质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 篇1

质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定

一 目的学习质粒的酶切及电泳分析。二 原理

限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。

三 试剂与主要仪器

（一）试剂

1．EcoRⅠ酶 2．λ DNA

3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍 4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

5．溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6．琼脂糖

（二）仪器

1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱

四 操作步骤

（一）质粒DNA酶切

1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。

管 号

质粒DNA EcoRⅠ/ μl

酶切Buffer（10×）/ μl ddH2O/ μl RNA酶

① 102 8

② 10 1 2 7

③ 10 1 2 6 1

2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 μl Loading buffer。

（二）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。冷却至65℃时加入2 μl EB，混匀。胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5× TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2毫米。加样每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。1-2㎝处时，停止电泳。观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。