迟缓爱德华氏菌（精选3篇）
迟缓爱德华氏菌 篇1
加州鲈[Micropterus salmoide (Lacépède) ]又名大口黑鲈 (Largemouth black bass) , 隶属于鲈形目 (Perciformes) 、鲈亚目 (Porcoidei) 、太阳鱼科 (Centrarchidae) 、黑鲈属 (Micropterus) [1]。加州鲈是广温肉食性淡水名贵鱼类, 具有个体大、生长快、适应性强、肉味鲜美等优点[2]。该鱼喜栖息于沙质或沙泥质且混浊度低的缓流静水中, 是发展池塘养殖的重要经济鱼类之一;同时该鱼较贪食, 易上钩, 又是发展休闲渔业的好品种[3]。
2013年6月江苏省吴江市八坼镇附近网箱养殖的加州鲈发病较严重, 发病对象主要为2龄加州鲈, 给养殖户造成了不小的经济损失。实验以此次加州鲈病鱼的细菌性病原体为研究对象, 通过分离纯化, 形态学观察, 结合16S r RNA基因序列同源性检索, 对该病原菌进行初步判断。通过药敏实验, 了解该病原菌对各种抗生素的耐药性和敏感程度, 结合养殖情况和发病情况, 对该病建立了有效的防治技术, 治疗效果良好。
1 材料与方法
1.1 材料
患病加州鲈 (濒死) 取自吴江市八坼镇区域养殖场。BHI培养基 (BD) 、细菌基因组DNA提取试剂盒和药敏纸片 (杭州微生物试剂有限公司) 提供。
1.2 方法
1.2.1 样品采集和病原分离
2013年6月, 对江苏省吴江市八坼镇区域养殖场加州鲈养殖的发病情况、病理变化等进行检查。
采用平板划线法, 在BHI固体培养基上对濒死的患病加州鲈的肝、脾和肾等实质性器官进行接种培养, 置28℃生化培养箱中过夜培养。选择呈优势生长的单菌落, 在BHI固体培养基上进行纯化培养, 从而得到单菌落, 并对得到的纯菌株进行革兰染色镜检。
1.2.2 分子生物学鉴定
对分离得到的纯菌株进行细菌基因组DNA进行提取后, 采用16S r RNA基因通用引物进行扩增, 样品送往上海生工生物工程有限公司测序, 并进行同源性检索。
引物:27 F:5'-AGAGTTTGATC (C/A) TG-GCTCAG-3';1492R:5'-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3'[6]。
PCR反应条件:20μL反应体系, 94℃预变性2min, 94℃变性1 min, 45℃复性1.5 min, 72℃延伸1.5 min, 30个循环后, 72℃温育2 min。
1.2.3 药敏实验
采用纸片扩散法, 病原菌接种BHI液体培养基, 28℃震荡培养24 h, 参照麦氏比浊管调整菌液浓度为1.0×108 CFU/m L, 将菌液均匀涂布在BHI平板上, 贴上药敏纸片, 28℃培养24h, 测量抑菌圈大小并判定结果。
1.2.4 治疗方法
根据病原菌鉴定和药敏试验结果, 以外用和内服相结合的方法进行治疗, 外用药选用二氧化氯, 内服药选用某公司生产的恩诺沙星粉。具体的治疗方法是按说明书的用量在网箱中使用二氧化氯, 恩诺沙星粉以每次每1 kg饲料中拌药3.3~6.7 g的剂量进行投喂, 连续用药7 d。
2 实验结果
2.1 自然发病病例临床特征
发病加州鲈主要为2龄加州鲈, 大小为30 cm左右, 离群独游, 反应迟钝。病鱼尾鳍溃烂, 有出血, 臀鳍出血, 解剖后肝脾肿大, 肝轻微发黄, 有少量腹水。现场水质检测结果, p H值8.2, 氨态氮为0.5 mg/L, 亚硝酸盐<0.05 mg/L, 水质良好, 适合加州鲈的生存和生长。
2.2 细菌分离
通过平板划线法进行分离和纯化, 结果发现在患病鲈鱼肝、肾处没有细菌, 但在脾和腹水处得到大小、形态一致的菌落, 通过纯化得到两株纯菌株, 编号为L2F和L2P2。该菌在BHI固体培养基平板上培养24 h后, 形成1~2 mm, 圆形光滑、边缘整齐、半透明的菌落。革兰染色呈红色, 为阴性杆状菌。
2.3 16S r RNA基因序列同源性检索
PCR扩增出菌株L2F和L2P2的16S r RNA基因片段大小约为1 500 bp, 测序结果表明其片段长度分别为1 445 bp和1 449 bp (图1) 。将该序列在Gen Bank数据库中与已报道的细菌基因序列进行Blast分析, 结果发现菌株L2F和L2P2与迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda) 的同源性达99%, 结合形态学初步判断该菌为迟缓爱德华氏菌。
2.4 药敏实验
药敏实验结果, 该菌对磺胺类 (磺胺异恶唑) 、氨基糖苷类 (链霉素) 和利福平等药物不敏感或耐药, 对喹诺酮类 (左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星) 、四环素类 (强力霉素) 、氯霉素类 (氟苯尼考) 、头孢菌素类 (头孢哌酮) 相对敏感 (表1) 。
注:1.药敏纸片直径为7 mm;2.敏感性判定标准:无抑菌圈, 表明不敏感或耐药 (-) ;0~10 mm为低度敏感 (L) ;11~14 mm为中度敏感 (M) ;15 mm或15 mm以上为高度敏感 (H) 。
3 讨论
近年来, 随着市场需要的增加, 各地养殖量和养殖规模逐渐扩大, 随之而来的病害问题也日渐突出。目前, 制约加州鲈养殖业健康发展的瓶颈就是病害问题, 尤其细菌性疾病。常见的加州鲈病害有气泡病、水霉病、烂鳃病、脂肪肝病及肠炎病等十几种, 也有多病原综合发病现象[4]。另外, 近几年来, 加州鲈养殖过程中又出现了不少新病症, 如脾肾坏死病、白头白嘴病、诺卡氏病、旋转病等, 业内人士表示, 这些疾病可能是由养殖过程中投喂的海水冰鲜饵料鱼带入的病原引起的。由于市场上目前还未出现治疗这些新病的有效药物, 一旦发生此类鱼病往往给养殖者带来巨大的经济损失[5]。
在本次加州鲈细菌性病害中, 我们根据病原菌鉴定和药敏试验结果, 以外用和内服相结合的方法进行治疗, 外用药选用二氧化氯, 内服药选用某公司生产的恩诺沙星粉。具体的治疗方法是按说明书的用量在网箱中使用二氧化氯, 恩诺沙星粉以每次每1.0 kg饲料中拌药3.3~6.7 g的剂量进行投喂, 连续用药7 d。用药后第3天, 死鱼数量逐渐减少, 鱼的摄食量也逐步增加, 病情得到初步控制, 用药1周后死鱼现象消失, 治疗效果好。
摘要：以江苏省吴江市八坼镇区域养殖场加州鲈鱼病鱼的细菌性病原体为研究对象。通过分离纯化, 形态学观察, 结合16S rRNA基因序列同源性检索, 对该病原菌进行初步判断。同时进行药敏实验, 了解该病原菌对各种抗生素的耐药性和敏感程度。研究结果:分离纯化得到2株纯菌株L2F和L2P2, 革兰染色均呈红色, 阴性杆状菌。16S rDNA序列分析, L2F和L2P2菌株与迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda) 的同源性达99%。初步判断该菌为迟缓爱德华氏菌。药敏实验结果, 该菌对磺胺异恶唑、链霉素和利福平等药物不敏感或耐药, 对左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、头孢哌酮相对敏感。
关键词：加州鲈鱼,迟缓爱德华氏菌,16S rDNA,药敏实验
参考文献
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[3]李胜杰.加州鲈养殖技术概述[J].内陆水产, 2008 (9) :26-28
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[5]李静红, 雷光英, 李丽雪, 等.广东加州鲈产业现状及发展建议[J].水产养殖, 2012 (9) :21-24
迟缓爱德华氏菌 篇2
本文以大菱鲆为免疫对象,采用迟缓爱德华氏菌福尔马林灭活全菌疫苗,通过浸泡和注射两种免疫途径进行免疫,将两种免疫途径的免疫效果进行比较,以此验证迟缓爱德华氏菌全菌疫苗对海水设施渔业首选养殖品种大菱鲆的免疫效果,确定最佳免疫方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验鱼
试验用大菱鲆采自汉沽区欣亿达养殖公司的工厂化养殖车间的养殖池,体长为(7.59±0.62)cm。在水族箱中进行暂养,连续充气,溶解氧7.1~7.5 mg/L、水温23℃、盐度21,适当进行饵料投喂,每天换水1次,每次20 cm。
1.1.2 试验菌株
迟缓爱德华氏菌为天津市水产养殖病害防治中心试验室从大菱鲆腹水病的分离鉴定菌株。
1.1.3 试剂
肠杆菌科细菌生化编码鉴定管(GYZ-15e),Freund不完全佐剂,0.5%福尔马林,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,0.85%生理盐水等。
1.2 试验方法
1.2.1 疫苗制备
将迟缓爱德华氏菌活化,37℃恒温培养24 h,用0.85%灭菌生理盐水将菌苔洗刮下,3 000 r/min离心15 min,收集菌体,向菌体中加入0.5%(V/V)福尔马林溶液,28℃灭活48 h,冰箱4℃保存备用。使用前,3 000 r/min离心15 min,收集灭活菌体,用生理盐水稀释至3×109 CFU/m L。
1.2.2 疫苗的安全试验
将灭活疫苗接种平板,37℃恒温培养24 h,观察是否有菌落生长。将疫苗以0.1 m L/尾的剂量,试验组20尾大菱鲆进行腹腔注射;对照组20尾大菱鲆腹腔注射活化的迟缓爱德华氏菌菌悬液,细菌密度为3×109 CFU/m L。观察并记录试验鱼的症状及死亡情况,试验时间15 d,结束时计算试验鱼死亡率。
1.2.3 疫苗注射免疫试验
试验设一个试验组及一个对照组,每组20尾大菱鲆,暂养7 d后进行试验。将去除福尔马林的制备保存疫苗(3×109 CFU/m L)与等体积弗氏不完全佐剂混合,制备成疫苗,试验组每尾鱼腹腔注射疫苗0.1 m L,对照组每尾鱼腹腔注射灭菌0.85%生理盐水0.1 m L。
1.2.4 疫苗浸泡免疫试验
试验设一个试验组及一个对照组,每组20尾大菱鲆,暂养7 d后进行试验。试验组将鱼放到5.0 L盐水(8%)中充气浸泡5min,放入同体积的养殖用水(盐度21)配制的疫苗溶液中浸泡60 min,疫苗浓度3×109 CFU/m L,然后放到水族箱中养殖。14 d内按相同方法免疫2次。对照组将鱼放入5.0 L正常养殖用水中充气养殖65min,放到正常条件养殖,与实验组同步。
1.2.5 免疫鱼的人工感染试验及疫苗免疫保护力的测定
第二次免疫后第10天,观察记录鱼体的体长体高。然后进行迟缓爱德华氏菌的人工感染,10 d后,计算疫苗的免疫保护力(RPS)。
RPS=(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100%
免疫鱼的人工感染参照莫照兰等[6]方法进行,取4组,分别为注射免疫试验组和对照组,浸泡免疫试验组和对照组,每组各20尾。试验条件与暂养方法相同,计录鱼死亡数。
人工感染试验过程中对患病鱼进行症状观察,并对具有临床症状的病鱼进行病原的分离纯化鉴定。
2 结果
2.1 疫苗的灭活及其安全性
将灭活疫苗接种平板,37℃恒温培养24 h,未见有菌落长出,表明疫苗灭活彻底。分别用迟缓爱德华氏菌灭活疫苗和爱德华氏菌菌悬液(3×109CFU/m L)腹腔注射健康大菱鲆,结果见表1,表明迟缓爱德华氏菌灭活疫苗对大菱鲆是安全的。
2.2 疫苗的免疫效果
在免疫鱼人工感染之前(第二次免疫后第10天),经过2次注射免疫以及浸泡免疫的免疫鱼和各自的对照鱼体均健康、活力强,未见患病、死亡。2.2.1人工感染结果注射免疫和浸泡免疫的对照鱼在注射感染后第3天同时发病,并在第4天大量死亡。浸泡免疫鱼在第6天开始发病,第7天开始死亡,没有出现死亡高峰。注射免疫鱼在第8天开始发病,第9天开始死亡,也没有出现死亡高峰。迟缓爱德华氏菌对免疫后大菱鲆及对照鱼的死亡情况见表2,免疫对照鱼10 d内的死亡率为100%,而免疫鱼的死亡率均低于各自的对照鱼,注射免疫鱼的死亡率低于浸泡免疫鱼。
2.2.2 人工感染病鱼病原分离鉴定结果
病鱼的症状表现为为典型的腹水病症状。病鱼的腹水及肾脏中分离的菌株菌落形态一致,为乳白色圆形菌落,鉴定结果为迟缓爱德华氏菌。
2.2.3 疫苗免疫保护力
根据死亡鱼的发病症状,以及病原菌的分离、鉴定,可以确定人工感染免疫试验鱼患病并致死的原因是腹水病,其病原为注射的迟缓爱德华氏菌。根据表2计算出注射接种疫苗、浸泡接种疫苗的大菱鲆对腹水病的免疫保护率分别为70%和35%,这表明无论注射还是浸泡接种迟缓爱德华氏菌全菌疫苗都能使大菱鲆对腹水病产生免疫效果,且注射免疫效果优于浸泡免疫。
3 讨论
3.1 全菌灭活疫苗的安全性
疫苗研制首要问题是疫苗的安全性,同时又要采取较温和的细菌灭活条件以便保证疫苗的抗原性及有效性。肖慧等[3]通过对鳗弧菌病疫苗不同制备方法的安全性进行比较,认为用福尔马林作灭活剂效果好。试验采用的疫苗制备方法安全性较高,注射疫苗的大菱鲆存活率为100%,注射活化的迟缓爱德华氏菌菌悬液(3×109 CFU/m L)的大菱鲆15d内的死亡率为100%。
3.2 鱼类全菌灭活疫苗的有效性
现今鱼类疫苗可分为传统型疫苗和新型疫苗两大类。多数学者研究结果表明,革兰氏阴性细菌细胞外膜的主要成分是表面抗原(O抗原),具有极高的免疫原性,这类细菌的传统型全菌灭活疫苗具有制备方法简便、易行,血清特异性免疫应答明显、免疫保护力强等优点。莫照兰等[6]将鳗弧菌制成福尔马林灭活全菌疫苗、脂多糖疫苗对牙鲆进行注射和浸泡免疫均获得较好的免疫效果,免疫7周后抗体效价达到最高,达到1∶768。黄新新等[5]采用注射接种的方法,用迟缓爱德华氏菌福尔马林灭活疫苗对异育银鲫进行免疫,结果为疫苗的免疫保护率为83.3%。朱开玲等[8]用福尔马林灭活的鳗弧菌注射免疫大菱鲆鱼苗,6周后血清抗体校价1∶1228.8,4周后免疫保护率为91.7%。本试验研究结果与其他学者的研究结果相一致,注射迟缓爱德华氏菌福尔马林灭活疫苗对大菱鲆腹水病的免疫保护率为75%,免疫保护率较高。
3.3 全菌灭活疫苗注射接种与浸泡接种的效果
鱼类疫苗接种方法主要包括注射、浸泡及口服三种,这三种方法在实际应用及免疫效果上均有各自的优缺点。目前关于鱼类疫苗不同接种方法的免疫效果研究很多,在对注射免疫和浸泡免疫的免疫效果评价方面,多数学者获得较一致的研究结果,认为不论是在鱼类血清特异性免疫应答
水平还是鱼体的保护力方面,注射免疫都优于浸泡免疫。注射全菌灭活疫苗后,免疫效价最高可达1∶192~1∶1228.8,免疫保护率可达57.9%~91.7%,而给鱼体浸泡相同疫苗后,免疫效价只为1∶36~1∶45.3,免疫保护率为32%~33%[6,8]。本文的研究结果与上述学者的研究结果相一致。注射迟缓爱德华氏菌全菌疫苗的免疫保护率为70%,而浸泡免疫的免疫保护率只有35%,远远低于注射免疫。
当然,上述研究结果并不能作为否定浸泡免疫效果的依据,一些学者的研究结果表明,鱼类鳃组织中具有分泌Ig M的B细胞,这为鱼类的浸泡免疫提供了一定的免疫细胞学基础[9]。另外,上述研究采用的疫苗种类都是全菌疫苗,也就是细胞疫苗,所采用的浸泡方法为将全菌疫苗制成一定浓度的疫苗溶液直接浸泡鱼体,或先用高渗盐水浸泡后再用低渗的疫苗溶液浸泡鱼体,无论是疫苗的种类还是浸泡方法都不是最佳的。一些学者对鱼类浸泡疫苗种类及方法的研究表明,一些种类的疫苗更适合浸泡免疫,例如DNA疫苗[7]、小分子多肽[10],并且浸泡免疫的方法也应该科学有效,例如,采用DNA疫苗的质体包埋技术[7]、免疫助剂处理鱼体技术[11]等。由于浸泡免疫具有对鱼体创伤小、利于水生动物群体免疫等优点,该领域的研究越来越受到诸多学者的重视,成为鱼类免疫学研究的活跃领域。
摘要：以大菱鲆为免疫对象,采用0.5福尔马林灭活的方法,将迟缓爱德华氏菌制成全菌疫苗,验证了其具有可靠的安全性。以浸泡和注射两种免疫接种方法对养殖大菱鲆14d内进行2次免疫,第二次免疫后第10天,对免疫鱼和各自的对照鱼进行爱德华氏菌的人工感染试验,获得注射接种疫苗的大菱鲆对腹水病的免疫保护率为70,浸泡接种疫苗的大菱鲆对腹水病的免疫保护率为35。表明注射和浸泡接种迟缓爱德华氏菌全菌疫苗都能使大菱鲆对腹水病产生免疫效果,并且注射免役效果优于浸泡免疫。
关键词：大菱鲆,迟缓爱德华氏菌,福尔马林灭活全菌疫苗,免疫效果
参考文献
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[5]黄新新,陆承平.迟缓爱德华氏菌全菌及外膜蛋白的免疫比较[J].免疫学杂志,2002,18(3):187-191
[6]莫照兰,徐永立,张培军.养殖牙鲆鳗弧菌疫苗的研究[J].海洋科学,2002,26(4):63-68
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[8]朱开玲,陈吉祥,李筠,等.鳗弧菌灭活疫苗对海水养殖大菱鲆的免疫预防研究[J].高技术通讯,2004,12:76-81
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迟缓爱德华氏菌 篇3
1 材料与方法
1.1 试验材料
患病杂交鳢取自广东省中山市某杂交鳢养殖场, 健康的杂交鳢购于广州市黄沙水产市场, 体质量为 (271±26) g, 放于池中暂养, 充气, 水温维持在 (25±2) ℃, 每天投喂饲料, 适应1周后开始试验。革兰氏染色液、芽孢染色液、细菌微量生化鉴定管均购于广东环凯微生物有限公司;抗生素纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购于广州维宁生物科技有限公司。
1.2 细菌的分离、纯化
无菌操作从患病濒死的杂交鳢的肝、脾、肾划线接种于营养琼脂平板上, 37℃培养48 h后挑取单菌落在营养琼脂平板上划线, 进行纯培养。对已分离纯化的细菌按染色液说明书进行格兰染色、芽孢染色, 参照文献[18]的方法进行荚膜染色, 光学显微镜下观察。
1.3 细菌的生理生化鉴定
将分离菌的新鲜菌落接种于LB (Luria-Bertani) 肉汤培养基中, 培养18 h后取80μL菌液加入每种微量生化鉴定管, 37℃培养12~48 h后判定结果。
1.4 细菌16SrRNA基因序列的分析
用上海英骏生物技术有限公司合成的通用引物[13]进行PCR扩增, 正向引物为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'[对应于大肠杆菌 (E.coli) 16S rRNA基因序列的第8~第27个碱基位置];反向引物1492R:5'-TACGGCTACCTTGT-TACGACTT-3' (对应于E.coli 16S rRNA基因序列的第1 492~1 510个碱基位置) 。按试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。反应体系为50μL, 0.2μg·μL-1细菌DNA模板2μL, 10 mmol·L-1的正反向引物各1μL, 含Mg2+的10×PCR缓冲液5μL, 10mmol·L-14×d NTP 2μL, 1 U·μL-1的Taq DNA聚合酶2μL, 双蒸水37μL。PCR采用反应条件为94℃预变性5 min 1次;94℃30 s, 58℃45 s, 72℃1 min 30 s, 30个循环;PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司纯化并测序。测序结果通过NCBI的BLAST检索系统进行同源序列比对, 从中选取相似序列, 并使用MEGA 4.1与从Gen Bank数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进行多序列匹配排列 (multiple alignments) , 采用邻接法 (neighbor joining method) 构建系统发育树, 并通过Bootstrap法 (1 000次重复) 检验。
1.5 人工感染试验
70尾健康的杂交鳢分为7组, 每组10尾, 6组为试验组, 1组为对照组。取菌株ZS201364-1的新鲜菌落制成浓度为1.12×109cfu·m L-1菌悬液, 然后分别稀释至1.12×108cfu·m L-1、1.12×107cfu·m L-1、1.12×106cfu·m L-1、1.12×105cfu·m L-1和1.12×104cfu·m L-1。分别将以上几个浓度的菌液按照每尾0.5 m L的剂量, 对健康杂交鳢腹腔注射进行感染。对照组的杂交鳢, 则按照每尾0.5 m L的剂量在相同部位注射0.85%无菌生理盐水。该人工感染试验持续15 d, 每日观察受试鱼的发病症状并记录死亡的尾数, 并从濒死的鱼重新分离细菌, 根据改进的寇氏法[17]计算半致死剂量 (LD50) 。lg LD50=Xk-d (ΣPi-0.5) , 其中Xk为最大对数剂量, d为相邻两组对数剂量之差数, Pi为死亡率, i为组号。同样的方法用于菌株ZS201364-2对杂交鳢的LD50的测定。
1.6 生长特性
1.6.1 温度对致病菌生长的影响
将菌株ZS201364-1的单菌落接种到无菌LB肉汤中振荡 (80 r·min-1) 培养18 h, 取25μL菌液分别接种到24支盛有5 m L无菌营养肉汤的试管中, 于5℃、10℃、15℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下培养, 每个温度设3个重复。18 h后取样分别测定不同培养温度下菌液的光密度 (OD460 nm) 。以培养温度为横坐标、OD460 nm为纵坐标绘制曲线。
1.6.2 p H对致病菌生长的影响
将菌株ZS201364-1的单菌落接种到无菌LB肉汤中振荡 (80 r·min-1) 培养18 h, 取25μL菌液分别接种到21支盛有p H为4、5、6、7、8、9和10的5 m L无菌营养肉汤的试管中, 每个p H设3个重复, 30℃下培养18 h后取样分别测定不同p H时菌液的OD460。以p H为横坐标、OD460为纵坐标绘制曲线。
1.6.3 Na Cl质量分数对致病菌生长的影响
将菌株ZS201364-1的单菌落接种到无菌LB肉汤中振荡 (80 r·min-1) 培养18 h, 取25μL菌液分别接种到33支含Na Cl质量分数分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%的5 m L无菌营养肉汤的试管中, 每个Na Cl质量分数设3个重复, 30℃条件下培养18 h后取样分别测定不同Na Cl质量分数时菌液的OD460。以Na Cl质量分数为横坐标、OD460为纵坐标绘制曲线。
1.7 药敏试验
采用纸片扩散法, 无菌操作将菌株ZS201364-1的24 h培养物以无菌生理盐水洗下制成1.5×108cfu·m L-1的菌悬液, 取80μL菌悬液涂布于营养琼脂培养基平板, 用无菌镊子将抗生素纸片轻轻贴在琼脂表面, 37℃恒温培养48 h后测量抑菌圈直径的大小。
2 结果
2.1 形态特征
该致病菌为革兰氏阴性短杆菌, 能运动, 无芽孢, 无荚膜。在普通营养琼脂培养基上37℃培养24 h, 形成正圆形、凸起、灰白色、有光泽的菌落, 直径0.5~1.0 mm。
2.2 生理生化鉴定
根据分离菌株的生理生化特性结果[18], 鉴定2株致病菌均为迟缓爱德华菌 (表1) 。
2.3 16SrRNA基因序列的分析
菌株ZS201364-1和ZS201364-2所扩增的16Sr RNA基因序列长度分别为1 428 bp和1 429 bp, 将此2条序列 (Accession No.KJ183027和KJ183028) 分别与Gen Bank中的序列进行比较, 结果与迟缓爱德华菌同源性均为99%, 从而鉴定此2株菌为迟缓爱德华菌。
根据菌株ZS201364-1和ZS201364-2的16S rRNA基因序列测定结果, 选取相似序列使用MEGA 4.1采用邻接法构建系统发育树, 并通过Bootstrap法 (1 000次重复) 检验。所构建的系统发育树见图1。菌株ZS201364-1和ZS201364-2的16 S rRNA基因序列与迟缓爱德华菌的16 S rRNA基因序列自然聚类。从而鉴定菌株ZS201364-1和ZS201364-2均为迟缓爱德华菌。
2.4 人工感染试验
人工感染后的杂交鳢第3天开始死亡, 从死亡鱼的肝、肾均可再次分离到原感染细菌。试验过程中, 注射了0.85%无菌生理盐水的对照组鱼摄食正常, 外观特征没有明显的变化。计算得到菌株ZS201364-1和ZS201364-2对杂交鳢LD50分别为7.1×105cfu·g-1和5.6×105cfu·g-1。
2.5 生长特性
2.5.1 温度对致病菌生长的影响
菌株ZS201364-1在温度10~45℃均能生长, 最适生长温度为25~35℃ (图2) 。
2.5.2 p H对致病菌生长的影响
菌株ZS201364-1在p H 4~10均能够生长, 其中最适生长p H为7~8 (图3) 。
2.5.3 Na Cl质量分数对致病菌生长的影响
菌株ZS201364-1在Na Cl质量分数为0~4%均能生长, 其中最适生长的Na Cl质量分数为1% (图4) 。
2.6 药敏试验
药敏试验结果显示, 菌株ZS201364-1对头孢噻肟、环丙沙星和诺氟沙星等抗生素高度敏感;对链霉素、复方新诺明、林可霉素、强力霉素和利福平等低度敏感。
3 讨论
迟缓爱德华菌在分类上属于肠杆菌科、爱德华氏菌属, 是水产养殖中常见的一种致病菌。迟缓爱德华菌感染的宿主广泛, 自1962年首次报道了其对日本鳗鲡 (Anguilla japonica) 的感染以来[19], 目前该菌已引起了多种鱼类如斑点叉尾 (Ictnlurus punctatus) 、大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 、尼罗罗非鱼 (Oreochromis nilotica) 、高体革 (Scortum barcoo) 、黑鲷 (Sparus macrocephlus) 和漠斑牙鲆 (Paralichthys lethostigmo) 等的病害[20,21,22,23,24,25]。该菌还可感染两栖类动物如牛蛙 (Rana catesbiana) 和大鲵 (Andrias davidianus) [26,27]。除此之外, 还有该菌感染爬行类、鸟类、哺乳动物甚至人类的一些报道。笔者从患病杂交鳢分离到迟缓爱德华菌在国内外尚属首次, 表明对于迟缓爱德华菌, 杂交鳢是一种新发现的宿主。
该研究中根据分离菌的形态学特征、生理生化特性的检测结果, 参考《常见细菌系统鉴定手册》[18], 鉴定2株致病菌均为迟缓爱德华菌。通过测定该菌株的16S rRNA基因序列并进行分析, 显示该菌株与迟缓爱德华菌的同源性最高, 达99%。经计算菌株ZS201364-1和ZS201364-2对杂交鳢LD50依次为7.1×105cfu·g-1和5.6×105cfu·g-1。根据鱼类致病菌划分标准[28], 2株致病菌对杂交鳢均具有很强的致病力。
关于迟缓爱德华菌的生长特性, WAKABA-YASHI和EGUSA[29]研究表明, 该菌在培养基中Na Cl质量分数为0~4%内能生长, p H 5.5~9能生长, LB肉汤中培养时15~42℃能生长。该研究中的菌株ZS201364-1的生长特性与上述报道的相比, 耐盐性基本一致, 但p H和温度的范围有所不同。同时, 菌株ZS201364-1与ISHIHAZA和KUSUDA[30]报道的最适生长温度为30℃的结论一致, 但与XIAO等[31]报道的最适生长的Na Cl质量分数为2%结论不同。这可能与菌株差异有关, 也可能与不同菌株所处的咸淡水环境有关。