凝集反应（共7篇）
凝集反应 篇1
2006年9月, 笔者收治1例静脉滴注凯西莱与穿琥宁注射液出现凝集反应的患者, 经合理处理, 精心护理, 效果满意, 现报告如下。
1病历资料
患者女, 65岁, 脂肪肝伴上呼吸道感染, 给予5%GS250ml加凯西莱0.2g静注, 1次/d。5%GS250ml加穿琥宁注射液0.4g静脉滴注, 1次/d, 患者输完凯西莱更换穿琥宁注射液时, 其输液器的墨非氏滴管内迅速产生乳白色胶状液体, 立即更换输液器, 单独滴注穿琥宁注射液, 并仔细观察, 未发生上述现象, 为证实两种药物之间的凝集反应, 笔者用注射器多次抽取两种药物时, 用其他液体作间隔静脉滴注或中间用生理盐水冲管, 未出现上述现象。
2讨论
凯西莱注射液具有保肝作用, 专用5%碳酸氢钠的溶媒对于肝功能损坏起到保护作用, 穿琥宁用于病毒性肺炎, 病毒性上呼吸道感染等。具有: (1) 对细菌内毒素引起发热有较强的解热作用能促进发热的消退, 作用迅速并可维持4h以上; (2) 较好的抗炎作用, 对肾上腺素急性肺水肿明显对抗作用; (3) 能明显促进肾上腺皮质功能, 增加机体对病原体感染的应急能力。本文发现在静脉滴注过程中, 上述两种药物交叉应用可迅速出现凝集反应, 其机理尚不清楚, 为保证用药安全, 建议两种药物分开应用或中间用生理盐水冲管, 以保病人用药放心及安全。
收稿日期2007-09-15
凝集反应 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究中资料来源于我中心收集的临床确诊布氏菌病患者血样, 抽取其中的28例作为研究对象, 包括有男17例, 女11例, 年龄24~58岁, 平均 (33.6±12.7) 岁, 包括放羊人员8例, 兽医10例, 屠宰工人6例, 皮毛加工工人4例。
1.2 方法
(1) 研究方法:对以上统计的28例研究对象分别采取虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验3种检验方法展开布氏菌检测, 并对各种方法的检测结果进行对比分析。 (2) 检验方法:检验过程中虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原均为我省疾病预防控制中心下发, 且在有效期内。双向肝浸液为我实验室自行配制, 经高压灭菌后使用。采集以上统计研究对象的血样标本, 分别经虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验对布氏菌进行检测, 其中虎红平板凝集反应采取快速玻片血清凝集反应, 抗体测定采取试管凝集实验, 并以1∶100++及以上者视为阳性[2]。
1.3 数据处理
研究中相关数据资料采用SPSS18.0统计学软件处理, 研究对象年龄等相关计量资料采用均数加减标准差 (±s) 形式表示, 在对比过程中计量资料的对比采取t检验, 计数资料的对比采取χ2检验, 在P<0.05时, 视为差异具有显著统计学意义。
2 结果
2.1 3种方法的检验结果统计
虎红平板凝集反应检测28例患者布氏菌均为阳性;经抗体测定检出有4例患者试管凝集实验效价为1∶100++及以上判定结果为阳性, 有1例患者的试管凝集实验效价为1∶50++判定结果为可疑, 其余23例患者均为阴性;经细菌学检验有5例患者血标本中分离得到布氏菌, 其中有1例患者为抗体测定可疑患者, 并且有1例为抗体检测结果阴性患者。由此可知, 以上3种检验方法的检出率以虎红平板凝集反应最高, 明显高于抗体测定与细菌学检验 (P<0.05) 。
2.2 结果对比分析
本次研究中28例患者经血样快速平板凝集反应均判定为阳性, 经抗体检测判定为阳性者4例, 可疑者1例, 经细菌学检验分离得到布氏菌者5例, 快速平板凝集反应、抗体测定以及细菌学检验结果相符者4例, 符合率为14.29%。其中有1例患者抗体测定效价为1:400++, 经细菌学检测中检出布氏菌的存在, 同时1例可疑患者和阴性患者均检测到了布氏菌。由此可证实抗体测定效价的高低与细菌学检测是否可以分离得到布氏菌并不一定存在必然联系。经快速玻片血清凝集反应对布氏菌进行检测的检出率较高, 结果准确, 操作简单, 反应迅速。
3 讨论
在我国大部分地区均发现了布氏菌病的报告, 且发病率呈现逐年升高的趋势, 已经引起了广大医学工作者的高度重视[3]。布氏菌病的主要致病物质为内毒素、荚膜、侵袭性酶等, 细菌在通过皮肤黏膜进入到人体后, 在机体内会迅速大量的繁殖, 并进入到血液, 若是细菌繁殖达到一定的数量后便会引起菌血症, 随后对患者的肝、脾、骨髓以及淋巴等脏器细胞造成侵害, 特别是对骨关节的损害, 严重影响了患者的健康和生存质量。调查结果显示, 除了与病羊接触的农牧民、屠宰户的发病率较高外, 由于饮食不卫生也可以导致布氏菌病的发生[4]。本次研究中出于对布氏菌病虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验3种检验方法的检测结果进行对比分析的目的, 对28例临床确诊布氏菌病患者血样分别展开了虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验, 结果发现, 经虎红平板凝集反应判定全部患者均为阳性, 经抗体测定判定阳性者4例, 可疑者1例, 经细菌学检测判定为阳性者5例, 其中有1例为抗体测定可疑者, 1例为抗体测定阴性者。通过本次研究我们发现, 细菌学检测结果与抗体测定效价的高低之间无显著的相关性, 虎红平板凝集反应在布氏菌检测中具有诸多的优势, 如检出率较高, 结果准确, 操作简单, 反应迅速, 适合大面积的筛查。细菌学检验的准确性也相对较高, 但是由于细菌培养的营养条件比较苛刻, 因此临床诊断推广存在困难[5]。对于抗体测定而言, 其比较适用于临床诊断, 值得对其给予关注。
通过本次研究我们体会到, 针对布氏菌病的检测, 不同的检测方法检测结果存在很大的差异, 且细菌学检测与抗体测定效价高低不存在必然的相关性, 临床应对其给予关注, 针对具体情况采取合适的方法进行检测。并建议直接接触者、病状疑似者经抗体检测结果为阴性者采取细菌学检测展开进一步的检测, 以提高临床诊断率, 避免出现漏诊与误诊现象。并提醒广大民众, 针对布氏菌病的预防, 不但直接接触者需要做好相应的防护, 喜欢吃牛羊肉的人们也应加强饮食卫生, 避免病从口入[6]。
综上所述, 在布氏菌病检测中, 虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验三种检验方法以虎红平板凝集反应的检出率最高, 然不同检测方法具有不同的优势, 在临床疾病诊断、治疗等诸多方面均发挥了重要的作用, 值得临床对其给予关注并推广, 为布氏菌病的防控工作打下坚实的基础, 降低布氏菌的发病, 改善人民的生活质量与安全。
摘要：目的 对布氏菌病虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验三种检验方法的检测结果进行对比分析, 为今后的临床检验工作提供可靠的参考依据。方法 抽取在2008年1月至2013年12月间我中心收集的布氏菌阳性患者的血样28例, 对其分别展开虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验, 并对检验结果进行对比分析。结果 28例患者经虎红平板凝集反应检测证实全部为阳性, 经抗体测定检测证实为阳性者4例, 可疑者1例, 经细菌学检验证实为阳性者5例。结论 虎红平板凝集反应、抗体测定与细菌学检验之间不一定存在对应的关系, 无论抗体检测效价情况如何均可分离得到布氏菌, 临床应对其给予关注。
关键词：氏菌病,虎红平板凝集反应,抗体测定,细菌学检验,临床价值
参考文献
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日本沼虾血清凝集素特性研究 篇3
实验以日本沼虾为材料，研究其血清中的凝集素对不同动物血细胞的凝集效价、糖抑制及有关影响因素，以期为寻找凝集素新来源及病害防治方面提供科学依据和基础材料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验用日本沼虾、鸡、鲢鱼均购自镇江市农贸市场，蟾蜍、兔和小鼠购自江苏大学医学院实验动物中心。乙酰甲胺磷乳油(30%)和敌百虫为江苏苏化集团有限公司产品。葎草黄酮、生姜黄酮、葎草多糖和桑叶多糖均由实验室用常规方法制备。α-乳糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，D-山梨醇，D-甘露糖，D-果糖，D-阿拉伯糖，L-鼠李糖为上海国药集团化学试剂有限公司产品。实验用化学试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 日本沼虾血清的制备
实验时取健康虾滤纸吸干表面水分，75%酒精擦拭消毒，无菌1 mL注射器(5号针头)从虾围心腔穿刺抽取血淋巴液，每尾抽取0.1～0.2 mL。多尾虾血淋巴混合，4℃放置12 h，待析出血清后，3 000 r/min离心5 min，取上清液，-20℃保存备用。
1.2.2 红细胞悬液的制备
分别采集鸡、鲢鱼、蟾蜍、兔和小鼠血液，保存于无菌Alsevers液中(与血液体积比为2∶1)，放4℃冰箱中备用(至多1周)。实验前2 500 r/min离心5 min，弃上清，用无菌生理盐水(鸡、兔、小鼠为0.85%NaCl;蟾蜍、鲢鱼为0.65%NaCl)洗涤血细胞2次，重复离心，以体积比配成2%的红细胞悬液备用。
1.2.3 动物血细胞凝集试验
凝集素效价测定采用微量滴定板凝集法。每孔加50μL生理盐水，第1孔分别加入虾血清和动物红细胞悬液50μL，混匀后，从第1孔中吸取50μL混合液加入第2孔，以此类推作倍比稀释，最后在每孔中加入50μL红细胞悬液(2%)，水平方向摇匀后，37℃培养箱中静置12 h。在低倍显微镜下观察各孔有无凝集块形成，以有细胞凝集现象的最高稀释倍数为该凝集素样品的凝集效价。以生理盐水作空白对照，每种血细胞作3个重复，以平均值作为凝集效价。
1.2.4 外界因素对日本沼虾血清凝集试验
温度对日本沼虾血清凝集试验：各取200μL日本沼虾血清置于Eppendorf离心管中，分别经4℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃水浴中保温20 min后，快速冷却，用0.85%生理盐水作倍比稀释，加入鸡红细胞悬液，检测凝集活性变化。
盐度对日虾沼虾血清凝集试验：分别用盐度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15的NaCl溶液对日本沼虾血清作倍比稀释(用8.5‰做对照)，混匀加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。
金属离子和EDTA-Na2对日本沼虾血清凝集素活性：将分别含有10 mmol/L MnCl2、FeCl2、ZnCl2、CuCl2和CaCl2的生理盐水和含0、2、4、8、16、32、64mmol/L EDTA-Na2的生理盐水各50μL对日本沼虾血清作倍比稀释，混匀后加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。
不同p H值对日本沼虾血清凝集素活性：用1mol/L NaOH和HCl将生理盐水pH值分别调整为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，以不同pH值的生理盐水对日本沼虾血清作倍比稀释，混匀加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。
有机磷农药对日本沼虾血清凝集素活性：用0.5、1.0、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/L的乙酰甲胺磷和敌百虫溶液对日本沼虾血清进行倍比稀释，混匀后加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化，以生理盐水作空白对照。
黄酮和多糖类物质对日本沼虾血清凝集素活性：将葎草黄酮、生姜黄酮、葎草多糖和桑叶多糖配制浓度为0.3 mg/mL，分别对日本沼虾血清作倍比稀释，混匀后加入鸡血细胞悬液，检测凝集活性变化。以生理盐水作空白对照。
2 结果
2.1 日本沼虾血清的凝集活性
日本沼虾血清对鸡、兔、小鼠、蟾蜍和鲢鱼的血细胞均产生不同程度的凝集(表1)。其中，日本沼虾血清对小鼠血细胞的凝集强度最高为64，鸡血细胞其次为32，兔、蟾蜍和鲢鱼均为16。由此小鼠和鸡血细胞对日本沼虾血清敏感性较高，可用于日本沼虾血清凝集素性质的测定，实验采用鸡血细胞。
2.2 温度对日本沼虾血清凝集素活性的影响
日本沼虾血清经50℃和60℃处理20 min后，血清凝集效价与未处理组(表1)相同。温度在80℃、90℃和100℃时，血清完全变成乳白色胨状物，无法检测(表2)。
注：“-”表示不发生凝集，下同。
2.3 盐度对日本沼虾血清凝集素活性的影响
随着盐浓度的升高，凝集活性呈现出先降低而后升高的总体趋势。盐度为13～15时，凝集活性最强效价达到64。盐度为5～7时，凝集活性最低效价为16。当盐度<4和8～12时，凝集活性效价为32(表3)。
2.4 金属离子和EDTA-Na2对凝集素活性的影响
实验结果显示Mn2+对日本沼虾血清凝集活性没有影响，Cu2+和Zn2+完全抑制了日本沼虾血清凝集素活性。Ca2+和Fe2+降低了日本沼虾血清对鸡红细胞的凝集作用，效价分别为16和4，而且Fe2+比Ca2+抑制作用更强(表4)。
金属离子螯合剂EDTA可以抑制日本沼虾血清凝集活性，当浓度为2、4、8 mmol/L时效价为8，当浓度为16 mmol/L时凝集活性被完全抑制(表5)。
2.5 不同p H值对凝集素活性的影响
实验结果显示日本沼虾血清在pH值2～12内均能凝集鸡血细胞。当pH值2、8、9、11、12时，效价为8;pH值3～5、7、10时，凝集效价较好为16;pH值6时，凝集效价最高为32(表6)。
2.6 有机磷农药对凝集素活性的影响
实验结果显示当乙酰甲胺磷的浓度在5～15mg/L时，日本沼虾血清的凝集活性不变，效价为32，浓度再高则引起效价降低。而敌百虫仅在更低浓度，即0.5～5.0 mg/L时，不会影响虾血清的凝集活性，高于5.0 mg/L则会引起凝集效价的快速下降，浓度达到20 mg/L时，效价仅为4，作用结果要强于同浓度下乙酰甲胺磷的作用，凝集效价为16(表7)。
2.7 黄酮和多糖类物质对凝集素活性的影响
实验结果表明，葎草、生姜黄酮和葎草、桑叶多糖在浓度为3 mg/mL时凝集效价均为128，凝集效价是日本沼虾血清对鸡红细胞的4倍(表8)。
2.8 糖对凝集素活性的影响
在实验的8种糖中，日本沼虾血清活性能被D-葡萄糖和D-果糖抑制，其他糖均出现不同程度的凝集。结果表明日本沼虾血清凝集素对D-葡萄糖和D-果糖具有特异亲和性(表9)。
3 讨论
日本沼虾血清凝集素无种属专一性。红细胞凝集现象是凝集素和其相应位点结合的结果，研究结果表明甲壳动物凝集素对动物血细胞的敏感性不同，凝集素对红细胞有的具有种属专一性，有的则没有[5,9]。实验结果表明日本沼虾血清凝集素对兔、鸡、小鼠、蟾蜍和鲢鱼的红细胞均产生一定的凝集，对小鼠和鸡血红细胞凝集效应最高。
日本沼虾血清凝集素具有热稳定性。多数甲壳动物的凝集素具有热不稳定性，不同虾热稳定效果不同，但变性温度一般在65～80℃[3,7,9]。实验结果表明，日本沼虾血清热稳定性较好。虾血清凝集素热稳定性的差异可能与其生活环境不同及凝集素分子的化学结构和活性位点的化学性质有关[11]。
牟海津等[3]在研究中国明对虾血清对鸡红细胞的凝集作用时发现，在一定盐度范围内，增加盐度可提高凝集活性。曹剑香等[9]对凡纳滨对虾血清凝集素特性研究中发现，盐度为4～60时检测到血清的凝集，当盐度为24～48时血清凝集素活性有所增强，认为对虾血清凝集活性的增强与对虾更适应于高盐度环境生长有关。对于淡水虾而言，水体盐度一般在1～5。从实验结果来看，低盐度日本沼虾血清的凝集素活性变化不大，当盐度达到13时凝集效价显著提高，这一方面可能与高盐度对虾体免疫机能的刺激作用有关，另一方面可能也显示日本沼虾对水体的盐度有较大的适应范围。
有文献报道，Ca2+能使凡纳滨对虾血清凝集素凝集活性明显增强[9]，而对中国对虾凝集活性没有影响[3]，罗氏沼虾和南美白对虾对Ca2+均有很强的依赖性[5,8]。实验中Ca2+对日本沼虾血清的凝集素活性表现出一定程度的抑制作用，可能原因在于凝集效价测定选用的红细胞类型不同，或者与凝集素本身的结构有一定的相关性，还有待于进一步研究。Cu2+和Zn2+完全抑制了日本沼虾血清凝集素活性，其原因可能是Cu2+和Zn2+使凝集素的结构发生变化，凝集活性丧失。
金属离子螯合剂EDTA的加入可以明显抑制凝集活性，当浓度达到16 mmol/L时凝集活性被完全抑制，说明在日本沼虾血清的凝集活动中，某些金属离子仍然是必不可少的。
不同血清凝集素保持凝集活力的pH值只范围略有不同[3,7,8,9]。实验结果表明日本沼虾血清在pH值2～12均能凝集鸡血细胞，在pH值3～7范围内凝集效果较好，pH值6时凝集效价最高，说明偏酸和偏碱性对凝集素活性有一定影响。
有机磷农药对日本沼虾血清凝集素活性具有一定影响，高浓度乙酰甲胺磷和敌百虫对凝集活性有抑制作用。随着有机磷农药生产和使用的逐年递增，在控制有害昆虫正效应的同时，也会随雨水冲刷等途径而进入河流、湖泊和海洋，对水生生物造成威胁[12]。实验中，不同浓度的乙酰甲胺磷和敌百虫溶液在一定浓度范围内对日本沼虾血清凝集活性变化有一定影响，高浓度乙酰甲胺磷和敌百虫对凝集活性有抑制作用。低浓度乙酰甲胺磷对血清中凝集素活性改变不显著，这是由于乙酰甲胺磷作为神经性毒剂，通过抑制突触部位乙酰胆碱脂酶的活性，使神经系统的正常活动受到干扰和破坏而导致死亡[13]。随着敌百虫浓度的增加，日本沼虾血清对鸡红细胞的凝集效价降低，说明高浓度敌百虫影响了虾的免疫机能。
实验结果中生姜、葎草黄酮和桑叶、葎草多糖凝集效价是日本沼虾血清对鸡红细胞的4倍，由此证明应用黄酮和多糖类物质作为免疫增强剂，可激活日本沼虾的非特异性免疫系统，起到加强防御的功能。近年来我国水产养殖规模不断扩大，集约化和工厂化程度越来越高，但养殖水域污染日趋严重，严重困扰着水产养殖业的健康发展。使用疫苗是预防疾病的可靠方法，但至今大部分病毒的疫苗尚未开发出来，且疫苗不具有广谱性，操作可行性差。开发无药残、抗菌谱广、食用安全、增强免疫功能的添加剂，成为当前水产饲料研究的热点[14]。从分布广、易获得的植物资源中提取黄酮和多糖等活性物质作为饲料添加剂提高虾免疫能力，具有较好的开发利用前景。
凝集素与肿瘤关系的研究进展 篇4
1 CLU与细胞的关系
近期研究表明, CLU不但参与促进细胞存活、耐药和肿瘤的发展, 也参与细胞凋亡的调节作用。有研究发现, 在转基因的模型中, 以CLU为靶点的治疗可阻断其过度表达, 从而增加光感受器的死亡, CLU蛋白有相反的功能[2]。s CLU是一种细胞保护的分子伴侣, 类似于促存活因子, 参与细胞碎片的清除和促进吞噬的作用, s CLU能够保护细胞免受刺激, 包括辐射、放疗、细胞毒性、化疗及生物制剂[2]。目前, s CLU的作用机制还没有完全阐明, 是一个新的研究热点。s CLU还能与各种各样的生物配体绑定, 这一特性与热休克因子1 (HSF-1) 相关。一个新兴的观点是:s CLU的功能与小分子热休克蛋白的分子伴侣功能相似, 当细胞受到应激时其蛋白质的构象稳定[3]。s CLU在抑制蛋白质沉淀方面的功能比热休克蛋白的能力强[3]。n CLU堆积在细胞核中, 可能参与诱导细胞的凋亡[4]。所以, 在细胞生长和凋亡中n CLU与s CLU起着不同的作用, s CLU好比于促存活因子, n CLU却是促凋亡因子。因此, CLU和肿瘤的发生、发展及转移关系密切。
CLU是热休克蛋白的功能性同系物, CLU的分子伴侣活性能改变多种不同蛋白质的非晶态和纤维聚合。CLU抑制应激蛋白的聚合主要是通过绑定非蛋白质暴露在外的疏水区, 形成可溶性、分子量高的复合物[2]。s CLU通过折叠途径参与蛋白质的无定型聚合。研究发现, s CLU能够抑制线粒体的凋亡主要是通过抑制p53激活压力信号和稳定Ku70-Bax胞质蛋白, 复杂的抑制Bax的活化[5]。s CLU可以降低Bcl-2家族成员的发病率, 抑制Ku70/Bax复合物的形成和Bax的激活[5]。此外, s CLU可以提高蛋白激酶磷酸化水平和细胞的存活率[7]。近年研究表明[7], CLU具有细胞保护的作用。因此, CLU作为细胞保护作用的分子伴侣越来越多地引人注目。
2 CLU与不良预后
CLU在多种肿瘤中, 例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肾癌和前列腺癌等都有表达。研究发现, 在恶性肿瘤的发展以及转移时, n CLU也会向s CLU转化[2]。临床研究发现, 在结肠癌中, 其表达水平与生存期相关[7,8]。在宫颈癌中, 患者化疗[9]和放疗[10]后的不良反应也与s CLU的表达有关。CLU的表达是预测浸润性宫颈癌患者接受根治性手术治疗和辅助化疗后化疗敏感性及生存期的一个重要指标[11]。在卵巢癌中, CLU不但是检测的标志物, 还和患者的预后不良及生存率相关[12]。在膀胱癌中, CLU也与病情的发展有关[13]。s CLU的表达与乳腺癌的生长和转移相关, 这也为乳腺癌的治疗提供了一个有价值的治疗方法[14]。前列腺癌中s CLU也有明显的升高[15]。因此, CLU可能成为一个治疗肿瘤的新的靶点。
3 CLU与肿瘤的治疗
CLU与肿瘤的发生、发展及转移的关系密切。目前, 在多种肿瘤 (膀胱癌、乳腺癌、肝癌、肾癌和胰腺癌) 中专门针对CLU进行了一系列的研究[17]。s CLU是一种细胞保护的分子伴侣, 在抗癌治疗后会引起过度的表达, 进而引起抵抗治疗;n CLU可以诱导细胞的凋亡。目前, 在恶性肿瘤的治疗中以CLU为靶点的研究有很多。研究表明[18], 对前列腺癌进展期患者采用CLU反义寡核苷酸 (OGX-011) 与多西紫杉醇联用治疗, 能有效抑制患者的病情, 检测表明, 血清中CLU的表达水平与患者的生存期有关。用OGX-011抑制CLU, 可以增强体内外肺癌细胞对放疗的敏感性[18]。OGX-011可能通过影响癌细胞的凋亡和存活而提高放疗和化疗的敏感性。通过抑制CLU的表达和应激反应可以提高多种抗癌疗法的功效[19]。在多种癌症的临床异种移植模型中, 如前列腺癌、肺癌、肾癌、乳腺癌等, 抑制CLU的表达可以增加细胞的凋亡[20]。在乳腺癌的治疗中发现, 敲除s CLU可能提供更有价值的治疗方法[14], 因为在肿瘤的生长和转移过程中s CLU发挥着重要的作用。研究发现, 在肝癌中, 肝细胞癌的转移可能是s CLU通过诱导上皮间质的转化所导致, 这有可能成为肝癌治疗的新靶点[21]。s CLU可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点。有研究显示, n CLU可以抑制前列腺癌的转移以及浸润, 主要是因为n CLU能够促进细胞的凋亡, 通过降低基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2) 的活性以及干扰细胞支架的成分;提示提高n CLU的表达、降低s CLU的表达可以有效控制前列腺癌的发展[22]。通过实验观察发现, 在人肺腺癌细胞中上调n CLU的表达可以明显抑制肿瘤细胞的增殖, 表明在恶性肿瘤的治疗中n CLU可以作为新的靶点[23]。综上, 在恶性肿瘤的治疗中, CLU成为新的治疗靶点。
目前, 已经超过300例癌症患者接受了OGX-011的一期和二期临床试验。在实验中发现, OGX-011对癌症的治疗有一定的效果, OGX-011和顺铂等药物联合使用治疗效果更加明显[24]。
4 结论
总之, CLU与肿瘤细胞的发生、发展以及患者的预后密切相关。CLU是肿瘤治疗的新靶点, 受到越来越多的关注。目前OGX-011的一期和二期临床试验已经完成, 正在进行三期和四期临床试验, 这为恶性肿瘤的治疗开辟了一条新途径, 越来越受到人们的关注。
摘要：凝集素 (CLU) 在肿瘤的发生和进展过程中起重要的抗肿瘤细胞坏死和抗凋亡作用, 肿瘤细胞中不同亚型的CLU表达水平与肿瘤细胞的侵袭能力相关, 肿瘤的发生发展与分泌型CLU (sCLU) 过表达和核型CLU (nCLU) 缺失有关。它们在肿瘤组织中都有异常的表达, 可作为多种恶性肿瘤和癌前病变的早期检测标志物, 也可作为肿瘤预后评价的参考指标。本文将CLU与肿瘤关系的研究做一综述。
凝集反应 篇5
刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门海参纲(Holothuroidea)木盾手目(Aspidochirota)刺参科(Stichopodidae)仿刺参属(Apostichopus),为温带种。刺参无适应性免疫,依靠体壁、体腔细胞和体液中的免疫因子来抵御外来侵犯。凝集素作为一种它的免疫因子,在体内起着重要的作用[3]。
我国从20世纪80年代开始进行刺参养殖以来相继出现一系列病害问题。其中"烂皮病"因其高传染性、高死亡率而成为刺参养殖病害研究的重点[4]。作者采用了实验室已成功分离的2株"烂皮病"致病菌对健康刺参进行致病感染,分离纯化其体内凝集素,并进行凝集活性检测和性质研究,与健康个体的凝集素的性质相比较,以期探索刺参免疫机制并为其药用价值提供科学的依据和参考。迄今为止,有关患病刺参凝集素的研究鲜见报道。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
实验用健康刺参购于青岛某刺参养殖厂;实验兔购于青岛大学医学院实验动物中心。
1.1.2 试剂
DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100等购自Pharmacia LKB Biotechnology。牛甲状腺球蛋白、鼠李糖、蔗糖均为分析纯,Sigma公司;其它为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 仪器
ALPHAPHOT-2型光学显微镜:Nikon;血球计数板:江苏丹阳市光学仪器厂;立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50SⅡ:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;台式离心机TGL-16G:上海安亭科学仪器厂;高速冷冻离心机GL-20G-Ⅱ:上海安亭科学仪器厂;HZQ-X100振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;DS-1型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;YC-1型层析实验冷柜:北京博医康实验仪器有限公司;SBS-100型数字记滴自动部分收集器、HD-1型核酸蛋白检测仪、TH-300梯度混合器:上海沪西分析仪器厂;DHL-B型电脑定时恒流泵:上海康华仪器制造厂;Amicon Ultra-4离心超滤管:Millipore;DYCZ-26电泳槽:北京六一仪器厂;TS-1型脱色摇床:江苏海门市麒麟医用仪器厂;96孔V形底板:杭州维特洁生化技术有限公司。
1.1.4 培养基
2216E培养基(1L):酵母膏1.0g;蛋白胨5.0g;磷酸高铁0.1g;琼脂20.532g;陈海水1000mL;pH 7.6。
1.2 方法
1.2.1 致病菌感染刺参个体
制备菌悬液:将Tenacibaculum属的一种菌(代号C6) 和Vibrionales属的一种菌(代号TB)分别划平板,28℃下培养48h,用过滤灭菌海水冲洗菌落制成菌悬液,每株菌菌液为3ml。分别取1ml,梯度稀释后用血球计数板计数。
准备感染场所:将4 000ml塑料盆用酒精消毒并用过滤灭菌海水冲洗3遍。向每个盆中分别注入2 000ml过滤灭菌海水,用充气阀通气。
刺参的前处理:将购回的刺参先在实验室环境中用过滤灭菌海水驯养3d,去除死亡或孱弱个体。挑选大小相近、健康的个体,用灭菌海水冲洗2次。然后用经火焰加热过的手术刀片在刺参背部和腹部分别划2道长度0.5cm的划痕,放于盆中饲养。每个盆中5～6头。
加入菌悬液:分别向盆中注入不同菌株的菌液,最终浓度均为108CFU/ml。空白对照组中加入与最大菌悬液注入量同剂量的过滤灭菌海水。
得到患病个体:每天观察各个盆中刺参的状况,记录并拍照。
1.2.2 刺参凝集素(AJL)的分离纯化
1.2.2.1 AJL粗提液的制备:
将患病个体捞出洗净,在冰块上解剖,用高速组织捣碎机捣碎,加2倍重量的0.15mol/L NaCl的PBS缓冲液[0.015mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, (1:20), pH 7.2],4℃、16h,离心(4℃、4 500r/min、60min),取上清,即为粗提液。
1.2.2.2 硫酸铵分级:
冰水浴下,向粗提液中加入研磨好的的固体硫酸铵至20%饱和度,4℃过夜,离心(4℃、4 500r/min、60min),弃沉淀取上清液。向上清液中加硫酸铵至75%饱和度,搅拌过夜(4℃),离心(条件同上),弃上清,收集沉淀于适量蒸馏水中溶解,用浓缩离心管脱盐至无SO42-(10%的BaCl2检验)。
1.2.2.3 DEAE-离子交换层析:
将上步所得的浓缩液上DEAE-纤维素柱(2.0cm×16cm),0～1 mol/L NaCl连续盐度梯度洗脱,缓冲液为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液,流速为30ml/h,3ml/tube,自动收集器收集,考马斯亮蓝法TU-1800型分光光度计测A595,洗脱至A595<0.01。检测每管的凝集活性,收集合并活力峰。
1.2.2.4 Sephadex G-100分子筛凝胶层析:
层析柱为2.0cm×75cm,洗脱液为生理盐水,流速20ml/h,3ml/tube,样品为经过浓缩并脱盐的离子交换层析得到的活力峰。检测每管的凝集活性,A595测定蛋白含量。
1.2.3 刺参凝集素性质
1.2.3.1 蛋白含量的测定:
以A595表示,以牛血清清蛋白作对照。
1.2.3.2 亚基分子量的测定:
采用SDS-PAGE方法,从标准蛋白质和刺参凝集素的迁移率来求得相对分子量[5]。
1.2.3.3 血凝活性的测定:
制备2%的红细胞悬液[6]。在96孔V型板上,40μL凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释,加入红细胞悬液40μL,振匀,室温下静置1.5～2h,肉眼观察。无凝集现象时红细胞沉积在V型孔底部呈一小圆点,有凝集现象时血球不下沉相互集聚成一片网络。血凝活性以产生凝集现象时的最小凝集素的量或凝集素最大稀释倍数表示[7]。比较3组凝集素(健康组、C6组和TB组)的活性。
1.2.3.4 热稳定性试验:
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为24.2g/L、23.5g/L、24.0 g/L,将3组凝集素分成若干份,每份0.5ml,分别在25～90℃的不同条件下温育,于10min、30min不同时间取样,冷却后测定血凝活性[6]。比较3组凝集素的热稳定性。
1.2.3.5 pH对血凝活性的影响:
参照李丹彤[6]方法配制pH 4.0～10.14的系列缓冲液。健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为24.2g/L、23.5g/L、24.0g/L。pH 4.0～6.0采用0.015mol/L的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液;pH 6.50～7.50采用0.015mol/L的磷酸盐缓冲液;pH 8.0～9.0采用0.015mol/L的Tris-HCl缓冲液;pH 9.5～10.14采用0.015mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。比较3组凝集素在不同pH条件下的血凝活性。
1.2.3.6 EDTA及二价金属离子对血凝活性的影响:
40μL EDTA、CaCl2、MgCl2溶液分别用生理盐水倍比稀释,加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的凝集素(健康组、C6组、TB组浓度分别为3.03mol/L、2.94mol/L、3.0mol/L),室温下静置15min,再加入40μL兔红细胞悬液,振匀,静置1.5～2h,比较3组凝集素的活性。
1.2.3.7 糖抑制实验:
糖或糖蛋白溶液40μL用生理盐水倍比稀释,加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的凝集素(健康组、C6组、TB组浓度分别为3.03g/L、2.94g/L、3.0g/L),室温下静置15min,再加入40μL兔红细胞悬液振匀,静置1.5～2h,比较3组凝集素的凝集结果。
2 结果
2.1 致病菌感染刺参个体
C6组、TB组刺参均在6～11d内出现预期病症,如体刺回收、腹部体色变浅,口部肿大,触手不能闭合,活动能力变差;接着口部、体表、体刺处出现大面积蓝白色溃烂斑。
2.2 刺参凝集素的分离纯化
组织捣碎后用PBS浸泡,离心得墨绿色粗提液;20%～75%硫酸铵分级沉淀得到黄绿色硫酸铵分级液;经DEAE-离子交换层析,初步得到活性物质,收集合并活力峰,浓缩脱盐;经Sephadex G-100分子筛凝胶层析,得到进一步纯化的活性物质,收集合并活力峰,浓缩脱盐,冷冻干燥的白色样品。纯化结果有关数据见表1、图1-6。
2.3 亚基分子量
在SDS-PAGE上显示一条带,与标准蛋白质比较,可计算出刺参凝集素亚基分子量为31 000Da(图7)。
1.标准蛋白; 2.健康组凝集素; 3.C6组凝集素; 4.TB组凝集素。
2.4 3组凝集素的血凝活性
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,用兔红细胞悬液进行血凝活性试验(表2)。
结果表明C6组刺参不仅凝集素含量高,而且活性较健康组和TB组强。
2.5 热稳定性
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,结果图7表明:在90℃、30min热处理后,均对兔红细胞显示出凝集活性,但活性下降50%。在25～70℃温育30min,活性均未见改变(表3)。
2.6 pH对3组凝集素血凝活性的影响
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,结果表明:当4.0≤pH≤7.5时,活性均无变化;当pH≥8.0时,活性均下降了50%(表4)。
2.7 EDTA及金属离子对3组凝集素血凝活性的抑制作用
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为0.18g/L、0.17g/L、0.18g/L,结果表明3组凝集素对兔红细胞的凝集活性保持不变,未出现凝集抑制现象。
2.8 糖抑制试验
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为0.18g/L、0.17g/L、0.18g/L,兔红细胞进行检测,结果表明3组凝集素不被所测试的单糖、二糖、三糖、聚糖所抑制,仅被牛甲状腺球蛋白抑制,最小抑制浓度分别为1.55mg/ml、1.45mg/ml、1.55mg/ml(表5)。
注:-表示无抑制作用。
3 讨论
用20%～75%饱和度的硫酸铵分级沉淀3组粗提液,得到的分级液纯化倍数均为粗提液的3倍,总活力回收率均超过95%,与李丹彤的结果一致[6]。分析其原因可能是粗提液中含有抑制剂,像多聚糖,它可以抑制凝集素的活性或阻碍凝集素与血红细胞的结合,抢占红细胞膜上凝集素的结合位点等[8,9]。因硫酸铵分级沉淀纯化倍数不高,所以有研究认为动物凝集素的纯化可不经硫酸铵分级沉淀[10],直接采用离子层析和分子筛凝胶过滤等方法。
用DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100凝胶层析进行纯化后,所得蛋白收获率(平均值为0.39%)及活性收获率(平均值为7.7%)都较小,一次处理样品量小。活力峰均在蛋白峰之前,说明凝集素在刺参体内蛋白质中属于离子强度偏小、分子量偏小的生物大分子。
凝集素亚基分子量测定用SDS-PAGE方法,测得结果为31 000Da,根据李丹彤结果[6],推断刺参凝集素含有两个相同亚基单位。
从血凝活性的结果看,表明C6组刺参不仅凝集素含量高,而且活性较健康组和TB组强。
3组凝集素在25～70℃活力保持不变,在80～90℃温育30min后均保留50%的血凝活性,表现出强的热稳定性。
当4.0≤pH≤7.5时,3组凝集素活性均无变化,当pH≥8.0时,活性均下降了50%,具有广泛的pH作用范围。
EDTA及二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对3组刺参凝集素的血凝活性均无影响。因此可推断刺参凝集素在进行凝集活动时,不需要二价离子的参与[6]。
糖抑制实验表明,3组凝集素均不被所测试的糖类所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白抑制,其中C6组凝集素活性更易受到牛甲状腺球蛋白的影响,与李丹彤的结果一致[6]。
推断菌株C6(Tenacibaculum属的一种菌)可诱导刺参体内产生大量的凝集素,但产生的大量凝集素更易受到牛甲状腺球蛋白的抑制,此结论有待进一步证实。
摘要：目的:研究刺参免疫机制,探寻其发病机理。方法:刺参(Apostichopus japonicus)经磷酸盐缓冲溶液抽提、2075%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100柱层析,得到刺参凝集素(AJL)。结果:经SDS-PAGE显示单一条带,亚基相对其分子量为31000。分别提取感染Tenacibaculum属和Vibrionales属两种刺参烂皮病病原菌的刺参凝集素,感染Tenacibaculum属病菌刺参的凝集素产量较大,但凝集兔红细胞的作用均不被所测试的单糖和寡糖所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白所抑制。凝集兔红细胞的作用均不被二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及EDTA所抑制。在pH4.010.14系列缓冲液中均有活性,其中在pH4.07.5时活性最大。该凝集活性在90℃加热30min后凝集活性仅损失50%。结论:推断菌株Tenacibaculum可诱导刺参体内产生大量的凝集素。
关键词：刺参,病原菌,凝集素,纯化,性质
参考文献
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凝集反应 篇6
1 材料来源
2012年11月到2013年12月在本院血常规检验中发现的冷凝集标本共22份。其中男性标本10份, 女性标本12份。
2 方法
2.1 仪器和试剂
日本S y sm ex公司X E-2 1 00全自动血液分析仪和原装试剂, 以及高、低浓度两水平质控品。仪器在日常工作中随机检测, 结果均在控。医用温、湿度计为上海仪表集团生产。
2.2 检测方法
血液分析仪出现RB C Ag gl ut (红细胞凝集) 和Turb/HGB (混浊/血红蛋白干扰) 等报警信息, 标本可用肉眼观察到试管壁上明显的小片状凝块, 颠倒混匀后凝块仍存在, 推片后显微镜下可观察到红细胞凝集现象, 置37℃水浴30min后, 试管壁上小片状凝块消失, 判断为红细胞冷凝集。采取4种处理方法: (1) 将标本置37℃水浴15min后立即在XE-2100上检测; (2) 将标本和试剂全置于37℃水浴15min后立即在XE-2100上检测; (3) 将室温提高到25℃后半小时, 再进行检测分析; (4) 室温直接检测。
注:t值与P值略, *表示与直接检测比较, P<0.05
2.3 统计分析
采用S P S S 1 0.0软件进行统计学处理分析。计量资料以 (±s) 表示, 采用配对t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果 (表1)
四种处理方法中, WBC、HGB、PLT结果相近, 而双重加温法与室温25℃检测中RBC、HCT、MCV、MCH、MCHC结果, 与直接检测、标本加温法间存在很大差异。
4 讨论
冷凝集是指人体被一些特殊病原体感染后, 血清中产生的高效价寒冷凝集素, 能和自己体内的红细胞在低温下出现凝集状态, 一般在16℃以下可能发生凝集现象, 0~4℃时最易和红细胞膜抗原结合[1]。很多疾病, 如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淋巴系统增殖性疾病、自身免疫性疾病, 某些病毒和支原体感染、癌症、白血病、妊娠等都可出现冷凝集[2]。当标本出现冷凝集时, 数个红细胞凝集在一起, 一并通过红细胞计数小孔, 导致RBC计数、HCT结果假性偏低;而根据RBC、HCT计算出的MCV、MCH、MCHC造成假性偏高, 影响结果的准确性。而HGB是采用SLS (SULFOLYSER) 检测方法测定, 故冷凝集对HGB无影响;因方法的不同, WBC和PLT检测结果也无太大影响。同行中已经有不少这方面相差的报道, 但很少关注到实验室的温湿度[3,4,5]。
笔者发现, 标本单独加温后上机检测, 仪器仍有RBC报警, 结果与处理前差异不大, 说明冷凝集现象并未消除。分析应该是有冷凝集现象的标本一遇温度较低的仪器进样针、样品旋转阀、反应室、检测器及试剂时立即出现了凝集现象, 室温越低影响越大。
标本和试剂双重加温后, 标本内的冷凝集现象被消除, 而被升温后试剂浸泡的仪器各部件温度也已经上升, 不会再诱发冷凝集, 排除了冷凝集素的干扰, 使红细胞在检测过程中不再凝集, 结果准确可信。但要将各种试剂浸泡在水浴中升温, 比较麻烦。笔者利用空调将室内温度调节稳定至25℃, 此时的标本冷凝集现象消除, 血液分析仪及试剂的温度也已经升高, 在检测过程中不会再诱发冷凝集现象, 可以说是最有效、最便捷的方式。
综上所述, 遇到冷凝集标本, 应采用标本和试剂双重加温法, 或者利用空调将室温稳定在25℃左右再进行检测, 可有效避免因冷凝集现象而出现RBC、HCT假性偏低, MCV、MCH、MCHC假性偏高的情况, 尽可能保证结果准确。这些措施在基层医院实验室也可很好做到。
参考文献
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[4]魏国庆.红细胞冷凝集现象引起血细胞计数异常一例报告[J].青海医药杂志, 2011, 41 (4) :49.
凝集反应 篇7
1 按GB/T 18646-2002方法
第一管中加入1.15m L稀释液。第2~4管各加入0.5m L稀释液。用1m L吸管取被检血清0.1m L;加入第1管内, 并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸入吸管内, 再沿试管壁吹入试管中, 如此吸入、吹出3~4次, 充分混匀后以该吸管吸混合液0.25m L弃去。取0.5m L混合液加入第2管, 用该吸管如前述方法混合。再吸第2管混合液0.5m L至第3管, 如此倍比稀释至第4管, 从第4管弃去混匀液0.5m L。
2 建议改进的方法
本方法有两方面的改进:其一是用移液器取代吸管, 其二是按比例将原方法中第一管的1250μL体系变成1000μL体系, 按如下操作:
第一管中加入920μL稀释液。第2~4管各加入500μL稀释液。取被检血清80μL, 加入第1管内。将移液器调至500μL刻度吹打混合均匀, 取500μL混合液加入第2管混匀。再吸第2管混合液500μL至第3管, 如此倍比稀释至第4管, 从第4管弃去混匀液500μL。
鹿、牛等血清的稀释可依本法按比例变成1000μL体系, 为960μL稀释液+40μL待检血清。
3 讨论
两种方法的血清稀释度相同, 从第1至第4管的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100, 只是在稀释液和血清的用量上有所差异, 阴阳结果的符合率为100%。在大批量检测中, 后者有明显的优势, 比前者减少了一次弃液, 降低了气溶胶产生的概率, 操作快速、简便, 并且能够减少肉眼衡量吸管刻度的主观因素, 结果更为稳定客观, 更适合应用于布病试管凝集试验。