C型凝集素（精选3篇）
C型凝集素 篇1
王浩教授
血小板黏附、激活及聚集在暴露的内皮下细胞外基质( extracellular matrix,ECM) 是止血过程必不可少的步骤。此步骤涉及多个环节及多个血小板受体-配体反应。其中,血小板黏附反应主要涉及的受体为血小板糖蛋白( glycoprotein,GP) IbV-IX复合物与整合素,激活与聚集反应主要涉及GPVI及C型凝集素样受体-2 ( C-type lectin-like receptors-2,CLEC-2)[1,2,3]。
CLEC-2 是近年发现的在血小板表面表达的信号受体,在最初通过生物信息学技术鉴定CLEC-2 之后,利用逆转录聚合酶链反应( RTPCR) 及印迹杂交( northern blot) 分析技术发现CLEC-2 mRNA在肝脏细胞、多种造血细胞( 包括单核细胞、树突细胞、NK细胞及粒细胞)中有表达[4]。后来发现CLEC-2 蛋白在人类血小板、巨核细胞系、肝窦内皮细胞、肝脏枯否细胞均有表达[5,6]。相比而言,CLEC-2 在血小板和巨核细胞内相对特异表达,而在其他类型细胞内表达水平较低[7]。既往研究发现,CLEC-2 激活后可以诱导血小板聚集。本文就CLEC-2 与血栓性疾病的研究进展综述如下。
1 结构与信号转导
CLEC-2 是在研究蛇毒蛋白( rhodocytin) 引起凝血及血栓形成的血小板受体时鉴定出来的。Rhodocytin依赖Src家族激酶激活血小板,但并不依赖胶原受体GPVI / FcRγ 链复合物,而后者是已知经典的依赖Src激酶激活血小板的受体途径[8],所以推测有另一种受体途径介导了rhodocytin所诱导的血小板聚集作用。最终应用rhodocytin亲和色谱法及质谱分析法确定CLEC-2 是rhodocytin在血小板表面的受体[3]。
CLEC-2 是一种32 ~ 40 k Da的Ⅱ型跨膜受体,携带一个C型凝集素样结构域。C型凝集素通过碳水化合物识别域以一种钙离子依赖模式与碳水化合物结合,而CLEC-2属于非典型的C型凝集素样蛋白,同样含有与碳水化合物识别域同源的C型凝集素样结构域,但是缺乏与糖和钙离子结合的共有序列[4]。CLEC-2 是凝集素受体家族第一个通过酪氨酸激酶依赖途径刺激血小板聚集的成员。
CLEC-2 的信号转导主要利用FcRγ 的胞浆侧尾部的免疫受体酪氨酸活化基序( ITAM)[9],每个ITAM包含2 个保守的YXXL序列,由6 ~ 12 个氨基酸分开,rhodocytin与CLEC-2 发生配体受体反应后使YXXL磷酸化,与Syk的串联SH2结构域结合,引发激酶活化。CLEC-2 拥有单个YXXL,其可以通过2 个磷酸化的受体之间通过串联的SH2 结构域进行桥接形成二聚体,1 个Syk的串联SH2 结构域与2个分子的磷酸化的YXXL以2: 1 形式结合[10,11],而后激活Syk。CLEC-2 激活Syk后启动适配体及效应蛋白信号级联反应,下游信号分子与GPVI一致,包括LAT、SLP-76、Vav1 /3 的酪氨酸磷酸化,效应蛋白包括Btk及磷脂酶Cγ2 ( phospholipase Cγ2,PLCγ2 )[12],并最终激活PLCγ2 并募集PLCγ2 至细胞膜[13,14]。人类血小板CLEC-2 的激活严格依赖ADP、血栓素A2( thromboxane A2,Tx A2) 及肌动蛋白聚合的反馈反应[15]。 另外,CLEC-2 通过调节PI3K及PKC的下游信号分子Akt及MAPK,引起糖原合成酶激酶( glycogen synthase kinase,GSK ) 3α / β 的磷酸化及抑制,增强血小板聚集及分泌[16]。CLEC-2 信号转导途径见图1[17]。
目前唯一已知的CLEC-2 内源性配体是podoplanin,在脉管系统外的多种细胞表达[18]。Rhodocytin是CLEC-2 外源性配体,是一种强力血小板激活蛋白,由马来亚蝮蛇分离获取[3]。另外,盐藻多糖作为血友病的治疗药物,可以激活血小板,缩短血友病患者出凝血时间,其激活血小板功能在CLEC-2 敲除的小鼠血小板被抑制,提示盐藻多糖是一种新型CLEC-2 激动剂[19]。
一种新型非细胞毒的5-硝基苯甲酸盐化合物2CP是目前第一个确定的血小板CLEC-2 拮抗剂[20],其利用与podoplanin相同的结合单元直接竞争性结合CLEC-2,抑制podoplanin诱导的血小板激活。
CLEC-2 的下游信号转导还可能与双重特异性磷酸酶3( dual-specificity phosphatase 3,DUSP3 ) 有关[21]。DUSP3 在人和小鼠血小板高度表达,在DUSP3 缺陷的小鼠的血小板,由胶原受体糖蛋白VI和CLEC-2 介导的血小板聚集和颗粒释放反应选择性受损。与野生型小鼠相比,DUSP3 缺陷的小鼠更加不易发生胶原和肾上腺素诱导的血栓形成。在分子水平,DUSP3 缺陷抑制了Syk酪氨酸磷酸化,随后抑制了PLCγ2 磷酸化和钙离子流动,从而抑制了血小板激活。
2 与血栓性疾病关系研究
由于CLEC-2 潜在的血小板活化作用,推测其可能成为抗血栓药物的靶点[22],但是CLEC-2 敲除小鼠的致命性,使得关于该受体在凝血及血栓形成中的功能研究变得非常困难。第一项直接涉及此问题的研究,是通过抗体来免疫耗竭小鼠血液循环中的CLEC-2 完成的,静脉内注射单克隆抗CLEC-2 Ig G抗体INU1 可导致血小板表面受体下调超过6 d[23]。与抗体( JAQ1) 介导的GPVI下调类似,血小板计数在4d后恢复,新生血小板缺乏CLEC-2[24],CLEC-2 耗竭的血小板对rhodocytin无反应,这种缺陷高度特异,因为血小板对于所有其他检测用激活剂的激活和聚集反应均无变化[23]。很快,有团队在CLEC-2 缺陷的嵌合子小鼠的造血系统内,报道了同样确切的反应缺陷[25]。进一步揭示了CLEC-2 对于稳定血小板聚集的重要作用。
在全血液灌注分析中,CLEC-2耗竭的血小板能够正常黏附在胶原覆盖的表面,但随即稳定的聚集形式在中到高的剪切率时遭到严重破坏。在氯化铁所致的肠系膜动脉损伤在体模型中,亦可见到血栓稳定性缺陷,证据是正常血小板可黏附在损伤的血管壁,但是CLEC-2 耗竭的血小板却阻碍了血栓形成过程[22]。与此一致,Suzuki-Inoue等描述了CLEC-2 缺陷的血小板如预期一样对Rhodocytin无反应,但对经典的血小板激活剂如胶原、凝血酶及ADP等诱导血小板聚集有正常反应,包括对胶原、层粘连蛋白及纤维蛋白原等不同基质的黏附反应亦正常,然而CLEC-2 嵌合体血小板在血栓形成方面发生了障碍,聚集稳定性出现了异常[25]。基于这些结果,可以推测CLEC-2 通过“接手”GPVI的血小板募集功能推动血栓生长,与胶原接触无关。利用抗体同时阻断GPVI及CLEC-2 可使凝血功能发生障碍,动脉内血栓形成严重受阻[26]。然而,与这些研究相反,其他学者在体外研究中发现CLEC-2 耗竭的血小板聚集功能正常[27]。出现这些矛盾结果的原因暂不明。CLEC-2 在止血过程中似乎扮演了一个小角色,因为在部分血小板存在CLEC-2 缺陷的的小鼠,出血时间没有延长或者仅仅中度延长[23]。
既往推测血小板( hem) ITAM、GPVI及CLEC-2 几种受体之间可以互相补偿以防止失血[3],因为有些缺乏GPVI的患者和小鼠只是表现出很轻微的出血倾向[28]。这个问题非常重要,因为涉及到在对有( hem) ITAM信号转导途径有部分缺陷的患者进行针对其他各自的( hem) ITAM受体治疗时,可能引起不可控制的出血。目前涉及血小板之间交互作用的CLEC-2 的生理配体尚不明了。推测其可以在活化的血小板上表达或固定[23]。有团队推测CLEC-2 的亲同种抗原交互作用可能在此发挥作用[25],但这种观点亦被其他人所质疑。
因为血小板的激活在血栓形成中至关重要,因此检测在体血小板激活对于鉴定病人是否处于血栓风险及监测抗血小板治疗效果有重要意义[29]。利用酶联免疫吸附测定法( enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 检测个体血浆中可溶性CLEC-2( soluble CLEC-2,s CLEC-2) 浓度,结果发现,10 名健康个体平均浓度为( 97 ± 55) pg /ml,同时25 例糖尿病患者为( 149 ± 260 )pg / ml,糖尿病患者有升高趋势,可能反映了在体血小板激活情况,提示s CLEC-2 作为在体血小板激活情况的生物标记物有重要临床意义。
3 展望
因为CLEC-2 缺陷小鼠在影响血栓形成的同时没有明显增加出血倾向,推测CLEC-2 可能是抗血小板药物的一个良好的靶点,安全性更高。 因此,进一步深入研究CLEC-2 将对动脉血栓的治疗和预防提供新的思路。
C型凝集素 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2009年2月至2011年5月行宫颈活检、锥切或子宫全切标本的55例CIN组织,其中CINⅠ10例、CINⅡ20例,CINⅢ25例,年龄21～63岁,平均51±3岁。并选取同期手术或组织活检的54例宫颈癌组织标本,年龄23～71岁,平均59±5岁。按国际妇产科联盟(FIGO) 2000年临床分期:Ⅰ期22例,Ⅱ期16例,Ⅲ期11例,Ⅳ期5例。病理类型:腺癌15例,鳞癌39例。组织学分级:G1级12例,G2级19例,G3级23例;淋巴结转移13例,无转移25例(Ⅲ、Ⅳ期未统计,仅统计Ⅰ、Ⅱ期患者数据)。同时选取同期因子宫肌瘤行子宫全切除术的正常宫颈组织20例,年龄36～60岁,平均51±5岁。所有标本均有详细的临床病理资料,取材前均未接受任何治疗,标本均经病理学诊断证实。
1.2 方法
1.2.1 Galectin-1蛋白检测
标本经10%甲醛固定,石蜡包埋,4 μm连续切片,采用SP法。鼠抗人Galectin-1单抗及SP试剂盒均为美国Zymed公司产品。详细步骤按SP试剂盒说明操作,Galectin-1单抗的工作稀释度为1∶100。每批实验同时设立阳性和阴性对照,用已知的免疫组化染色阳性的甲状腺组织切片作为阳性对照,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判定:免疫组化阳性信号显示棕色颗粒。无阳性细胞或阳性细胞<10%为(-),阳性细胞10%～60%为(+),阳性细胞>60%为(++)。为便于统计,(+)和(++)记为Galectin-1蛋白阳性。
1.2.2 HR-HPV检测
采用HC-Ⅱ进行HR-HPV检测。HPV取样器、HPV DNA高危型检测试剂盒均购自美国Digene公司。同时检测13个HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)。结果判断标准:≥1.0 mg/L为阳性,<1.0 mg/L为阴性。
1.2.3 统计学方法
应用SPSS 11.0统计分析软件,率的比较采用χ2检验和Fisher确切概率计算法。Galectin-1与HR-HPV的关系采用一致性检验,KI值≥0.75时,一致性良好。
2 结 果
2.1 Galectin-1蛋白在各组织中的表达
Galectin-1蛋白阳性染色定位于细胞浆内,为粗细不均的黄色或棕黄色颗粒。正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌中Galectin-1蛋白的阳性表达率分别为5.0%(1/20)、20.0%(2/10)、40.0%(8/20)、56.0%(14/25)、48.1%(26/54)。宫颈癌和CINⅡ、CINⅢ明显高于正常宫颈组织和CINⅠ(P<0.01);而宫颈癌与CINⅡ、CINⅢ间比较、正常宫颈组织与CINⅠ间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。在正常宫颈组织中,绝大多数上皮Galectin-1蛋白呈阴性表达,有1例呈弱阳性表达。随CIN病变加重,Galectin-1蛋白表达水平逐渐增强,用等级相关分析显示两者呈正相关关系(r=0.635,P<0.01)。见图1～图4。
2.2 Galectin-1蛋白与宫颈癌临床病理特征的关系
Galectin-1蛋白在宫颈癌中的阳性表达率随临床分期和组织分级的增高而增高,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。有淋巴结转移的宫颈癌组织中Galectin-1蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义(P<0.05);宫颈鳞癌中Galectin-1蛋白的表达率与宫颈腺癌中的表达率相似,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
①Ⅲ、Ⅳ期未手术,仅统计Ⅰ、Ⅱ期患者数据
2.3 HR-HPV感染情况及其与宫颈病变患者临床病理特征的关系
HR-HPV在正常宫颈、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌中的感染率分别为10.0%(2/20)、20.0%(2/10)、40.0%(8/20)、60.0%(15/25)和79.6%(43/54),组间比较差异有统计学意义(P<0.05);随病变加重,HR-HPV感染率增加呈正相关关系(r=1.201,P<0.05)。HR-HPV在宫颈癌组织中的阳性率与宫颈癌的临床分期、组织学分级、有无淋巴结转移、病理类型间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.4 Galectin-1蛋白的表达与HR-HPV
感染之间的关系 宫颈癌中HR-HPV阴性患者中Galectin-1蛋白的阳性表达率为27.3%(3/11),HR-HPV阳性患者中Galectin-1蛋白的阳性表达率为53.5%(23/43),两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈病变组织中HR-HPV阳性的68例中,有44例Galectin-1蛋白的表达阳性,一致性检验显示,两者间的一致性极好(KI=0.82)。
3 讨 论
Galectin-1蛋白是半乳糖凝集素(GALs)家族成员之一,由于其共有的碳水化合物识别结构域和对β半乳糖亲合性而命名,在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要的作用[3,4]。本实验发现,Galectin蛋白的表达在宫颈癌和CINⅡ、CINⅢ明显高于正常宫颈组织和CINⅠ(P<0.01),在晚期宫颈癌组织中Galectin-1蛋白的表达率明显高于其在早期宫颈癌组织中的表达率,提示Galectin-1蛋白可作为宫颈病变进展的监测指标。推测在宫颈癌变的过程中,由于宫颈上皮中Galectin-1基因表达水平明显增高,相应引起宫颈上皮细胞质中Galectin-1浓度增高,通过激活信号传导通路,无限度在促进宫颈细胞生长与增殖,极大地抑制宫颈细胞的凋亡,使细胞生长与凋亡失衡,从而导致宫颈癌变的发生。本研究中Galectin-1蛋白在宫颈癌组织中的表达与宫颈癌的临床分期、组织学分级和有无淋巴结转移关系密切,因此检测Galectin-1可作为估计宫颈癌患者预后的重要指标。以上结果与童华生等[5]在大肠癌上的研究结果相一致。但Galectin-1蛋白在宫颈鳞癌中的表达率与其在宫颈腺癌中的表达相似,表明Galectin-1蛋白的表达可能无组织特异性。本研究还发现随着CIN病情的加重,Galectin-1蛋白的表达增强(r=0.635,P<0.01),提示Galectin-1蛋白可能是CIN的一种较好的标志物,Galectin-1蛋白可以用于宫颈病变的早期诊断,其表达水平亦可以在一定程度上提示疾病的预后。
HPV为嗜上皮性球状病毒,是引起宫颈上皮癌变的主要致病因子之一。其致癌机制为HPV感染后持续性刺激角化细胞,并激活和促进有丝分裂增殖的肿瘤基因。分子生物学的研究结果显示,90%以上宫颈癌中均能检测到HPV DNA[6]。本实验对HR-HPV的检测发现,HR-HPV在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌中的感染率分别为10.0%、20.0%、40.0%、60.0%和79.6%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),且随病变加重,HR-HPV感染率增加。本研究结果还显示,76.9%的宫颈鳞癌和86.7%的宫颈腺癌中均能检测到HR-HPV的表达,提示HR-HPV感染是宫颈癌变的主要原因,与组织学分型无关。
HPV感染到发展为宫颈浸润癌大约需要二十年左右,说明除了HPV感染,在宫颈癌的发病过程中还有许多未知的因素,其中就涉及到癌基因和抑癌基因的状态[6]。我们对Galectin-1蛋白与HR-HPV两者的相关性研究发现,宫颈癌中HR-HPV阴性患者中Galectin-1蛋白的表达率为27.3%,HR-HPV阳性患者表达率为53.5%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);宫颈病变组织中HR-HPV阳性的68例中,有44例Galectin-1蛋白的表达阳性,一致性检验显示,两者间的一致性极好(KI=0.82)。表明HR-HPV阳性患者中Galectin-1蛋白的表达率明显高于HPV阴性患者,说明宫颈癌中HR-HPV的感染与Galectin-1蛋白的表达缺失有关。Galectin-1蛋白和HR-HPV通过何种方式在抑癌基因的失活上起到相同的作用,两者在其他方面是否存在相互作用还有待进一步研究。
参考文献
[1]Yang RY,Liu FT.Galectins in cell growth and apoptosis[J].Cell Mol Life Sci,2003,60(2):267-276.
[2]Pace KE,Hahn HP,Pang M,et al.CD7delivers a pro-poptotic signal during galectin-1induced T cell death[J].J Immunol,2000,165(5):2331-2334.
[3]Thijssen VL,Postel R,Brandwijk RJ,et al.Galectin-1is essential in tumor angiogenesis and is a target for antiangiogenesis therapy[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(43):15975-15980.
[4]朱曦龄,梁莉,丁彦青.Galectin-1在大肠癌组织中的表达及其临床意义[J].南方医科大学学报,2007,27(9):1331-1336.
[5]童华生,赖晓嵘,张亚历,等.大肠癌细胞外基质galectin-1梯度表达的研究[J].现代肿瘤医学,2009,17(2):288-291.
日本沼虾血清凝集素特性研究 篇3
实验以日本沼虾为材料，研究其血清中的凝集素对不同动物血细胞的凝集效价、糖抑制及有关影响因素，以期为寻找凝集素新来源及病害防治方面提供科学依据和基础材料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验用日本沼虾、鸡、鲢鱼均购自镇江市农贸市场，蟾蜍、兔和小鼠购自江苏大学医学院实验动物中心。乙酰甲胺磷乳油(30%)和敌百虫为江苏苏化集团有限公司产品。葎草黄酮、生姜黄酮、葎草多糖和桑叶多糖均由实验室用常规方法制备。α-乳糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，D-山梨醇，D-甘露糖，D-果糖，D-阿拉伯糖，L-鼠李糖为上海国药集团化学试剂有限公司产品。实验用化学试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 日本沼虾血清的制备
实验时取健康虾滤纸吸干表面水分，75%酒精擦拭消毒，无菌1 mL注射器(5号针头)从虾围心腔穿刺抽取血淋巴液，每尾抽取0.1～0.2 mL。多尾虾血淋巴混合，4℃放置12 h，待析出血清后，3 000 r/min离心5 min，取上清液，-20℃保存备用。
1.2.2 红细胞悬液的制备
分别采集鸡、鲢鱼、蟾蜍、兔和小鼠血液，保存于无菌Alsevers液中(与血液体积比为2∶1)，放4℃冰箱中备用(至多1周)。实验前2 500 r/min离心5 min，弃上清，用无菌生理盐水(鸡、兔、小鼠为0.85%NaCl;蟾蜍、鲢鱼为0.65%NaCl)洗涤血细胞2次，重复离心，以体积比配成2%的红细胞悬液备用。
1.2.3 动物血细胞凝集试验
凝集素效价测定采用微量滴定板凝集法。每孔加50μL生理盐水，第1孔分别加入虾血清和动物红细胞悬液50μL，混匀后，从第1孔中吸取50μL混合液加入第2孔，以此类推作倍比稀释，最后在每孔中加入50μL红细胞悬液(2%)，水平方向摇匀后，37℃培养箱中静置12 h。在低倍显微镜下观察各孔有无凝集块形成，以有细胞凝集现象的最高稀释倍数为该凝集素样品的凝集效价。以生理盐水作空白对照，每种血细胞作3个重复，以平均值作为凝集效价。
1.2.4 外界因素对日本沼虾血清凝集试验
温度对日本沼虾血清凝集试验：各取200μL日本沼虾血清置于Eppendorf离心管中，分别经4℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴中保温20 min后，快速冷却，用0.85%生理盐水作倍比稀释，加入鸡红细胞悬液，检测凝集活性变化。
盐度对日虾沼虾血清凝集试验：分别用盐度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的NaCl溶液对日本沼虾血清作倍比稀释(用8.5‰做对照)，混匀加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。
金属离子和EDTA-Na2对日本沼虾血清凝集素活性：将分别含有10 mmol/L MnCl2、FeCl2、ZnCl2、CuCl2和CaCl2的生理盐水和含0、2、4、8、16、32、64mmol/L EDTA-Na2的生理盐水各50μL对日本沼虾血清作倍比稀释，混匀后加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。
不同p H值对日本沼虾血清凝集素活性：用1mol/L NaOH和HCl将生理盐水pH值分别调整为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，以不同pH值的生理盐水对日本沼虾血清作倍比稀释，混匀加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。
有机磷农药对日本沼虾血清凝集素活性：用0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/L的乙酰甲胺磷和敌百虫溶液对日本沼虾血清进行倍比稀释，混匀后加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化，以生理盐水作空白对照。
黄酮和多糖类物质对日本沼虾血清凝集素活性：将葎草黄酮、生姜黄酮、葎草多糖和桑叶多糖配制浓度为0.3 mg/mL，分别对日本沼虾血清作倍比稀释，混匀后加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。以生理盐水作空白对照。
2 结果
2.1 日本沼虾血清的凝集活性
日本沼虾血清对鸡、兔、小鼠、蟾蜍和鲢鱼的血细胞均产生不同程度的凝集(表1)。其中，日本沼虾血清对小鼠血细胞的凝集强度最高为64，鸡血细胞其次为32，兔、蟾蜍和鲢鱼均为16。由此小鼠和鸡血细胞对日本沼虾血清敏感性较高，可用于日本沼虾血清凝集素性质的测定，实验采用鸡血细胞。
2.2 温度对日本沼虾血清凝集素活性的影响
日本沼虾血清经50℃和60℃处理20 min后，血清凝集效价与未处理组(表1)相同。温度在80℃、90℃和100℃时，血清完全变成乳白色胨状物，无法检测(表2)。
注：“-”表示不发生凝集，下同。
2.3 盐度对日本沼虾血清凝集素活性的影响
随着盐浓度的升高，凝集活性呈现出先降低而后升高的总体趋势。盐度为13～15时，凝集活性最强效价达到64。盐度为5～7时，凝集活性最低效价为16。当盐度<4和8～12时，凝集活性效价为32(表3)。
2.4 金属离子和EDTA-Na2对凝集素活性的影响
实验结果显示Mn2+对日本沼虾血清凝集活性没有影响，Cu2+和Zn2+完全抑制了日本沼虾血清凝集素活性。Ca2+和Fe2+降低了日本沼虾血清对鸡红细胞的凝集作用，效价分别为16和4，而且Fe2+比Ca2+抑制作用更强(表4)。
金属离子螯合剂EDTA可以抑制日本沼虾血清凝集活性，当浓度为2、4、8 mmol/L时效价为8，当浓度为16 mmol/L时凝集活性被完全抑制(表5)。
2.5 不同p H值对凝集素活性的影响
实验结果显示日本沼虾血清在pH值2～12内均能凝集鸡血细胞。当pH值2、8、9、11、12时，效价为8;pH值3～5、7、10时，凝集效价较好为16;pH值6时，凝集效价最高为32(表6)。
2.6 有机磷农药对凝集素活性的影响
实验结果显示当乙酰甲胺磷的浓度在5～15mg/L时，日本沼虾血清的凝集活性不变，效价为32，浓度再高则引起效价降低。而敌百虫仅在更低浓度，即0.5～5.0 mg/L时，不会影响虾血清的凝集活性，高于5.0 mg/L则会引起凝集效价的快速下降，浓度达到20 mg/L时，效价仅为4，作用结果要强于同浓度下乙酰甲胺磷的作用，凝集效价为16(表7)。
2.7 黄酮和多糖类物质对凝集素活性的影响
实验结果表明，葎草、生姜黄酮和葎草、桑叶多糖在浓度为3 mg/mL时凝集效价均为128，凝集效价是日本沼虾血清对鸡红细胞的4倍(表8)。
2.8 糖对凝集素活性的影响
在实验的8种糖中，日本沼虾血清活性能被D-葡萄糖和D-果糖抑制，其他糖均出现不同程度的凝集。结果表明日本沼虾血清凝集素对D-葡萄糖和D-果糖具有特异亲和性(表9)。
3 讨论
日本沼虾血清凝集素无种属专一性。红细胞凝集现象是凝集素和其相应位点结合的结果，研究结果表明甲壳动物凝集素对动物血细胞的敏感性不同，凝集素对红细胞有的具有种属专一性，有的则没有[5,9]。实验结果表明日本沼虾血清凝集素对兔、鸡、小鼠、蟾蜍和鲢鱼的红细胞均产生一定的凝集，对小鼠和鸡血红细胞凝集效应最高。
日本沼虾血清凝集素具有热稳定性。多数甲壳动物的凝集素具有热不稳定性，不同虾热稳定效果不同，但变性温度一般在65～80℃[3,7,9]。实验结果表明，日本沼虾血清热稳定性较好。虾血清凝集素热稳定性的差异可能与其生活环境不同及凝集素分子的化学结构和活性位点的化学性质有关[11]。
牟海津等[3]在研究中国明对虾血清对鸡红细胞的凝集作用时发现，在一定盐度范围内，增加盐度可提高凝集活性。曹剑香等[9]对凡纳滨对虾血清凝集素特性研究中发现，盐度为4～60时检测到血清的凝集，当盐度为24～48时血清凝集素活性有所增强，认为对虾血清凝集活性的增强与对虾更适应于高盐度环境生长有关。对于淡水虾而言，水体盐度一般在1～5。从实验结果来看，低盐度日本沼虾血清的凝集素活性变化不大，当盐度达到13时凝集效价显著提高，这一方面可能与高盐度对虾体免疫机能的刺激作用有关，另一方面可能也显示日本沼虾对水体的盐度有较大的适应范围。
有文献报道，Ca2+能使凡纳滨对虾血清凝集素凝集活性明显增强[9]，而对中国对虾凝集活性没有影响[3]，罗氏沼虾和南美白对虾对Ca2+均有很强的依赖性[5,8]。实验中Ca2+对日本沼虾血清的凝集素活性表现出一定程度的抑制作用，可能原因在于凝集效价测定选用的红细胞类型不同，或者与凝集素本身的结构有一定的相关性，还有待于进一步研究。Cu2+和Zn2+完全抑制了日本沼虾血清凝集素活性，其原因可能是Cu2+和Zn2+使凝集素的结构发生变化，凝集活性丧失。
金属离子螯合剂EDTA的加入可以明显抑制凝集活性，当浓度达到16 mmol/L时凝集活性被完全抑制，说明在日本沼虾血清的凝集活动中，某些金属离子仍然是必不可少的。
不同血清凝集素保持凝集活力的pH值只范围略有不同[3,7,8,9]。实验结果表明日本沼虾血清在pH值2～12均能凝集鸡血细胞，在pH值3～7范围内凝集效果较好，pH值6时凝集效价最高，说明偏酸和偏碱性对凝集素活性有一定影响。
有机磷农药对日本沼虾血清凝集素活性具有一定影响，高浓度乙酰甲胺磷和敌百虫对凝集活性有抑制作用。随着有机磷农药生产和使用的逐年递增，在控制有害昆虫正效应的同时，也会随雨水冲刷等途径而进入河流、湖泊和海洋，对水生生物造成威胁[12]。实验中，不同浓度的乙酰甲胺磷和敌百虫溶液在一定浓度范围内对日本沼虾血清凝集活性变化有一定影响，高浓度乙酰甲胺磷和敌百虫对凝集活性有抑制作用。低浓度乙酰甲胺磷对血清中凝集素活性改变不显著，这是由于乙酰甲胺磷作为神经性毒剂，通过抑制突触部位乙酰胆碱脂酶的活性，使神经系统的正常活动受到干扰和破坏而导致死亡[13]。随着敌百虫浓度的增加，日本沼虾血清对鸡红细胞的凝集效价降低，说明高浓度敌百虫影响了虾的免疫机能。
实验结果中生姜、葎草黄酮和桑叶、葎草多糖凝集效价是日本沼虾血清对鸡红细胞的4倍，由此证明应用黄酮和多糖类物质作为免疫增强剂，可激活日本沼虾的非特异性免疫系统，起到加强防御的功能。近年来我国水产养殖规模不断扩大，集约化和工厂化程度越来越高，但养殖水域污染日趋严重，严重困扰着水产养殖业的健康发展。使用疫苗是预防疾病的可靠方法，但至今大部分病毒的疫苗尚未开发出来，且疫苗不具有广谱性，操作可行性差。开发无药残、抗菌谱广、食用安全、增强免疫功能的添加剂，成为当前水产饲料研究的热点[14]。从分布广、易获得的植物资源中提取黄酮和多糖等活性物质作为饲料添加剂提高虾免疫能力，具有较好的开发利用前景。