枸杞子、熟地、牛膝、何首乌、川芎、丹参、当归、大黄、芍药、淫羊藿等配伍制成, 福州新大陆药业公司生产 (国家药品监督管理局于2002年审批, 国药准字号:Z35020207) 。尼莫地平由河北永丰药业有限公司生产, 批号20060501。
1.3 主要试剂与仪器
原位细胞凋亡检测试剂盒, 北京中山生物技术有限公司。CH20-BIM光学显微镜, Olympus公司。Morris水迷宫由福建中医学院中西医结合老年病研究所提供。
1.4 动物分组与造模
将大鼠随机分成5组, 假手术组8只;模型组13只;尼莫地平对照组13只;软脉灵口服液高剂量组13只;软脉灵低剂量组13只。采用双侧颈总动脉永久结扎方法 (2VO) 制备拟血管性痴呆大鼠模型[1]。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外, 其余过程与手术组相同。
1.5 动物给药
假手术组造模后次日起用生理盐水0.45 mL/100 g灌胃;模型组造模后次日起用生理盐水0.45 mL/100 g灌胃;尼莫地平对照组, 将尼莫地平用生理盐水配成0.67 g/L的混悬液, 造模后次日起将尼莫地平液0.45 mL/100 g灌胃;软脉灵高剂量组造模后次日起用灌胃针将软脉灵口服液0.90 mL/100 g灌胃;软脉灵低剂量组造模后次日起用灌胃针将软脉灵口服液0.45 mL/100 g灌胃。各组每日灌胃1次, 共30 d。
1.6 检测指标及方法
1.6.1 行为检测
Morris水迷宫, 池壁上四个等距离点分水池为四个象限, 任选一象限在其中央放置平台。平台无色透明, 直径6 cm, 高28 cm, 平台没于水面下2 cm。于治疗结束后作水迷宫实验, 包括5 d的定位航行试验和最后一天的空间探索试验。
1.6.2 病理形态学观察及大鼠海马CA1区凋亡神经元检测
取连续的切片分别作HE染色、TUNEL染色。凋亡细胞数:细胞核呈棕黄色者为阳性细胞, 即凋亡细胞, 每张切片高倍镜下 (×400) 均观察大鼠海马CA1区部位切片5个视野, 计数TUNEL阳性细胞数 (个/每高倍视野) , 取均值。
1.7 统计学处理
实验数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 动物的一般状况
所有大鼠自双侧颈总动脉结扎之日起, 即出现明显的神经损伤症状, 同假手术组比较, 缺血大鼠进食量和在笼中的活动明显减少, 行动迟缓, 体重减轻, 毛色干枯, 对外界环境刺激如开关灯、开关门窗, 甚至人为激惹等反应淡漠, 于一周后有所改善, 但依旧不如假手术组。
2.2 Morris水迷宫测试
2.2.1 定位航行实验
模型组大鼠逃避潜伏期明显比假手术组延长 (P<0.01或P<0.001) , 拟VaD大鼠的空间学习记忆能力较差, 软脉灵高剂量及尼莫地平治疗组较模型组明显缩短拟VaD大鼠的逃避潜伏期 (P<0.05或P<0.001) , 软脉灵高剂量治疗及尼莫地平治疗组能改善拟VaD大鼠的学习记忆能力。软脉灵低剂量组逃避潜伏期与模型组比无统计学意义 (P>0.05) , 表明软脉灵低剂量治疗没有明显改善拟VaD大鼠的学习记忆能力。详见表1。
s
2.2.2 空间探索实验
与假手术组比, 在空间探索实验中拟VaD大鼠1 min内穿越原平台所在位置次数明显减少 (P<0.05或P<0.001) , 拟VaD大鼠有严重的空间记忆力障碍。软脉灵高剂量组、尼莫地平治疗组大鼠穿越原平台位置的次数比模型组增加, 但仍不及假手术组, 其中软脉灵高剂量组大鼠比尼莫地平组穿越原平台次数增加 (P<0.01) 。详见表2。
次/分
2.3 HE染色
假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞层结构紧密, 层次丰富, 细胞排列整齐, 细胞形态正常, CA1区神经元呈复层排列, 神经元核胞膜完整, 细胞核圆而大, 染色浅, 核仁清晰, 无变性坏死细胞。模型组大鼠海马CA1区组织疏松, 可见锥体细胞固缩, 核不规则、呈三角形、多角形、深染呈核固缩, 细胞周围出现间隙。正常细胞数量减少, 细胞缺失明显, 细胞层次不完整。软脉灵高剂量组、软脉灵低剂量组及尼莫地平组海马CA1区锥体细胞明显较模型组增多, 其中软脉灵高剂量组形态接近假手术组, 仅见少量的神经元核固缩。
2.4 TUNEL染色
假手术组海马CA1存在极少TUNEL阳性细胞, 甚至无TUNEL阳性细胞存在, 模型组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数比假手术组明显增多 (P<0.01) , 反映了拟VaD大鼠存在更多的凋亡细胞, 而各治疗组能不同程度减少拟VaD大鼠海马CA1区的凋亡细胞数, 其中以软脉灵高剂量组治疗效果为优, 但仍比假手术组存在更多的凋亡细胞 (P<0.01) 。尼莫地平组与软脉灵低剂量组比无统计学意义, 但两组均比模型组明显减少。详见表3。
个/高倍视野
3 讨 论
VaD属于中医学“善忘”“文痴”“呆病”“癫疾”等范畴。祖国医学认为老年人的脏腑功能减退, 精气血不足、髓海亏虚是痴呆发生的内在体质因素[2]。肾气虚弱, 元气不足, 必致气虚无力行血而致瘀[3];肝肾同源, 肾精不足, 无力化生肝血, 而肝血不足, 脉络不充, 导致脉络涸涩, 血行涩滞产生瘀血, 同时阴虚阳亢虚火内生亦可灼血成瘀, 瘀血阻窍, 而脑髓失养[4]。所以肝肾阴虚、气虚血瘀是痴呆发病的主要病机, 应用滋补肝肾、益气活血法治疗血管性痴呆有较强的针对性和普遍的指导意义。
软脉灵口服液味甘、辛, 以熟地、枸杞、何首乌等滋养肝肾、填精补髓, 辅以当归、川芎、丹参等活血化瘀、通脉去滞之品;并佐以人参、黄芪、远志、五味子等益气养心安神, 共奏滋补肝肾、益气活血、健脑促智之功效。本实验通过Morris水迷宫的行为学测试, 软脉灵高剂量组缩短拟VaD大鼠的逃避潜伏期, 增加空间探索实验穿越原平台所在位置次数, 软脉灵口服液有改善拟VaD大鼠的学习记忆能力作用, 并呈一定的量效关系, 软脉灵高剂量组作用优于低剂量组和尼莫地平组。
缺血性脑损伤的神经元死亡与细胞凋亡关系密切, 脑缺血的神经元损伤不只是坏死, 而且与凋亡关系密切, 特别是脑缺血后的迟发性神经元死亡, 细胞凋亡为其主要的死亡方式[5]。余芬等[6]采用永久性双侧颈总动脉结扎 (2VO) 法制作的慢性脑缺血模型大鼠海马神经元凋亡明显增加。本实验通过TUNEL证实了拟VaD大鼠海马CA区的凋亡神经元明显增加, HE染色显示拟VaD大鼠海马CA1区结构紊乱、神经元丢失, 这可能是脑缺血导致大鼠学习记忆能力受损的原因之一。软脉灵口服液能降低拟VaD大鼠海马CA1区的凋亡细胞, 改善其形态学变化, 且呈一定的剂量关系, 软脉灵高剂量组作用优于低剂量组和尼莫地平组。
VaD凋亡的发生机制尚在研究之中, 自由基是导致脑缺血后细胞凋亡的重要原因, 还有兴奋性氨基酸、钙离子超载等。其中关于氧自由基 (OFR) 的报道较多, ① OFR对DNA的氧化损伤产生大量的无嘌呤/无嘧啶 (AP) 位点的形成, 进而引起基因突变, 复制中断和遗传不稳定, 甚至导致细胞死亡[7]。②OFR攻击线粒体, 使细胞色素 (CytC) 从线粒体释放到胞质中, CytC能激活Caspase, 诱导细胞凋亡。③提高内源性或外源性自由基清除剂。④OFR上调一些转录因子的活性如NF-κB[8]。软脉灵口服液的抗凋亡作用可能与其抗氧自由基作用有关。软脉灵口服液是否影响凋亡相关基因的表达或通过其他途径实现其抗凋亡作用有待于进一步研究。
参考文献
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海马CA1区 篇5
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性成年SD大鼠 (230 g～250 g) , 随机分为3组, 每组6只。空白对照组 (Control) , 溶剂对照组 (Vehicle) 及Aβ1-42组。
1.2 手术
30%乌拉坦 (5 ml/kg) 经腹腔注射麻醉大鼠, 颅骨表面钻小孔 (前囟后2.8 mm, 中线左侧旁开2.0 mm) , 用定位仪右侧旋臂夹持器固定不锈钢有芯套管, 并将其调整到小孔位置, 定位于硬膜下3.0 mm处。在同侧定位海马Schaffer侧支及CA1区, 开方形骨窗 (2 mm×2 mm) , 以前囟后4.0 mm, 中线左侧旁开3.5 mm, 为中心。用于插入刺激/记录电极 (刺激/记录电极被平行固定于聚乙烯管内, 两电极尖端中心距离为1.0 mm, 尖端高度差为0.8 mm) 。用定位仪左侧旋臂夹持器固定刺激/记录电极, 并将其缓慢插入到预定位置。最终刺激电极的尖端定位在海马Schaffer侧支处, 参数为前囟后4.2 mm, 中线左侧旁开3.8 mm;记录电极尖端定位在海马CA1区的放射层, 参数为前囟后3.8 mm, 中线左侧旁开2.9 mm;参比电极夹在头皮上。电极的深度以电生理反应为准。实验结束后, 经套管给予2%的旁胺天蓝1 μL, 10 min后取脑组织, 行组织切片及HE染色。
1.3 在体记录海马场电位和LTP诱导
脉冲刺激由计算机控制的电子刺激器 (SEN-3301, Japan) 和刺激隔离器 (SS-102J, Japan) 产生。生物电信号由多通道生物信号放大系统 (成都仪器技术有限公司, 中国) 采集并记录, 低通滤波1 Hz。本试验中记录的生物电信号为场兴奋性突出后电位 (field excitatory postsynaptic potential, fEPSP) 。在刺激/记录电极插入海马的过程中, 每10 s给予一个测试刺激 (频率0.33 Hz, 电流强度为引起最大fEPSP幅度50%时的强度) 。缓慢推进电极, 直至刺激诱导出最大fEPSP幅度50%的波形。诱导LTP的高频刺激 (high frequency stimulation, HFS) , 包括3串频率为200 Hz, 每串20个刺激, 串间隔30 s。LTP诱发的标准为fEPSP幅度至少增大到最大反应强度的75%。基础的fEPSP记录时间为30 min, 海马给药后亦记录30 min, 以确保突触反应的稳定性。HFS诱发后, 记录LTP时间为1 h。另外给药30 min后, 采用双脉冲刺激诱发fEPSP, 以观察双脉冲易化 (paired pulse facilitation, PPF) 现象。本实验中所用的配对脉冲刺激间隔50 ms, 波宽50 μs, 每30 s一次, 诱发3次。实验结果离线分析:以基础fEPSP幅度为100%, HFS及给药后的fEPSP幅度均以此进行标准化;PPF以fEPSP2/fEPSP1的比值为指标进行分析。
1.4 统计学处理
计量资料以均数±标准差
2 结 果
2.1 用改良法在海马内局部给药的定位及药物扩散范围
为了确定改良法局部给药的准确性, 在电生理记录结束后, 经套管给予2%的旁胺天蓝1 μL, 10 min后取脑组织, 行组织切片及HE染色。可以很明确地看到给药针芯在海马内的穿行针道及其尖端位置 (前囟后2.8 mm, 中线左侧旁开2.0 mm) ;旁胺天蓝注射10 min后, 可以在前囟后4.68 mm附近的切片中观察到扩散的旁胺天蓝。这说明给药后, 药物可以在较短的时间内扩散至海马的其他部位, 包括刺激/记录部位。
2.2用改良法局部给予溶剂对海马CA1区突触传递及LTP的影响
为了明确改良法局部给药是否会影响突触传递及LTP, 对比Vehicle组与Control组结果。两组的基础波在记录期间内均稳定 (P>0.05) ;HFS后, 两组均成功诱导出了LTP, 并且在1 h内fEPSP幅度的变化趋势无明显差异 (P>0.05) 。详见图1。
2.3 用改良法局部给予侧脑室给药量1/10的Aβ1-42对海马CA1区突触传递及LTP的影响
Aβ组与Vehicle组的基础波在记录期间内均稳定且无明显差异;但HFS后, 与Vehicle组相比, Aβ对HFS诱导的LTP有明显的压抑作用 (P< 0.05) 。在HFS后的不同时间点, 与Vehicle组相比, Aβ组的fEPSP增大幅度都明显减小 (P< 0.05) 。详见图2。
(A) 给予Vehicle或Aβ1-42后fEPSP幅度随时间的变化; (B) 给予Vehicle或Aβ1-42后, 特定时间点fEPSP幅度的变化, *P<0.05
2.3 用改良法局部给予溶剂或Aβ1-42对PPF的影响
各处理组均记录到了在体正常的PPF, 表明海马注射均没有明显影响Schaffer侧支与CA1之间的突触传递及突触前事件。详见图3。
3 讨 论
记录动物海马CA1区的场电位是经典的神经电生理研究方法。1973年 Bliss和 Lomo首次报道海马长时程增强 (LTP) [2], 并逐步发展成为研究学习记忆的一个重要模型[3]。目前, 在体大鼠海马CA1区场电位的记录是研究突触可塑性和脑的学习记忆功能的重要方法, 较离体脑片记录具有不可替代的生物学意义。海马LTP和PPF是以记录fEPSP为基础的两个常用的电生理学指标。LTP是一种由强直刺激或其他特殊刺激作用后, 其神经突触传递效能长时间增强的现象;PPF则是由前后两个相距很近的刺激作用于突触传递通路时引起的突触传递效率短时间增强现象。鉴于海马LTP与学习记忆行为的重要联系[3], 记录海马LTP已成为研究学习记忆的生理学机制、探讨神经退行性疾病的发病机制的一个重要电生理手段。但传统在体记录海马CA1区场电位的方法存在诸多不足。如, 侧脑室给药时药物浓度和发挥作用的时间不易掌握, 而且难以界定药物反应是对记录部位的直接作用, 还是通过影响其他脑区而间接引起;实验操作过程中, 刺激和记录分别所需的推进装置和脑室导管等将占据有限的操作空间, 使实验者难于下手;双推进装置和脑室给药 (特别是贵重药品) 又使实验成本大大增加[1]。而刺激/记录/给药一体化装置的开发, 实现了在体同侧海马记录/给药及药物作用的观察。但该一体化装置的缺陷在于, 记录/给药是同一中空电极, 必需极其严格地控制给药量及速度, 否则极易对场电位记录造成较大的干扰, 甚至造成记录电极位置的改变。因此, 刺激/记录/给药一体化装置的实际可操作性并不十分理想。本研究针对一体化装置的不足, 在其基础上做了进一步的改进, 完善了海马CA1区在体刺激/记录及同侧海马局部给药的方法。并通过给予旁胺天蓝后, 行组织切片及HE染色后, 与大鼠脑立体定位图谱[4]中海马切片的位置和形态进行对比, 确认了给药部位及药物在海马内的扩散效果。本实验改良法的优越性有:可操作性强, 干扰小, 针对性更强, 影响范围局限, 更容易控制药物的浓度, 能明显地观察药物的直接作用。改良法的用药量更小, 约是侧脑室给药量的1/10, 是一种更为经济、实用、高效的研究方法。
现有研究已经表明, Aβ所致突触可塑性的损伤, 伴随了认知功能下降与痴呆的形成, 是AD发病的重要病理过程[5]。采用改良的大鼠在体海马CA1区局部给药及场电位记录的方法, 观察了Aβ1-42对海马CA1区突触传递及LTP的影响。实验结果显示, 单纯插入套管组 (Control组) 和海马注射溶剂组 (Vehicle组) 对基础的突触传递及突触前事件均无明显的影响。HFS后, 两组都成功诱导出了LTP, 并且在1 h内两组的fEPSP幅度变化趋势无明显差异。但局部给予Aβ1-42后, 与Vehicle组相比, 虽未对基础的突触传递及突触前事件产生明显影响, 但明显地压抑了HFS所诱导的LTP。该结果与利用脑片所做的研究结果一致[6,7]。其他的在体实验中, 侧脑室注射Aβ, 也观察到了海马的LTP被显著压抑, 而其突触传递并未受到明显影响[8,9,10]。因此, 用改良的海马给药/记录法得到的结果与现有的实验方法得到的结果是一致的。
本研究完善了海马CA1区在体激刺/记录及同侧海马局部给药的方法, 并用该方法成功记录并观察了Aβ1-42对海马CA1区fEPSP、LTP及PPF的影响, 实现了用该方法对神经突触可塑性的评价。随着该方法的不断完善和改进, 其将会为神经生理和药理学研究提供更加理想的实验手段。
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