纳米脂质（精选7篇）
纳米脂质 篇1
恶性肿瘤是近年来危害人类健康的三大杀手之一, 是仅次于心血管疾病的第二大死因。脑肿瘤发病率约占全身肿瘤发病率的5%。常见的脑肿瘤有:胶质瘤、脑膜瘤及神经鞘瘤。其中, 胶质细胞瘤 (也称恶性胶质瘤) 是脑肿瘤中发病率最高, 死亡率最高和最常见的一种[1,2], 约占40.49%, 每年发病率是5/10万~7/10万人。
替莫唑胺 (Temozolomide, TMZ) 于1999年8月11日通过FDA批准, 在美国上市。TMZ可通过血脑屏障, 对颅内恶性胶质瘤的作用显著[3,4,5]。目前, 国内上市的剂型为胶囊 (商品名分别为泰道, 蒂清) 。
然而由于TMZ水溶性差, 生物半衰期短, 容易被肝细胞内的巨噬细胞所吞噬, 缺乏靶向性, 口服给药对其他器官的毒副作用大[6]。因此, 选择新型给药载体, 延长血液循环时间, 提高脑靶向性显得尤为重要。
有文献报道, 纳米脂质载体 (nanostructured lipid carriers, NLC) 可以明显提高疏水性药物非口服给药的传递效率[7,8]。此外, NLC还具有以下优势:增加难溶性药物的溶解性;控制药物释放;生物相容性好, 且可生物降解。
普通纳米粒进入体循环首先是被肝、脾的单核巨噬细胞系统 (mononuc Learphagocytesystem, MPS) 所摄取, 对于治疗肝、脾脏的疾病具有天然的优势, 但是要达到其他部位靶向, 则要尽量避免被MPS摄取。因此如何减少或避免纳米载体递药系统在体内对吞噬细胞的趋向性及增加纳米粒与所载药物对非MPS器官的分布成为近年来药剂学研究的一个热点。有研究表明, 纳米粒经PEG修饰后, 由于PEG亲水性长链可以在纳米粒表面形成水化层, 阻止了调理素及血浆蛋白的调理作用, 避开了MPS的摄取, 纳米粒的血液循环时间得以延长[9]。
因此, 选择纳米脂质载体作为替莫唑胺的载体, 并对其进行PEG修饰, 制备替莫唑胺长循环纳米脂质载体 (TMZ-PEG-NLC) , 为抗脑胶质瘤纳米制剂的开发奠定基础。
1 仪器和材料
1.1 试剂及药品
替莫唑胺 (杭州和素化学技术有限公司) ;单硬脂酸甘油酯 (天津四通化工厂) ;油酸 (天津大毛试剂有限公司) ;吐温80 (上海市国药集团化学试剂有限公司) ;泊洛沙姆F68 (美国Sigma公司) ;PEG40-硬脂酸酯 (美国Sigma公司) ;卵磷脂 (上海太伟药业) ;色谱甲醇 (上海市国药集团化学试剂有限公司) ;冰醋酸 (天津市富宇精细化工有限公司) ;0.22μm微孔滤膜 (上海市新亚净化器件厂) ;乙醇、氢氧化钠等均为市售分析纯试剂。
1.2 仪器
AL104-IC精密分析天平 (瑞士梅特勒公司) ;eppendorf移液器 (德国Eppendorf公司) ;TU-1810型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) ;Agi Lent-1200高效液相色谱仪 (美国安捷伦) ;水浴超声仪 (天津先德科技仪器有限公司) ;G1314A可变波长检测器 (美国安捷伦) ;ZHSY-50水浴恒温振荡器 (上海知楚仪器厂) 。
2 方法与结果
2.1 替莫唑胺长循环纳米脂质载体的制备
本论述采用高温乳化-低温固化法制备TMZ-PEG-NLC, 处方和工艺[10]如下:精密称取处方量的TMZ、单硬脂酸甘油酯以及PEG-40硬脂酸酯、油酸和卵磷脂溶于9m L甲醇和1m L丙酮中, 在75℃下水浴加热使其混匀形成油相。将表面活性剂F68和吐温80溶于30m L注射用水, 在相同温度下水浴加热形成水相。在1200rpm电磁搅拌的条件下, 将油相用微量注射泵以18ml/h缓缓滴入水相, 直至甲醇和丙酮完全挥发, 形成初乳。将初乳放入冰水浴中, 搅拌, 低温固化0.5 h, 即得。
2.2 替莫唑胺长循环纳米脂质载体制剂形态观察
按照最佳处方和工艺制备三批TMZ-PEG-NLC, 分别经适当稀释后, 滴在专用的铜网上, 然后在铜网上滴加1滴2.0%磷钨酸染色, 1 min后将铜网置于洁净滤纸上干燥, 置于透射电镜下观察并拍照, 见图1。由电镜图片可知, TMZ-PEG-NLC外观呈圆整的球形或类球形实体, 粒径均匀, 外层有明显的亲水层。
2.3 替莫唑胺长循环纳米脂质载体的含量及包封率的测定
2.3.1 检测波长的确定
在200 nm~400 nm波长范围内, 分别对TMZ-0.5%冰醋酸水溶液和辅料甲醇溶液进行紫外扫描, 二者的紫外图谱分别见图2。由图2可知, TMZ在260 nm和329 nm波长处有两个最大吸收峰, 在260 nm波长处, 辅料溶液有吸收, 而在329 nm波长处辅料溶液几乎无吸收, 因此选择329 nm作为检测波长。
2.3.2 色谱条件
色谱柱:Diamonsi L-ODS柱 (4.6mm×150mm) ;流动相:甲醇-0.5%冰醋酸溶液 (8:92, V/V) ;检测波长:329nm;流速:1.0m L/min;进样量:20μL;理论塔板数不低于6000。
2.3.3 专属性试验
在规定的色谱条件下, 分别取辅料溶液和TMZ标准溶液, 进样20μL, 记录色谱图, 如图3所示。由图3A和B可知, TMZ色谱峰的保留时间约为7.8 min, 与有关物质分离度良好, 辅料对TMZ的测定无干扰。
2.3.4 标准曲线的建立
精密称取TMZ5.2mg置于10m L容量瓶中, 用水准确配制成浓度为520μg/m L的贮备液。用0.5%冰醋酸稀释制成0.104-33.28μg/m L的系列标准溶液, 分别进样20μL进行测定。以峰面积 (A) 为纵坐标, 浓度 (C) 为横坐标, A对C进行线性回归, 得标准曲线方程:y=59.153x+1.4657 (r=0.9999) 。结果表明, TMZ在0.104-33.28μg/m L浓度范围内, 峰面积与浓度呈良好的线性关系。
2.3.5 精密度与回收率实验结果
在确定的色谱条件下, 分别进样TMZ的1.04、4.16、16.64μg/m L的标准溶液20μL, 1天内测定5次, 计算日内精密度分别为0.95%, 0.26%, 0.20%;每天测定一次, 连续测定5d, 计算日间精密度分别为0.64%, 0.23%, 0.17%。
取TMZ及处方量的辅料, 精密称定, 配成80%、100%、120%的样品溶液各3份。在“2.3.2”所述色谱条件下, 将对照溶液和样品溶液分别进样20μL, 记录峰面积, 代入标准曲线方程求TMZ的实测浓度, 计算得提取回收率分别为101.16%±0.031, 104.38%±0.010, 98.39%±0.004;RSD分别为3.11%, 1.01%, 0.42%。TMZ高、中、低三种溶液的日内、日间RSD均小于2.0%, 结果表明, 提取回收率均大于95%, RSD均小于5.0%, 辅料对主药的含量测定无干扰。
2.3.6 超滤离心法测定包封率和载药量
精密量取蒸馏水400μL加入超滤离心管内管, 再往内管中加入TMZ-PEG-NLC混悬液200μL, 将得到的混悬液在3500rpm的转速下高速离心30min, 时间到后然后往向内管中加入400μL蒸馏水, 在3500rpm的转速下高速离心30min, 再往内管中加入200μL蒸馏水, 在3500rpm的转速下高速离心30min, 精密量取外管溶液体积, 取50μL用0.5%醋酸溶液稀释200倍, 微孔滤膜过滤, 进样20μL测定游离药物量。同样精密量取TMZ-PEG-NLC混悬液50μL, 加甲醇500μL破乳, 用0.5%醋酸溶液稀释200倍, 微孔滤膜过滤, 进样20μL测定总药量。按照下式计算包封率 (EE) 和载药量 (DL) :
2.3.7 超滤离心法提取回收率测定[11]
精密称取TMZ30.8mg置于10m L容量瓶中, 用水准确配制成浓度为3.08mg/ml的贮备液。分别精密吸取贮备液0.4ml、0.5ml、0.6ml置于试管中, 加空白PEG-NLC配制成0.411mg/ml、0.513mg/ml、0.616mg/ml的溶液, 用“2.3.5”得离心方法超滤。在“2.3.2”所述色谱条件下, 将外管溶液和破乳所得溶液稀释相同倍数, 分别进样20μL, 记录峰面积, 代入标准曲线方程求TMZ的实测浓度, 计算方法回收率分别为97.91%±0.008, 95.15%±0.008, 97.45%±0.014;RSD分别为0.79%, 0.82%, 1.39%。结果表明, TMZ高、中、低三种溶液的方法回收率均大于95%, RSD均小于2.0%, 此法符合要求。
2.4 替莫唑胺长循环纳米脂质载体的单因素考察
采用乳化-低温固化法制备TMZ-PEG-NLC, 处方及制备工艺中其他条件固定不变, 改变其中的某一个条件, 以包封率和载药量为主要的考察指标, 分别对药脂比 (w/w) 、液固脂质比 (w/w) 、水浴温度、搅拌速度和滴加速度等因素进行考察, 以确定TMZ-PEG-NLC的最佳处方和制备工艺。
2.4.1 药脂比
参照“2.1项”下基础处方, 固定其它条件不变, 改变药物与脂质材料质量之比, 分别为1:2.5;1:4;1:5;考察药脂比对TMZ-PEG-NLC包封率和载药量的影响, 如表1所示。
由结果可知, 投药量过多, 超出了脂质的承载能力, 包封率降低;并且由于替莫唑胺在水中有一定的溶解度, 使其容易扩散到外水相中。当药脂比为1:4或1:5时, 包封率较高。
2.4.2 液固脂质比
控制处方和工艺中其他因素不变, 改变液态脂质和固态脂质的质量比, 分别为1:4;1:3;1:1;考察液固脂质比对TMZ-PEG-NLC包封率和载药量的影响, 如表2所示。
由表2可知, 在其他因素不变的情况下, 随着液固脂质比 (w/w) 的增大, 包封率出现先减小后增大的趋势, 当液固脂质比 (w/w) 达到1:4时, 包封率达到最大。这可能是因为当液固脂质比大于1:4时, 液体脂质量过大, 而不能完全载于固态脂质骨架中, 部分液体脂质以油滴的形式存在, 导致包封率变低。
2.4.3 水浴温度
控制处方和其他工艺因素不变, 改变水浴温度, 分别为65℃;75℃;85℃;考察水浴温度对TMZ-PEG-NLC包封率和载药量的影响, 如表3所示。
由表3可知, 水浴温度对TMZ-PEG-NLC的包封率影响较大, 当温度较低时, 固体脂质熔融不完全, 影响了脂质对药物的包封;当温度过高时, 有机溶剂挥发太快, 纳米粒在形成的过程中, 部分药物来不及包封, 且部分药物在高温条件下可能降解失活, 因而包封率也较低。
2.4.4 两种固体脂质比
控制处方和工艺中其他因素不变, 改变两种固体脂质的质量比, 分别为1:2;1:1;2:1;考察两种固体脂质比对TMZ-PEG-NLC包封率和载药量的影响, 如表4所示。
由表4可知, 在其他因素不变的情况下, 随着两种固体脂质比 (单硬脂酸甘油酯:PEG-硬脂酸) 的增大, PEG-TMZ的包封率和载药量出现先增大后减小的趋势, 当两种固体脂质比 (单甘:PEG-硬脂酸) 达到1:1时, 包封率和载药量达到最大。
2.4.5 滴加速度
固定其它条件不变, 改变滴加速度, 分别为15m L/h, 18m L/h, 20m L/h;考察滴加速度对TMZ-PEG-NLC包封率和载药量的影响, 如表5所示。
由表5可知, 在其他因素不变的情况下, 随着滴加速度的增大, PEG-TMZ的包封率和载药量出现先增大后减小的趋势, 当滴加速度达到18 m L/h时, 包封率达到最大。当滴加速度较小时, 滴加时间较长, 液体挥发较多, 使包封率变小;当滴加速度较大时, 油滴乳化不好, 药物分散进入水相, 所以包封率会相应减小。
2.4.6 搅拌速度
控制处方和其他工艺因素不变, 改变搅拌速度, 分别为500rpm, 800rpm, 1200rpm, 考察搅拌速度对TMZ-PEG-NLC包封率和载药量的影响, 如表6所示。
由上表可知:搅拌速度小时, 油滴乳化较差, 包封率和载药量较低;搅拌速度大, 乳滴分散度大, 包封和载药能力提高。
2.5 替莫唑胺长循环纳米脂质载体正交实验设计最优处方重现性考察的结果
2.5.1 替莫唑胺纳米脂质载体的正交实验设计
为优化替莫唑胺长循环纳米脂质载体的工艺条件, 参照有关文献[12], 精密称取替莫唑胺原料药, 对影响较大的因素进行正交试验设计, 考察TMZ-PEG-NLC的包封率和载药量, 并筛选出最佳处方和制备工艺, 如表7所示。
正交实验结果见表8。
附:K=包封率×0.7+载药量×0.3
根据正交实验考察的结果, 由表8可知, 极差分析结果D>B>C>A, 显示D因素对纳米脂质载体包封率影响最为显著。由各因素对应的K1、K2和K3值筛选出各因素的最佳水平, 最终确定TMZ-PEG-NLC的最佳处方和工艺为A2B2C1D2。
2.5.2 替莫唑胺纳米脂质载体的最优处方重现性考察的结果
按照最佳处方和工艺制备三批TMZ-PEG-NLC, 其重现性考察结果见表9。
由表9可知, TMZ-PEG-NLC最佳处方和工艺重现性良好, 平均包封率为22.98%, 平均载药量为3.71%, p H的平均值为5.18。
2.6 长循环替莫唑胺纳米脂质载体冻干制剂的考察
2.6.1 冻干制剂的制备
向新制得的TMZ-PEG-NLC混悬液中加入12%甘露醇, 分装于5 m L西林瓶中, 在-80℃超低温冰箱预冻24h, 置于冷冻干燥机中, 冻干48h, 取出加盖密封即可。以冻干后外观、复溶情况以及复溶后载药量, 包封率, 颗粒形状等方面综合考察冻干保护剂对冻干效果的影响。
2.6.2 冻干制剂外观形态的考察
TMZ-PEG-NLC的冻干粉外观如图4所示。复溶后, 观察其外观形态, 结果如图5所示。
2.6.3 冻干制剂载药量和包封率的考察
取三批冻干制剂, 加入蒸馏水复溶。按第二部分的“2.3.5”项下方法测其包封率和载药量。
由表10可知, 复溶后, 溶液包封率的平均值为23.92, 高于原制剂包封率的平均值22.98。可能是因为冻干制剂复溶后粒径增大, 比表面积增大, 导致对游离药物的包封率增大。
2.7 长循环替莫唑胺纳米脂质载体体外释放测定
量取2m L TMZ-PEG-NLC于透析袋中, 以p H=5.0的PBS为释放介质, 转速100rpm, 温度为 (37.5±0.5) ℃, 采用动态膜透析法研究TMZ-PEG-NLC在体外的释药特性[13]。分别于0.083h, 0.167h, 0.333h, 0.5h, 0.75h, 1h, 2h, 4h, 6h吸取释放介质0.2 m L, 同时补入同温的释放介质, 样品用0.5%的醋酸溶液稀释5倍后过滤, 然后进样20μL进行高效液相分析。计算累积释放百分率, 绘制体外释放曲线如图6, 释放百分率见表11。
由表11与图6可知, 将药物载入用PEG修饰的纳米脂质载体有缓释作用, 可能是由于药物被包封于脂质骨架内, PEG纳米脂质载体可起到微贮库作用, 缓慢释放药物。
3 讨论
本实验以PEG-SA为载体修饰材料, 采用高温乳化-低温固化方法制备了TMZ-PEG-NLC, 以包封率和载药量为评价指标, 通过单因素考察和正交实验, 确定了TMZ-PEG-NLC的最佳处方和工艺。对最佳处方和工艺的重现性考察结果表明, 处方合理, 工艺稳定。但包封率较低, 可能是因为TMZ的水溶性略高于脂溶性, 所以在制备PEG修饰的纳米脂质载体的时候, TMZ更倾向于分布在水相中, 不易被脂质载体包封。
通过冻干制剂复溶后理化性质考察结果表明, 外观呈蓝色混悬液, 包封率从22.98%增高到23.92%, 稍有增大, 分析原因可能是由于冻干制剂复溶后粒径, 比表面积有所增大, 导致纳米脂质载体对游离药物的包封能力增加, 使包封率增大。
本论述采用动态膜透析法比较了TMZ水溶液和TMZ-PEG-NLC体外释放特性。体外释放结果表明, TMZ-PEG-NLC比TMZ水溶液显示出更慢的缓释特性, 这可能PEG纳米脂质载体可起到微贮库作用, 缓慢释放药物。
摘要：目的:制备替莫唑胺长循环纳米脂质载体, 考察其理化性质和体外释放。方法:采用高温乳化-低温固化法制备莫唑胺长循环纳米脂质载体, 超滤离心法测定其包封率和载药量, 通过单因素考察, 分别考察药脂比、液固脂质比、水浴温度、两种固体脂质比、滴加速度、搅拌速度对包封率的影响, 通过正交设计法确定最佳处方。制备冻干制剂, 并进行理化性质的考察和体外释放的研究。结果:根据单因素考察和正交设计得到的最佳处方制备三批莫唑胺长循环纳米脂质载体, 其包封率为22.98%±2.6, 载药量为3.71%±0.16, p H值为5.18±0.34, 电镜照片显示替莫唑胺纳米脂质载体外观呈圆整的球形或类球形实体, 粒径均匀;冻干制剂外观呈白色粉末, 复溶后包封率略有增大, 平均包封率为23.92%±2.6;体外释放显示出缓释效果。结论:采用高温乳化-低温固化法制备替莫唑胺长循环纳米脂质载体方法简单, 冻干制剂稳定, 包封率变化不大, 缓释效果良好。
关键词：替莫唑胺,长循环,纳米脂质载体,体外释放
纳米脂质体的制备 篇2
1材料与方法
(1)称取卵磷脂100 m g、胆固醇20 m g置于15m L离心管中,加入乙醚至刻度10m L,将离心管盖盖紧,将离心管底部放于W H-2微型旋涡混合仪的中心处,微微倾斜离心管,使管中的卵磷脂与胆固醇在旋涡混合仪的作用下完全溶解于乙醚中,溶解所需时间大约为20～30 m in之间。
(2)将溶解均匀的液体置于一圆底旋转烧瓶中,此烧瓶接口大小应与旋转仪接口相吻合,旋紧放气口,将圆底旋转烧瓶倾斜置于水浴锅中,水浴温度为45℃,烧瓶中的液体应低于水浴锅中的水面,转速(50～60)r/m in,每隔8 m in放出气体一次,扭开放气口,一次放气时间大约为3 m in,待乙醚完全挥发,可见一层淡黄色薄膜贴于旋转圆底烧瓶底部,制膜期间需中途放气3次,整个旋转蒸发成膜过程大约需35 m in左右。
(3)从旋转蒸发器上取下烧瓶,用乙醚10 m L溶解干燥薄膜,再加入双蒸水10 m L,花10 m in左右摇匀混合液体,将其倒入100 m L刻度的烧杯中,另取一稍大点的烧杯,放入少许冰块,加入一点水,将装有混合液体的烧杯置于盛有冰水混合物的烧杯中。用75%无水乙醇清洗超声探头,待其自然挥发干后,将探头置于混合液体中央,浸于水中0.5 cm处,超声5 m in(功率30%,间歇30 s);
(4)将超声后的混合物溶液倒入一干净旋转圆底烧瓶中,按照(2)中同样的方法旋转蒸发混合溶液,待35 m in左右旋转蒸发成乳白色的混悬液,即为脂质体溶液。
2结果
用旋转蒸发超声法在45℃水浴温度条件下制备出的纳米脂质体,其形态为圆形,分布比较均匀,粒径为(159.45±13.25)nm,呈弱酸性,用原子力显微镜观察,其二维形貌如图1所示,其三维形貌如图2所示。
在5℃冰箱中存放1个月后仍然比较稳定,其粒径比较结果如图3、图4所示。
3讨论
脂质体作为一种新型的载药系统,越来越受到广泛的重视、应用和研究[3]。脂质体作为药物载体的优势,包括以下几个方面:(1)提高溶解度。对于低溶解度的药物,脂质体是优良的增溶剂。由于脂质材料无毒,还可消除用作增溶的传统辅料的毒性。(2)药物保护,增强稳定性,免于降解。药物包封于脂质体内(特别是位于水相中),就能避免受降解酶、不适宜的pH和生理过程的影响而降解。(3)缓释系统。脂质体释放药物的速度决定于药物的性质、脂质成分、是否存在pH和渗透梯度等。高密度脂蛋白能破坏脂双层而加速药物泄漏。控制以上影响脂质体泄漏的因素,就能控制药物释放速度。改变脂质组成,制成温度、pH或微波敏感脂质体,就能在药物特定的作用部位触发药物的释放。(4)克服多重药物耐受。有证据表明抗肿瘤药物做成脂质体能克服由多药耐药相关蛋白或P-糖蛋白介导的多重药物耐受。(5)改变药物的药代动力学和组织分布。
脂质体作为药物载体的应用虽然具备许多优点。但就目前来看,还存在一定的局限性,因为从脂质体的整个发展过程看,它起初是作为生物膜模型,而后进入药学领域的,因此是涉及相关学科基础理论较多的一项新技术。由于脂质体的表面特性如大小、双层膜流动性、表面电荷等与体内行为有着密切的关系,给制备技术特别是工业化生产带来了一定的难度。而且脂质体在体内主要集中于肝、脾、肾等网状内皮细胞丰富的器官,如欲对其它组织器官进行治疗,则其靶向性不明显。另外,脂质体对某些药物,尤其是某些水溶性药物包封率较低,并且药物极易从脂质体中渗漏。包封率低和稳定性差是脂质体这种新型药剂在实现商品化的过程中仍待解决的问题。
本文开头简单介绍了脂质体的构造,空白脂质体是指囊内没有包裹药物的脂质体,通过实验证明用逆向旋转蒸发超声法制备的空白脂质体粒径均匀、无毒副作用、呈弱酸性、保存时间较长,是一种很好的药物载体。
参考文献
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[2]胡剑均,乔卫红,李宗石.脂质体在药物控释与基因治疗中的应用[D].第7届国际表面活性剂/洗涤剂会议论文集.太原:山西化工出版社,1972:20-23.[2]H U JJ,QIAO W H,LI ZS.Liposom al drug release and the ap-plication of gene therapy[A].Seventh International surfactant/detergent conference proceedings.Taiyuan:Shanxi Chem ical In-dustry Press,1972:20-23.Chinese
阿霉素纳米脂质体的免疫毒性研究 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
BALB/c纯系小鼠6～8周龄,体重16.30～20.08 g,平均17.70 g。雄性。共70只。
1.1.2 主要试剂
阿霉素纳米脂质体标准试剂由中南大学卫生部国家纳米重点实验室提供,平均粒径181.60 nm,包封率79.72%,单剂量1 mg阿霉素/120mg阿霉素纳米脂质体(相当于临床剂量);小鼠IL-1、IL-2、TNF-α、IgG、IgM、IgA、IgE、补体C3、补体C4 ELISA试剂盒;抗小鼠Fas-L抗体(SANTA CRUZ)和SP免疫组化检测试剂盒;MTT(AM-RESCO);RPMI1640细胞培养液(Gibco);小牛血清;刀豆蛋白A(ConA);Hank’s液;PBS缓冲液(pH7.2～7.4)。
1.2 方法
1.2.1 动物的分组及处理
将健康小鼠分为两组,对照组25只,每天腹腔注射0.9%生理盐水0.5 m L,实验组45只,每天腹腔注射阿霉素纳米脂质体(按阿霉素6 mg/(kg·d)给药,连续3 d,每天1次。间隔2周后再连续3d给药。共给药5个周期。5周期后做相关检测。
1.2.2 脾脏指数和胸腺指数
实验观察期结束后实验组和对照组小鼠分别称取体重并取胸腺和脾脏称重,按下列公式计算胸腺指数和脾脏指数:胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)重(g)/体重(g)×100。
1.2.3 淋巴细胞转化实验
无菌制备小鼠脾淋巴细胞,以RPMI-1640完全培养液调节细胞浓度为1×107/m L,实验孔每个样本加两份(各设4个复孔),一份加ConA,一份不加ConA。96孔板中每孔加入100μL细胞悬液,加ConA孔再加入含有ConA的RPMI-1640完全培养液100μL(终浓度ConA 5mg/L),不加ConA孔加入RPMI-1640完全培养液100μL,本底孔只加培养液,一式3孔;于5%二氧化碳、37℃培养箱内培养66 h后,用MTT法测定反应:加入MTT液使终浓度为0.5 g/L,继续培养6 h,加入100μL二甲亚砜裂解液,2 h后于酶标仪570nm处测A值,计算刺激指数SI:刺激指数(SI)=ConA孔A值(4孔平均)/无ConA孔A值(4孔平均)。
1.2.4 脾脏淋巴细胞凋亡相关抗原Fas-L表达改变
该实验选择抗Fas-L抗体标记脾脏,用免疫组化SP法检测阿霉素纳米脂质体用药后Fas-L在脾脏的表达状况。方法和结果如下:脾脏石蜡切片经常规脱蜡水化,PBS浸泡5 min,蛋白酶K(1μg/m L)消化抗原修复5 min,3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性,用正常山羊血清孵育10min消除非特异性背景后滴加稀释的抗Fas-L抗体第一抗体(稀释度1∶200)4℃过夜孵育,PBS冲洗后加生物素化二抗体37℃孵育15 min,PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素复合物37℃孵育15分钟后DAB显色,苏木素复染,逐级脱水,封片,显微镜下观察并计数高倍镜视野下(×400)200个细胞中Fas-L反应阳性细胞所占的百分率。阳性细胞为细胞表面和胞浆中棕褐色色素颗粒沉积。按照试剂盒说明书操作。
1.2.5血清IL-2、IL-1和TNF-α含量测定
均采用ELISA法检测小鼠血清相应蛋白含量。方法按试剂盒说明进行。简述如下:分别设空白孔(不加样品和酶标试剂)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL,待测样品孔先加样品稀释液40μL,然后再加待测样品10μL,封板膜封板后37℃孵育30 min,30倍稀释的洗涤液洗板并重复5次,拍干,每孔加入酶标试剂50μL,37℃孵育30min并洗板(同上),每孔加入显色剂A和B各50μL,震荡混匀,37℃避光显色15min,每孔加入反应终止液50μL,在酶标仪上以空白孔调零,450 nm波长依次测量各孔光密度(OD值)并经仪器调整后直接读出相应浓度,将待测样品孔读数乘以稀释倍数5倍即是样品实际含量。按照试剂盒说明书操作。
1.2.6 血清抗体及补体活性测定
采用ELISA法检测小鼠血清抗体IgE、IgG、IgA、IgM及补体C3、C4活性。按照试剂盒说明书操作。在酶标仪上以空白孔调零,450 nm波长依次测量各孔光密度(OD值)。
1.2.7 巨噬细胞吞噬功能检测
实验选择小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定。于给药第5周期结束2周小鼠腹腔注射10%硫乙醇酸钠2 m L(用RPMI1640培养液配制),96 h后将小鼠处死,按常规方法无菌取腹腔液5 m L,用Hanks液洗2次,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整成1×106/m L细胞悬液。将细胞悬液加入96孔板孔内.每孔100μL,置37℃、5%二氧化碳孵育箱内孵育4 h,去除培养液,每孔加入0.072%中性红溶液200μL继续孵育30min,甩去上清液,用RPMI1640培养液洗3次,加入细胞溶解液(50%乙酸和50%无水乙醇)200μL,4℃过夜将细胞溶解后,酶标仪上波长492 nm测量OD值。
1.2.8 迟发性变态反应检测
(DTH)于给药第5个周期结束后2周用5%SRBC悬液作致敏注射,7d后再用5%SRBC悬液足底皮内注射,对照侧注射生理盐水。48 h后用千分卡尺测量足底部厚度,DTH指数=(试验侧脚掌厚度一对照侧脚掌厚度)/对照侧脚掌厚度×100%。
1.2.9 统计学分析
所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组间数据的比较依据资料的性质,采用t检验或方差分析。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 染毒小鼠的一般状况
从第3轮用药后部分小鼠发生死亡,部分小鼠出现轻度腹泻,体重减轻,余未见异常。于第5个周期用药和观察结束后实验组共死亡12只/45只(剩余33只),死亡率26.67%。因此,实验组25只于观察结束后处死做相关检测,另8只做巨噬细胞功能和迟发性变态反应实验。对照组参加全部实验检测。
2.2 血白细胞和淋巴细胞计数
表1可见阿霉素纳米脂质体可降低小鼠血白细胞和淋巴细胞数量。
注:覮两组比较,P<0.01
2.3 脾脏指数和胸腺指数
表2可见阿霉素纳米脂质体显著降低小鼠胸腺和脾脏指数(P<0.01)。
注:覮两组比较,P<0.01
2.4 脾脏淋巴细胞增殖能力
表3可见阿霉素纳米脂质体显著降低脾脏淋巴细胞对ConA刺激的反应能力。
注:覮两组比较,P<0.01
2.5 脾细胞Fa s-L表达
表4可见阿霉素纳米脂质体用药组脾细胞Fas-L表达与对照组比较明显增强。正常脾脏较少表达Fas-L抗原,当脾细胞凋亡时表达增强。本实验对照组仅见少数Fas-L抗原阳性细胞且阳性反应较弱;实验组可见大量Fas-L抗原阳性细胞和阳性小体(凋亡小体),主要分布在脾索和白髓局部;部分阳性凋亡小体被网状内皮系统或单核/巨噬细胞吞噬(图1、2)。
注:两组比较,P<0.01
2.6 血清IL-1、IL-2和TNF-α含量测定
表5可见阿霉素纳米脂质体对小鼠血淋巴因子IL-1和IL-2产生具有显著抑制作用;而对血TNF-α含量无明显影响(P>0.05)。
注:覮两组比较,P<0.01
2.7 血清抗体IgG、IgA、IgM和IgE活性
表6可见阿霉素纳米脂质体对小鼠血IgG、I-g A、IgM和IgE活性具有显著抑制效应。
注:覮两组比较,P<0.01
2.8 血清补体C3和C4活性
表7可见阿霉素纳米脂质体对小鼠血补体C3和C4活性具有显著抑制效应。
注:覮两组比较,P<0.01
2.9 巨噬细胞吞噬功能
表8可见阿霉素纳米脂质体对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能具有抑制作用。
注:覮两组比较,P<0.01
2.9.1 迟发性变态反应表9可见实验组小鼠迟发性变态反应明显降低。
注:覮两组比较,P<0.01
2.9.2 淋巴器官和主要脏器病理改变
胸腺:实验组胸腺皮质变薄,淋巴细胞减少,髓质加宽,充血,胸腺小体增多伴钙化。对照组未见明显异常。脾脏:实验组白髓淋巴索变窄,淋巴小结数量减少,淋巴细胞密度减低,红髓加宽,充血,含铁血黄素明显增多,间质轻度增生。对照组未见明显异常(图3、4)。心脏:实验组、对照组均未见明显异常。肝脏:实验组部分肝细胞轻度空泡变性,余未见异常。对照组未见明显异常。肾脏:实验组部分肾近曲小管上皮细胞空泡变性,余未见明显异常。对照组未见明显异常。肺脏:实验组和对照组均未见明显异常。脑组织:实验组和对照组均未见明显异常。胃组织:实验组和对照组均未见明显异常。睾丸和附睾:实验组和对照组均未见明显异常。眼睛:实验组和对照组均未见明显异常。
3 讨论
阿霉素是一种抗瘤谱广、疗效好,对多种肿瘤有效的蒽环类抗癌药物。然而该药在杀伤肿瘤细胞的同时,也产生严重的不良反应,如心脏损害、骨髓抑制等,严重影响生活质量。人们一直在寻找减少阿霉素副作用的方法。基础及临床研究均表明用脂质体包裹阿霉素可以产生很好的效果。KESTERSON等[6,7]对42名妇科恶性肿瘤患者应用脂质体阿霉素进行治疗,累积剂量大于400 mg/m2没有发现明显的心脏毒性。纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题,纳米药物载体是其在医药领域的研究成果[8]。纳米药物载体是指粒径在10～1 000 nm的一类新型载体,通常由天然或合成高分子材料制成。其主要优点是提高药物的吸收度和稳定性,改善药物性质和靶向性,延长药物作用时间,减毒增效等。而纳米脂质体是纳米药物载体的一种,其粒径控制在100 nm左右,并用亲水性材料进行表面修饰,在静脉注射后,兼具长循环和隐形或立体稳定的特点,对减少肝脏巨噬细胞对药物的吞噬、提高药物靶向性、阻碍血液蛋白质成分与磷脂等的结合、延长体内循环时间等具有重要作用[5]。而且纳米粒子将使药物在体内的传输更为方便,可以通过肿瘤的给养血管完整地渗透出来[4]。为了进一步提高阿霉素的疗效,减少毒副作用,本组用纳米脂质体包裹阿霉素,并探讨其对小鼠的免疫毒性。
笔者观察了阿霉素纳米脂质体对小鼠非特异性免疫和特异性免疫功能的影响。结果发现,给药组白细胞和淋巴细胞数量,脾脏淋巴细胞刺激指数、迟发性变态反应指数、血清IL-1、IL-2含量、抗体(IgG、IgA、IgM、IgE)活性、补体C3、C4活性、巨噬细胞吞噬功能等均呈现不同程度的降低。笔者同时检测了小鼠胸腺和脾脏等免疫器官重量,发现该药物可减少脾脏及胸腺指数;脾脏淋巴细胞细胞凋亡相关抗原Fas-L表达与对照组相比明显增强,这可能是免疫器官萎缩及整体免疫功能降低的主要原因之一。
T淋巴细胞在受到特异性抗原(如植物血凝素和刀豆素A等)刺激后,细胞的代谢和形态发生变化,转化为淋巴母细胞,转化率在一定程度上反映细胞免疫功能;迟发型超敏反应试验是检测细胞免疫功能的一种常用方法,它依赖于T淋巴细胞的反应,其主要特征是致敏机体在抗原攻击部位出现迟发型炎症反应[9]。实验结果显示脾脏淋巴细胞刺激指数、小鼠足跖厚度差均降低,T细胞分泌的淋巴因子IL-2含量也降低,提示T淋巴细胞活化发生障碍。体液免疫功能正常与否直接与B淋巴细胞密切相关,而抗体主要由B淋巴细胞转化的浆细胞产生,而补体是抗体发挥作用的必要补充条件。直接测定血清抗体及补体活性可反映机体的体液免疫功能[10]。实验检测到抗体及补体活性均下降,说明阿霉素纳米脂质体可致小鼠体液免疫功能下降。巨噬细胞是免疫反应的重要参与者,不仅担负着机体的非特异性防御功能,而且可分泌具有不同生物学活性的因子,参与抗感染、抗肿瘤、调节免疫应答等。本实验结果表明阿霉素纳米脂质体组小鼠巨噬细胞的吞噬功能明显下降,分泌的细胞因子IL-1含量也降低,说明阿霉素纳米脂质体会造成小鼠非特异性免疫功能的损伤。体内TNF-α主要来源于巨噬细胞,实验发现TNF-α含量并未见明显变化,可能是因为TNF-α产生有多种途径,不能完全反映巨噬细胞功能。
综上所述,小鼠腹腔注射阿霉素纳米脂质体(剂量6 mg/kg)每天1次,连续3d,每隔两周反复注射,连续5个周期对小鼠的非特异性免疫和特异性免疫功能产生抑制作用,其机制有待进一步研究。
摘要：目的 探讨阿霉素纳米脂质体对实验小鼠的免疫毒性作用。方法 小鼠经腹腔注射阿霉素纳米脂质体(按阿霉素有效治疗量6 mg/kg给药),注射5个周期后取血做血常规测定白细胞含量,测定免疫器官脏体比,淋巴细胞转化实验测刺激指数,免疫组化法检测脾脏细胞凋亡,ELISA法测IL-2、IL-1及TNF-α细胞因子含量,抗体及补体活性,选择测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能,测定迟发性超敏反应,常规病理观察主要脏器改变。结果 阿霉素纳米脂质体实验组白细胞和淋巴细胞数量、胸腺和脾脏指数、脾脏淋巴细胞刺激指数、血清IL-1、IL-2含量、抗体(IgG、IgA、IgM和IgE)活性、补体C3、C4活性、巨噬细胞吞噬功能及迟发性变态反应均降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);实验组脾细胞Fas-L表达与对照组比较明显增强,细胞凋亡增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。实验组胸腺及脾脏淋巴细胞均明显减少,对照组未见明显异常。而阿霉素纳米脂质体实验组TNF-α含量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);结论 阿霉素纳米脂质体对小鼠具有免疫毒性作用。
关键词：阿霉素纳米脂质体,小鼠,免疫毒性
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纳米脂质 篇4
柔性纳米脂质体作为载体，介导经皮渗透给药可避免肝脏首过效应[3,4,5]，且药物吸收不经胃肠道，同时能长时间持续扩散进入血液循环，减少用药次数，改善患者用药顺应性，提高治疗效果，是一种理想的剂型选择[6,7]。本文对苯磺酸氨氯地平柔性纳米脂质体(AM-FNL)的冻干工艺进行优化，探讨不同条件的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器
紫外可见分光光度计(美国Biogate公司);RE-52旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂);WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);超声破碎乳化仪;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂);AUW120D电子天平;Zetasizer激光粒度分析仪(英国马尔文公司);HP-01抽滤仪;低速冷冻离心机(广州吉瑞);恒温磁力搅拌器(TH2-82A上海);pH值测定仪(PB-10);冷冻干燥机(LAB-CONCO);600三用水箱。
1.2 试剂
磷脂(美国AVANTI POLAR LIPIDS INC)、胆固醇(天津博迪化工有限公司)、维生素E(德国BASF公司)、苯磺酸氨氯地平原料药(常州瑞明药业有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 苯璜酸氨氯地平冻干脂质体的制备方法称取处方量的磷脂、胆固醇、维生素E、苯璜酸氨氯地平溶于适量的氯仿中，所得类脂溶液与磷酸缓冲液混匀超声，抽真空除去氯仿，得到乳白色胶体液，加入冻干保护剂，依次过0.45μm和0.22μm微孔滤膜后，冷冻干燥即得苯璜酸氨氯地平冻干脂质体。1.3.2冷冻干燥工艺的单因素考察针对液体脂质体易缓慢发生水解、易聚沉、不稳定的特点，本文采用冷冻干燥技术制备苯璜酸氨氯地平冻干脂质体以解决此问题。冷冻干燥(freeze-drying)，简称“冻干”，系将药物溶液或混悬液在体系共熔点以下预冻成固体，然后在低温真空的条件下，从冻结状态不经过液体而直接升华除去水分的一种干燥方式。冻干后的脂质体和主药的稳定性都得到了保证。冻干过程一般分为三个过程:预冻、升华干燥、解吸干燥，冻干过程的每一步骤中均有重要因素影响到冷冻干燥的效果和冻干产品的质量，本文就预冻方式、预冻速度、预冻时间、冻干保护剂、水化方式等进行了单因素的考察。
1.3.3 苯璜酸氨氯地平冻干脂质体的理化性质考察采用透射电镜观察苯璜酸氨氯地平脂质体的形态、粒径，采用激光动态散射仪检测苯璜酸氨氯地平脂质体的粒径、粒径分布以及Zeta电位。
2 结果
2.1 预冻方式的考察
对于容易结晶的样品来说，预冻温度应低于药液的最低共融点温度，否则样品冻结不实，会引起干燥过程中药液喷瓶。此外，预冻温度在玻璃化温度以下，以实现样品的玻璃化，可以得到无定形产品，重建容易且保护微观粒子。本文考察了两种方式预冻:冰箱预冻(-18℃)和冻干机冷阱预冻(-47℃)，考察不同预冻方式对产品质量的影响。结果见表1。预冻方式对冻干产品质量有很大影响，应选择在冷阱中即较低的温度下预冻。
2.2 预冻速度的考察
预冻速度即样品降温速度，是冷冻过程中一个非常重要的参数，对产品的质量有很重要的影响.本文将样品进行慢冻(样品放入冷阱后开始降温)、速冻(冷阱温度降至最低后将样品放入)后干燥，考察预冻速度对产品外观的影响，结果见表2。结果表明所得产品的外观并没有显著差别，这是由于机器快冻和慢冻的降温速率相差并不多，但慢冻有少量药物结晶，速冻则无，因此选择速冻方式。
2.3 冻干保护剂的加入方式
保护剂需要在脂质体的内外膜中均存在一定浓度，才能起到足够的保护作用。如果保护剂只存在于膜内或膜外，则无法起到足够的保护作用。本文以内加(在脂质体制备中将保护剂加入到水相介质中)和外加(保护剂溶液加至已制备好的脂质体液中)两种方式考察对冻干产品的影响，结果见表3。结果表明，内加和外加两种方式对冻干产品的外形影响不大，但内加方式的包封率降低，可能是保护剂与磷脂的相互作用，使部分被包裹的药物发生渗漏，因此本文选择以外加的方式加入冻干保护剂。
2.4 甘露醇量的考察
将磷脂与甘露醇质量比1∶1,1.0∶1.5,1∶2外加，考察甘露醇的量对冻干产品的保护作用，结果见表4。当磷脂与甘露醇的质量比为1.0∶1.5时，冻干产品的外观平整光滑，当甘露醇的量再增加时，外观并没有显著改善。
2.5 苯璜酸氨氯地平冻干脂质体的理化性质
室温(20℃)条件下，分别测定冻干前和冻干水化后脂质体的粒径和粒子分布，结果表明，冻干前后粒子均较小，均在50～150 nm之间。冻干前，平均粒径为115.1 nm，冻干后，粒度分布呈现单峰，平均粒径为83.2 nm。可见，冻干后，粒子分布更均匀，稳定性增加。
室温(25℃)条件下，取苯璜酸氨氯地平脂质体混悬液适量加水稀释到一定浓度，加入到用校正液校正后的Zeta电位分析仪的样品池中，测定Zeta电位。分别测定了苯璜酸氨氯地平脂质体混悬液和冻干产品制剂再分散后的Zeta电位，结果表明，制得的苯璜酸氨氯地平脂质体表面荷负电，冻干后其Zeta电位绝对值有所增加，分别为(-22.1±-5.27)m V和(-29.3±-4.61)m V，说明冻干后脂质体的稳定性有所增加。
4 讨论
预冻速度即样品降温速度，是冷冻过程中一个非常重要的参数，对产品的质量有重要的影响[8]。足够快的冷却速度，可以使样品最大程度地实现玻璃化，以减小冷冻过程冰晶对脂质体膜的破坏。在实际应用中，样品应最大程度地实现玻璃化;不能实现玻璃化的部分样品，最好以小结晶存在，因为小结晶与大结晶相比对膜的机械破坏作用小些。快速降温的冰晶比较细腻，有利于水蒸气的逸出[9]，不仅能更好地保持粒子重建后的结构完整，还能缩短冻干时间。
由于冻干时需加入甘露醇作为保护剂，考察内加和外加的方式对冻干产品包封率的影响，结果表明，采用外加冻干保护剂的方式，冻干后的脂质体包封率较高。这可能是因为外加时的内外水相的保护剂分布情况更有利于保护作用的发挥。
本文采用较简单的方法对冻干工艺和处方进行了优化。一个良好的脂质体冻干产品，不仅外观饱满致密，而且应保持冻干前各项理化性质，包括粒子形态和粒子大小，水化容易程度、包封率等。对于粒子形态和大小，可采用显微镜下观察、纳米粒径仪检测粒径的方法。显微镜法虽不能测出粒子的具体大小，但是就观察比较粒径的变化来初步筛选冻干处方而言，是完全可行的。因此在初步筛选处方时，采用了冻干产品的外形、显微镜下的粒子形态等为主要考察指标，方法简单快速且可行。
Zeta电位为评价脂质体稳定性的重要指标，因为荷电的脂质体能够减少相互间的聚集和融合，增加稳定性，而Zeta电位可以衡量电荷的多少。当Zeta电位大于60 m V时，荷电粒子相当稳定;Zeta电位在30～60 m V时，荷电粒子比较稳定;Zeta电位小于30 m V时，荷电粒子较不稳定，容易聚集。测得苯璜酸氨氯地平脂质体冻干前后的Zeta电位分别为(-22.1±-5.27)m V和(-29.3±-4.61)m V，说明冻干有利于增加脂质体的稳定性。
摘要：目的探讨苯磺酸氨氯地平柔性纳米脂质体的冻干工艺。方法采用薄膜-超声法制备苯磺酸氨氯地平柔性纳米脂质体,透射电镜和激光粒度分析仪观察苯璜酸氨氯地平脂质体的形态、粒径。结果应选择在较低的温度下预冻;慢冻有少量药物结晶,速冻则无;与外加方式比较,保护剂内加使包封率降低。结论经优选得到的苯磺酸氨氯地平柔性纳米脂质体冻干工艺,性能稳定可靠。
关键词：柔性纳米脂质体,苯磺酸氨氯地平,冻干工艺
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纳米脂质 篇5
1 Materials and methods
1.1 Materials
Doxorubicin hydrochloride was obtained from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products(Beijing,China).Egg phosphatidylcholine,cholesterol,tween-80 and ethanol were purchased from Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd(Shanghai,China).Dialysis membrane was bought from Sigma(Shanghai,China).Other reagents were commonly used in the laboratory,and al chemicals were of analytical grade.
1.2 Methods
1.2.1 Preparation
The doxorubicin nanoliposomes were produced using aseptic(filter-sterilized and endotoxin-free solutions,endotoxin units/mL as measure with Limulus test).Doxorubicin hydrochloride were dissolved in citric acid solution(0.075mol/L)which is 55℃at a thermostated reaction vessel.Egg phosphatidylcholine and cholesterol(the ratio is 0.67:0.33,w/w)were dissolved in absolute ethanol containing some Vit-E and tween-80,addition of ethanol to lipid can result in an increase ion permeability[12,13].The lipid solution was rapidly injected using a syringe as a pump into doxorubicin solution,and the ratio of doxorubicin solution to lipid solution is 0.15∶1(w/w).Then the solution was stirred for 15 mins with the nitrogen pumped15 mins later,the solution was adjusted to pH7.0then stirred for 15 mins again to volatilize the ethanol.Finally,the fresh prepared liposomes were lyophilized in the presence of cryoprotectant.
1.2.2 Characterization of DHNP
Small diameters will decrease the rate of liposome clearance from plasma[14],it also can reduce its uptake in to the RES[15].Meanwhile,the most important parameter defining surface properties of electrostatically stabilized solids in aqueous solutions is the zetapotentia value.The mean diameter and zetapotential of the DHNPweremeasuredbyzetasizer(ZEN3600Malvern).
1.2.3 Determination of encapsulation efficiency and drug loading rates
Liposome encapsulation efficiency(EE)was determined by the dialysis technique[16,17].According to this method,0.1 g of DHNP lyophilized powder was dissolved into 10 m L phosphate buffer solution,then it was put into a cellulose acetate dialysis bag immersed in a closed vessel containing 100 m L phosphate buffer solution a4℃.Samples withdrawn at given time intervals from the receiver solution,were replaced with equal volumes of fresh solvent.The samples were spectrometrically assayed at 478 nm(UV-1601 Shimadzu Japan).The experiment was stopped when constant absorbance values were obtained in subsequent withdrawals from the receiver phase.The percent of encapsulation efficiency(EE%)and drug loading rate were calculated according to the following equation:EE%=(total drug?diffused drug)/total drug×100%,loading drug rate=(total drug?diffused drug)/DHNP,each result is the mean of three separate experiments.
1.2.4 Stability Studies of DHNP
Liposome stability is an important factor which greatly limits its application in clinic[18].To determine the stability of doxorubicin nanoliposomes,the lyophilized DHNP liposome powder was seperately stored in air tight sealed vials at 4～5℃and room temperatures(25℃).The lyophilized DHNP powder was sampled at regular intervals of 0,1,2,3 and 6 months and tested for the following qualities of each temperature group:(1)change of the color,(2)diameter of particles and encapsulation efficiency,(3)redispersibility.
1.2.5 Acute toxicity of DHNP in mice
100male healthy Kunming mice(obtained from Laboratory Animal Center of Central South University),weighing 18～22 g,were randomly divided into five groups for DHNP administration by tail vein injection.They were maintained at room temperature with a photoperiod of 12 h,and frequent changes,mice had free access to water and feed.DHNP were dissolved in 5%glucose solution and filtered by 0.22μm filter.The five groups were respectively received dose of 24.50 mg/kg,27.10 mg/kg,30.00mg/kg,33.17 mg/kg and 36.70 mg/kg(Dox=DHNP*Loading drug rates)DHNP.After DHNP administration,the animals were continuously observed for general behavioral changes,signs of toxicity and mortality for 1 h after treatment,then intermittently for 4 h,and thereafter over a period of 24 h,the mice were further observed for up to 7 days for behavioral changes and toxicity signs.The median lethal dose(LD50)and 95%confidence interval was calculated by Bliss method.The experiment was approved by the Ethics Committee of Central South University(Changsha,China).
1.2.6 Chronic toxicity of DHNP
80 healthy Kunming mice were randomly assigned into four groups(ten males,ten females),and their weights were recorded.The three experiment groups were respectively received 3,6 and 9 mg of DHNP per kilogram of body weight,while the control group was given glucose solution at a concentration o5%.All the mice administrated by intraperitonea injection biweekly.The deviations in normal behavior,movement and mortality,as well as the body weight changes of mice were recorded weekly over12 weeks.
On the 84th day,all surviving animals were fasted overnight,and anesthetized afterwards for blood collection from the retroorbital vein.The blood was used for hematological determination which included white blood cell counts(WBC),lymphocyte counts(LY),monocyte counts(MO),red blood cells(RBC),hemoglobin concentration(Hgb),hematocrit(Hct),platelets(PLT),neutrophile granulocyte(NEU),eosinophilic granulocyte(EOS),and basophilic granulocyte(BASO).
Immediately after collecting the blood samples vascular perfusion was performed for tissue fixation with isotonic saline followed by treatment with 10%formalin solution.The organs including liver,lung kidney,spleen,brain,heart,paranephros and ovaries were removed and weighted immediately for subsequent analysis.The pathological observations o tissues were performed on gross and microscopic base.
1.2.7 Statistical analysis
Statistical analysis involved the use of the Statistical Package for Socia Sciences(SPSS)version 15,data are expressed as the(x±s)Significant differences between the control and treatments groups were determined using Paired-Sample t test and P<0.05 was considered significant.
2 Results
2.1 Characterization of DHNP
Dynamic light scattering(DLS)technique is widely used to characterize the size of the nanoparticles.Figure 1 shows the particle size distribution of the DHNP,and figure 2 shows the zeta potential distribution of DHNP.The results showed the z-average diameter of DHNP was 140.7 nm,and the mean zeta potential was-31.9 m V.According to the dialysis technique method,the EE of DHNP reached 99.85%,the loading drug rates was 9.85%.
2.2 Stability studies of DHNP
In the stability study,the DHNP lyophilized powder was found to be more stable at 4℃than at25℃.The results showed that the EE and the particle size had no significant change at 4℃in 6months,but at 25℃,the EE reduced greatly from99.86%to 77.25%,and the particle size increased from 140.7 nm to 192.1 nm.Even worse,the redispersibility of lyophilized powder preserved at 25℃for 6 months was not very well,there was a little sediment in the solution.While when the 4℃preserved lyophilized powder was redispersed,no sediment was found and it was dispersed uniformly.In general,low temperature is good to preserve lyophilized liposomes powder.
2.3 Acute toxicity of DHNP in mice
The result showed there was a dose-dependen increase in mortality.No death was found in the24.50 mg/kg group,while in the 27.10,30.0033.17 and 36.70 mg/kg groups,there were respectively 3,8,11,20 rats dead.Adverse effects,such as hyperspasmia,trembling and eclampsia were observed except in the 24.50 mg/kg group.It was found the maximum tolerated dose was 36.70 mg/kg and the calculated LD50 was 31.69 mg/kg body weight(95%confidence intervals:23.17～35.58mg/kg).
2.4 Chronic toxicity of DHNP
2.4.1 Body weight
Changes in body weight o the control group and the DHNP-treated groups are presented in table 1 and table 2.It was found the male and female rats in high dose group had significantly lower mean body weight compared with that of the control group(P<0.05)since two weeks in the medium dose group,significant difference o male rats was found after seven weeks,while significant difference of female rats was found after four weeks;there was no significant difference in the low dose group both of the male and female rats.
Note:覮compared with control group,P<0.05.
Note:覮compared with control group,P<0.05.
2.5 Effect on hematological and biochemical parameters
The effects of DHNP on the hematological parameters of the experimental and the control rats are presented in Table 3.Compared with the control group,the platelets counts of the high,medium and low dose groups had statistical significant difference(P<0.05).The hematocrit,mean red blood cell volume and eosinophilic granulocytes of the high,medium groups showed significant difference(P<0.05)compared with the control group,while other indexes had no obvious difference.
Note:SD rats(n=20 per group)were intraperitoneally injected with DHNP biweekly at doses of 0,3,6 and 9 mg/kg for up to 30days.RBC:red blood cell;HGB:hemoglobin concentration;Hct:hematocrit;MRV:mean red blood cell volume;MHC:mean hemoglobin concentration;PLT:platelets;WBC:white blood cell;LY:lymphocyte;MO:monocyte;MCV:mean corpuscular volume;NEU:neutrophilc granulocyte;EOS:eosinophilic granulocyte;BASO:basophilic granulocyte.
2.6 Tissue analysis
According to the macroscopic observation,the tissues on a gross basis appeared no detectable abnormalities.In the microscopic examination,it was found the alveolar interval in the lungs was obviously wider in the treated group and the pathological degree of interstitial edema and inflammatory cells increased as the dose increased.No other pathological changes were detected in other tissues.
3 Discussions
DOX is a faintly acidic and solubile drug while the ethanol injection loading method is no very good to entrap hydrophilic drugs[19].In our experiment,we combined ethanol injection method and pH gradient method,the pH gradient method can increase the encapsulation efficiency of DHNP[20],it also can reduce the rate of drug leakage from the liposomes[21].Its mechanism is that some weak acid weak base and neutral molecules can pass through the phospholipids bilayer while the ionization form cannot pass through lipid membrane.In our study we used 0.3 mol/L(pH≈4.0)of citric acid solution as internal aqueous phase,so the DOX existed with the form of DOX.H+ions in the inner of liposomes.And then the pH of external aqueous phase was adjusted to 8 by sodium carbonate solution,so the DOX of external phase existed with the form of molecular types.In the preparation of DHNP,the DOX of external phase can pass through the phospholipid bilayer while the DOX of internal phase can't pass through the membrane[20,21,22,23].According to this method,the EE reached 99.85%,and the drug loading rates reached 9.83%.
Median lethal dose(LD50)is an important parameter to evaluate the toxicity,safety and quality of the drug.Now there are a lot of methods to determine the LD50,such as visual probability unit method,bliss method,Karber's method,sequential method and so on.In our experiment,the Bliss method was used to determine the LD50,and the LD50 was 31.69 mg/kg,higher than that of DOX injection which was only 17 mg/kg[24].The result showed the DHNP prepared by us was safer than free Dox.In the chronic toxicity experiment,compared with the control group,there were significan differences in the body weights,platelets counts hematocrit,mean red blood cell volume,eosinophilic granulocyte of the 9,6 mg/kg treated groups.According to the pathological analysis of tissues pathological change was not founded in any tissue except in the lungs.
In a word,this study provides a new preparation method(ethanol injection-pH gradient methods for doxorubicin nanoliposomes,by which the EE and drug loading rates can reach 99.85%and9.83%,respectively.The diameter range of DHNP is in nanometers,this will contribute it to target tissues and increase its retention time in plasma And the results of acute and chronic toxicity experiments also show good safety compared with free doxorubicin.
摘要：目的 制备阿霉素纳米脂质体,并研究其急性毒性和慢性毒性。方法 通过乙醇注入法结合pH梯度法,制备阿霉素纳米脂质体,并通过粒径仪测定其物理化学性质。阿霉素纳米脂质体的长期毒性和慢性毒性则通过昆明小鼠实验进行评价。结果 通过该方法制备的阿霉素纳米脂质体粒径为140～170 nm,包封率高达99.85%。急性毒性实验表明,阿霉素纳米脂质体的LD50为31.69 mg/kg,病理结果提示,阿霉素纳米脂质体在0 mg/kg和6 mg/kg的剂量下未对小鼠各脏器产生明显的毒性;12 mg/kg及以上剂量,对小鼠心、肺及肝组织都有一定的毒性,且与剂量大小相关;18 mg/kg及更低的剂量下,未见其对小鼠肾脾组织有明显毒性。慢性毒性实验中,与空白对照组比较,6 mg/kg和9 mg/kg剂量组小鼠体质量、RBC压积、平均RBC体积、PLT计数和嗜酸性粒细胞百分数及尿素氮含量(BUN)有显著影响(P<0.05)。结论 该方法制备的阿霉素纳米脂质体质量稳定,且对动物的毒性具有剂量依赖性。
纳米脂质 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
所选48例患者为2012年3月至2013年2月我院皮肤科门诊治疗患者,其中治疗组24例,男性13例,女性11例;对照组24例,男12例,女性12例;两组患者年龄最小23岁,最大77岁,病程5个月～3年,入选患者皮损程度总积分<8;皮损总面积不超过体表面积的10%。经统计学处理,两组病例性别、年龄、病程及治疗前病情无显著性差异,两组具有可比性,入院前1个月均未经抗组胺药、激素药物等皮肤科治疗。
1.2 治疗方法
所有门诊患者治疗前进行血液常规,生化检查,排除其他内科疾病,实验组采用甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶,对照组采用丁酸氢化可的松软膏,两组患者均每日早、晚各1次,用药前用温水清洗患处,将药涂于患处,涂抹均匀,治疗2周。治疗期间停用其他内服及外用治疗该类疾病的相关药物,避免使用碱性洗涤剂及其他外用擦剂,忌食辛辣油腻食物。
1.3 观察指标及评分标准[2]
治疗2周后对患者进行疗效评价,治疗前后分别进行临床疗效评价并记录不良反应。根据1998年Chairil及Hallifm等提出的湿疹面积、瘙痒程度及疗效指数评分法进行评分,
(1)瘙痒评分0分=无任何瘙痒;1分=偶尔瘙痒,不用药,不影响学习生活;2分=阵发性瘙痒,时轻时重,影响睡眠学习生活,需用药;3分=剧烈瘙痒,严重影响工作学习生活。
(2)湿疹面积用患者手掌为1%估算,比较两组患者用药前后湿疹面积的变化。
(3)疗效指数(%)=(治疗前积分一治疗后积分)/治疗前积分×100%。痊愈:疗效指数>90%;显效:疗效指数60%～89%;好转:疗效指数20%～59%;无效:疗效指数<20%;有效率(%)=(痊愈例数+显效例数)/本组病例总数×100%。
1.4 统计学处理
所有数据输入计算机,使用SPSS15.0统计软件对数据进行分析,计数资料采用卡方检验,P<0.05代表差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 患者治疗2周后比较两组患者平均皮疹面积和瘙痒程度,见表1。
2.2 患者治疗2周后比较两组患者的疗效指数和有效率,见表2。
3 讨论
目前临床上治疗湿疹主要为对症治疗,包括外用或系统使用糖皮质激素、外用钙调神经磷酸酶抑制剂、口服抗组胺药物、系统使用免疫调节剂、免疫抑制剂等[3]。其中,糖皮质激素已成为皮肤科领域应用最广泛的药物之一,但此类药物大多数渗透性差、疗效欠佳,全身给药时临床副作用明显等缺点[4,5]。
在本次试验研究中,共有患者48例,经过2周外用甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶和丁酸氢化可的松软膏对比治疗后,实验组有效率为70.83%。对照组有效率为62.50%,实验组的有效率高于对照组。其中甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶用后2-3天,患者瘙痒程度,皮疹面积逐渐减轻,而用丁酸氢化可的松软膏的患者,临床症状减轻慢,说明用甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶治疗湿疹,起效快,疗效明显。外用脂质体其特有的优越性主要表现为一下几点:(1)能在皮肤局部能保持较高的药物浓度,不像口服或注射性药物,引起全身反应。(2)脂质体在皮肤表面形成一个相对封闭、湿润的外壳,可以减少水分的流失。(3)能在皮肤表面保持较高的药物浓度,减少吸收入血的药物量,增强药物作用时间,减少给药次数。(4)起到持续释放的作用,同时减少药物的入血量。从而增强局部治疗效果,减少不良反应,增加患者顺应性。随着新的检测手段的应用,脂质体促进透皮机制会更加明确,加之新型合成材料的不断涌现、新的制备方法广泛应用,相信不久的将来会有各种优良的稳定性好的外用脂质体制剂问世。
本试验结果表明,甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶在治疗湿疹中,2周临床有效率高达70.83%,可明显减轻患者的湿疹面积和瘙痒程度,改善患者的生存质量,由于为外用药,具有安全、不良反应少等优点,值得临床推广。
摘要：目的 探讨甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶治疗湿疹的临床疗效观察。方法 选取我院选择2012年3月至2013年2月期间在我院门诊疗的湿疹患者48例,分为实验组和对照组;对照组予丁酸氢化可的松软膏,试验组采用甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶治疗,对两组病人治疗前和治疗后进行临床评估和疗效评定,结果 治疗2周后对两组患者进行临床效果评估,试验组临床治疗有效率显高于对照组两组数据差异均具有统计学意义,P<0.05。结论 甲氨蝶呤柔性纳米脂质体凝胶治疗湿疹具有更好的改善临床症状减小皮疹面积和瘙痒程度。
关键词：甲氨蝶呤,柔性纳米脂质体凝胶,湿疹
参考文献
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[4]刘永生,马琳,尤立平,等.特应性皮炎皮损微生物与外用药对比治疗研究[J].中华皮肤科杂志,2002,35(6):472-474
纳米脂质 篇7
研究发现,药物包封于脂质体内后,对溶解性的增加、半衰期的延长,靶向性的提高,用药剂量的降低,不良反应的减少起到明显的改善作用[6]。盐酸多柔比星脂质体[7]、长春新碱脂质体[8]、紫杉醇脂质体等[9]的实验室研究结果均证实,药物包封于脂质体内以后,在不同程度上延长了药物在血液中的循环时间,并增强了其抗肿瘤的效果,并能有效减轻不良反应。另外,一些抗肿瘤的药物以脂质体包载后的Ⅰ期和Ⅱ期临床研究试验[10,11]也表明,抗癌药物制备成脂质体形式并不会引起不良反应的增加。经修饰后长循环纳米脂质体通过粒径控制能够达到被动靶向的效果[12],不易被MPS的巨噬细胞识别吞噬,降低药物的体内消除速度[13],延长药物在体内的作用时间,达到持久稳定释药的目的[14],极大地增强长循环纳米脂质体的稳定性[15,16],提高药物的生物利用度,具有靶向性和长效性等优点[17,18]。
通过工艺优化选择,以乙醇注入法制备,奥沙利铂∶天然大豆磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇(2 000)为1∶2∶1∶1,搅拌时长40 min的药物样品作为MTT实验药物样品,以奥沙利铂标准品作为阳性对照组药品,检测其对SW480结肠癌细胞株的毒性作用,并验证其长效性和缓控释作用。
1 材料和方法
1.1 实验仪器与耗品
奥沙利铂标准品购自中国药品生物制品检查所;胆固醇,天然大豆磷脂,聚乙二醇(2 000)购自国药集团化学试剂有限公司;Coster 96孔板,细胞株选用的SW480细胞株,中南大学肝胆肠研究中心馈赠;使用的仪器主要有Dataplate磁力搅拌器;Thermo酶标仪;高速离心机(Sigma);Malvern纳米粒度及电位分析仪;Branson水浴超声分散仪;JJ-1型增力电动搅拌仪;倒置荧光显微镜(Nikon);Shimadzu液相色谱仪等。
1.2 实验方法与步骤
1.2.1 奥沙利铂长循环纳米脂质体的制备
室温25℃条件下,称取大豆磷脂、胆固醇、聚乙二醇(2 000)充分溶解于10 m L无水乙醇中,超声3 min,超声频率50 kHz,0.2μm的滤膜过滤后,5 m L无菌注射器吸取溶解好的无水乙醇溶液,缓慢注入含30 m L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)的三嘴烧瓶中,55℃恒温水浴加热,搅拌速度200 r/min,注入速度5 s/滴。奥沙利铂∶天然大豆磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇(2 000)的比例为1∶2∶1∶1,搅拌时长40 min时取3 m L样品经0.2μm微孔滤膜过滤后保存。
1.2.2 实验分组及细胞转染
当细胞长满板底70%时加入用不含血清的培养基溶液,润洗细胞3次,每孔给药50μL,设奥沙利铂长循环纳米脂质体药品组,未加细胞只有培养基为空白组,含细胞和培养基为阴性对照组,奥沙利铂标准品为阳性对照组,药品组和阳性对照组的给药浓度分别为25、50、75、100、125和150μg/m L。每个药物浓度设定3个复孔,轻轻摇晃,使药物能够均匀完全覆盖细胞表面,培养条件:37℃,5%CO2,每间隔12 h分别吸取细胞上清液50μL用于测定,每次取样后补充适量的培养液。
1.2.3 检测与分析
精确称取MTT 5.0 g,溶于1 000m L磷酸缓冲液中(pH 6.0),0.22μm微孔滤膜过滤,在96孔板的每孔加5 mg/m L浓度的MTT溶液20μL,继续孵育4 h后终止培养,小心吸弃孔内培养的上清液,每孔加150μL的DMSO后,振荡10min混匀,使其中的结晶物充分溶解,酶标仪测定96孔板上各孔的吸光度,波长选择为454 nm,阴性对照孔组OD平均值如果低于0.05,就按0.05计算,高于0.05则以实际OD值为准,以时间为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制细胞的生长曲线,计算出其IC50值,lg IC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4],其中,Xm为lg最大剂量,I则是lg(最大剂量/相临剂量),P等于阳性反应率之和,而Pm与Pn分别代表最大阳性反应率和最小阳性反应率。
2 结果
2.1 奥沙利铂脂质体对细胞抑制率的影响
通过优化选择后,奥沙利铂∶天然大豆磷脂∶胆固醇∶聚乙二醇(2 000)为1∶2∶1∶1,搅拌时长40 min的药物样品作为MTT实验药物样品,以奥沙利铂标准品作为阳性对照组药品。MTT实验中,药物样品的抑制率见表1,浓度在100μg/m L以上的3个组别,在72 h时抑制率能达到90%以上,而150μg/m L组在72 h的抑制率达到了97.2%。
2.2 奥沙利铂标准品对细胞抑制率的影响
阳性对照组的抑制率见表2,抑制率随浓度的增加而迅速上升,36 h内达到顶峰后持平,125μg/m L组与150μg/m L组抑制效果的差别并不明显,显示奥沙利铂标准品最佳选择浓度应在125μg/m L左右。
3 讨论
药物样品组在72 h内持续稳定释放,浓度在100μg/m L以上的抑制率在72 h后均达到90%以上,150μg/m L组更是达到97.2%,说明药物样品的长效性超过72 h,见图1。细胞MTT实验检测制备得到的药物样品对细胞的抑制率结果表明,阳性对照组在36 h内抑制率迅速上升到高峰后持平,125μg/m L和150μg/m L组的抑制率区别不大,说明奥沙利铂标准品有效制浓度控制在125μg/m L为宜,见图2。72 h内抑制率随着药物样品浓度的增加而上升,且增势稳定,说明其具有长效性和缓释稳定性。36 h内阳性对照组的抑制率随着奥沙利铂浓度的增加而迅速上升而达到顶峰,其后变化不大,而125μg/m L组与150μg/m L组抑制效果的差别并不明显。
MTT实验检测药物样品对细胞的抑制率的浓度效应结果表明,48 h抑制率曲线随着药物样品浓度的增加而增势稳定,效果明显,选择其作为IC50值的计算曲线,见图3、4。48 h抑制率随着药物样品浓度的增加而上升,且增势稳定,效果明显,选择其作为IC50值的计算曲线。48 h抑制率随着药物样品浓度的增加而上升,且增势稳定,参照药物组选择其作为IC50值的计算曲线。
以48 h浓度效应曲线为代表曲线,通过改良寇式法计算药物样品抑制率的IC50值。
公式:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]
Xm:lg最大剂量=2.176;I:lg(最大剂量/相临剂量)=0.079;P:阳性反应率之和=3.353;Pm:最大阳性反应率=0.837;Pn:最小阳性反应率=0.408。lg IC50=2.176-0.079[3.535-(3-0.837-0.408)/4]=1.9314,IC50=85.39μg/m L。
而阳性对照组则是:Xm:lg最大剂量=2.176;I:lg(最大剂量/相临剂量)=0.079;P:阳性反应率之和=4.516;Pm:最大阳性反应率=0.977;Pn:最小阳性反应率=0.418。lg IC50=2.176-0.079[4.516-(3-0.977-0.418)/4]=1.8509,IC50=70.96μg/m L。