JAK2（精选5篇）
JAK2 篇1
自2005年James[1]首先报道在真性红细胞增多症 (PV) 患者中发现JAK2-V617F点突变以来, 该基因目前已成为国际上研究的热点。为了进一步明确JAK2-V617F点突变在各种血液病中的表达情况, 建立简单、准确、高效的实验室检测方法, 为临床诊断和治疗提供帮助, 笔者对我院血液科2007年6月至2008年6月门诊及住院, 确诊为骨髓增殖性肿瘤 (MPN) 、骨髓增生异常综合征 (MDS) 、骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤 (MDS/MPN) 、急性髓系白血病 (AML) 、急性淋巴细胞白血病 (ALL) 、慢性粒细胞白血病 (CML) 的部分患者及正常对照共124例进行JAK2-V617F检测, 并报道如下。
1 对象及方法
1.1 研究对象
我院血液科2007年6月至2009年6月门诊及住院确诊的相关患者, PV组男性11例, 女性21例, 年龄32~83岁, 中位年龄66.5岁。ET组男性8例, 女性12例, 年龄35~88岁, 中位年龄69.5岁。IMF组男性1例, 女性2例。MDS组男性14例, 女性8例, 年龄35~76岁, 中位年龄48.0岁。MDS/MPN组男性5例, 女性3例, 年龄55~78岁, 中位年龄62.0岁。AML组男性9例, 女性5例, 年龄25~75岁, 中位年龄44.5岁。ALL组男性5例, 女性5例, 年龄23~45岁, 中位年龄32.5岁。Bcr-abl阳性CML组男性3例, 女性2例, 年龄46~69岁, 中位年龄53.5岁。10例健康志愿者对照。MPN、MDS、MDS/MPN、AML、A L L、C M L诊断参照W H O相关标准[2]。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA制备
抽取患者和正常对照外周血5mL, 按酚-氯仿法提取白细胞基因组DNA。用紫外分光光度仪检测DNA的浓度和纯度, 取吸光度A260/A280介于1.6~1.8的标本, DNA终浓度50~100mg/L, 置于-80℃冰箱冻存备用。
1.2.2 PCR扩增
采用AS-PCR法, 设计2条正义引物F1、F2和一条反义引物R, 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。F1在野生型和突变型DNA中均可出现, 作为内参照以保证反应的精确度;F2为突变特异性引物, 跨越G-T突变位点。F1序列为:5′-A T C T A T A G T C A T G C T G A A A G T A G G A G A A A G-3′;F2序列为:5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′;R序列为:5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′。反应体系为:模板DNA2μL, 反义引物R1.0μmol/L, 正义引物F10.5μmol/L, F2 0.5μmoL/L, 10×PCRBuffer5μL, Mgcl2 1.2mmol/L, dNTP各2mmol/L, TaqDNA聚合酶2.5U (广州莱德尔生物科技有限公司) , 去离子水25.5μL。反应条件:94℃预变性11min, 94℃变性30s, 55℃30s, 72℃30s, 循环36次, 72℃延伸6min。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳
取5μLPCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外光透视仪分析图像、摄像并保存结果。出现364bp产物为野生型, 出现364bp和243bp2条产物为突变型。
1.2.4 基因测序
对所有阳性标本和阴性标本均再次分别在与上述相同反应体系和条件下, 进行PCR反应, PCR产物经纯化后, 由上海生工生物工程技术有限公司进行测序, 将所得到的测序结果与野生型基因序列进行对比, 出现G-T突变为阳性。比较直接测序结果与AS-PCR检测结果的一致性。
1.2.5 统计学处理
采用SPSS 13.0软件对所获得的数据进行统计分析, 计量资料以 (x-±s) 表示, 2组间均数比较用t检验;计数资料以率表示, 率的比较用χ2检验, P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 AK2-V617F突变PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
出现364bp和243bp2条条带为阳性, 出现364bp一条条带为阴性, 见图1。
2.2 JAK2-V617F突变在各种疾病中的表达情况
(1) PV组阳性率为93.8% (30/32) , ET组阳性率为60.0% (12/20) , IMF组阳性率为0% (0/3) , MDS组阳性率为4.5% (1/22) , MDS/MPN组阳性率为12.5% (1/8) , AML、ALL、CML患者及正常对照均为阴性。JAK2-V617F突变在PV、ET、MDS、MDS/MPN患者中的阳性率差异有显著性 (χ2=47.799, P<0.05) 。 (2) JAK2-V617F突变阳性ET患者的血红蛋白均数为 (198.6±27.1) g/L, 与阴性患者血红蛋白值均数201.5g/L相比, 差异无显著性 (t=0.062, P>0.05) 。 (3) JAK2-V617F突变阳性ET患者的血小板均数 (834.1±283.5) ×109/L, 与阴性患者血小板均数 (826.3±228.8) ×109/L相比, 差异无显著性 (t=0.083, P>0.05) 。 (4) JAK2-V617F突变阳性PV和ET患者白细胞均数为 (20.6±4.7) ×109/L, 与阴性患者白细胞均数 (16.7±4.2) ×109/L相比, 差异有显著性 (t=2.44, P<0.05) 。 (5) 骨髓活检:根据Comori网硬蛋白染色结果, 按网状纤维积分标准 (Manoharan改良法) [3], 将PV及ET患者按照骨髓纤维组织增生程度分为 (±) 、 (+) 、 (++) 、 (+++) 及 (++++) 5组, JAK2-V617F突变阳性患者骨髓纤维组织增生较明显, 差异有显著性 (P<0.05) , 见表1。
2.3 基因测序结果
阳性标本显示为T峰, 阴性标本显示为G峰, 证实突变型DNA存在JAK2-V617F点突变, 即JAK2基因12号外显子第1849位核苷酸G被T所取代。AS-PCR法检测出44例阳性, 80例阴性。直接测序法检出29例阳性, 并同时为AS-PCR法检出;另外95例阴性, 其中15例用AS-PCR法检测为阳性。2种方法检测阳性率有显著差异, AS-PCR法高于直接测序法 (χ2=4.368, P<0.05) 。2种方法所得结果之间存在正关联, 关联系数r=0.74, 说明直接测序法阳性者AS-PCR法也趋向阳性, 见表2。
M:DNA Marker;1、9、10、11:JAK2-V617F阳性;3、4、5、7、8、12:JAK2-V617F阴性;13:正常对照
3 讨论
MPN是一组以骨髓髓系中一系或多系增殖为特征的克隆性造血干细胞疾病。迄今为止, 人们对MPN的确切发病机制仍不十分明确, 过去的诊断[4]主要依靠临床表现、血常规、血清EPO水平、NAP积分、骨髓细胞形态和骨髓活检等, 并且必须排除继发性因素。但有时仍难以与有相似症状和血象表现的其他疾病相鉴别, 如继发性红细胞增多症, 反应性血小板增多, 类白血病反应, MDS等, 给诊断造成一定困难, 且治疗上也无特异性药物。James[1]首先报道了在PV患者中发现JAK2-V617F点突变, 其后在MPN的其他亚型中也陆续发现了该突变的存在, 但阳性率不一。本实验研究发现JAK2-V617F点突变在PV患者中阳性率最高, 其次为ET患者, 在AML、ALL、CML中为阴性, 与国际上报道相符[5];在IMF患者中未发现阳性, 可能与标本数太少有关。
MDS是一组以髓系细胞分化和成熟异常、骨髓衰竭为特征的髓系肿瘤, 伴有外周血细胞减少和红系、粒系、巨核细胞系一系或多系形态学异常, 由于遗传不稳定因而高风险向急性髓系白血病 (AML) 转化[6]。近期研究发现, 有部分MDS某些亚型的患者中有JAK2突变, Coffer[7]等在通过对MDS患者发病机制的研究中发现JAK/STAT信号传导在MDS细胞凋亡机制中发挥重要的作用, 是影响髓系祖细胞成熟障碍、调控MDS细胞凋亡的重要通路。本研究在MDS和MDS/MPN中各发现1例JAK2-V617F突变。Szpurka[8]研究57例MDS/MPN患者发现11例携带JAK2-V617F。这个发现意味着共同发生并不是偶然的, 什么机制影响M D S患者获得JAK2-V617F, 或者JAK2-V617F阳性MPN发展为MDS?是否这种单一突变在人类中就足以导致MPN的发生?这些问题仍有待进一步探讨。
注:χ2=12.944, P<0.05
注:χ2=4.368, P<0.05;r=0.74
本研究还发现ET患者中JAK2-V617F突变与血红蛋白量、血小板数量无关。但国外有报道[9]ET患者中JAK2-V617F突变阳性者血红蛋白量较高、血小板计数较低, 故我们的研究还有待增加病例数以作进一步分析。PV患者阴性例数太少, 未做比较。PV和ET阳性患者白细胞计数显著高于阴性患者, 且骨髓纤维化程度亦较阴性者严重。国外学者[10]亦发现阳性患者中白细胞计数高, 且可以作为独立的危险因素与血栓形成及骨髓纤维化成正相关。
JAK2-V617F的检测目前有直接测序、BsaⅪ限制性酶切分析、AS-PCR和荧光实时定量PCR (RT-PCR) 等方法。直接测序法准确率高但敏感度低, 多应用于科研;限制性酶切方法较复杂且阳性率不高;AS-PCR特异性强、敏感度高;RT-PCR敏感度高, 且对于突变基因的含量及纯合子、杂合子的比例能定量分析, 但费用较高。Baxter等[11]应用AS-PCR检测发现ET中阳性率高达57%, 明显高于直接测序法仅12%的阳性率。由于MPN患者中只有一部分外周血粒细胞可能起源于恶性祖细胞, 同时普通方法仅可在超过40%的细胞 (等位基因>20%) 有杂合子突变时才可检测到, 因此普通测序可能会低估携带JAK2-V617F突变的比例, 应用AS-PCR方法可以在3%的细胞有杂合子突变就可检测到。在我院临床检测中, 测序阳性者与应用AS-PCR方法检测完全一致, 但AS-PCR灵敏度更高, 且方法简便、成本较低, 是值得广泛开展的临床检测方法。
参考文献
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JAK2 篇2
供肝缺血再灌注损伤是肝脏移植重要的病理生理过程,缺血再灌注损伤过程中可产生大量自由基,导致脂质、蛋白质和核酸过氧化,细胞膜破坏。FK409是一种合成的新型NO促释放剂,已有不少研究结果表明FK409的移植物保护作用可能通过NO的多种功能如抗血小板集聚和抗中性粒细胞黏附,抗肝细胞凋亡和改善肝窦微循环障碍等功能来实现。本研究采用大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤模型,观察NO促释放剂FK409是否能通过抑制与炎性细胞因子及氧化应激有密切关系的JAK2/STAT3信号转道通路而起到细胞保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
雄性SD大鼠,体重250~300 g,由广西医科大学实验动物中心提供。动物随机分为假手术组、生理盐水干预组、FK409干预组,每组20只动物。治疗组于新肝开放前5 min分别经鼠尾静脉注射FK4092 mg/kg或等量生理盐水。24 h后处死动物,取肝组织检测。
1.2 主要试剂
FK409(南京大治生物科技有限公司);Trizol RNA提取试剂盒(美国Gibco公司);逆转录试剂盒(美国MBI公司);磷酸化JAK2多克隆抗体、磷酸化STAT3单克隆抗体(p Tyr705)均为Santa Cruz,CA公司产品,生物素标记羊抗兔Ig G抗体和单抗鼠Ig G抗体购自美国Upstate Biotechnology,Inc,、ABC试验盒、TUNEL法细胞凋亡检测试验盒、DAB显色试剂盒PCR试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 动物模型的制备
大鼠原位肝移植模型采用Kamada袖套法[1],乙醚吸入麻醉,肝上下腔静脉用7/0带线缝合针连续缝合,肝下下腔静脉重建采用套管(内径0.3 cm的聚乙烯管),门静脉重建采用套管(内径0.2 cm的聚乙烯管),胆总管重建采用插管法(内径0.1 cm的硬膜外导管),肝动脉不予重建。供肝的热缺血时间0~1 min,冷缺血时间90~100 min,无肝期平均为18~22 min。FK409干预组:于新肝开放前5分钟经鼠尾静脉注射FK409 3 mg/kg+生理盐水共2m L;生理盐水干预组(NS):于新肝开放前5 min经鼠尾静脉注射生理2 m L;假手术组(SO):打开腹腔,充分游离肝脏,结扎左膈静脉,左肝至食管周围的静脉,右肾上腺静脉,然后关腹,此组不进行肝移植。
1.4 RT-PCR步骤
半定量RTPCR分析检测供肝JAK2和STAT3m RNA表达:(1)一步法总RNA提取试剂(Trizol试剂)提取肝脏总RNA,用紫外分光光度仪测定其纯度和含量。(2)在逆转录酶(MLV)催化下合成c D-NA,以适量c DNA为模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增。(3)参照Gene Bank中的JAK2和STAT3全长序列,计算机辅助设计引物。JAK2上下游引物为:5'-TTCTGTGGCCTCAGATGTGTG-3'和5'-TGAAAGAGGGACGTTGGTTGA-3',扩增片段为452 bp;STAT3上下游引物为:5'-CCTTCCTGCGGTT CAGT-3'和5'-GCTGCAGGTCGTTGGTGTCAC-3',扩增片段为602 bp;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上下游引物为:5'-TATCGGACGCCTGGTTAC-3'和5'-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3',扩增产物为209bp。所用引物均由上海生工生物公司合成。JAK2的扩增条件为:预变性94℃5 min,进入循环,94℃50 s,55℃60 s,72℃60 s,32个循环后72℃延伸8min。STAT3扩增条件为:预变性94℃5 min,进入循环,94℃50 s,58℃60 s,72℃60 s,30个循环后72℃延伸8 min。(4)将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,置于凝胶图像分析系统(Bio Rad公司,美国)进行吸光度(A值)扫描,以GAPDH作为内参照校正,用目的基因与GAPDH的比值(A值比)代表目的基因相对表达含量。
1.5 免疫组织化学步骤
(1)3%甲醇过氧化氢孵育10 min清除内源性过氧化物酶。(2)封闭用3%BSA室温孵育1 h。(3)分别入P-JAK2兔多克隆抗体(1∶200)P-STAT3鼠单克隆抗体(1∶500)4℃过夜。(4)生物素标记羊抗兔IG抗体或单抗鼠Ig G抗体室温放置1 h。(5)AB复合物室温反应1 h。(6)DAB显色;苏木素轻度复染。脱水,透明和中性树胶封片。以上各步骤间均用0.01mol/L PBS洗3×5 min;阴性对照用0.01 mol/LPBS代替Ⅰ抗。(6)在40×10倍的光镜下,分别对肝组织切片各5个视野里JAK2、STAT3免疫阳性细胞数目计数。
1.6 细胞凋亡检测步骤
(1)冰冻切片用0.01 mol/L PBS洗2 min×2次。蒸馏水洗2 min×2次。(2)3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶,室温处理10 min。蒸馏水洗。(3)每片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μL,以保持切片湿润。按每张切片取Td T和DIG-d-UTP各1μL,加入18μL标记缓冲液中,混匀。甩去切片上多余液体后加标记液。置样品于湿盒中,37℃标记2 h。(4)0.01 mol/L TBS后,每片加封闭液50μL,室温30min。甩掉封闭液,不洗。(5)用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体,混匀后50μL/片加至标片上。置样品于湿盒中,37℃反应30 min。0.01mol/L TBS洗。(6)用抗体稀释液1∶100稀释SABC:取1 m L抗体稀释液加SABC 10μL,混匀后50μL/片加至切片。37℃反应30 min,0.01 mol/L TBS洗5min。(7)DAB显色,苏木素复染。脱水,透明和中性树胶封片。(8)在40×10倍的光镜下,分别对肝组织切片各5个视野里凋亡阳性细胞的数目计数。
1.7 统计学方法
实验结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析。采用成组设计的方差分析检验和LSD检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 FK409对大鼠肝移植缺血再灌注损伤后JAK2,STAT3 m RNA表达的影响
假手术组JAK2,STAT3 m RNA表达很弱,生理盐水治疗组缺血再灌注损伤后24 h肝组织JAK2,STAT3 m RNA表达明显增强,FK409能明显抑制JAK2,STAT3 m RNA表达。经统计学处理差异有显著性(P<0.05),见表1,图1、2。
2.2 FK409对大鼠脑缺血再灌注损伤后JAK2,STAT3免疫阳性细胞及TUNEL阳性细胞的影响
假手术组偶见JAK2,STAT3免疫阳性细胞及偶见TUNEL阳性细胞,见图3~5,生理盐水治疗组24h肝组织JAK2,STAT3免疫阳性细胞及凋亡细胞明显增加,见图6~8,FK409治疗组肝组织P-JAK2,P-STAT3蛋白表达及凋亡细胞减少,见图9~11,经统计学处理差异有显著性(P<0.05),见表2。
3 讨论
JAK(janus kinase)/信号转导和转录激活因子(signal transducers and activator of transcription,STATs)是近年来新发现的一条细胞内信号转导途径。分别由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族(STAT1,STAT2,STAT3,STAT4,STAT5a,STAT5b,STAT6)组成。细胞外可溶性信号分子(细胞因子、生长因子等)识别并与细胞膜上的特异受体结合后诱导受体聚化构成二聚体或三聚体,在胞浆内形成高亲和性的JAKs结合位点,JAKs与受体胞浆区域的JAKs结合位点结合后发生自身或与受体交叉酪氨酸磷酸化而活化,活化的JAKs进一步募集细胞浆内相应的信号传导和STATs,并使其磷酸化而活化,活化的STATs蛋白可相互形成同源或异源二聚体并移向核内,与目的基因的启动子结合,直接激活目的基因表达,完成细胞因子受体介导的信号传导过程,表达细胞因子的效应[2]。目前已知有多种细胞因子(IFN、IL-2、IL-4、IL-6和CNKT等),生长因子(ECF、PDGF、CSF和EPO等)通过活化JAK-STAT途径来进行信号转导,不同的受体亚家族分别通过特定的JAK和STAT家族成员转导信号,该途径已经成为细胞因子信息转导的一条重要通道[3]。近来研究表明氧化应激也能激活JAK/STAT信号转导通路[4,5]。肝移植缺血再灌注损伤不仅能释放大量的炎性细胞因子,如IL-1、IL-6和TNF-α等[6],同样能引起大量氧自由基的产生。JAK/STAT信号通路是一条应激反应通路,广泛参与细胞的增殖、分化成熟、凋亡及免疫调节等过程,是众多细胞因子及氧化应激信号转导的重要途径之一,它激活后可诱导许多靶基因的表达[7]。最近国外及本实验室近期研究发现肝缺血再灌注损伤后,磷酸化JAK2(P-JAK2)、磷酸化STAT3(P-STAT3)在缺血再灌注损伤肝组织表达明显增强,并促进肝细胞死亡[8],注射JAK2抑制剂(AG490)能明显抑制肝缺血后JAK2和STAT3表达,显著减少肝细胞凋亡,使缺血肝细胞的损伤明显减轻[9]。FK409是一种NO促释放剂,体外及动物实验已证实本药可以通过NO的多种功能如抗血小板集聚和抗中性粒细胞黏附,抗肝细胞凋亡和改善肝窦微循环障碍等功能来实现的,减轻血管内皮细胞损伤,从而减轻很多器官缺血和缺血引起的器官水肿及组织损伤,缩小坏死面积,改善缺血后引起的功能缺损[10~12]。李相成等认为,采用小剂量的FK409可以使再灌注后的30 min产生大量的NO使门脉血流切应力降低,从而降低由于上调EGR-1及其下游基因如ET-1、ETA、i NOS和MIP-2、TNF-a引起的急性期的炎症反应。减轻原位减体积肝移植大鼠的再灌注损伤,改善微循环,提高移植肝脏的功能[13]。从而证明FK409不仅通过减轻膜脂质过氧化,而且通过抑制炎症因子的产生对氧自由基引起的急性肝损害有明显保护作用[14]。但是是何种通路尚不清楚。本研究首次采用大鼠原位肝移植缺血再灌注操作模型,观察NO促释放剂FK409是否能通过抑制JAK2/STAT3信号通道而起到肝细胞保护作用,实验结果发现大鼠肝移植后立即给予FK409治疗,再灌注损伤24 h治疗肝组织JAK2,STAT3m RNA及JAK2,STAT3免疫阳性细胞表达明显减少,TUNEL阳性的凋亡细胞数量也明显减少,说明了FK409能够通过抑制JAK2/STAT3的激活,下调缺血后肝组织中P-JAK2,P-STAT3蛋白的表达,减少缺血再灌注损伤大鼠肝细胞凋亡的发生。FK409有可能通过抑制与氧化应激有密切关系的JAK2/STAT3通路,显著减轻肝移植缺血再灌注损伤后细胞损伤,从而起到肝细胞保护作用。
摘要：目的探讨FK409对大鼠肝脏移植缺血再灌注损伤后细胞凋亡及JAK2,STAT3表达的影响。方法雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、生理盐水干预组、FK409干预组,采用Kamada's袖套法建立大鼠原位肝移植模型。干预组于新肝开放前分别鼠尾静脉注射FK4092mg/kg或等量生理盐水,于24h后RT-PCR及免疫组织化学方法检测JAK2,STAT3表达水平的变化;利用原位缺口末端标记法(TUNEL法)研究肝细胞凋亡的变化。结果与生理盐水干预组相比,FK409干预组JAK2,STAT3表达明显减少(P<0.05);凋亡细胞也减少(P<0.05)。结论FK409尚能通过抑制与炎性细胞因子及氧化应激有密切关系的JAK2/STAT3信号转导通路显著减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤。
JAK2 篇3
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
雄性SD大鼠, 体重250~300g。动物随机分为假手术组、生理盐水干预组、依达拉奉干预组, 每组20只。治疗组于新肝开放前5min分别经鼠尾静脉注射依达拉奉3mg/kg或等量生理盐水。24h后处死动物, 取肝组织检测。
1.2 主要试剂
依达拉奉;Trizol RNA提取试剂盒;逆转录试剂盒;磷酸化JAK2多克隆抗体、磷酸化STAT3单克隆抗体 (p Tyr705) , 生物素标记羊抗兔Ig G抗体和单抗鼠Ig G抗体、ABC试验盒、TUNEL法细胞凋亡检测试验盒、DAB显色试剂盒PCR试剂盒。
1.3 动物模型的制备
大鼠原位肝移植模型采用Kamada’S袖套法[1]。
1.4 RT-PCR步骤
半定量RTPCR分析检测供肝JAK2和STAT3 m RNA表达。
1.5 免疫组织化学步骤
(1) 3%甲醇过氧化氢孵育10min清除内源性过氧化物酶。 (2) 封闭用3%BSA室温孵育1h。 (3) 分别入P-JAK2兔多克隆抗体 (1∶200) P-STAT3鼠单克隆抗体 (1∶500) 4℃过夜。 (4) 生物素标记羊抗兔IG抗体或单抗鼠Ig G抗体室温放置1h。 (5) AB复合物室温反应1h。 (6) DAB显色;苏木素轻度复染。脱水, 透明和中性树胶封片。以上各步骤间均用0.01mol/L PBS洗3×5min;阴性对照用0.01mol/LPBS代替Ⅰ抗。 (6) 在40×10倍的光镜下, 分别对肝组织切片各5个视野里JAK2、STAT3免疫阳性细胞数目计数。
1.6 细胞凋亡检测步骤
(1) 冰冻切片用0.01mol/LPBS洗2min×2次。蒸馏水洗2min×2次。 (2) 3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶, 室温处理10min。蒸馏水洗。 (3) 每片加标记缓冲液 (Labeling Buffer) 20μL, 以保持切片湿润。按每张切片取Td T和DIG-d-UTP各1μL, 加入18μL标记缓冲液中, 混匀。甩去切片上多余液体后加标记液。置样品于湿盒中, 37℃标记2h。 (4) 0.01mol/LTBS后, 每片加封闭液50μL, 室温30min。甩掉封闭液, 不洗。 (5) 用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体, 混匀后50μL/片加至标片上。置样品于湿盒中, 37℃反应30min。0.01mol/LTBS洗l。 (6) 用抗体稀释液1∶100稀释SABC:取1m L抗体稀释液加SABC10μL混匀后50μL/片加至切片。37℃反应30min, 0.01mol/LTBS洗5min。 (7) DAB显色, 苏木素复染。脱水, 透明和中性树胶封片。 (8) 在40×10倍的光镜下, 分别对肝组织切片各5个视野里凋亡阳性细胞的数目计数。
1.7 统计学方法
实验结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析。采用成组设计的方差分析检验和LSD检验。
2 结果
(1) 依达拉奉能明显抑制JAK2, STAT3m RNA表达。经统计学处理差异有显著意义 (P<0.05) 。
(2) 依达拉奉治疗组肝组织P-JAK2, P-STAT3蛋白表达及凋亡细胞减少, 经统计学处理差异有显著意义 (P<0.05) 。
3 讨论
依达拉奉是一种合成的新型自由基清除剂和抗氧化剂。Tsuji等在大鼠70%肝切除后48h注射脂多糖 (1ipopolysacchari, LPS) , 注射前给予依达拉奉治疗.结果显示依达拉奉可以抑制血清中各种炎症因子如TNF-α、IL) -1p、IL-12、INF-γ、细胞因子诱导的中性粒细胞化学趋化因子1, 并减少肝组织中TNF-α、IL-12、CINc-1和i NOS的含量, 明显提高了肝切除后内毒素血症大鼠的存活率.减轻肝脏炎症改变, 进一步用电泳迁移率改变法检测显示依达拉奉明显抑制了由LPS刺激而活化的库否细胞NF—KB活性.可能通过抑制库否细胞的NF—KB活性起到抗炎作用.进而减轻肝损害。Nakamoto N等在给予大鼠四氯化碳 (carbon tetrachloride, CC14) 后应用3mg/kg的依达拉奉治疗.可明显减轻CC14引起的肝脂肪变性和坏死、肝细胞凋亡及血清谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶升高, 降低CC14引起的IL-6、TNF-α、IL-4和IL-1O血清水平及肝内转录水平的升高, 并减少肝内MDA、8-OHd G的形成。从而证明依达拉奉不仅通过减轻膜脂质过氧化, 而且通过抑制炎症因子的产生对氧自由基引起的急性肝损害有明显保护作用。
参考文献
JAK2 篇4
1 MPD发病机理
酪氨酸激酶异常、信号转导激酶活化与血液病的关系已被普遍了解, 蛋白质酪氨酸激酶磷酸化是生长刺激因子信号转导中的关键步骤, EPO、GM-CSF和TPO等受体缺乏胞质酸的酪氨酸激酶结核域, 它们信号转导需要通过JAK/STAT信号转导系统, JAK2作为胞质酪氨酸激酶, 在多种造血生长因子受体信号转导过程中发挥关键作用。受体信号转导起始于JAK, 受体结合后JAK活化进一步激活STAT, 促进生长增殖相关基因转录和翻译, 促进基因表达[1]。
2 MPD中JAK2 V617F突变
JAK2在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用, 值得注意的是, JAK2参与MPD中造血祖细胞高度敏感的生长因子包括EPO、GM-CSF、IL-3、GCF、ICF-1和TPO的信号转导过程, 激酶抑制剂包括JAK2抑制剂和JAK2的siRNA可阻断EEC的形成。
3 JAK2 V617F突变在MPD中的作用
JAK2 V617F对MPD的发病起作用, 不是在同一细胞中存在的偶发突变, JAK2 V617F突变对MPD尤其是对PV密切相关: (1) 该突变发生对激酶 (JH1) 结构域起负调控作用的JAK2激酶样区 (JH2) 结构域模型提示缬氨酸617和半胱氨酸618在保持JAK2激酶结构域非活化构象中起重要作用。 (2) 动物实验表明, 给小鼠转入突变的JAK2基因后出现明显的红细胞增多和脾肥大, 而野生型不具有该作用[2]。
4 KLF4与MPD的关系
KLF4是一种新发现的真核锌指转录因子。通过调节其下游目标基因转录表达而在细胞周期调控、细胞增生分化中担任重要角色。转录因子是一类具有重要功能的序列特异性DNA结合蛋白, 它们通过激活或抑制其目标基因的转录来调控基因的时相性及细胞的组织特异性表达, 而在细胞生长、分化、凋零等生理过程起重要作用[3]。
4.1 KLF4表达
KLF4在多种组织中存在, 最近Andrew认为人和鼠的KLF4有差别。KLF4在表皮细胞中上层分化成熟的细胞表达高。在体外试验中, DNA损伤能使KLF4的表达上调, 缺失KLF4小鼠出生后1d, 结肠上皮细胞将无增生变化而死亡。多个研究组发现它在消化道、口腔、食管上皮及皮肤表皮都有表达。最近发现它在造血细胞和胚胎细胞中存在, 促进细胞分化。
4.2 KLF4与细胞增生的关系
Andrew等[4]也认为人或鼠的KLF家族中KLF2或KLF4在原始红系造血组或胚胎珠蛋白的生成起重要作用。干细胞高表达基因有KLF4, 一个转录因子家族成员, 研究当DNA损害后, 还发现KLF4是一个重要的调停者, 在P21生长抑制G1/S细胞抑制周期上, 研究发现KLF4能成功抑制HPC分化抗原和产生诱导作用, P21样通路在细胞周期抑制和增加编程细胞死亡, 进一步研究KLF4细胞组和分子活度不能了解干祖细胞休眠分子基础, 但可以了解正常干祖细胞扩充的方法。
5 JAK2 V617F与KLF4之间的关系
JAK2是广泛表达的胞质酪基酸激酶, 在多种生长因子受体信号转导中发挥核心作用。JAK2 V617F突变发生在对激酶 (JH1) 结构起负性调控作用的JH2结构域, 617位缬氨酸被大量苯丙氨酸替代, 将引起交互抑制作用的不稳定, 从而使MPD某一系列的细胞呈增长优势。
6 问题与展望
MPD患者中JAK2 V617F突变的发现, 扩展了对PV、ET、IMF的分子病因学和生物学特征的认识, 以下问题有待于进一步解决: (1) JAK2 V617F突变对疾病的发生、转归、治疗及预后有无影响; (2) 单一突变如何在3种以上的不同的MPD间起作用; (3) 能否找到抑制该突变的靶向药物, 从而有效控制疾病发展; (4) JAK2 V617F和KLF4在细胞增殖分化方面是因果关系还是协同关系。目前医学界靶向治疗越来越受到重视, JAK2 V617F为我们找到了MPD的治疗策略的新思路。
参考文献
[1] Thle JN.Cytokine receptor signaling[J].Nature, 1995, 377:591-594.
[2] Wernig G, Mercher T, Okabe R, et al.Expression of JAK2V617Fcauses a polycythemia vera-like disease with associated myelofi-brosis in a murine bone marrow transplant model[J].Blood, 2006, 107 (11) :4 274-4 281.
[3] Bieker JJ.Kruppel-like factors:three Fingers in manypies[J].Bi-ol Chen, 2001, 276:34 355-34 358.
JAK2 篇5
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年杂种犬24只 (山西医科大学实验动物中心提供) , 雌雄不限, 体重10 kg～15 kg, 一般状况良好。随机分为4组, 每组6只。假手术组 (Sham组) :丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎;缺血/再灌注组 (I/R组) :结扎左冠状动脉前降支30 min, 再灌注120 min;舒芬太尼后处理组 (Sufentanil组) :在缺血后再灌注前5 min静脉注射0.6 μg/kg舒芬太尼注射液, 其余同缺血再灌注组;舒芬太尼后处理+AG490组 (Sufentanil+AG490组) :操作同舒芬太尼后处理组, 但在再灌注前5 min静脉输注JAK2 抑制剂AG490 (1 mg/kg) 。
1.2 主要试剂和仪器 MDA、SOD和考马斯亮蓝试剂盒 (均购自南京建成生物工程研究所) ;舒芬太尼 (购自宜昌人福药业有限责任公司) , AG490 (购自Biosource公司) ;欧米达201麻醉机, 多功能监护仪。
1.3 实验过程 实验前动物禁食8 h, 自由饮水, 称重, 于犬后腿内侧大静脉缓慢推注3%戊巴比妥钠 (30 mg/ kg) , 当犬角膜反射消失则停止给药。固定, 经口明视气管内插管, 麻醉机控制呼吸, 按需给予阿曲库铵、戊巴比妥钠维持麻醉。心前区备皮消毒, 在左侧第4、5肋间 (扪及心跳最强处) 沿第5肋上缘开胸, 切口约10 cm , 充分暴露心脏左前侧壁。于冠状动脉左前降支第一、二分支之间穿针引线 (2-0号无创丝线) , 连同一小段硬质圆钝头的塑料管一起结扎, 造成缺血, 及时记录心电图的改变。结扎成功的标准:①心肌缺血区局部发绀;②结扎后心电图ST -T融合抬高 (Ⅱ导联) 。结扎30 min 后, 在硬质塑料管上切断结扎线, 恢复冠脉血流。再灌注成功的标准: ①缺血区局部颜色变红;②心电图ST - T 逐渐恢复到缺血前水平。术中实时监测有创动脉血压, 全程二导联心电监护, 注意ST-T 的改变, 持续监测心率。术中各组动物按15 mL/kg 补予液体。
1.4 标本采集及指标检测 于再灌注2 h 后, 立即剪开心脏, 取缺血中心区发绀的心肌组织检测MDA含量和SOD活性, 采用硫代巴比妥酸 (TBA) 检验法和嘌呤氧化酶法测定。MDA可与TBA形成红色产物, 此红色物质在532 mm波长处有最大吸收峰, 采用分光光度法对其进行定量测定来间接反映细胞损伤程度。黄嘌呤氧化酶法是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基, 后者氧化羟胺形成亚硝酸盐, 在显色剂作用下呈现紫红色, 用可见分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时, 则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用, 使形成的亚硝酸盐减少, 比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值, 通过公式计算可求得被测样品中的SOD活性。
1.5 统计学处理 实验数据以均数±标准差
2 结 果
与Sham组比较, I/R组、Sufentanil组和Sufentanil+AG490组MDA含量明显升高 (P<0.01) , SOD活性显著下降 (P<0.01) 。与I/R组比较, Sufentanil组能显著降低MDA含量 (P<0.01) , 提高SOD活性 (P<0.01) 。与Sufentanil组比较, Sufentanil+AG490组MDA含量显著升高 (P<0.05) , SOD活性显著下降 (P<0.05) 。详见表1。
3 讨 论
心肌缺血再灌注损伤的发生机制通常认为与氧自由基、钙超载、中性粒细胞释放、微血管损伤和高能磷酸化合物生成障碍等有关[2,3]。缺血/再灌注时脂质过氧化增强 (自由基引发) , 细胞膜脂质过氧化改变膜酶、离子通道的脂质微环境, 从而使膜通透性增高, 细胞外钙离子内流。膜上Na+-K+-ATP酶失活, 可使细胞内Na+升高, Na+-Ca2+交换增强, 而使细胞内钙超载[4,5]。线粒体膜富有磷脂, 缺血/再灌注时自由基引发的线粒体膜脂质过氧化或细胞内形成脂质过氧化物作用于线粒体膜, 使膜的液态及流动性改变, 从而导致线粒体功能障碍, 高能磷酸化物产生减少, 自由基产生增多, 细胞丧失能量贮备[6,7,8]。缺血/再灌注时, 组织及血浆中脂质过氧化物显著增高, 超微结构严重受损[9,10]。MDA是氧自由基致脂质过氧化的中间代谢产物, 可反映细胞氧化损伤的严重程度, SOD可清除机体内氧自由基保护细胞, 因而SOD活性高低可反映机体清除氧自由基的能力。本实验结果显示, 与Sham组比较, I/R可使心肌组织MDA含量明显升高, SOD活性显著下降;而舒芬太尼后处理能显著抑制I/R所致的MDA含量明显升高, SOD活性显著下降。提示舒芬太尼后处理可抑制氧化损伤, 从而保护心肌细胞。
JAK-STAT通路主要由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族组成, 其中JAK是STAT的上游共有激酶, 它广泛参与了细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等多种生物学效应。有研究发现JAK2/STAT3 信号通路通过增强SOD 活性, 减轻膜脂质过氧化损伤[11]。还有研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型, 观察到了JAK2-STAT3通路在缺血后处理心肌保护中的作用, 再灌注前5 min静脉注射AG490能明显抑制缺血后处理的心肌保护作用[12], 说明JAK2-STAT3 通路在这一过程中发挥了重要作用, 证实了缺血后处理心肌保护作用与JAK2-STAT3 通路关系密切。本实验结果显示, 与舒芬太尼后处理组比较, 舒芬太尼后处理+AG490能显著抑制舒芬太尼后处理对心肌细胞氧化损伤的保护作用。
本实验表明, 舒芬太尼后处理对犬心肌缺血再灌注损伤中MDA含量有明显降低作用和SOD活性有明显提高作用, 从而对犬心肌缺血再灌注氧化损伤有保护作用;舒芬太尼后处理对犬心肌缺血再灌注氧化损伤的保护机制与JAK2-STAT3通道的作用有关。
摘要：目的 探讨舒芬太尼后处理对犬心肌缺血再灌注氧化损伤中心肌组织丙二醛 (MDA) 含量和超氧化物歧化酶 (SOD) 的影响, 及其与JAK2-STAT3通道的关系。方法 24只犬随机分为假手术组 (Sham组) 、缺血/再灌注组 (I/R组) 、舒芬太尼后处理组 (Sufentanil组) 和舒芬太尼后处理+AG490组 (Sufentanil+AG490组) 。观察心肌组织MDA含量和SOD活性。结果 与Sham组比较, I/R组、Sufentanil组和Sufentanil+AG490组MDA含量明显升高, SOD活性显著下降。与I/R组比较, Sufentanil组能明显降低MDA含量, 提高SOD活性。与Sufentanil组比较, Sufentanil+AG490组MDA含量明显升高, SOD活性显著下降。结论 舒芬太尼后处理对犬心肌缺血再灌注氧化损伤有保护作用, 机制与JAK2-STAT3通道的作用有关。
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