K+-ATP酶（共4篇）
K+-ATP酶 篇1
仿刺参(Apostichopusjaponicus)的食用和药用价值极高[1,2,3],市场需求量大,养殖效益可观,近年来养殖面积不断扩大。由于近年气候变化较大,强降雨或是长时间不降雨使得近岸池塘海中盐度变化较大,因而导致海水盐度升高,对刺参养殖有不利影响[4]。盐度的变化常导致刺参渗透压调节失衡[5],而目前对于刺参渗透调节方面的研究较少。国内的相关研究主要关注盐度对仿刺参生长、存活方面的影响,或者进行呼吸排泄和组织学以及免疫方面的研究[6,7,8,9,10],国外有盐度对不同生长阶段叶瓜参(Cucum.aria frondosa)[11]和尖塔海参(Holotthuria.spinifera)[12]生长发育的影响的相关报道。本实验研究了盐度对仿刺参存活的影响,以及肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性的变化,为育苗中一些操作技术提供科学的验证,以提高幼苗生长阶段的成活率和产量。
1 材料与方法
1.1 材料
仿刺参购于普兰店养殖场,体质量约3.0 g,暂养于塑料水槽(50 cm×40 cm×30 cm)中,密黑石礁海域,经沙滤处理,海水盐度28,水温12～15℃。暂养期间每2 d投饵1次,每天换水1/3,抽去残饵和粪便。不同实验海水盐度用饲养海水加海水晶或自来水调配而成。ATP酶测试盒购于南京建成生物技术公司。饵料使用本实验室设计的饲料,主要原料为海泥、藻粉、贝壳粉、鱼粉、矿物盐和维生素等。饲料中水分、蛋白质和脂肪的质量分数分别为7.61%、16.44%和1.78%。
1.2 方法
盐度急性实验:配制盐度分别为10、15、20、25、30、35、40、42共8个梯度的海水,每个盐度梯度里放入规格相等的10尾仿刺参,于1 h、2 h、4 h、6 h、3 h、12 h、24 h、28 h、32 h、36 h、48 h观察仿刺参的吐肠和死亡情况,记录下每天的观察结果。
同一盐度下不同时间段,仿刺参肠和呼吸树中Na+-K+-ATP酶活性的测定:1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h时测定盐度为20、28、33时,仿刺参肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶的活性,计算出结果。
不同盐度下同一时间段仿刺参肠和呼吸树中Na+-K+-ATP酶活性的测定:测定盐度为10,15,20,25,30,35,40的海水中,在6 h,24 h时仿刺参肠
2 结果
2.1 不同盐度急性实验
当盐度为20～35时,48 h内仿刺参生活良好,未出现异常情况;低于20或高于35时,仿刺参均出现不同程度的化皮或排脏现象,说明仿刺参的存活的适宜盐度范围为20～35。如果盐度低于20,盐度越低,仿刺参的死亡时间越短,反应越明显;如果高于35,盐度越高,仿刺参反应越明显(表1)。
注:漂浮是指仿刺参浮于水中或随充氧产生的水波被移动。
2.2 同一盐度下不同时间仿刺参肠和呼吸树Na+-K+-ATP酶的活性
在适宜盐度范围,盐度为20、33时仿刺参肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性先急剧下降,然后再回升,最后达到稳定;盐度为28时,即暂养的海水盐度,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶一直保持稳定的数值(图1-a)。在盐度为20和33时仿刺参Na+-K+-ATP酶活力发生变化(图1-b、图1-c),在最初的数个小时,Na+-K+-ATP酶活力急剧下降,推测Na+-K+-ATP酶受到外界不良条件影响导致酶活力下降;其后的24 h内,Na+-K+-ATP酶活力逐渐上升,其活力被激活;24 h后仿刺参已适应环境,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶趋于稳定。盐度33时,仿刺参肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活力稳定而明显高于盐度28时
2.3 不同盐度下不同时间时仿刺参肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性
在盐度为30海水中6 h时,仿刺参肠和呼吸树中Na+-K+-ATP酶活性最高,盐度低于20或高于35,Na+-K+-ATP酶活性急速降低,即20<25<30,此阶段仿刺参肠和呼吸树刺参应激并启动了相应的调节机制,盐度越接近28,受到抑制越小,所以30时最高(图2-a)。到了24 h,仿刺参肠和呼吸树刺参的自身渗透调节,适应了一定的盐度范围,此范围内,盐度越高,Na+-K+-ATIP酶活性越高,而此范围之外,超出了刺参自身的耐受能力,难以进行渗透调节,Na+-K+-ATP酶活性严重下降(图2-b)。
3 讨论
Na+-K+-ATP酶是仿刺参组织渗透压调节中离子交换的关键酶,主要功能是参与细胞内外Na+、K+跨膜运输,使细胞内外的离子浓度处于相对稳定的生理平衡状态。Na+-K+-ATP酶极易受外界不利因素的影响,如温度、盐度、pH、重金属离子等均能改变Na+-K+-ATP酶活力[13]。不同盐度下,Na+-K+-ATP酶基因表达不同[14],推测生物主要通过改变Na+-K+-ATP酶基因的表达量来调节渗透压。
仿刺参呼吸树是由肠后端排泄腔向体内延伸形成,通过泄殖腔与体外环境进行水交换,体外海水盐度的变化必然引起渗透压失衡。据文献报道,刺参通过肌肉收缩尽量减少低盐海水进入呼吸树,以适应渗透压失衡[5]。
仿刺参体内的离子浓度低于或高于体外海水盐度时,通过吞饮海水、减少尿量、排出离子等方式来调节渗透压。排出离子是其中一个重要方式,仿刺参的肠和呼吸树起重要作用,主要靠Na+-K+-ATP酶活性增加为排出NaCl提供能量。通过本试验可知,在仿刺参可以耐受的盐度范围内,随着环境盐度的增加,Na+-K+-ATP酶活性增加。国内外学者相关研究也得到了类似的结果,如在军曹鱼(Rachhycentronn canadum)[15]、褐牙鲆(Paralichthy.s olivaceus)[16]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[17]、日本囊对虾(Pennaeus japonicus)[18]和河豚(Siganus rivulatus)[19]等多种水产动物盐度胁迫实验研究中发现,水产动物自身渗透压调节过程中Na+-K+-ATP酶活力随外界环境盐度的变化逐步升高或降低,经过一段时间达到峰值或低谷,然后逐步适应,最终达到稳定,稳定时的酶活力明显高于或低于初始的酶活力。
本实验结果表明,同规格仿刺参在相似环境下,20～35为仿刺参存活的正常盐度范围,当盐度从暂养海水28降低至20以下或增高到35以上时,部分仿刺参出现应激反应而导致排脏或化皮;一旦盐度降至15或升至42时,仿刺参因盐度变化过大而大批死亡。龚海滨等研究了仿刺参对盐度的耐受能力[20],Hu等[21]研究了不同温度和盐度条件下的中国刺参的盐度耐受性,二者结果与本实验类似,说明盐度对刺参养殖影响的重要性,因此在仿刺参养殖过程中,特别是在汛期或干旱期的养殖管理上,要切实加强对养殖用水盐度的监测,如果出现盐度突变就应该及时采取人工补救措施,以免造成重大损失。
摘要：在水温1215℃下采用实验生态法研究了盐度(10、15、20、25、30、35、40和42)对体质量3.0 g的仿刺参(Apostichopus japonicus)存活参肠、呼吸树Na+-K+-ATP酶活性的影响。48 h盐度急性实验表明:仿刺参存活适宜盐度范围为。相同盐度时不同时间仿刺参Na+-K+-ATP酶活性测定试验表明:盐度为20、33时肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性先急剧下降后回升,最后稳定;盐度为28(暂养的海水)时,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶一直保持稳定值。时间相同时不同盐度下仿刺参Na+-K+-ATP酶活性测定试验表明:6 h时,盐度越接近28,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性越高,盐度低于20或高于35,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性急速降低;24 h时,在盐度2035范围内,盐度越高,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性越高,而此范围之外,肠和呼吸树的Na+-K+-ATP酶活性严重下降。
关键词：刺参,盐度,肠,呼吸树,渗透调节,Na+-K+-ATP酶
K+-ATP酶 篇2
1 材料与方法
1.1 实验动物
中国小型猪28只,雌雄兼用,体重18 kg～23 kg,购自中国农业大学,合格证号:京动管字(96)第003号。
1.2 实验药物
益气养阴活血中药由黄芪、黄精、党参、丹参、郁金、赤芍组成(药物剂量比例4∶3∶3∶2∶2∶2),简称复方芪丹液,每毫升含5.5 g生药,由本院制剂室提供;卡托普利片(开搏通),每片12.5 mg,由上海施贵宝制药公司生产,批号:990123。
1.3 实验试剂
丙二醛(MDA)试剂盒(批号:20030321)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号:20030403)、ATP酶试剂盒(批号:20030326)、羟脯氨酸试剂盒(批号:20030404)均由南京建成生物工程研究所提供。
1.4 AMI动物模型的制作
动物采用氯氨酮(25 mg/kg)及安定(1 mg/kg)肌肉注射麻醉,硫喷妥钠每次2 mL～3 mL维持,通过角膜反射消失证实麻醉是否充分。建立静脉通道,气管插管,连接电动人工呼吸机(SC-3型,上海医疗设备厂)辅助呼吸。整个实验过程中监测ECG(12导联)和血压。沿第四肋间剪开皮肤,钝性分离肌肉组织,打开胸腔。剪开心包膜,结扎冠状动脉左前降支中下1/3部,造成急性心肌梗死模型,然后迅速缝合心包膜、胸腔及皮肤。假手术组除不结扎冠状动脉外,其余操作与AMI模型组动物相同。术后给予青霉素32×105 U/d(共3 d)。造模前后均记录12导联心电图,胸导ST段弓背向上抬高,冠脉造影显示左前降支闭塞,显示AMI形成。术中动物死亡3只。
1.5 实验分组及给药方法
手术成功后,动物结扎后成活者随机分为复方芪丹液大剂量组、复方芪丹液小剂量组、卡托普利组、模型组、假手术组,每组5只。复方芪丹液大剂量组予复方芪丹液10 g生药/kg;复方芪丹液小剂量组予复方芪丹液5 g生药/kg;卡托普利组予开博通溶液2 mg/kg。上述实验药物,均口服给药4周,掺于动物饲料中,每次给药均由专人观察证实动物服用,假手术组及模型组予以相应剂量的消毒自来水。
1.6 血流动力学相关指标测定
饲养4周后,麻醉(方法同前),经股动脉插管测得血压(BP)后,送管至左心室,连接压力换能器(MPU-0.5A),经滤波放大器(AP-601G)测左室内压(LVP),再经微分器计算左室内压上升最大速率(dp/dtmax);取血,按测定指标加用不同抗凝剂。注射大剂量氯化钾,使心室于舒张期停跳,剥离心脏组织,冷冻保存备用。
1.7 心肌ATP酶和SOD、丙二醛(MDA)的测定
将猪心肌组织匀浆后,采用比色法测定Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶、MDA、SOD。
1.8 统计学处理
采用SPSS 10.0软件处理数据。计量资料以均数±标准差
2 结 果
2.1 益气养阴活血对中国小型猪AMI后血流动力学的影响
手术后,模型组及各给药组胸前导联的ST段均有明显的弓背向上的抬高,与假手术组比较有明显差异(P<0.01),4周后模型组及各给药组均有所恢复;手术后模型组及各给药组的心率与假手术组比较无统计学意义(P>0.05)。
模型组及各给药组结扎冠脉后4周后,LVP、BP均较假手术组有所下降,其中模型组、复方芪丹液小剂量组及卡托普利组与假手术组比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01);复方芪丹液大剂量组LVP、BP值较假手术组下降不明显,但较模型组明显升高(P<0.01);复方芪丹液小剂量组及卡托普利组LVP明显高于模型组(P<0.05)。与假手术组相比,各组的-dp/dtmax值均下降,其中模型组、芪丹液小剂量组、卡托普利组与假手术组明显下降(P<0.05或P<0.01);复方芪丹液大剂量组较假手术组下降不明显,但较模型组明显升高(P<0.01),卡托普利组-dp/dtmax值亦明显高于模型组(P<0.05)。详见表1。
与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,3)P<0.05,4)P<0.01
2.2 益气养阴活血对中国小型猪ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶、SOD、MDA的影响
模型组及各给药组Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶含量均较假手术组下降;各给药组Na+-K+ATP酶含量较模型组显著上升(P<0.01);复方芪丹液大剂量组Ca2+-Mg2+ATP酶含量较模型组显著升高(P<0.05),复方芪丹液小剂量组、卡托普利组与模型组相比仅有升高的趋势,但无统计学意义(P>0.05);SOD测定结果表明,模型组及各给药组较假手术组降低,其中模型组较假手术组显著降低(P<0.01),复方芪丹液大小剂量组、卡托普利组SOD活力较模型组均显著升高(P<0.05);MDA测定结果表明,模型组及各给药组与假手术组比较均升高,其中模型组较假手术组显著升高(P<0.05);复方芪丹液大剂量组与模型组比较显著降低(P<0.05)。详见表2。
与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,3)P<0.05,4)P<0.01
3 讨 论
AMI后血流动力学的改变主要表现为左心室舒张和收缩功能障碍。心脏收缩力减弱、顺应性降低、心肌收缩不协调[8]。目前认为原发性心肌损害和心脏负荷过重引起的室壁应力增加可能是VR的始动机制。VR可持续数周至数年,直到扩张的力量与斑痕的抗力相平衡。LVP、dp/dtmax等反映左室功能的指标,其值均有所下降表明心肌收缩性能减弱。AMI后血流动力学的改变导致心脏机械性超负荷对AMI后VR的发展起到重要的作用[9]。LVP代表等容收缩期左心室内压力的变化,当前后负荷升高或心肌收缩力加强时LVP上升。dp/dtmax为左室等容期压力最大变化速率,在一定程度上反映室壁张力的变化速率,为评价心肌收缩性能的常用指标。当心率、前后负荷不变或降低时dp/dtmax上升或不变则表示心肌收缩性能增强[10]。
ATP酶存在于组织细胞和细胞器上,是生物膜上的一种蛋白,负责物质运送、能量转换及信息传递,心肌细胞膜Ca2+-Mg2+ATP酶是将钙离子主动泵出细胞外的主要途径,心肌缺血引起细胞膜及细胞内亚细胞结构对Ca2+运转失常,导致细胞浆游离Ca2+浓度提高,其活力下降将导致细胞内高钙。而细胞膜Na+-K+ATP酶活力下降可导致细胞内高钠,增加Na+- Ca2+交换而使胞内钙浓度升高。VR的形成过程中,钙离子代谢失常发挥着重要的作用,作为细胞信号传导的第二信使。MDA可损害膜结合酶的空间结构,从而降低Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活力[12,13]。AMI后SOD活力明显的降低,MDA含量增加,细胞受氧自由基攻击的程度加重且清除超氧阴离子的能力减弱,SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,可清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤;而MDA为氧自由基攻击生物膜的多不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物,间接的反映出细胞损伤的程度[14]。急性心肌梗死后心肌膜脂及自由基代谢发生紊乱,而膜损伤是缺血心肌细胞不可逆损伤的早期标志[15]。
急性心肌梗死属于中医“真心痛”“厥心痛”“心痛”等病的范畴。古代医学对“真心痛”病因病机、辨治等方面已经积累了丰富的经验,《灵枢·厥病》篇指出“真心痛,手足青至节,心痛甚,旦发夕死,夕发旦死”。复方芪丹口服液方中黄芪为君药,补肺气、宗气以促血行;臣以党参、黄精,助黄芪补气;佐以丹参、郁金、赤芍活血化瘀、通络止痛和清心解郁。诸药相伍,共奏益气活血、化瘀止痛之功效。
本实验结果表明,4周后动物血压降低,左室收缩性能降低;心肌细胞抗氧化能力下降;病理观察表现为部分心肌细胞核较假手术组明显增大,心肌纤维增粗等改变,可反映AMI后早期VR的特点。复方芪丹液大、小剂量和卡托普利具有明显升高SOD活力的作用,复方芪丹液大剂量还可显著降低MDA含量。AMI后心肌细胞膜Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶的活力降低,复方芪丹液大、小剂量和卡托普利可提高Na+-K+ATP酶活力;复方芪丹液大剂量尚可提高心肌细胞膜Ca2+-Mg2+ATP酶的活力。益气养阴活血中药减少氧自由基对细胞的损伤,减弱心肌细胞受氧自由基攻击时的损伤程度,降低胞内钙浓度,以干预AMI后VR的过程。
摘要：目的采用结扎中国小型猪冠状动脉造成急性前壁心肌梗死(AMI)模型,应用益气养阴活血中药(复方芪丹液)干预动物AMI后早期心室重构(VR)的影响,并研究其对动物心肌钙、镁离子和氧自由基的作用。方法中国小型猪28只,采取结扎冠状动脉左前降支中下1/3部,造成AMI模型。手术成功存活动物随机分为复方芪丹液大、小剂量组及卡托普利(开搏通)组、模型组、假手术组共5组,均予灌胃给药或自来水4周。4周后测定猪的血流动力学指标、心肌Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性、心肌超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量等。结果与模型组比较,复方芪丹液大剂量组的左室内压(LVP)、血压(BP)、-dp/dtmax值明显升高(P<0.01),复方芪丹液小剂量组及开博通组LVP显著升高(P<0.05),开博通组-dp/dtmax值显著升高(P<0.05)。复方芪丹液大剂量组Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP含量较模型组显著升高(P<0.05),复方芪丹液小剂量组、开博通组与模型组相比Ca2+-Mg2+ATP酶仅有升高的趋势,未有统计学意义(P>0.05);复方芪丹液大剂量组、复方芪丹液小剂量组、开博通组SOD活力较模型组均显著升高(P<0.05)。复方芪丹液大剂量组的MDA含量与模型组比较显著降低(P<0.05)。结论益气养阴活血中药可提高中国小型猪AMI后心肌收缩力,改善血流动力学指标;增加SOD活性,降低MDA含量,提高细胞膜Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力,起到干预AMI后VR和保护心肌的作用。
K+-ATP酶 篇3
1 研究对象与方法
1.1 研究对象
昆明(KM)小鼠30只,雌雄各半5周龄,体重18~23克,由中国医科大学动物中心购入。
1.2 分组与运动方式
小鼠购进后,适应性喂养一周,随机分3组,常规分笼饲养。小鼠每日上午均灌胃,给药方案见表1。
小鼠在长100cm,宽60cm,高70cm的玻璃泳缸中游泳,水深45cm,水温控制在32±2℃。各运动组小鼠每周游泳6天,每次运动时间为:第一周30min/d,第二周60min/d,第三周90min/d,第四周120min/d。
1.3 样本的收集和处理
所有小鼠在最后一次训练结束后次日摘眼球取血,肝素抗凝。取抗凝血350ul,置于弹头试管中用于红细胞Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及血红蛋白的测试。余血1500rpm离心10min,取上层液体(血浆)置于弹头试管中,待测丙二醛(MDA)含量。
2 实验结果
2.1 四周游泳训练后各组小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及血浆MDA含量
训练组小鼠Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性增均显著低于安静组(P<0.05),血浆MDA含量显著高于安静组(P<0.05);训练+蜂胶组小鼠Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著高于单纯训练组,而血浆MDA则显著降低(P<0.05)。提示四周大强度游泳训练造成机体氧化损伤,而蜂胶有抗氧化损伤的作用。
注:*为与A组相比p<0.05△为与C组相比p<0.05
3 分析与讨论
3.1 四周游泳训练后红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的变化
红细胞Na+-K+-ATP酶的基本功能是将细胞内的Na+转移到细胞外,将细胞外的K+运送入细胞内,维持细胞内外的渗透压平衡和跨膜电化学梯度。如果酶活性异常,会导致过量的水随Na+进入细胞内,使红细胞体积增大而变成球形,这可能是一些运动性贫血和运动后红细胞溶血增强的原因之一。Ca2+-Mg2+-ATP酶不但可维持膜脂的不对称分布,而且对维持细胞内Ca2+的浓度起重要作用。当红细胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降时,红细胞泵出Ca2+的能力下降,[Ca2+]升高可影响膜蛋白相互作用,降低RBCM粘弹性,膜变僵硬,并可导致RBCM脂质与细胞膜骨架蛋白的分离,使膜稳定性和流动性降低,红细胞形态改变,变形能力下降[1,2]。4周游泳训练使红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低,这种改变与训练导致自由基增加有关[3]。有报道红细胞膜流动性特别是膜内层流动性与Na+-K+-ATP酶的活性呈正相关[4]。此外,Na+-K+-ATP酶分子中有16个与自由基结合的巯基,极易被氧化成二硫键,所以自由基对Na+-K+-ATP酶结构的直接破坏也会影响到酶活性,使其活性下降,并与血浆脂质量密切相关[5]。本实验中,经过4周游泳训练后小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著低于对照组,而血浆MDA则显著高于对照组。
3.2 蜂胶对训练小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响
蜂胶的化学成分极其复杂,目前已鉴定出300多种化合物,其中黄酮类化合物71种。已有实验证实蜂胶有抗氧化作用。可能的机制如下:(1)蜂胶可以提高机体抗氧化酶(如SOD、CAT)的活性,阻止自由基反应的引发。(2)蜂胶可以阻断自由基导致的链式反应。蜂胶中起抗氧化作用的主要成分之一是黄酮类化合物。黄酮化合物B环上3,4-邻二羟基是具有清除自由基活性的关键结构,其它位上的羟基也起一定作用。黄酮类化合物通过酚羟基与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基,从而终止自由基链式反应,这是黄酮类化合物清除自由基的最主要机制。(3)蜂胶中其它物质的抗氧化活性。研究发现,蜂胶中除黄酮有较强的抗氧化作用外,其它的成分也具有较好的抗氧化能力,如果糖、氨基酸、Ve、Se等。张燕平研究蜂胶对自由基的清除作用时发现,蜂胶分离纯化后的收集液比粗提取物清除自由基效果减弱,说明蜂胶抗氧化性是各种组分协同作用的结果[6]。(4)也有人认为蜂胶抗氧化活性的发挥主要是通过螫合金属离子而削弱金属离子的促氧化作用。以上综合作用的结果提高了机体的抗氧化能力,减弱了自由基对机体的氧化损伤。
本实验研究发现,4周游泳训练后训练+蜂胶组小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著高于训练组小鼠,而MDA则低于训练组。提示蜂胶对红细胞有保护作用,且与蜂胶的抗氧化作用有关。
4 结论
在4周的游泳训练过程中,给小鼠灌服蜂胶,可以明显改善小鼠运动后红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。此作用与蜂胶的抗氧化作用有关。
参考文献
[1] Huang Y,Liu D,Sun S.Mechanism of free radicals on themolecular fluidity and chemical structure of the red cellmembrane damage.Clin Hemorheol microcirc,2000,23(2-4):287-290
[2]衣雪洁;常波;许豪文;力竭游泳对红细胞膜的影响[J].中国运动医学杂志2001,20(2):139～141
[3]池爱平;熊正英;陈锦屏;服用姜黄素对过度运动大鼠部分组织及红细胞膜损伤保护研究.中国体育科技2006,42(3):72～74
[4]姚成灿;pH值对红细胞膜动力学特性和胞内蛋白结构与功能的影响[J].科学通报,48(10);2003(5):1050～1054
[5]胡多利;脑梗死急性期自由基对红细胞结构和功能的影响[J].医学综述2000,6(8):362
K+-ATP酶 篇4
1 材料与方法
1.1 动物与试剂 选用健康雄性Wistar大鼠 (山西医科大学实验动物中心提供) 40只, 鼠龄3个月～4个月, 体重250 g±15 g。左卡尼汀 (珠海亿邦制药有限公司, 批号20090102) ; ATP酶试剂 (南京建成生物工程研究所提供) ;普通试剂由山西医科大学实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及给药方法 健康雄性Wistar大鼠40只, 随机分为假手术组 (A组) 、生理盐水对照组 (B组) 、左卡尼汀100 mg/kg治疗组 (C组) 、左卡尼汀200 mg/kg治疗组 (D组) , 每组10只。B组、C组、D组制作模型前30 min分别以生理盐水1 mL, 左卡尼汀100 mg/kg、200 mg/kg腹腔注射。
1.2.2 右侧大脑中动脉缺血再灌注模型的建立 采用改良Longa法[2]建立大鼠脑缺血再灌注模型。将大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉, 颈正中右旁开0.5 cm～1.0 cm切口, 钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉, 结扎颈外动脉、颈总动脉近心端, 在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口, 将直径0.236 mm的进口尼龙鱼线插入, 以分岔口处开始测量距离, 插入1.8 cm～2.0 cm后固定鱼线, 缝合。缺血2 h后将线栓拉出1 cm左右即可, 形成再灌注。其中假手术组插入1.0 cm鱼线, 其余步骤同实验组。神经功能缺损评分:按照Longa等[2]的5级4分法标准, 神经功能缺损评分在1分～3分者入选。
1.2.3 标本及病理切片的制备 左卡尼汀各剂量组、生理盐水对照组在缺血2 h再灌注24 h, 假手术组在24 h后, 颈椎脱臼处死, 迅速取脑, 各组随机取两只大鼠右侧脑组织迅速固定, 石蜡包埋后, 在海马部位做矢状切片, 厚约5 μm, HE染色, 观察组织学变化。
1.2.4 脑组织匀浆的制备与指标的检测 将脑组织用生理盐水漂洗, 除去血液, 滤纸拭干, 精确称重后制备10%匀浆。低温离心机将匀浆以3 500 r/min离心15 min, 取上清液检测ATP酶, 严格按照试剂盒提供的步骤进行测定。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包, 数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 光镜下HE染色结果
假手术组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。生理对照组神经细胞变性坏死明显, 胞体肿胀, 周围间隙增宽, 结构不清, 出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。左卡尼汀各剂量组神经细胞呈轻度缺血改变, 变性坏死不明显, 胞体呈轻度肿胀, 神经细胞缺失较生理对照组轻。
2.2 脑组织ATP酶活性的变化
与A组比较, B组3种ATP酶的活性均明显降低 (P<0.01) 。C组、D组与B组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。详见表1。
3 讨 论
缺血性脑损伤的病因和病变机制十分复杂, 其中能量耗竭被认为是缺血性神经元损伤的始动因素。脑缺血再灌注后细胞能量代谢障碍可使脑细胞内ATP逐渐耗竭, 依靠ATP运转的离子泵 (Na+-K+-ATPase) 因能量障碍而受到抑制, 同时因Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低, 导致胞内Na+和Ca2+超载。细胞内Na+增多, 导致渗透压升高, 是再灌注早期脑细胞内水肿和神经细胞坏死的重要原因[3]。细胞内Na+增多, Na+-Ca2+交换增多, 进一步加重细胞内Ca2+超载, 引起自由基产生增多, 使细胞膜结构破坏, 细胞膜通透性增加, 细胞内外环境失去平衡, 最后导致神经元死亡。本研究显示, 大鼠脑缺血再灌注后脑组织ATP酶活性均明显较假手术组降低 (P<0.01) 。ATP酶活性被认为是神经细胞质膜功能状态的标记, 其活性已成为间接反映细胞能量代谢情况及脑缺血损伤程度评价的一项重要指标。
左卡尼汀是线粒体脂肪酸β-氧化产生能量的重要辅因子, 最近国外研究发现, 脂肪酸也作为一个重要能量底物被大脑使用, 大脑中13碳-辛酸酯 (13C-octanoate) 氧化产生能量几乎占大脑总能量的20%[4]。脑缺血后补充左卡尼汀可降低游离脂肪酸浓度, 使堆积的脂酰CoA进入线粒体内, 进行β氧化, 产生ATP供能[5]。左卡尼汀能降低脑乳酸/丙酮酸比率, 提高丙酮酸脱氢酶的活力, 促进葡萄糖的氧化利用, 改善预后的神经功能[6]。在体外神经细胞培养缺血缺氧模型中, 左卡尼汀可保持呼吸链复合物的活性, 提高呼吸链的代谢, 保护线粒体的蛋白质, 对抗线粒体氧化应激反应和调节细胞应激, 促进线粒体细胞色素C氧化酶的活性, 促进线粒体ATP的产生, 对缺血神经细胞产生保护作用[7,8]。Alves等[9]研究表明, 左卡尼汀对抗MDMA (二亚甲基双氧苯丙胺) 的神经毒性作用, 降低线粒体mtDNA缺失, 发挥神经保护作用。
本实验研究显示, 缺血前0.5 h腹腔注射左卡尼汀能使降低的ATPase活性不同程度的恢复, 提示左卡尼汀提高脑组织ATP酶活性, 减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的保护机制可能有:通过促进脑缺血再灌注后线粒体脂肪酸代谢, 提高糖代谢, 加速ATP产生, 及早恢复缺血半暗区能量供应, 阻断后续的链式神经元损伤反应, 产生神经细胞保护作用。Na+-K+-ATPase活性升高可纠正细胞内酸中毒, Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高可纠正Ca2+超载, 左卡尼汀通过提高脑缺血再灌注后Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性, 维持钠泵、钙泵的稳定, 使细胞内外Na+、Ca2+平衡, 从而稳定神经细胞膜电位, 起到神经细胞保护作用。关于左卡尼汀在神经细胞保护的其他相关机制, 尚有待于进一步研究。
摘要：目的研究左卡尼汀对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法采用线栓法制备局灶性脑缺血 (MCAO) 再灌注损伤大鼠模型, 观察左卡尼汀对大鼠脑组织ATPase活性的影响。结果左卡尼汀各剂量组均能提高缺血再灌注大鼠脑组织ATPase的活性。结论左卡尼汀对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护机制可能与其促进脑能量代谢, 提高脑组织ATP酶活性, 维持钠泵、钙泵的稳定有关。
关键词：左卡尼汀,脑缺血再灌注,ATP酶
参考文献
[1]Inano A, Sai Y, Nikaido H, et al.Acetyl-L-carnitine permeability across the blood-brain barrier and involvement of carnitine trans-porter OCTN2[J].Biopharm Drug Dispos, 2003, 24 (8) :357-365.
[2]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cere-bral artery occlusion without craniectomyin rats[J].Stroke, 1989, 20 (1) :84-91.
[3]张三妹, 李光来.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤后ATP酶的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2008, 6 (2) :186-188.
[4]Ebert D, Haller RG, Walton ME.Energy contribution of octanoate to intact rat brain metabolism measured by13C nuclear magnetic resonance spectroscopy[J].J Neurosci, 2003, 23 (13) :5928.
[5]Virmani A, Binienda Z.Role of carnitine esters in brain neuropa-thology[J].Mol Aspects Med, 2004, 25 (5-6) :533-549.
[6]Martin E, Rosenthal RE, Fiskum G.Pyruvate dehydrogenase com-plex:Metabolic linktoischemic braininjury and target of oxidative stress[J].Neurosci Res, 2005, 79 (1-2) :240-247.
[7]Picconi B, Barone I, Pisani A, et al.Acetyl-L-carnitine protects striatal neurons against in vitro ischemia:The role of endogenous acetylcholine[J].Neuropharmacology, 2006, 50 (8) :917-923.
[8]Bagetta V, Barone I, Ghiglieri V, et al.Acetyl-L-carnitine selective-ly prevents post-ischemic LTP via a possible action on mitochon-drial energy metabolism[J].Neuropharmacology, 2008, 55 (2) :223-229.
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