重组真核表达质粒

重组真核表达质粒（共6篇）

重组真核表达质粒 篇1

肺癌是常见的恶性肿瘤之一,全球肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位。我国肺癌的发病率和死亡率逐年上升,在城市居恶性肿瘤的首位,但到目前为止,它的发病机制仍然不清楚。肺鳞癌是肺癌最主要的组织学类型,它起源于支气管上皮且其发生发展是一个多阶段的复杂过程。在致癌因素作用下,支气管上皮细胞的癌变过程一般要经过基底细胞增生、鳞状化生,进而进展为不典型增生、原位癌,再发展为浸润癌。笔者在应用比较蛋白质组学方法研究肺鳞癌癌变机制的过程中发现,GSTP1蛋白的表达在正常支气管上皮到肺鳞癌这一癌变过程中逐步降低。国内外学者[1,2,3,4]对GSTP1与肿瘤的关系进行了大量研究,但对于GSTP1与肺鳞癌癌变关系的研究尚少,且GSTP1在肺鳞癌癌变过程中的生物学功能并不清楚。为此,笔者构建了人GSTP1基因的真核表达质粒,并转染肺鳞癌细胞NCI-H520,以建立稳定表达人GSTP1蛋白的肺鳞癌细胞系,为深入研究GSTP1蛋白在肺鳞癌癌变过程中的生物学功能,探讨肺鳞癌的癌变机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

GSTP1基因(p DNR-LIB-GSTP1,BC010915,有一个氨基酸突变)购自Yrbio基因库;载体pCDNA3.1(+)购自Invitrogen公司;菌株E.coliDH5a和NCI-H520细胞由笔者实验室保存;Taq DNA多聚酶、T4DNA连接酶购于Ta Ka Ra公司;限制性内切酶(EcoRⅠ,Bam H I)购于Fermentas公司;凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Yrbio公司;MarkerⅡ、MarkerⅣ购自天根公司;脂质体Lipofectamine TM2000为Invi trogen公司产品;G418购自Amresco公司;anti-GSTP1抗体购自Abcam公司;相应的二抗购自Sigma公司;RPMI 1640、小牛血清等购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 已有的G ST P1 c D N A

克隆与欲获得的G ST P1 c D N A克隆的比较需构建GSTP1 c DNA克隆(NM-000852),以表达人GSTP1蛋白。Yrbio基因库中原有1个GSTP1基因,BC010915,载体为pD NR-LIB,但是该克隆有2处突变,即CDS区序列的第313位碱基A突变为G,第555位碱基T突变为C。第555位碱基突变没有导致氨基酸突变,但第313位碱基A/G突变导致蛋白质105位上的异亮氨酸(Ile)转变为缬氨酸(Val)。这一突变可导致基因产物活性和底物特异性发生改变。故先构建1个GSTP1的ORF表达型克隆,将已有的GSTP1 c DNA克隆(B C010915)的CDS区序列的第313位碱基G,修正为A,同时将该突变氨基酸修正过来。

1.2.2 引物合成

引物设计采用premier 5.0软件完成。共合成4条引物,GSTP1-f:5'-ATGCCGCCCTAC ACCGTGGTCTAT-3';GSTP1-r:5'-TCACTGTTTCCCG TTGCCAT-3';GSTP1-313-f:5'-TGGAGGACCTCCGC TGCAAATACATCTCCCTCATCTACACCAA-3';GSTP1-313-r:5'-TTGGTGTAGATGAGGGAGATGTATTTG CAGCGGAGGTCCTCCA-3'。其中分别在GSTP1-f上游和下游引物的5'端加上了Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切位点和2个保护碱基(CG),并且在起始密码前添加了Kozak序列(GCC ACC),引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.3 PC R扩增G ST P1 C D S区片段

以pDNR-LI B-GSTP1(BC010915)为模板,GSTP1-f、GSTP1-313-r为引物,PCR扩增GSTP1-A PCR反应体系2μL中加入pDNR-LIB-GSTP1 1μL,10×LA PCR Buffer(Mg2+plus)2.5μL,LA Taq(Takara)0.25μL,dNTP(2.5m M)1μL,GSTP1-f(10μM)0.25μL,GSTP1-313-(10μM)0.25μL,dH2O补足至25μL;反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性20 s,61℃退火25 s,72℃延伸25 s,共进行30个循环,72℃继续延伸3 min。PCR产物GSTP1-A不回收,直接进行后续实验。

以pDNR-LIB-GSTP1(BC010915)为模板,GSTP1-313-f、GSTP1-r为引物,PCR扩增GSTP1-B。PCR反应体系25μL中加入pDNR-LIB-GSTP1 1μL,10×LA PCR Buffer(Mg2+plus)2.5μL,LA Taq(Takara)0.25μL,dNTP(2.5 m M)1μL,GSTP1-313-f(10μM)0.25μL,GSTP1-r(10μM)0.25μL,dH2O补足至25μL;反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性20 s,58℃退火25 s,72℃延伸25 s,共进行30个循环,72℃继续延伸3 min。PCR产物GSTP1-B不回收,直接进行后续实验。

PCR扩增GSTP1 CDS区片段。各取部分GSTP1-A、GSTP1-B的PCR产物,加至一新的PCR管中,再加入GSTP1-f、GSTP1-r为引物,进行PCR反应。P CR反应体系25μL中加入10×LA PCR Buffer(Mg2+plus)2.5μL,LA Taq(Takara)0.25μL,dNTP(2.5 m M)1μL,GSTP1-f(10μM)0.25μL,GSTP1-r(10μM)0.25μL,GSTP1-A(PCR)10.25μL,GSTP1-B(PCR)10.5μL,共25μL;反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性20 s,59℃退火25 s,72℃延伸40 s,共进行30个循环,72℃继续延伸3 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离后,切胶回收GSTP1条带。

1.2.4 人G ST P1真核表达载体的构建

用Bam HⅠ和EcoRⅠ将GSTP1的PCR片段及载体pcDNA3.1(+)双酶切,然后进行连接。连接反应体系:10×T4DNA Ligase Buffer 1μL,T4 DNA Ligase 1μL,pcDNA3.1(+)(B/E)0.7μL,GSTP1-PCR(B/E)7.3μL,共10μL。置于16℃2 h后,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态,在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长,挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定和DNA测序鉴定,并命名为pc DNA3.1(+)/GSTP1。

1.2.5 细胞培养

NCI-H520细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,于37℃含5%CO2孵育箱中培养。

1.2.6 G 418筛选浓度的确定

将NCI-H520细胞稀释到5×103个细胞/m L,每孔1 m L加入24孔板中,培养24 h后,分别加入100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000μg/m L不同浓度的G418培养液。培养7～14 d,细胞全部死亡的最低浓度(500μg/m L)即为筛选浓度。

1.2.7 pc D N A 3.1(+)/G ST P1在N C I-H 520细胞中的稳定转染及鉴定

取对数生长期的NCI-H520细胞,0.25%胰酶消化后以2×105个细胞/孔接种于6孔培养板,培养24 h,待汇合度达到80%～90%时,按照Lipofectamine TM2000操作说明书将重组质粒pcD NA3.1(+)/GSTP1和空载pcDNA3.1(+)转染NCI-H520细胞。转染48 h后,用胰蛋白酶消化细胞,按1︰5与1︰10稀释后转入新的6孔板中,贴壁后在含有G418(500μg/m L)的选择性培养基中加压筛选,2周后G418浓度改为300μg/m L维持筛选。用选择培养液培养4周后,分离阳性克隆并扩大培养备用。

1.2.8 转染后G ST P1蛋白表达的鉴定

分别收集稳定转染重组质粒pcDNA3.1(+)/GSTP1和空载pcDN A3.1(+)以及未转染的NCI-H520细胞,裂解后各取30μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温振荡封闭2 h,用兔抗人GSTP1一抗(1︰200,Abcam)4℃孵育过夜,T BST漂洗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育2 h,TBST漂洗,ECL发光,X片曝光,显影,定影。β-actin为内参照,Image Quant软件分析蛋白质条带的灰度值,计算蛋白质表达的相对强度。实验重复3次。

2 结果

2.1 P CR扩增得到GS TP 1 CDS区片段

以pDNR-LIB-GSTP1(BC010915)为模板,GSTP1-f、GSTP1-313-r为引物,PCR扩增得到GSTP1-A;以pDNR-LIB-GSTP1(BC010915)为模板,GSTP1-313-f、GSTP1-r为引物,PCR扩增得到GSTP1-B;再取部分GSTP1-A、GSTP1-B的PCR产物,加至一新PCR的管中,再加入GSTP1-f、GSTP1-r引物,进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示,PCR产物长度为654bp,与预期PCR产物大小一致(见图1A)。

2.2 pcDNA3.1(+)/GS TP 1真核表达载体的构建与鉴定

用Bam HⅠ和EcoRⅠ将GSTP1的PCR片段及载体pc DNA3.1(+)双酶切,然后进行连接,获得pcD-NA3.1(+)/GSTP1真核表达质粒,该质粒再经Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切,电泳结果显示,pcDNA3.1(+)/GS TP1(1)和pcDNA3.1(+)/GSTP1(2)切出1条约650 bp的目的片段和1条约5 400 bp的载体片段(见图1B)。由图1B可知,pcDNA3.1(+)/GSTP1(1)pcDNA3.1(+)/GSTP1(2)为正确克隆。将pcDNA3.1(+)/GSTP1(2)送Ta Ka Ra公司测序,测序引物为T7,测序结果显示(见图2A),GSTP1基因片段为633 bp。采用比对软件Dassit 2.0将测序序列与欲获得的目的序列进行比对,比对结果显示(见图2B),原GSTP1 CDS区313位的碱基G,已经成功修正为A。综上所述,pcDNA3.1(+)/GSTP1构建成功。

A:GSTP1部分测序结果;B:GSTP1序列比对结果

1:未转染的NCI-H520细胞;2:pcDNA3.1(+)/NCI-H520细胞;3:pcDNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520细胞Ⅰ;4:pcDNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520细胞Ⅱ;5:pcDNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520细胞Ⅲ;6:pcDNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520细胞ⅣA:Western-blotting检测到GSTP1蛋白在pcDNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520Ⅰ中高表达;B:GSTP1蛋白在未转染组、对照组与转染组中的相对表达强度

2.3 稳定表达株的筛选与鉴定

转染细胞经G418(500μg/m L)持续筛选14 d后可观察到单克隆形成,挑选单克隆细胞,再以含维持量的G418(300μg/m L)培养液进行克隆扩增,得到pc DNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520(转染组)和pcDNA3.1(+)/NCI-H520(对照组)两种细胞株。而未经转染的NCI-H520细胞在上述筛选压力下2周内死亡脱落。收集转染组与对照组的单克隆细胞,用Western blotting检测GSTP1蛋白的表达,结果见图3,稳定转染pc DNA3.1(+)/GSTP1的NCI-H520细胞Ⅰ检测到GSTP1蛋白的高表达,而转染空质粒的对照组及未转染组细胞则表达较低,表明所构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)/GSTP1已在真核细胞NCI-H520Ⅰ内稳定表达。

3 讨论

谷胱甘肽转移酶PⅠ(glutathione s-transferase P1,GSTPl)基因定位于染色体的11q13,该基因全长约3 kb,包括6个内含子和7个外显子,c DNA序列全长0.633 kb,编码210个氨基酸,是GSTs超基因家族中π家族的成员。GSTP1参与代谢、解毒和消除潜在的具有基因毒性的外来复合物,它能够代谢多种致癌化合物,起到保护细胞避免DNA损伤和癌细胞形成的作用,抑制GSTP1活性可以导致DNA损伤的敏感性增强和癌变发生的几率增加。对于GSTP1的研究原来主要集中在其耐药机制方面,现在则着重于在肿瘤发生中的作用。在肺癌的研究中,研究较多的是GS TP1的多态性与肺癌易感性及化疗敏感性的关系[5,6],而在肺鳞癌癌变过程中的作用尚未见报道。笔者采用激光捕获显微切割技术纯化正常支气管上皮、鳞状化生、非典型增生、原位癌及肺鳞癌组织,运用i TRAQ标记技术和多维液相色谱及串联质谱对上述肺鳞癌癌变阶段的蛋白质进行了定性及定量分析,以筛选肺鳞癌癌变各阶段的差异蛋白,研究这些差异蛋白质在肺鳞癌癌变过程中的生物学功能,以探讨肺鳞癌的癌变机制。在研究过程中笔者发现GSTP1蛋白的表达从正常支气管上皮到肺鳞癌这一癌变过程中逐步降低。为进一步研究GSTP1在肺鳞癌癌变过程中的生物学功能,笔者将此基因构建于真核表达载体pcDNA3.1(+),经限制性核酸内切酶酶切鉴定、测序证实目的基因GSTP1序列正确,成功构建了重组子pcDNA3.1(+)/GSTP1。然后将所构建的含GSTP1基因的重组质粒转染到NCI-H520细胞,并用G418筛选稳定转染细胞株,选择抗性克隆并扩大培养。为了进一步证实GSTP1基因是否已经转染到NCI-H520细胞中,笔者采用Western blotting检测了抗性克隆细胞中GSTP1蛋白的表达水平,稳定转染pcDNA3.1(+)/GSTP1的pcDNA3.1(+)/GSTP1/NCI-H520Ⅰ细胞检测到GSTP1在蛋白水平的过量表达,而转染空质粒的对照组细胞与未转染细胞则GSTP1蛋白表达水平较低,表明所构建的真核表达载体已在真核细胞NCI-H520内表达。表明GSTP1基因已经稳定转染到NC I-H520细胞中并且有此蛋白的过量表达。笔者的实验为进一步研究GSTP1蛋白在肺鳞癌癌变过程中的生物学功能奠定了实验基础。

笔者成功构建了pcDNA3.1(+)/GSTP1真核表达质粒,通过脂质体转染及G418筛选建立了稳定表达人GSTP1基因的NCI-H520细胞系,为深入研究GS TP1蛋白在肺鳞癌癌变过程中的生物学功能,探讨肺鳞癌的癌变机制奠定了基础。

摘要：目的 构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法 以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论 成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。

关键词：pcDNA3.1(+)/GSTP1,NCI-H520细胞,稳定转染

参考文献

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[4]WANG Z,HE W,YANG G,et a1.Decreased expression of GSTpi is correlated with a poor prognosis in human esophagealsquamous carcinoma[J].BMC Cancer,2010,10:352.

[5]GERVASINI G,SAN JOSE C,CARRILLO JA,et a1.GST poly-morphisms interact with dietary factors to modulate lung cancerrisk:study in a high-incidence area[J].Nutr Cancer,2010,62(6):750-758.

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重组真核表达质粒 篇2

目前借助基因工程技术将需要研究的目的基因与真核表达载体相连接,构建重组表达载体,将重组表达载体瞬转转染入真核细胞,该表达模型已经广泛应用于研究目的基因以其对应的蛋白质[11]。

本研究从Hela细胞中通过RT - PCR方法获得目的基因,连接真核表达载体,成功构建了重组真核表达质粒。将重组真核表达质粒瞬转转染到293T细胞中进行蛋白表达,利用间接免疫荧光的方法对转染细胞进行荧光显微镜观察,并在转染试剂不同比例以及转染不同时间后用免疫印迹方法观察蛋白表达水平。为进一步研究JAK1 蛋白通路以及疾病的发生奠定基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验材料

TOP10 感受态细胞购自TIANGEN天根生化科技( 北京) 有限公司; 293T细胞由南方医科大学抗体工程研究所保存; Hela细胞为南方医科大学抗体工程研究所保存; pc DNA4. 0 载体由南方医科大学罗树红教授惠赠。

1. 1. 2 试剂

胎牛血清( FBS) 、opti - MEM和DMEM培养基购自Gibco公司; RNA提取试剂盒、逆转录酶Reverse Transcriptase M - MLV购自美国Invitrogen公司; Prime STAR Max酶、限制性内切酶EcoR Ⅴ 和Xho Ⅰ、T4 连接酶,DNA marker DL5000 和DNA marker DL15000 购自Ta KaRa公司; DNA纯化试剂盒购自Tiangen天根生化科技( 北京) 有限公司; 质粒小提取试剂盒购自美国OMEGA公司; X - treme GENE HP DNA Transfection Reagent( Roche公司) 转染试剂由南方医科大学罗树红教授惠赠; 兔源GAPDH抗体、鼠源抗His抗体、山羊抗鼠Ig G - HRP、山羊抗兔Ig G - HRP购自Bioworld公司。

1. 1. 3 仪器设备

离心机,Centrifuge 5418,Eppendorf; 双人单面净化工作台,SW - CJ - ZFD,苏州净化设备有限公司;核酸电泳仪,JY600,JUNYI; SDS电泳仪,Power Pac Basic,Bio - RAD。

1. 2 方法

1. 2. 1 引物设计与合成

在Gen Bank中获取JAK1 基因序列( NM _002227. 2 ) ,根据mRNA中的编码区,利用Primer Primer 5. 0 软件进行引物设计,加入限制性内切酶以及保护碱基,引物上游: 5’- GCGGATATCATGCAGTATCTAAATATAAAAGAGG - 3 ’( 下划线部分为EcoRⅤ酶切位点) ,引物下游: 5 ’- GGCTCGAGCCTTATTTTAAAAGTGCTTCAA - 3 ’( 下划线的部分为XhoⅠ内切酶的酶切位点) ,扩增的JAK1 基因片段大小为3 426 bp。由华大基因有限公司合成并提供所有引物。

1. 2. 2 JAK1 基因扩增

用10% 的1640 培养液常规培养Hela细胞,利用Trizol试剂盒提取Hela细胞总RNA,逆转录合成c DNA严格按照MLV逆转录试剂盒说明书进行,PCR体系: c DNA模板5 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,总体积50 μL。PCR反应条件: 98℃ 5 min,98℃ 10 s,50℃ 15 s,72℃ 40 s,30 个循环,72℃ 20min。利用1. 0% 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。

1. 2. 3 重组真核表达质粒pc DNA4. 0 - His - JAK1的构建

将获得的JAK1 基因片段与pc DNA4. 0 质粒进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切24 h,分别利用DNA回收试剂盒回收各自的酶切产物。用T4 连接酶在16℃条件下连接JAK1 基因片段回收产物与pc DNA4. 0质粒回收产物18 h。连接产物转化TOP10 感受态细胞,转化液在固体培养基中进行涂板培养过夜约16 h,次日挑取单个菌落进行摇菌培养,严格按照提取质粒试剂盒说明书提取质粒。经过质粒PCR和酶切鉴定为阳性克隆后,送到华大基因科技有限公司进行测序鉴定。

1. 2. 4 细胞培养与质粒转染

将293T细胞从液氮中取出,放到37℃ 水浴中迅速融化,1 000 r/min离心5min,弃上清,用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞,转到细胞培养瓶中,于37℃、5% CO2条件下培养。将生长状态良好的细胞接种到6 孔板中,培养24 h,细胞密度达约50% ,按照罗氏转染试剂说明书,严格操作进行真核表达质粒转染,每孔转染操作如下,100 μL的opti -MEM中加入2. 5 μg重组质粒pc DNA4. 0 - His -JAK1,轻柔混合,分别按照比例1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3 加入2. 5 μL、5 μL和7. 5 μL罗氏转染试剂,轻柔混合,静置30 min后,缓慢滴加入细胞中进行转染。转染293T细胞24 h、36 h与48 h,转染过程中不换新的培养液。

1. 2. 5 荧光显微镜观察转染细胞JAK1 表达

利用间接免疫荧光( IFA) 方法检测重组质粒pc DNA4. 0 - His - JAK1 在293T细胞中的表达情况,取转染48 h的293T细胞,每孔加入2 m L的2% 多聚甲醛固定15 min,用PBS洗涤3 次,加入2 m L的2% 羊血清,4℃ 封闭16 h,用PBS洗涤3 次,加入抗JAK1 抗体,37℃ 孵育1 h,用PBS洗涤3 从,加入荧光二抗体,37℃孵育1 h,PBS洗涤3 次后在荧光显微镜下观察细胞。

1. 2. 6 免疫印迹方法鉴定JAK1 蛋白在细胞中表达

采用免疫印迹方法。分别取加入1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3不同比例的罗氏转染试剂转染的293T细胞和转染24 h、36 h与48 h的293T细胞。去掉上清,每100μL的loading buffer工作液中加入5 μL的 β - 巯基乙醇,去100 μL配置好loading buffer工作液直接加入细胞中,收集到1. 5EP管中,沸水中煮15 min,取出14 000 r/min室温离心15 min。经12% SDS -PAGE进行蛋白电泳。用全湿法电转移到0. 22 μm的PVDF膜上,配置5% 脱脂奶粉4℃ 封闭过夜。次日取出,加入1∶ 10 000 的抗质粒携带的His抗体和1∶ 10 000的内参GAPDH抗体,室温孵育2 h; TBST工作液洗涤3 次,每次10 min,配置新的5% 脱脂奶粉,分别加入1∶ 10 000 的羊抗鼠二抗与1∶ 10 000 的羊抗兔二抗,室温孵育1 h; TBST工作液洗涤4 次,每次10 min。ECL显影。

2 结果与分析

2. 1 JAK1 基因扩增产物的鉴定

利用合成的引物以c DNA为模板进行PCR扩增JAK1基因全长,利用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物在3 000 bp与5 000 bp之间可见约3 426 bp的特异性单一条带,基因大小与预期相符(图1)。

2.2重组真核表达质粒pc DNA4.0-His-JAK1的鉴定

将JAK1 基因扩增产物与pc DNA4. 0 载体连接,转化感受态TOP细胞,进行菌液PCR鉴定( 图2) 。同时,分别用限制性内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ对重组质粒和空质粒进行双酶切鉴定( 图3) 。菌液PCR中在约3 426 bp处可见阳性条带,双酶切鉴定中,约3 426 bp和5 259 bp处分别见JAK1 基因与pc DNA4. 0 质粒的阳性条带。

M:DNA分子量标准;1、2:JAK1基因PCR产物。M:DNA marker DL5000;1,2:JAK1.

图2重组真核质粒pcD NA4.0-His-JAK1的质粒PCRM:DNA分子量标准;1、2:pcD NA4.0-His-JAK1的质粒PCR产物;3、4、5:JAK1的PCR产物阳性对照组。Fig.2 Restriction map of PCR of eukaryotic expression vector pcD NA4.0-His-JAK1M:DNA marker DL 15000;1,2:Electrophoretic profile of PCR product of pcD NA4.0-His-JAK1;3,4,5:Electrophoretic profile of PCR product of JAK1 gene.

2. 3 间接免疫荧光检测重组质粒pc DNA4. 0 - His- JAK1 在293T细胞中的表达情况

对实验组转染重组真核表达质粒pc DNA4. 0 -His - JAK1 36 h的293T细胞以及空白对照组正常293T细胞进行了间接免疫荧光检测。结果如图4 所示,转染了重组真核表达质粒pc DNA4. 0 - His - JAK1的实验组293T细胞,图中可清晰看到特异性的绿色荧光。结果显示重组真核表达质粒pc DNA4. 0 - His- JAK1 在293T细胞中转染成功并表达。

图3重组真核质粒pcD NA4.0-His-JAK1的双酶切鉴定结果M:DNA分子量标准;1:pcD NA4.0-His-JAK1的双酶切产物;2:pcD NA4.0空质粒。Fig.3 Restriction enzymes analysis of recombinant plasmid pcD NA4.0-His-JAK1M:DNA marker DL 5000;1:pcD NA4.0-His-JAK1 digested by EcoRⅤand XhoⅠ;2:pcD NA4.0.

2. 4 免疫印迹方法分析鉴定重组质粒pc DNA4. 0 -His - JAK1 在293T细胞中不同时间段的表达

收集转染48 h的293T细胞,Western Blot鉴定结果( 图5) 显示,实验组转染了重组质粒pc DNA4. 0- His - JAK1 的细胞中可见到133 k Da左右的JAK1蛋白目的条带,而空白对照组未转染的细胞中未能检测到特异性条带,表明重组真核表达质粒pc DNA4. 0 - His - JAK1 成功表达在293T细胞中。分别收集利用罗氏转染试剂1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3 不同比例转染试剂的细胞,Western Blot鉴定结果如图6,说明在罗氏试剂1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3 的比例下,重组真核表达质粒pc DNA4. 0 - His - JAK1 均能在293T细胞中得到表达,1∶ 3 比例条件下Western Blot条带最明显,因此1∶ 3为最佳转染试剂比例。收集分别转染了24 h、36h和48 h的细胞,结果见图7,说明细胞从转染24 h开始表达JAK1 蛋白,但是表达量极小,随着转染时间的增加,JAK1 表达量不断增加,48 h达到表达最大量,Western Blot条带最明显。

A:B和C的叠加效果;B:光镜下转染的293T细胞;C:荧光显微镜下转染pcD NA4.0-His-JAK1的293T细胞。A:Merged image of B and C;B:Light microscopy image;C:Fluorescence microscopy image of pcD NA4.0-His-JAK1 plasmid transfected 293T cells.

3 讨论

JAK1 是JAK家族中重要的成员之一,在生物体内各个组织细胞中广泛表达。参与体内很多细胞因子信号转导,JAK1 的作用方式分为两种,一是依赖多种细胞因子使JAK1 蛋白磷酸化,比如INF - α、INF - β、INF - γ 等细胞因子。从而增强该蛋白的活性,并激活下游的STAT信号分子,使JAK1 /STATs传导通路得到活化[12]。二是非细胞因子依赖的机制,利用JAK1 基因片段的突变与表达,使得JAK1蛋白对上游细胞因子的敏感性增强,同时也促进下游STATs通路持续活化[13]。JAK - STAT是体内及其重要的一条途径。Van der Plas DC等发现G -CSF刺激鼠前 β 细胞系Ba / F 3 时,同时引起了JAK1、STAT1、STAT5 的活化[14]。除了STAT1 与STAT5,JAK1 蛋白也会促进STAT3 的活化。Biethhn S等检测AML - M 3 细胞株与原发继发AML - M 4,AML - M 1 患者与AML - M 5 患者的标本,发现标本中均有JAK1 及STAT1、STAT3、STAT5 表达[15]。据饶志方报道,JAK激酶是炎症细胞因子网络信号传导中枢蛋白,该信号通路可以调控类风湿性关节炎相关细胞的活性,使机体发生促炎活性作用[16]。据曲直研究发现,支气管气道肿瘤细胞中JAK1 的表达明显高于健康人群的细胞,说明在支气管气道肿瘤发病中JAK1 表达升高起着非常重要作用[17]。支气管气道肿瘤形成中普遍存在JAK/STAT通路的异常。

1:未转染组;2:pcD NA4.0-His-JAK1转染组。M:Standard protein marker;1:untransfected group;2:pcD NA4.0-His-JAK1 transfected group.

1:质粒(μg)∶转染试剂(μL)为1∶1;2:质粒(μg)∶转染试剂(μL)为1∶2;3:质粒(μg)∶转染试剂(μL)为1∶3。1:the proportion is 1∶1;2:the proportion is 1∶2;3:the proportion is1∶3.

1:转染24 h;2:转染36 h;3:转染48 h。1:expression of JAK1 in 293T cell at 24 h;2:expression of JAK1 in293T cell at 36 h;3:expression of JAK1 in 293T cell at 48 h.

重组真核表达质粒 篇3

关键词：HP450基因,质粒转染,BRL细胞株

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一, 过去尽管综合应用手术、放化疗等多种治疗手段, 但患者生存率并无明显改善, 也未能从根本上解决肝癌转移和复发的问题[1]。随着分子生物学、细胞生物学等学科的飞速发展, 肿瘤生物治疗越来越受到重视。

抗组胺药敏感性细胞色素P450 (简称HP450) 主要存在于肝脏微粒体, HP450在肝脏疾病发展过程中具有一定的规律性和相关性[2,3,4], 有可能作为肝癌诊断的一个新指标和治疗肝癌的一个新靶点。

本实验以HP450基因作为研究靶点, 利用先进的RNAi技术, 构建sh RNA真核表达载体, 将该载体经脂质体转染大鼠正常肝细胞株BRL, 研究质粒转染后对HP450基因表达及BRL细胞增殖的影响, 为今后研究HP450基因对BRL细胞功能的影响提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器设备

超净工作台 (AIRTECH公司) 、5%CO2恒温培养箱 (美国BIO-RAD公司) 、倒置相差显微镜 (日本奥林巴司公司) 、大容量冷冻高速离心机 (德国Eppenndorf Centrifuge公司) 、-80℃超低温保存箱 (海尔公司) 、电热恒温水浴箱 (上海精宏实验设备有限公司) 、AB204-E分析天平 (瑞士梅特勒一托利多公司) 、紫外可见分光光度计 (Thermo基因有限公司) 、SZ-93自动双重纯水蒸馏器 (上海亚荣生化仪器厂) 、电热恒温鼓风干燥箱 (上海跃进医疗器械厂) 、高压灭菌消毒锅 (日本TOMY公司) 、微量移液器 (德国Eppendorf公司) 、微波炉 (广东格兰仕家电集团) 。

1.1.2 细胞培养材料

大鼠肝细胞株BRL购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基 (美国Hyclone公司, 批号:SH30022.01B) 、二甲基亚砜 (DMSO, 上海市欣诚化工有限公司, 批号:CAS:67-68-5) 、磷酸盐缓冲液 (PBS, 北京索莱宝生物科技有限公司, 型号:H1045) 、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液 (北京索莱宝生物科技有限公司, 型号:T1300) 、胎牛血清 (杭州四季青公司, 型号:HB0205) 。

1.1.3 质粒转染材料

p GPH1/GFP/Neo质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司, No.11668-027。

1.1.4 RT-PCR引物设计材料

根据H1 m RNA全长序列 (Gene Bank ID:24448) , 由广州Gene Copoeia公司设计合成, 扩增产物片段大小为154 bp, 引物序列如下:上游:5'-ttcttctccttcctgtgggtta-3' (Lenth:22, Tm:61.9, GC:60) ;下游:5'-tcctacactggggtctcttgat-3' (Lenth:22, Tm:61.9, GC:60) 。内参引物F18由上海生工生物工程有限公司合成, 扩增产物片段大小为207bp, 序列如下:上游:5'-cacccgcgagtacaaccttc-3' (Lenth:20, Tm:60.7, GC:50) ;下游:5'-cccatacccaccatcacacc-3' (Lenth:22, Tm:60.07, GC:50) 。

1.1.5 试剂的配置

(1) PBS缓冲液:将PBS干粉倒入干净的烧杯中, 加入2000 m L三蒸水, 用玻棒稍搅拌后, 放入磁力搅拌子, 转移烧杯至磁力搅拌器上, 调整合适转速, 5 min左右即可完全溶解。之后用p H计测量其p H值, 如若p H值未在预定范围中, 用Na OH或浓HCl将其p H值调至7.2~7.4, 分装入容量为500 m L的干净玻璃瓶中, 高压灭菌后备用。 (2) 0.25%胰酶消化液:称取0.25 g胰酶加入100 m L PBS缓冲液, 分装, 过滤即可。

1.2 细胞株的培养

BRL细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中, 放置于37℃含有5%的CO2培养箱中培养, 每隔2~3 d传代培养。

传代培养:用PBS洗2次培养瓶, 弃掉PBS, 加入2 m L 0.5%的胰酶, 置37℃5%CO2培养箱消化2 min, 加入含有胎牛血清的DMEM培养基5 m L终止消化, 轻度吹打瓶壁, 使细胞脱落, 然后移至10 m L的离心管, 1000 r/min, 5 min离心, 去掉上层液体, 重新加入含胎牛血清的DMEM培养基5 m L, 吹打混匀, 接种至培养瓶进行培养。

1.3 脂质体介导的质粒转染

脂质体/质粒DNA混合物的准备: (1) Solution A:取干扰质粒、阴性对照质粒各9μL分别加入1.5 m L EP管内, 分别加入无血清无抗生素的DMEM培养基500μL, 轻轻摇匀, 室温静置5 min。 (2) Solution B:取18μL的Lipofectamine 2000脂质体加入2.0 m L EP管内, 加入无血清无抗生素的DMEM培养基1000μL, 轻轻摇匀, 室温静置5 min。 (3) 将Solution B分别等量地加入Solution A中, 轻柔混匀, 室温静置30 min。转染细胞: (1) 转染前1 d, 用无抗生素含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养, 调整BRL细胞浓度为2×105个/m L接种于6孔板中培养, 每孔5 m L, 以保证细胞在转染时细胞融合度达到50%~80%。 (2) 24 h后, 观察6孔板的细胞状态, 当细胞铺满至80%时即可进行转染。 (3) 将细胞分为空白对照孔、阴性对照孔、质粒转染孔, 每孔去掉含血清的DMEM, 用PBS轻柔洗涤以彻底去除血清, 加入1 m L无血清DMEM, 放置37℃的CO2培养箱孵育。 (4) 空白对照孔加入1000μL无血清的DMEM, 阴性对照孔加入脂质体与阴性质粒混合液1000μL, 质粒转染孔加入脂质体与目的质粒混合液1000μL, 并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养基充分混匀, 置37℃5%CO2培养箱孵育5 h后弃去细胞培养板的上清液, 加入PBS清洗2次, 再加入含10%胎牛血清的DMEM继续培养, 转染后6、12、24 h于倒置显微镜下观察细胞生长情况, 转换荧光光源, 观察绿色荧光蛋白 (GFP) 所发出的绿色荧光, 计数荧光细胞数。

2 结果

如图1~3所示 (封三) , 转染6、12、24 h后在荧光倒置显微镜下观察细胞状态, 可见因为p GPH1/GFP/Neo质粒本身带有GFP, BRL细胞均有不同数量的绿色荧光, 且随时间增长, 荧光数量呈正比例增长, 说明转染质粒在BRL细胞中有明显表达。

3 讨论

基因转染技术在研究基因的结构和功能中是不可缺少的, 正在兴起的基因治疗也是因为基因转染技术的发展而步入实用阶段。目前常用的RNA干扰方法是化学合成si RNA片段, 构建病毒载体以及sh RNA的真核表达载体。化学合成si RNA的缺点是价格较贵, 效率只有转录合成sh RNA的1/10~1/40, 基因抑制持续时间较短, 对细胞毒性较大, 转染效率较低, 合成工艺上也存在不可弥补的缺陷。病毒载体的主要缺点是价格较高, 耗费时间比较长, 不适用于大量筛选si RNA序列, 对实验条件要求较高[5,6]。本实验选择构建sh RNA的真核表达载体, 是因为该实验方法经济易操作, 且质粒载体能够在细胞中表达sh RNA, 是一种干扰RNA的良好方式, 与化学合成si RNA的作用一致, 相比较而言, 持续时间更长, 费用更低, 是作为筛选有效基因干扰片段的常用方法。

有效的sh RNA序列设计是RNA干扰实验中重要的一步。在本实验中成功地构建了特异性针对HP450基因的sh RNA真核表达载体, 为后续试验RNA干扰研究HP450基因表达对BRL细胞的影响奠定了基础。本研究选用Lipofectamin2000为转染试剂, 按其推荐使用量操作, 变换质粒的用量, 调整质粒与脂质体的比例, 将质粒成功地转入了BRL细胞, 未见到明显的毒性反应, 细胞生长良好, 荧光倒置显微镜下观察见BRL能成功表达GFP。本实验采用Lipofectamin2000阳离子脂质体法进行转染, 这是目前最常用也是比较高效的方法。转染过程中, 细胞密度和生长状态、质粒的纯度、质粒与脂质体的比例等均是影响转染效率的重要因素。对数生长期的细胞生理活动旺盛, 细胞内的各种酶类等复制和表达比较充分, 可以方便地被外源基因利用, 从而利于外源基因的表达。磷酸钙、脂质体等均可介导外源基因转入细胞, 其中脂质体是目前比较理想的转染用载体, 已广泛应用于基因转染等实验研究中[7,8]。脂质体与质粒载体的用量比例对转染效率有重要影响, 质粒载体的用量越多, 转染入细胞的载体可能就越多, 这就需要有更多的脂质体将其包裹。但由于脂质体本身的毒性, 加大用量又会增加对细胞的损伤。所以, 对不同的细胞, 脂质体与质粒之间应该使用不同的且合适的用量比例。根据脂质体说明书的用量范围, 本实验经过多次探索观察, 调整质粒与脂质体的剂量比例以8∶9 (μL) 为最佳条件, 在此剂量下, 脂质体对细胞的毒性较小, 质粒转染率也较高。此外, 转染温度、时间、脂质体的种类、DNA的量等对转染均有影响。

为了达到较高效率的转染, 在转染实验的探索过程中, 总结出以下几点: (1) 避免RNA酶的污染。微量的RNA酶则可导致实验的失败, 由于实验环境中RNA酶广泛存在, 如皮肤、头发、所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等, 保证每个实验步骤不受该酶的污染是非常重要的。 (2) 状态良好的细胞和严格的操作。只有状态良好的细胞才能保证转染的高效率, 细胞状态欠佳, 后续的实验都是徒劳。此外, 较少的传代数能确保实验所用细胞的稳定性, 一般而言, 20代以下的细胞转染率也较高。 (3) 避免使用抗生素和血清。转染期间要避免使用抗生素, 抗生素会在穿透的细胞中积累毒素, 此外, 在脂质体和细胞相互作用过程中, 血清的存在可能会显著减少脂质体的结合。 (4) 选择合适的转染试剂。针对靶细胞类型的不同, 选择合适的转染试剂和优化的操作对转染实验的成功至关重要[9]。 (5) 实验所用的细胞最好选择在70%~80%的融合度为佳, 细胞太少转染效率低, 太多则容易导致细胞间接抑制而影响细胞DNA合成。 (6) 不同的受体细胞对所需的质粒最佳剂量不同。质粒对细胞也有明显的毒性, 可影响细胞的生长, 本研究按0.5μg/μL的浓度加入质粒至6孔板中的细胞, 观察结果显示, 以4.0μg (即8μL) 的质粒剂量最为合适, 死细胞的出现较少, 且转染率较高。 (7) 一般来说, 转染效率随着脂质体作用时间的延长而提高, 但由于质粒DNA对细胞生长有影响, 因而与细胞的作用时间需要进行控制, 孵育时间太短转染效率偏低, 过长则影响细胞的活性[10]。经过比较, 笔者认为5 h较为合适。

参考文献

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重组真核表达质粒 篇4

1 材料与方法

1.1 组织标本

从我院计划生育科取3~5个月人工流产胎儿,产妇及家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

p SG5真核表达质粒由天津市泌尿外科研究所牛远杰教授赠送;Trizol试剂购自Invitrogen公司;TaqDNA Mix、Quant c DNA第1链合成试剂盒、EZ-geneTMGel Extraction Kit、质粒小量中提试剂盒均为天根公司产品;EcoRⅠ、Bam HⅠ酶、T4连接酶及DNA maker为Ta Ka Ra公司产品;Fugene HD转染试剂购自Roch公司;小鼠抗人Oct4抗体和山羊抗小鼠二抗购自北京中衫公司;澳洲胎牛血清为北京全式金公司产品,α-MEM购自Gibco公司;大肠杆菌DH5α为本实验室保存;引物由Invitrogen公司合成;其他试剂均为分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 f BMSCs的制备

将人工流产的胎儿在75%酒精溶液中浸泡15 min进行体表消毒,超净台内截取四肢长骨,剔除骨外软组织,PBS液冲洗外表面3、4遍后,剪去两端软骨,用10 m L注射器吸取3 m L PBS反复冲洗骨髓腔至四肢骨发白;吸取冲洗混悬液沿管壁缓慢滴加至底部有2倍体积Percoll(1.077g/m L)分离液的离心管中,2 000 r/min离心20 min,吸取中间界面白膜层,经等体积PBS洗涤,1 000r/min,离心10 min,弃上清,沉淀细胞内含f BMSCs,直接用于总RNA的提取。

1.3.2 目的基因的扩增

人Oct4的c DNA全长1411 bp,以Primer 5.0软件设计以下引物扩增Oct4的ORF区:上游引物P1:5'-CCGGAATTCAGGATG-GCGGGACACCTGGCTT-3';下游引物P2:5'-CGC GGATCCAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3',其中下划线部分为引入的限制性内切酶EcoRⅠ(GAATTC)和Bam HⅠ(GGATCC);参考Trizol说明书步骤,向制备好的f BMSCs中加入1 m L Trizol进行总RNA的提取,完毕后电泳观察,并检测总RNA的纯度和浓度;应用Quant c DNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录为c DNA;然后进行RT-PCR反应,反应条件如下:预变性94℃,3 min;变性94℃,30 s;退火62℃,45 s;延伸72℃,1 min;循环35次;72℃再延伸5 min。反应完毕后,1.5%琼脂糖电泳鉴定及纯化回收RT-PCR产物。

1.3.3 真核表达质粒pSG5-Oct4的构建

纯化回收的RT-PCR产物和真核表达质粒pSG5,分别经EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切后,再次纯化回收,在T4连接酶的作用下16℃连接过夜后,将连接产物加入新鲜制备的感受态细胞DH5α中,冰中放置30min;42℃加热45 s,冰浴1 min;加入890μL LB培养基,37℃振荡培养60 min;取适量转化产物涂布于Amp+的L-琼脂培养基上,倒置培养过夜。挑取4~6个大小均匀的阳性克隆,加入12 m L Amp+的LB培养基,37℃振荡过夜,按质粒小量中提试剂盒说明书提取重组质粒pSG5-Oct4,EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定并送华大基因测序。

1.3.4 pSG5-Oct4转染胎儿胰岛间质细胞

胰岛间质细胞于37℃、50 m L/L二氧化碳条件下,用含10℅血清的α-MEM培养,细胞长满后传代,之后每2 d传代1次。取传代2~3次的细胞接种于六孔板中,当单层细胞铺至平板的80%~90%时,按Fugene HD转染试剂操作步骤转染质粒,以不做任何转染和转染质粒pSG5的胰岛间质细胞为阴性对照。

1.3.5 R T-PCR检测Oct4基因的表达

真核表达质粒pSG5(如图1)全长4.1 kb,其中T7噬菌体启动子保证外源基因在体外转录,SV40真核启动子启动体内表达,SV40和T7之间有一段内含子β-globin,重组质粒pSG5-Oct4若在胰岛间质细胞中表达,则内含子β-globin在m RNA修饰时被剪接掉。因此,在SV40与β-globin连接处设计上游引物P3:5'-AAAGCTGGATCGATCCTGAGAA-3',以P2为下游引物,按照上述方法对转染后2~5 d的胰岛间质细胞进行RNA提取、反转录及RT-PCR(条件同上),鉴定pSG5-Oct4在胰岛间质细胞中是否表达。

1.3.6 免疫细胞化学染色

应用免疫细胞化学染色检测诱导后的胰岛间质细胞中Oct4蛋白的表达情况。步骤如下:将贴附细胞的玻片经4%多聚甲醛溶液固定30 min取出,PBS洗3次,每次2 min;滴加0.5%Triton-X,室温孵育20 min,PBS洗3次,每次2min;滴加小鼠抗人Oct4抗体,室温下放置1 h后,4℃过夜,待恢复室温后,PBS洗3次,每次2 min;滴加聚合物辅助剂,室温孵育30 min,PBS洗3次,每次2 min;滴加山羊抗小鼠二抗,室温孵育30 min,PBS洗3次,每次2 min;DAB显色8 min,蒸馏水洗2次,每次1 min;苏木复染1 min,自来水洗8 min;中性树胶封片,镜下观察。

2 实验结果

2.1 目的基因的扩增

总RNA提取完毕,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测(图2A)见3条亮带,A260~A280为1.83,说明总RNA的纯度较高;经RT-PCR反应后,1.5%琼脂糖凝胶电泳见约1.1 kb处有亮带,与预计相符(图2B)。

2.2 p SG5-Oct4的酶切鉴定及测序报告

挑取单个白色菌斑,扩大培养并提取质粒,分别经EcoRⅠ和Bam HⅠ单、双酶切鉴定,双酶切结果显示在4.1 kb和1.1 kb均有亮带,说明酶切片段的大小和插入方向均与预计相同(图3);将鉴定正确的菌液送取华大基因测序,利用NCBI的BLAST服务器对Oct4序列进行的分析同源性达到97%(图4),以上结果均表明真核表达载体pSG5-Oct4构建成功。

2.3 RT-PCR检测p SG5-Oct4转录

分别在重组质粒p SG5-Oct4转染胎儿胰岛间质细胞的第2~5天,以P3和P2为引物对其进行RT-PCR,发现转染pSG5-Oct4的细胞可见两条亮带(图5,泳道2),位置分别在1.8 kb和1.2 kb左右,这是由于在基因转录时,1.8 kb的初级转录本中的内含子β-globin(如图1,约573 bp)部分被剪切掉了,成熟的m RNA的长度大概为1.2 kb,故而以P3和P2为引物进行的RT-PCR会出现两条亮带;另外,以引物P1和P2对受转染的胰岛间质细胞进行RT-PCR(图5,泳道4),在1.1 kb左右出现一条亮带,为受转染细胞Oct4的表达产物;以引物P3和P2直接对重组质粒pSG5-Oct4进行PCR反应扩增,发现在1.8 kb处有一条非常亮且宽的条带,以上结果均表明重组质粒pSG5-Oct4在胰岛间质细胞中成功转录。

泳道1:DL 2000 marker;泳道2:Oct4 RT-PCR产物;A:总RNA凝胶电泳图;B:Oct4 RT-PCR产物凝胶电泳图

泳道1:DNA marker 15 000;泳道2、3:分别为Eco RⅠ和Bam HⅠ单酶切重组质粒p SG5-Oct4结果;泳道4:Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切重组质粒p SG5-Oct4结果

2.4 免疫细胞化学染色检测Oct4蛋白表达

倒置显微镜下观察,未转染质粒、转染质粒pSG5及转染重组质粒pSG5-Oct4的胎儿胰岛间质细胞生长状态良好;转染后第6天起,相比未转染质粒、转染质粒pSG5的胰岛间质细胞仍为贴壁梭形细胞;而含重组质粒pSG5-Oct4的细胞形态上已发生了变化,逐渐变圆,转变为悬浮细胞(图6A~C)。应用免疫细胞化学染色,发现大量的pSG5-Oct4细胞胞浆有棕黄色颗粒(图7C),而未转染质粒和转染质粒pSG5的细胞(图7A和B)均呈现阴性反应,以上结果均表明重组质粒在胎儿胰岛间质细胞不仅能成功表达,且对胰岛间质细胞的内部结构产生了影响。

真核表达质粒pSG5-Oct4中的Oct4从测序图谱中第42个碱基开始,在Blast上比对同源性达到97%;A:Oct4 c DNA的序列对比图;B:真核表达质粒p SG5-Oct4的部分测序图谱

泳道1:DNA Maker 2000;泳道2:RT-PCR产物(引物P3/P2);泳道3:重组质粒p SG5-Oct4的PCR产物(引物P3/P2);泳道4:Oct4 RT-PCR产物(引物P1/P2)

A:转染前的胰岛间质细胞(×10);B:转染pSG5的胰岛间质细胞第6天(×10);C:转染pSG5-Oct4的胰岛间质细胞第6天(×20)

A:未转染质粒的免疫细胞化学染色,转染后第6天,胰岛间质细胞仍为贴壁梭形细胞,小鼠抗人Oct4免疫细胞化学阴性;B:转染pSG5的免疫细胞化学染色,转染后第6天,胰岛间质细胞仍为贴壁梭形细胞,小鼠抗人Oct4免疫细胞化学阴性;C:转染p SG5-Oct4的免疫细胞化学染色,转染后第6天,胰岛间质细胞生长状态良好,逐渐脱壁变圆,成为悬浮细胞,小鼠抗人Oct4免疫细胞化学阳性,胞浆内可见棕黄色颗粒。

3 讨论

i PS的出现为备受争议的ES的应用提出新的解决方案,将干细胞研究领域拓展到了一个新的层面。由于最初诱导成功的i PS均以逆转录病毒为载体携带外源性转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4(或Nanog和Line28),使得i PS的安全性成为隐患,各国科学家试图寻求更为安全的i PS:载体方面由最初的逆转录病毒到非整合的腺病毒[6]、转座子[7]、游离表达载体[8]等;外源性转录因子的导入数量也在不断减少,从刚开始的四因子联合转染到Oct4、Sox2二因子联合转染[9],甚至是仅Oct4添加少量小分子化学物质[10]即可诱导i PS的产生。由此不难看出,Oct4是重编程过程中不可或缺的转录因子,其在起始重编程和维持胚胎干细胞的多能性中起到的作用不容置疑。

本实验通过从胎儿骨髓中获取含有f BMSCs的混合悬液,没有对其进行培养而是直接提取总RNA,是考虑到MSC易分化难以培养,这样可缩短细胞的培养周期,此法经济实用,而且笔者成功克隆了Oct4的ORF全长序列,并通过DNA序列分析证实了其正确性。在基因表达系统中笔者选择了高效、瞬时表达载体p SG5,此载体为穿梭质粒,即可在大肠杆菌中复制扩增,亦可在真核细胞中表达,这样就可省去传统的TA克隆测序、酶切后连接的过程,方便快捷;另外,该载体的真核启动子SV40后有一段内含子β-globin,可用于含目的基因的表达载体在受转染的细胞中m RNA水平表达的鉴定,这也弥补了该质粒缺乏筛选标志的不足之处;穿梭质粒pSG5具有很强的复制能力,全长4.1 kb,分子量较小,易携带外源性基因进入细胞,在转染后48 h即可通过RT-PCR检测出重组质粒pSG5-Oct4在胰岛间质细胞中开始表达,且在哺乳动物细胞中游离存在,不整合入基因组染色体,对受转染的真核细胞的影响不大。另外,基因转染方法有很多种,如电穿孔、磷酸钙共沉淀、微注射、阳离子脂质体介导及非脂质体介导等;与其他方法相比,Fugene HD非脂质体介导的细胞转染具有细胞毒性低及转染过程简单高效的特点,且能在含血清的培养基中进行转染。本研究应用的Fugene HD介导转染胎儿胰岛间质细胞,在转染过程中对细胞的损伤小,呈现了较好的转染效果。最后,适合的宿主细胞是决定基因工程中相关实验成败的关键因素之一,本研究选择胎儿胰岛间质细胞作为宿主细胞,主要考虑到间质细胞易于培养,状态稳定,细胞成活率高,且相对成人的细胞更为幼稚,为后续实验带来便利;在转染重组质粒pSG5-Oct4的第6天起,笔者发现胎儿胰岛间质细胞不仅生长状态良好,而且发生了形态学的变化,由贴壁的梭形细胞转变为圆形的悬浮细胞,这种变化可以重复。外源基因Oct4的表达引起胎儿胰岛间质细胞所发生的变化,也为后续实验进一步揭示其在调节细胞生命活动中的功能提供了平台。

本实验成功构建了真核表达载体pSG5-Oct4,通过RT-PCR和免疫细胞染色分别从m RNA和蛋白水平验证了目的基因Oct4可在胎儿胰岛间质细胞中表达。本研究为进一步揭示人胚胎干细胞关键因子Oct4在维持胚胎干细胞自我更新方面及在体细胞重编程为i PS中的调节作用奠定了基础。

摘要：目的 克隆人胚胎干细胞的关键基因Oct4,构建真核表达质粒pSG5-Oct4,并检验其在胎儿胰岛间质细胞中的瞬时表达。方法 通过RT-PCR从胎儿骨髓间充质干细胞克隆出基因Oct4的全长序列,插入真核表达载体pSG5中,经筛选阳性克隆、EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及测序分析后,用Fugene HD转染试剂转染胎儿胰岛间质细胞,采用RT-PCR和免疫细胞化学染色检测重组质粒pSG5-Oct4在胎儿胰岛间质细胞中的表达情况。结果 经RT-PCR扩增得到大小约1.1 kb的条带,测序与GenBank中Oct4(NM002701.4)基因序列的同源性达97%;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒,琼脂糖凝胶电泳分析插入基因的大小和方向均正确;经RT-PCR和免疫细胞化学染色检测,pSG5-Oct4转染胎儿胰腺间质细胞后能表达Oct4蛋白。结论 本实验成功构建了真核表达质粒pSG5-Oct4,且目的基因可在胎儿胰岛间质细胞瞬时表达,为进一步研究Oct4在真核细胞中的调节作用及后续实验奠定了基础。

关键词：Oct4骨髓间充质干细胞,真核表达

参考文献

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重组真核表达质粒 篇5

山羊痘病毒基因组大小约为150 kb, 含147个开放阅读框 (ORF) , 其中ORF073编码的P32蛋白由319~324个氨基酸组成, 位于GTPV病毒粒子表面的囊膜上, 是羊痘病毒具有较强免疫原性的结构蛋白之一, 能诱导动物产生保护性抗体。因此, P32蛋白成为各国学者研究羊痘病毒的热点, 也是开展山羊痘免疫防控的重要候选蛋白之一[3,4]。

目前对山羊痘的预防控制主要采取疫苗接种措施, 但采用现有山羊痘疫苗接种有许多不足, 如灭活疫苗免注射剂量较大, 免疫效果有限, 只能提供短时间保护;弱毒疫苗免疫效果较好, 但易引起痘疹反应, 且存在毒力返强的风险, 因此有必要探究其它新型的山羊痘疫苗。DNA疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗之后的第三代疫苗, 已用于艾滋病、流感、疱疹病毒感染等多种疾病的防制研究, 并取得了积极的进展[5,6]。本研究以山羊痘病毒P32基因作为靶基因, 以真核表达质粒PVAX1为载体, 构建重组质粒PVAX1-P32并观察其诱导山羊的体液免疫应答效果, 以期为山羊痘DNA疫苗的临床应用提供一定的实验数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用黑山羊为3月龄, 15只, 雌雄各半, 购自贵州省雷山县西江镇麻料村某养羊场, 经监测为山羊痘抗体阴性。试验用小白鼠为清洁级BALB/c小鼠20只, 5周龄左右 (约20 g) , 购自贵阳医学院实验动物中心。

1.1.2 含p MD-18T-P32大肠杆菌、真核表达载体PVAX1和大肠杆菌DH5α等, 由贵州大学动物疫病研究所提供;山羊痘标准阳性血清和阴性血清, 购自中国兽医药品监察所;PCR试剂、限制性内切酶 (Bam HⅠ、HindⅢ) 、Gel Extraction Kit (50×) 胶回收试剂、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit、DNA提取试剂盒和T4 DNA连接酶等, 购自上海生工生物工程有限公司;DNA Marker, 购自北京天根生化科技有限公司;山羊痘弱毒疫苗, 为哈尔滨维科生物技术开发公司产品;山羊免疫球蛋白G ELISA检测试剂盒, 购自北京冬歌博业生物科技有限公司;抗山羊痘病毒P32抗体ELISA检测试剂盒, 由贵州大学动物疫病研究所研制提供;其它试剂均为国产或进口分装分析纯。

1.2 山羊痘病毒P32基因重组表达质粒PVAX1-P32的构建

1.2.1 引物设计:

根据Gen Bank山羊痘病毒P3 2基因序列 (AY8 8 1 7 0 7) 设计1对P3 2基因特异性引物 (P1:5’-CCCAAGCTTACGATGGATG-GCAGATATCCCATTATATG-3’/P2:5’-CGG-GATCCCTAAACTATATACGTAAATAACATAC-3’, 扩增长度为969 bp) , 由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2.2 山羊痘病毒P32基因的获取:

取含p MD-18T-P32大肠杆菌经37℃恒温振荡培养18 h后, 采用E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit提取重组质粒p MD-18T-P32, 然后以重组质粒为模板, 以上述引物进行PCR扩增;取PCR产物进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 采用Gel Extraction kit (50×) 胶回收试剂盒回收目的基因, -20℃保存备用。

1.2.3 真核表达质粒PVAX1-P32的构建:

取回收的目的基因和真核表达载体PVAX1, 分别采用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收目的片段, 以T4 DNA连接酶进行连接过夜, 转化至感受态细胞大肠杆菌DH5α, 涂抹接种到含Kana、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上, 37℃培养过夜, 挑取白色菌落接种到含Kana的LB液体培养基上, 培养过夜备用。

1.2.4 真核表达质粒PVAX1-P32的鉴定:

取培养好的细菌培养物, 采用E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit提取重组质粒PVAX1-P32, 分别采用上述P32基因特异性引物进行PCR扩增和核酸酶切酶Bam HⅠ/HindⅢ进行双酶切后, 10 g/L琼脂糖电泳, 于凝胶成像系统下观察结果。

1.3 免疫小鼠后重组质粒PVAX1-P32的分布动态

1.3.1试验设计:

取20只BALB/c小鼠, 肌肉注射重组质粒PVAX1-P32, 100μg/只, 分别于免疫0、7、15、30、45 d处死小鼠, 每次3只, 分别收集腿肌、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织和十二指肠等组织样本, -20℃保存备用。

1.3.2 重组质粒PVAX1-P32在小鼠体内的分布动态检测取上述组织样本研磨匀浆后, 采用DNA提取试剂盒提取组织DNA样本并以此为模板, 应用GTPV P32基因特异性引物进行PCR扩增, 10 mg/L琼脂糖凝胶电泳后, 凝胶成像仪观察结果。

1.3.3 重组质粒PVAX1-P32与小鼠基因组整合情况分析取45 d小鼠心、肝、脾、肺和肾组织DNA样本, 8 mg/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶回收试剂盒回收小鼠组织基因组, 用GTPV P32基因引物进行PCR扩增, 10 mg/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像仪观察结果。

1.4 重组质粒PVAX1-P32诱导山羊体液免疫应答效果分析

1.4.1 试验设计:

选取15只健康黑山羊, 随机分为3组, 即重组质粒组、弱毒疫苗组和空白对照组, 每组8只。重组质粒组肌肉注射PVAX1-P32, 500μg/只;弱毒疫苗组皮内注射山羊痘弱毒疫苗, 0.5 m L/只;空白对照组肌肉注射灭菌生理盐水, 0.5 m L/只。分别于免疫0、7、15、30、45 d采集山羊血清样本, -20℃保存备用。

1.4.2 免疫山羊血清中总Ig G含量检测:取上述山羊血清样本, 采用山羊免疫球蛋白G (Ig G) 抗体酶联免疫分析试剂盒进行检测, 分析重组质粒诱导山羊产生总Ig G情况。

1.4.3 免疫山羊血清中抗P32 Ig G检测:取上述山羊血清样本, 采用抗山羊痘病毒P32抗体ELISA检测试剂盒进行检测, 分析重组质粒诱导山羊产生抗P32-Ig G情况。

2 结果

2.1 山羊痘病毒P32基因的获取结果

采用山羊痘病毒P32基因特异性引物对提取的p MD-18T-P32进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳, 可见1条大小约为969 bp的DNA条带 (见图1) , 与预期结果相符。

2.2 真核表达质粒PVAX1-P32的鉴定结果

以提取的DNA样本为模板, 应用山羊痘病毒P32基因特异性引物进行PCR鉴定, 结果可见与预期大小相一致的目的条带 (见图2) ;应用HindⅢ和Bam HⅠ进行双酶切, 结果可见2条大小约为3 000 bp和969 bp的目的条带 (见图3) , 说明本研究成功构建了山羊痘病毒P32基因的真核表达质粒PVAX1-P32。

2.3 重组质粒PVAX1-P32在小鼠体内的分布情况

采集注射后不同时间段小鼠的腿肌、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织和十二指肠等组织样本, 提取组织DNA样本进行PCR检测, 结果:注射重组质粒后至45 d, 除脑组织和粪便外所检组织均能检测出GTPV P32基因片段, 说明重组质粒能较长时间存在小鼠体内各个器官组织中, 且不能分泌到粪便中。见表1。

2.4 重组质粒PVAX1-P32对小鼠基因组的整合情况

琼脂糖凝胶电泳分离小鼠组织基因组后, 应用GTPV P32基因引物进行PCR扩增, 结果发现:在所检组织中均未扩增出目的DNA片段 (见图4) , 说明注射重组质粒后, 目的基因并未整合到宿主基因组上, 具有较好的安全性。

2.5 重组质粒PVAX1-P32诱导山羊血清总Ig G变化

肌肉注射重组质粒后, 于不同时间段检测山羊总Ig G含量变化, 结果:重组质粒能诱导山羊血清总Ig G的分泌, 其分泌量比弱毒疫苗组稍低, 但差异不显著 (P>0.05) , 说明重组质粒能诱导山羊较好的免疫应答反应。见表2。

2.6 重组质粒诱导山羊血清抗P32 Ig G变化

肌肉注射重组质粒后, 于不同时间段检测山羊血清抗P32-Ig G含量变化, 结果:重组质粒能诱导山羊血清抗P32-Ig G的分泌, 其分泌量比弱毒疫苗组高, 差异显著 (P<0.05) , 说明重组质粒能较好诱导山羊对P32蛋白的免疫应答反应。见表3。

3 讨论

3.1 关于山羊痘病毒P32基因真核表达质粒的构建

山羊痘是目前危害和威胁山羊养殖业健康发展的重要疫病之一, 被国家农业部列为一类疫病。目前对山羊痘的控制主要是采取疫苗接种, 在现行使用的山羊痘疫苗中, 弱毒疫苗的免疫效果较好, 但存在副反应大和毒力返强等安全隐患;灭活疫苗具有较好的安全性, 但存在免疫期短和免疫效果一般等不足。山羊痘病毒P32蛋白为病毒囊膜蛋白, 由319~324个氨基酸组成, 是羊痘病毒具有较强免疫原性的结构蛋白, 免疫后能使动物产生保护性抗体。因此, P32蛋白成为各国学者研究山羊痘预防与控制的立足点。目前用于外源基因体外表达的载体主要有真核表达质粒和原核表达质粒2种, 其中真核表达质粒具有较完整的蛋白质翻译后加工能力而得到较好的应用。真核表达质粒PVAX1是在载体pc DNA3.1的基础上改建而成的一种新型真核表达载体, 大小为3.0 kb, 是美国食品和药品管理委员会推荐的唯一可应用于人体实验的质粒, 具有强启动子p CMV和BGH poly A, 可在哺乳动物细胞中高水平表达外源基因[7]。本研究以p MD-18T-P32/LD为模板, 通过PCR方法快速扩增获得了山羊痘P32基因, 并定向克隆到真核表达载体PVAX1中, 经PCR扩增和酶切鉴定, 成功构建了山羊痘病毒P32基因真核表达质粒。

3.2 关于真核表达质粒目的基因与宿主基因组的重组问题

自核酸疫苗自问世以来, 其安全性和长效性问题一直深受人们的关注。质粒DNA在动物体内的分布和存留时间是评价DNA疫苗的重要内容。一个理想的重组质粒应具有较长时间的存在能力, 以持续刺激动物机体产生较好的免疫应答反应。重组质粒在动物体内的存在方式主要有2种:一是游离存在动物体内;二是整合到动物的基因组中。若注射到动物机体的重组质粒以游离形式存在, 则不影响动物的生物安全性;若重组质粒外源基因整合到动物基因组中, 在体内持续表达, 可导致自身免疫性疾病或表现出遗传毒性。本研究采用PCR方法检测重组质粒在小鼠体内的动态分布及其与染色体DNA的整合情况, 结果发现构建的重组质粒在小鼠机体分布具有广泛性, 且重组质粒未经粪便释放到环境中, 也未与小鼠染色体DNA重组, 说明本研究构建的重组质粒PVAX1-P32在动物体内的安全性。

3.3 关于真核表达质粒PVAX1-P32诱导山羊的体液免疫应答

外源抗原诱导动物机体产生的应答反应主要包括B细胞介导的体液免疫应答和T细胞介导的细胞免疫应答。其中体液免疫应答产生的抗体对感染早期病毒的防御及对感染细胞溶解释放出的致细胞病变性病毒的防御都具有重要意义。因此, 本研究重组质粒诱导山羊机体免疫应答效果是以检测体液免疫应答反应指标Ig G为主。经检测发现, 注射重组质粒PVAX1-P32诱导山羊机体产生高水平的抗P32 Ig G, 其应答效果优于弱毒疫苗, 与陈轶霞等[8]研究结果不尽一致, 这可能与注射的免疫剂量不同所致。

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重组真核表达质粒 篇6

1 资料与方法

1.1 大肠杆菌质粒来源

大肠杆菌感受态细胞DH5a:北京天为时代生物公司。

1.2 主要试剂

质粒pcDNA3-HERG:美国Wisconsin大学Anson BD博士惠赠, Chelex-100 (Bio-Rad) , DL2000marker (北京天为时代生物公司) , 碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602 (北京百泰克) , 固体培养基, 限制性内切酶BamHI (购自Promega公司) , 50×TAE, 溴化乙锭 (EB) , 0.8%琼脂糖凝胶, 其余试剂均为进口及国产。

1.3 主要设备

小型DNA电泳仪及电泳槽 (日本产) 、低温离心机 (Backman) 、电磁炉 (上海产) , WP型紫外透射反射分析仪 (上海医疗器械厂) 、可见分光光度机 (日本岛津, UV-2401PC型) 、全自动凝胶成像及分析系统 (法国VL) 、电热恒温水浴箱 (上海医疗器械厂) 。

1.4 大肠杆菌的培养

挑取LB固体培养基上生长的单菌落, 接种于2.0 ml LB (含氨苄青霉素) 液体培养基中, 37 ℃、250 g振荡培养过夜 (约12～14 h) 。

1.5 SDS-碱裂解法提取质粒pcDNA3-HERG

于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液, 按照碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602说明书进行操作, 最终用70 μl EB洗脱缓冲液将大肠杆菌质粒DNA洗脱保存。

1.6 Chelex-100提取质粒pcDNA3-HERG

于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液轻轻振荡5 min, 以求充分混匀, 12 000 r/min离心2 min, 去上清液, 加200 μl 5% Chelex-100, 56 ℃保温30 min, 剧烈振荡5 s, 沸水煮8 min, 1000 r/min离心3 min, 上清液即含用于酶切的质粒DNA样品。

1.7 质粒DNA定量

在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取质粒DNA的吸光度 (A, 曾称光密度OD) 值。

1.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定

将获得的环状质粒用BamHI酶切为线性, 反应体系如表1, 快速混匀后, 置37 ℃水浴1.5 h后, 酶切产物经0.8%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.9 统计学处理

计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用两样本均数t检验法进行统计学处理, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1

同体积大肠杆菌液提取的质粒DNA获得量 (A260/A280) 分别为 (1.8±0.6) 、 (1.9±0.4) , 两种方法比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。

2.2

用两种方法提取的质粒DNA片段均为9.3 kp, 且条带清晰可见 (图1) 。

注:1为Chelex-100 法提取的质粒, 2为SDS-碱裂解法提取的质粒

3 讨论

质粒pcDNA3-HERG和细胞内DNA不同的是质粒呈环状, 作为表达载体有其特有cDNA启动子等其表达所需要的上游调节片断。但其实质仍然是DNA, 因此, 笔者尝试用提取DNA的方法来提取质粒pcDNA3-HERG。

本文用经典的碱裂解法和Chelex-100法分别提取质粒pcDNA3-HERG, 然后把环状的质粒酶切成单链DNA, 进行鉴定。结果显示, 在琼脂糖电泳上都出现了特定区带, 而且Chelex100法也可成功提取纯度较高的质粒pcDNA3-HERG。

经典的碱裂解法的基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中, 蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来, 这是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 适合于所有生物检材, 且提取的质粒纯度高, 但操作繁琐、复杂、费时[1]。

Chelex-100是一种螯合型离子交换树脂, 由苯乙烯和苯乙二烯组成的聚合物, Chelex悬液在100 ℃煮沸时可使蛋白质变性, 大肠杆菌细胞壁破裂, 质粒从细胞中释放[2]。Chelex与二价金属离子螯合, 从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度溶液中作为催化剂使DNA降解, Chelex还能够抑制核酸酶对DNA的消化作用, 并在高温、低离子强度条件下催化DNA的释放。它已广泛应用于微量血液、组织块、精斑、骨骼及牙齿等法医物证检材[3], 这样的处理过程既达到了分离提取DNA的目的, 同时除去了一些影响酶切反应以及免疫化学反应的因子 (如重金属离子) , 提高了质粒pcDNA3-HERG在细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等实验过程中的利用率。该方法简便快速, 无腐蚀, 提取过程始终在同一试管中进行, 可减少DNA的损失, 由于操作步骤简单, 减少了污染机会。Sepp等[4]研究认为, 由于高温对DNA有一定程度的降解作用, 使得Chelex-100法提取的DNA片段在1000 bp以下, 但是笔者的结果说明该方法可以成功提出大于1000 bp的质粒。

摘要：目的 探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法 分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒, 将环状质性DNA酶切为线性, 0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果 用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD (A260/A280) 比较差异无统计学意义[分别为 (1.8±0.6) , (1.9±0.4) , P>0.05], 经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论 两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA, Chelex-100法简便、省时, 值得推广。

关键词：pcDNA3-HERG,真核表达质粒质粒,Chelex-100法,SDS-碱裂解法

参考文献

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