反应体系（精选12篇）
反应体系 篇1
南瓜属 (Cucurbita) 是一个大族群, 包括5个栽培种:中国南瓜 (Cucurbitamoschata) , 美洲南瓜 (C.pepo) , 印度南瓜 (C.maxima) , 灰籽南瓜 (C.mixta) 和黑籽南瓜 (C.ficifolia) , 在中国栽培比较多的是前三种。南瓜中有一特殊的类群称为“观赏南瓜” (orna-mental gourd) , 也叫微型南瓜、玩具南瓜或“迷你型”南瓜, 以其果型小、奇特, 色彩艳丽, 适合赏玩而深受人们喜爱[1]。前人对南瓜的亲缘关系进行了同工酶和RAPD的研究[2,3,4,5,6,7], 但观赏南瓜的研究目前尚停留在栽培方面, 还未见对观赏南瓜进行分子标记方面的专门研究的报道。
ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) 是继SSR后发展出来的新型分子标记, 是由Zietkiewicz等[8]在1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。ISSR技术以其操作简单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力强、所需DNA模板的量少而倍受青睐。
本文以观赏南瓜基因组DNA为模板, 探讨ISSR-PCR反应体系中6种因素对扩增的影响, 以期获得观赏南瓜ISSR扩增的最佳反应体系, 为进一步探究观赏南瓜培育品种的遗传多样性, 指导制定科学的培育方案奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料来源
供试材料是西南大学园艺园林学院多代自交留种的观赏南瓜材料, 每个材料播种5粒, 当苗龄约20天左右, 具有2~3片真叶时, 取5株的新叶混合, 提取总基因组D N A。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取
采用改良CTAB法提取。
1.2.2 ISSR原初扩增条件及PCR扩增程序
ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学 (University of British-Columbia, ) 提供的序列, 由上海生工生物工程公司合成。原初的扩增反应条件是25μL PCR反应体系包括:10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/LMg C12, 0.25 mmol/L d NTPS, 20 ng模板DNA, 引物0.6μmol/L (上海Sangon公司) , 1 U Taq酶 (鼎国) 。初步设定的ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min, 94℃变性45 S, 52℃退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 共35个循环;72℃完全延伸5 min。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶 (含0.5 g/m LTE溴化乙锭) 中电泳 (电泳缓冲液为1×TAE) , 采用DL2000 DNA Marker (Ta Ka Ra) 作标准分子量参照物。
1.2.3 退火温度的确定
采用PCR温度梯度模式, 自动设定温度从48~60℃, 生成的温度梯度为48℃、48.1℃、48.8℃、49.9℃、51.3℃、52.8℃、54.5℃、56.1℃、57.7℃、59.0℃、59.9℃、60.5℃。其余PCR扩增程序同1.2.2, 以确定最合适的退火温度。
1.2.4 观赏南瓜ISSR-PCR扩增反应体系的优化
ISSR-PCR扩增反应体系的优化按常规采用单因素试验, 共试验了5个因素各5个水平 (表1) 。其余条件同原初扩增条件。
2 结果与分析
2.1 退火温度对ISSR扩增的影响
理论退火温度往往与实际退火温度存在差异, 所以对于退火温度的确定是很重要的。从图1可以看出, 退火温度对于扩增的影响还是很大的。当退火温度处于48.8~52.8℃之间时, 低分子量条带连接在一起, 条带模糊。当退火温度升高至54.5℃, 条带清晰明亮, 数目最多。当退火温度继续从56.1升高至59.0℃时, 条带数目明显减少, 亮度减弱。综上所述, 观赏南瓜ISSR扩增的最适退火温度为54.5℃。
2.2 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响
Mg2+对ISSR扩增的特异性和产量有显著的影响。Mg2+浓度过高, 反应特异性降低, 出现非特异扩增, 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性, 使反应产物减少。实验结果显示:Mg2+浓度为2mmol/L时条带最亮;浓度较低时条带稍暗;浓度为2.5和3.0时低分子量条带很模糊, 甚至很难看清, 中间的非特异性条带增多 (见图2) 。因此选择2 mmol/L Mg2+浓度用于观赏南瓜ISSR-PCR扩增。
2.3 d NTPs浓度对ISSR扩增的影响
d NTPs作为扩增的底物, 对于扩增条带影响是很大的。底物浓度太低, 扩增产物不完全, 底物浓度太高, 又会出现非特异性扩增。比较d NTP浓度的5个梯度可知 (见图3) , 当d NTP浓度为0.25~0.3 mmol/L时扩增条带清晰, 亮度高;等于或低0.2 mmol/L时, 扩增条带少且弱, 选用d NTP浓度为0.25 mmol/L用于观赏南瓜ISSR-PCR扩增。
2.4 Taq酶单位对ISSR扩增的影响
Taq酶浓度是影响PCR反应的重要因素。增加Taq酶量会导致反应特异性下降, 且成本提高, 造成浪费。若酶量过低则会导致合成速率下降。Taq酶单位的变化也对条带的数量和强弱影响较大。随所加Taq酶单位的逐渐增多, 条带的数量开始减少, 并出现严重的拖带。从图4即可判断出0.5 U是5个梯度中最适的Taq酶单位。
2.5 模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
PCR反应中对模板DNA浓度要求的范围通常较宽, 但最佳的DNA模板浓度范围取决于研究的物种、类群以及DNA模板纯度。本研究对不同量的模板DNA分别进行了PCR扩增, 发现80ng的模板DNA浓度用于观赏南瓜ISSR-PCR扩增为最佳选择 (图5) 。
2.6 引物浓度对ISSR扩增的影响
在引物浓度等于或低于0.2μmol/L时, 扩增条带较少, 且亮度较弱, 从0.4μmol/L开始, 扩增条带亮度减弱, 清晰度下降。重复实验结果显示, 均以引物浓度为0.6μmol/L时, 扩增条带最清晰、稳定 (见图6) 。故确定0.6μmol/L为观赏南瓜ISSR-PCR反应的最适引物浓度。
3 讨论
ISSR-PCR扩增易受诸多因素的影响如:Mg2+、d NTPs、ISSR引物的浓度, Taq DNA聚合酶、模板DNA的用量和引物适宜退火温度等。因此, 要保证观赏南瓜ISSR-PCR实验结果的稳定性、重复性和可信性, 必须针对各自的仪器设备、不同来源的试剂以及影响PCR扩增的主要因子进行适当地调整、筛选和优化。试验表明, 只要反应条件保持不变, 反应体系中多种试剂来源和浓度保证一致并严格控制反应程序的各个环节及各个循环参数的稳定性, 重复结果是不难得到的。
参考文献
[1]孙丽, 李桂荣, 刘弘.观赏南瓜优良品种与栽培技术.安徽农业科学, 2006, 34 (9) :1839-1840.1851
[2]漆小泉, 东惠如, 胡是林.南瓜属三个种过氧化物酶和酯酶同工酶分析.园艺学报, 1989, 16 (4) :299-304
[3]区炳庆, 任吉君, 何丽烂.不同品种南瓜POD及PPO同工酶的比较研究.武汉植物学研究, 2003, 21 (1) :77-80
[4]孙正海, 李跃建, 宋明, 等.南瓜属三个种种质的遗传多样性.西南农业学报, 2004, 17 (1) :71-73
[5]李海真, 许勇, 武峻新, 等.南瓜属三个种的亲缘关系与品种的分子鉴定研究.农业生物技术学报, 2000, 8 (2) :161-164
[6]刘小俊, 李跃建, 赵云, 等.到中国部分栽培南瓜种质资源遗传多态性RAPD分析西南农业学报2004, 17 (5) :567-571
[7]李俊丽, 向长萍, 张宏荣, 等.南瓜种质资源遗传多样性的RAPD分析.园艺学报.2005, 3 (25) :834-839
[8]Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D.Genome finger-printing by simple sequence repeat (SSR) —anchored polymerase chain reaction amplification.Genomics, 1994, 20:176-183
反应体系 篇2
导意见
国食药监安[2011]466号
2011年11月09日 发布
各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局），新疆生产建设兵团食品药品监督管理局：
为落实医药卫生体制改革相关要求，进一步完善药品不良反应报告和监测体系，提高监测、评价和安全预警能力，保障公众用药安全，根据《药品不良反应报告和监测管理办法》，现就加强药品不良反应监测体系建设提出以下指导意见：
一、指导思想、基本原则和总体目标
（一）指导思想：深入贯彻落实科学发展观，大力践行科学监管理念，以深化医药卫生体制改革为契机，以保障人民群众用药安全有效为目的，以提高监测评价能力为重点，全面加强药品不良反应监测体系建设，保证公众用药安全。
（二）基本原则：按照地方政府对药品安全监管负总责的要求，在遵循国家确定的编制、人员、经费等基本建设标准的基础上，结合本地区人口数量、经济发展水平和用药情况，坚持统筹兼顾、合理配置、分级管理、加强指导、高效运转的原则，强化各级药品不良反应监测机构建设。各级药品不良反应监测机构在当地食品药品监督管理部门的组织领导下，按照职能和工作任务要求，健全工作机制、完善工作程序、提高队伍素质，确保各级监测机构职能分工明确、规模结构适用、监测应急到位，并接受上级药品不良反应监测机构的业务指导，形成管理规范、运行有序的良好局面。
（三）总体目标:力争通过五年时间，全国各级药品不良反应监测机构逐步健全，规章制度不断完善，监测行为日益规范，预警应急能力显著提高，形成比较完善的全国药品不良反应监测体系，基本满足保障人民群众用药安全有效的需求。
二、职责分工
（四）国家药品不良反应监测机构：在国家药品监督管理部门的领导下，负责全国药品不良反应报告和监测的技术工作。承担国家药品不良反应报告和监测资料的收集、评价、反馈和上报，以及全国药品不良反应监测信息网络的建设和维护；组织开展严重药品不良反应的调查和评价，协助药品监督管理部门和卫生行政部门开展药品群体不良事件的调查；制定药品不良反应报告和监测的技术标准和规范，对地方各级药品不良反应监测机构进行技术指导；负责对药品生产企业开展的重点监测进行监督、检查，并对监测报告进行技术评价；发布药品不良反应警示信息；承担药品不良反应报告和监测的宣传、培训、研究和国际交流工作。
（五）省（区、市）药品不良反应监测机构：在省（区、市）药品监督管理部门领导和国家药品不良反应监测机构的业务指导下，负责本行政区域内药品不良反应报告和监测的技术工作。承担本行政区域内药品不良反应报告和监测资料的收集、评价、反馈和上报，以及药品不良反应监测信息网络的维护和管理；组织开展本行政区域内严重药品不良反应的调查和评价，协助药品监管部门和卫生行政部门开展药品群体不良事件的调查；对设区的市级以及县级药品不良反应监测机构进行技术指导；负责对药品生产企业开展的重点监测进行监督、检查，并对监测报告进行技术评价；组织开展本行政区域内药品不良反应报告和监测的宣传、培训工作。
（六）设区的市级以及县级药品不良反应监测机构：在同级药品监督管理部门领导和上级药品不良反应监测机构的业务指导下，负责本行政区域内药品不良反应报告和监测资料的收集、核实、评价、反馈和上报；开展本行政区域内严重药品不良反应的调查和评价；协助药品监管部门和卫生行政部门开展药品群体不良事件的调查；对药品生产、经营、使用单位开展药品不良反应报告与监测工作进行技术指导；组织并开展本行政区域内药品不良反应监测工作的宣传普及和教育培训工作。
三、建设要求
（七）组织机构：各级药品监督管理部门应综合考虑本地区人口数量、经济社会发展水平、药品不良反应报告数、医药企业数、用药水平等因素，合理制订本级药品不良反应监测机构设置标准和要求，建立健全药品不良反应监测机构，开展本行政区域内药品不良反应报告和监测工作。
国家药品不良反应监测机构：作为国家药品监督管理部门的直属技术机构，按照中央编办要求按独立法人单位建设。省（区、市）药品不良反应监测机构作为省（区、市）药品监督管理部门的直属专职技术机构，一般按照独立法人单位建设。设区的市级药品不良反应监测机构一般按照本级药品监督管理部门直属专职技术机构建设，设置药品不良反应报告和监测工作机构，配置人员和办公场所。县级药品监督管理部门应安排专门部门及人员负责药品不良反应报告和监测工作，有条件的可设置药品不良反应监测机构，配置人员和办公场所。
（八）监测队伍:要选拔业务素质强、专业水平高的人员充实到监测岗位，以医学、药学及流行病学等专业背景人员为主构建监测技术骨干团队。要加强业务培训，使各级监测机构人员准确掌握药品不良反应监测工作的各种技能和方法，提高监测工作能力和水平。建立健全各级药品不良反应监测专家库，充分发挥专家在药品不良反应监测与评价中的决策咨询和技术指导作用。
（九）监测装备：药品不良反应监测机构应有固定的工作场所，各级药品不良反应监测机构根据工作任务需要，配备可上网的电脑、电话、传真机、打印机、复印机、投影仪、碎纸机、照相机、摄像机、录音笔等常规的设备；配备信息系统建设所需的服务器等；配备符合现场调查、应急处置需要的交通工具、移动电话、笔记本电脑、录影摄像设备及无线上网等相关设施与设备。
（十）信息化建设：信息化建设是药品不良反应监测体系基础设施建设的重要组成部分，信息技术的有效应用是提升药品安全监测与评价技术水平、管理水平、服务能力的重要手段。各省及省以下药品不良反应监测机构应按照国家药品不良反应监测中心统一规划、部署和要求，统筹规划、分步实施，做好行政区域内信息化工作的组织、协调与落实，加强网络系统的日常应用、维护与管理，保障网络系统安全、有效运转。
四、工作重点
（十一）建立健全药品不良反应监测工作机制。按照药品不良反应监测工作的职责要求，围绕病例报告的上报、分析、评价、信息反馈和预警应急等环节,进一步建立健全药品不良反应监测工作的制度和程序，细化监测工作的实施细则、操作流程和工作标准,提高监测工作的制度化、规范化和科学化水平。进一步强化对药品群体或严重不良事件的应急处置工作，规范调查程序，落实监管责任，促进基层药品监督管理部门对于群体和严重药品安全事件在调查的基础上尝试预研预判工作，提高风险信号检出的灵敏度和应急措施的有效性和针对性，切实做到安全隐患 “早发现、早报告、早评价、早控制”。
（十二）提高药品不良反应监测队伍的分析评价能力。要加强基层药品不良反应监测机构和队伍建设，吸引优秀的专业人才投身到监测事业。要加强对监测队伍的培训和指导，加强对基层药品不良反应监测人员业务能力的培养，充分调动现有药品不良反应监测体系的工作效能，提高省级药品不良反应监测机构的综合分析评价水平，提高地市级药品不良反应监测机构的调查评价能力。要制定相关技术原则，规范监测报告行为，提高对病例报告的分析评价水平，促进药品安全性信号的快速报告准确处理。
（十三）夯实报告收集上报的基础。督促行政区域内药品生产、经营企业和医疗机构建立药品不良反应报告和监测管理制度，提高监测和报告意识，主动承担药品不良反应报告和监测的责任。通过培训带动、手册指导和讨论交流等多种形式，深化病例报告的质量评估和反馈，提高药品生产经营企业和医疗机构的认识水平及能力，促进病例报告表格信息填报完整、内容准确规范。
（十四）强化药品安全的预警与应急工作。建立健全风险评估和预警体系，做好对药品风险信号的提取与分析工作，对可能发生的药品质量安全问题及时预警,对可能存在安全隐患的药品及时抽验，必要时应立即采取暂停销售使用等控制措施。深化群发或者死亡的不良反应病例的现场调查，准确掌握病例的基本信息、药品使用情况、不良反应发生及诊治情况等，为分析评价工作奠定信息基础。加强应急培训与指导，提升应急处置能力。
（十五）提高药品不良反应监测信息的利用水平。深入开展药品不良反应病例报告和信息的分析工作，提高药品不良反应监测数据分析评价水平，及时将安全用药信息反馈给医疗机构，指导临床合理用药，维护患者健康。积极对公众开展药品不良反应知识的普及和宣传，提高社会公众正确认识药品不良反应、主动防范药品风险的意识，为药品不良反应监测工作创造良好的社会环境。积极尝试重点监测、药物流行病学研究、信号检出等方式，主动利用不良反应监测信息开展研究，提高药物警戒工作水平。
（十六）提高药品生产企业的风险防范意识。督促药品生产企业落实药品不良反应监测报告责任，按要求提交定期安全性更新报告，严格落实药品不良反应报告责任制和重大质量事故报告制度，建立健全企业主动防范药品安全风险的工作机制。引导企业将不良反应监测数据和本企业生产及质量管理等情况相结合，主动排查消除药品生产环节的安全隐患，发现问题后主动采取修改说明书、召回等措施，有效防范重大药品安全事故的发生。
（十七）引导医疗机构深化药品不良反应监测工作。各级药品监督管理部门应加强与同级卫生行政部门的沟通协调，将药品不良反应监测的考核与医院质量管理评估相结合，形成工作合力，提高临床医护人员、药师对药品不良反应的识别能力和分析判断能力，提高医疗机构的报告意识。加强对医疗机构的培训和指导，加强病例报告的质量评估和反馈，提高报告质量。
五、保障措施
（十八）切实加强组织领导。各地要着眼深化医药卫生体制改革全局，把加强省及省以下药品不良反应监测体系建设作为一件大事摆在重要位置。各级药品监督管理部门要紧密结合本地区实际，抓紧研究制订加强药品不良反应监测机构建设的工作计划和方案，并认真组织实施。要坚持一把手亲自抓、分管领导具体抓，切实加大组织领导和统筹协调力度，同时建立健全督查考核机制，着力推动机构建设各项目标任务的落实。要主动加强与同级卫生、机构编制管理、财政等部门的沟通协商，并有效调动各方面的积极性和主动性，形成推进机构建设的合力。
（十九）着力强化资金保障。各级药品监督管理部门要根据体系建设需要，在充分利用国债和中央转移支付等项目的基础上，积极向地方财政争取配套资金，并将药品不良反应监测经费纳入部门预算予以重点保障。无中央转移支付支持的省市，应积极向地方财政争取相应的资金，纳入部门预算予以重点保障。要对建设资金和药品不良反应监测经费使用等情况实行归口管理，强化监督检查和跟踪指导，努力提高资金使用效益，为扎实推进机构建设和监测工作创造良好条件。
（二十）建立健全推进机制。各地要以提高监测能力为中心，合理确定各级机构职责，规范监测工作流程，构建监测网络平台，强化监测队伍建设，确保机构高效运行，全面提高监测水平和预警能力。在推进体系建设过程中，要善于发现问题和薄弱环节，积极向当地政府和上级部门反映，并努力寻找解决办法。各省（区、市）药品监督管理部门要善于发现地市、县级药品监督管理部门在机构建设中的典型经验和创新举措，及时在本地区总结推广，不断提高工作的科学性、针对性和实效性。
国家食品药品监督管理局
反应体系 篇3
关键词：杨梅；iPBS-PCR；体系优化
中图分类号： S667.601文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0051-04
收稿日期：2015-05-13
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）2011]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2012361）；国家公益性行业（农业）科研专项（编号：20120389）；江苏省农业三新工程[编号：SXGC（2014）076]。
作者简介：郭志海（1965—），男，江苏江阴人，高级农艺师、副教授，主要从事园艺种质资源研究。E-mail：Gzh8115@163.com。
通信作者：王鹏凯，讲师，主要从植物分子生物学研究。E-mail：mengxiao02181@hotmail.com。杨梅（Myrica rubra） 是杨梅科杨梅属常绿小乔木，原产于我国，主要生长在长江流域以南的丘陵山地。杨梅果实营养丰富，具有较强的保健功能，是南方经济效益较高的水果之一[1]。我国杨梅栽培历史悠久，生态环境的多样性产生了性状多样的品种、品系和类型，形成了丰富的种质资源。利用形态学、同工酶等方法鉴定杨梅种质资源局限性大、效率低。因此，常利用分子标记对杨梅种质资源进行分析，包括遗传多样性、亲缘关系分析、品（杂）种鉴别等方面。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR、iPBS、ScoT等技术[2-7]在杨梅中都已得到应用[8]。
iPBS是以LTR类反转录转座子保守位点设计引物进行扩增的一种分子标记技术，针对LTR类反转录转座子中2个PBS（引物结合位点）区间进行扩增[9]。该方法简单、有效，可节约大量人力、物力，不用预先获知LTR序列，直接进行引物筛选。目前，该技术已经成功应用于亚麻[10]、大麦、小麦、苹果、玉米[9]、葡萄[11]等的研究。当材料、方法不同时，需对扩增条件进行优化才能得出更科学的标记谱带。本研究利用单因素试验对杨梅iPBS-PCR反应体系进行优化，通过对电泳结果的分析建立了杨梅iPBS-PCR反应体系。同时利用该反应体系对已有的iPBS引物进行初步筛选，研究结果将为使用iPBS标记评价、鉴定杨梅种质资源提供了技术基础。
1材料与方法
1.1试验材料
试验所用的杨梅种质资源材料均采自江苏省太湖常绿果树技术推广中心国家杨梅种质资源圃，杨梅品种为晚稻（浙江舟山）、狗色头（江苏常熟）、浪荡子（江苏苏州东山）。PCR试剂购于TaKaRa公司（10×rTaq buffer，2.5 μmol/L dNTP，25 μmol/L MgCl2，5 U/μL rTaq ），引物由上海生工合成（溶解至10 μmol/L）。
1.2试验方法
1.2.1杨梅DNA提取与检测杨梅基因组DNA提取采用改良CTAB快速提取法[12]。将杨梅嫩叶直接在CTAB提取液中匀浆，经过抽提、沉淀、溶解等步骤得到基因组DNA溶液。获得的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。通过紫外分光光度计测定260、280 nm 处的吸光度，用于测算DNA纯度（D260 nm/D280 nm）、浓度（D260 nm）。完成浓度测定的DNA溶液进一步稀释成10 ng/μL的工作液，用于后续PCR反应。
1.2.2杨梅iPBS-PCR反应体系优化杨梅iPBS-PCR扩增反应总体积为20 μL，选择在葡萄iPBS-PCR反应体系优化中使用的2249引物（5′-AACCGACCTCTGATACCA-3′）进行PCR扩增（预试验结果显示该引物在杨梅中扩增效果较好）[11]。采用单因素法对2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L Mg2+、10 μmol/L引物、模板用量进行试验，其中包括：（1）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，0.2 μL Taq酶，1.6 μL dNTP，Mg2+用量设为1.2、1.4、1.6、1.8 μL，DNA模板用量设为5、10、15、20、25、30、50 ng，用以确定最佳Mg2+和模板DNA用量。（2）2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL dNTP，1.6 μL Mg2+，0.2 μL Taq酶，2 249引物用量设为1、2 μL，DNA模板用量设为10、20、30、40 ng，用以确定引物与模板的最佳比例和用量；（3）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，30 ng DNA模板，0.2 μL Taq酶，1.6 μL Mg2+，dNTP用量设为1.2、1.6、2.0 μL，用以确定dNTP的最佳用量。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳方法进行检测，通过紫外凝胶成像系统对不同反应体系进行评价，筛选出适合杨梅iPBS-PCR最佳反应体系。
1.2.3杨梅iPBS-PCR反应程序本试验中杨梅iPBS-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，49～59 ℃（2 ℃/梯度，共6个梯度）退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保温。PCR产物评价方法与“1.2.2”节相同，显示出退火温度对杨梅iPBS-PCR反应的影响，用以确定最佳退火温度。
nlc202309021028
2结果与分析
2.1基因组DNA提取与质量控制
电泳检测结果（图1）表明得到的杨梅基因组DNA主带明亮，无明显拖尾，经RNA酶处理后RNA降解较好。分光光度计检测结果表明70 mg新鲜叶片可以得到2～3 μg基因组DNA，经RNA酶处理后D260 nm/D280 nm在1.65～1.90之间，纯度较好。
2.2PCR反应各因素对iPBS-PCR扩增反应的影响
选用3个品种的杨梅基因DNA进行iPBS-PCR反应，测试不同反应体系下的扩增效果，筛选PCR反应各因素的优化组合。
2.2.1Mg2+浓度对iPBS-PCR的影响PCR反应中的Mg2+对扩增的特异性和Taq酶活性有明显的影响。随着Mg2+用量的增加，扩增出的谱带逐渐增多且亮度也逐步增加，弥散情况基本良好，有利于谱带的判读；但Mg2+用量增至1.8 μL时，部分谱带的弥散程度有所增加，可能增加差异较小的谱带判读难度，进而影响后续的结果分析。为了结果的一致性，在测试时设置了7个模板用量（5、10、15、20、25、30、50 ng），发现Mg2+用量对iPBS-PCR的影响在不同模板量的情况下是一致的（图2）。因此，在本研究中1.2～1.8 μL Mg2+用量均适宜杨梅的iPBS-PCR反应，但是为了平衡谱带数量和判读质量，在后续试验中Mg2+用量固定为1.6 μL。
2.2.2模板DNA用量对iPBS-PCR的影响模板用量是PCR体系的重要影响因素，杨梅iPBS-PCR的预试验中就发现100 ng以上的模板用量会导致扩增失败。当Mg2+用量固定为1.6 μL时在5～50 ng模板量范围内，模板量的改变对iPBS-PCR影响较大（图3）。当模板量增加时，扩增出的谱带逐渐增多、亮度也有所增加，并且这种影响在3个杨梅品种中具有一致性；对于得到谱带较多的品种，当模板量增至50 ng时弥散程度增加，影响了结果分析。因此 综合考虑以上结果，确定后续试验中模板DNA用量为30 ng。
2.2.3引物用量对iPBS-PCR的影响引物用量对扩增的特异性和谱带的清晰度有明显影响。当引物用量由1 μL增加至2 μL后，谱带数量减少且弥散情况比较严重， 谱带的特
征性也发生变化；本试验中同时使用3个品种、4个模板梯度，电泳结果显示引物用量增加对杨梅iPBS-PCR的影响是一致的（图4）。因此，综合分析电泳结果，确定后续试验中引物用量为1 μL。
2.2.4dNTP用量对iPBS-PCR的影响dNTP用量与PCR反应的扩增效率关系密切。当dNTP用量为1.2 μL时，扩增效率低、谱带亮度不足；随着dNTP用量增加，条带逐渐变亮，但是过多的dNTP（2.0 μL）会使谱带中的主带亮度大大增加，从而影响其它条带的判读（图5）。因此，后续试验中dNTP用量确定为1.6 μL。
2.2.5杨梅iPBS-PCR最优化体系通过一系列的单因素测试，综合分析电泳结果，建立20 μL杨梅iPBS-PCR扩增体系（表1）。
表1杨梅iPBS-PCR优化体系
成分加入量（μL）10×Taq buffer2.025 mmol/L Mg2+1.62.5 mmol/L dNTP1.610 μmol/L 引物1.05 U/μL Taq酶0.210 ng/μL 模板DNA1.0灭菌ddH2O12.6
2.3退火温度对扩增反应的影响及杨梅iPBS-PCR优化体系验证
2.3.1退火温度对iPBS扩增反应的影响PCR程序中的退火温度直接决定了引物扩增的效果，对产物的特异性有重要的影响。在分子标记中，退火温度可以直接影响谱带特征。报道的引物2249理论退火温度为51 ℃，合成报告Tm值为53 ℃，为检测不同退火温度对扩增反应的影响，以浪荡子为材料，在“2.2.5”节优化体系的基础上设置49～59 ℃（2 ℃/梯度）共6个退火温度进行扩增反应；电泳结果显示随着退火温度的升高，得到的谱带逐渐减少，谱带特征发生很大变化（图6）；比较发现以Tm值（53 ℃）为退火温度得到的谱带数目较多且比较清晰， 因此在选择不同引物退火温度时推荐使用Tm值作为参考进行上下调节。
2.3.2优化体系下的扩增效果从杨梅资源圃中随机挑选10个品种提取DNA，并在已报道的iPBS引物中随机选择4条引物，以优化后的反应体系为基础、引物Tm值作为退火温度，进行iPBS-PCR扩增反应，验证优化体系和退火温度设置的有效性。结果（图7）显示，4条引物均扩增出清晰的谱带且多态性明显，说明上述优化体系的确适用于杨梅iPBS分子标记。
3结论与讨论
高等植物中过半的重复DNA由反转录转座子组成，它们散布于各染色体上，是动态的基因组组件，有能力整合新的拷贝，促进内部染色体重组[13]。用其开发分子标记，信息量高，多态性好，但是iPBS分子标记也是基于PCR反应的分子标记，虽然多态性非常丰富，但是与其他分子标记一样受到多种因素的影响。试验的稳定性和可靠性与PCR反应体系和条件关系很大，因此在使用前需要对反应体系进行优化。PCR体系中的各个组分不仅在绝对用量方面决定反应的扩增效果，各个组分之间的比例也会对反应造成影响。除此以外，扩增程序尤其是退火温度对iPBS分子标记的谱带特征影响非常大，本试验的测试结果同样支持此观点。综合本试验的扩增结果，可以看出杨梅iPBS-PCR反应体系中的各个组分在一定的用量范围内均可以得到较好的扩增效果， 因此在实际试验过程中应该根据引物和模板的实际情况进行调整，最终得到最佳效果的分子标记谱带信息。本研究利用单因素法获得了适用于杨梅iPBS标记检测的PCR体系，即在20 μL反应体系中：2 μL 10 × Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA，灭菌ddH2O补足20 μL。该反应体系重复性好，多态性高，有利于谱带的判读。本试验结果将为利用iPBS-PCR技术进行杨梅种质遗传多样性评价及鉴定提供技术支持，也将为应用于其他植物的研究提供借鉴。
nlc202309021028
参考文献：
[1]郑锡良，张振兰，梁森苗，等. 杨梅品种果实性状图谱分析[J]. 浙江农业科学，2015（3）：388-390.
[2]钱皆兵，陈子敏，陈俊伟，等. 优质大果杨梅新品系乌紫杨梅的生物学特性及其RAPD鉴定[J]. 果树学报，2007，24（1）：64-67.
[3]Zhang S M，Gao Z S，Xu C J，et al. Genetic diversity of Chinese bayberry （Myrica rubra Sieb. et Zucc.） accessions revealed by amplified fragment length polymorphism[J]. HortScience，2009，44（2）：487-491.
[4]林旗华，钟秋珍，张泽煌. 18份杨梅种质资源遗传多样性的SRAP分析[J]. 热带作物学报，2013，34（9）：1667-1671.
[5]赖恭梯，刘炜婳，张梓浩，等. 戴云山野生杨梅自然群体遗传结构的ISSR分析[J]. 热带作物学报，2013，34（10）：1863-1870.
[6]Zhang S M，Xu C J，Gao Z S，et al. Development and characterization of microsatellite markers for Chinese bayberry （Myrica rubra Sieb. & Zucc.）[J]. Conservation Genetics，2009，10（5）：1605-1607.
[7]Chen F Y，Liu J H. Germplasm genetic diversity of Myrica rubra in Zhejiang Province studied using inter-primer binding site and start codon-targeted polymorphism markers[J]. Scientia Horticulturae，2014，170：169-175.
[8]倪海枝，陈方永，王引，等. 杨梅分子生物学研究现状[J]. 中国南方果树，2015（（1）：112-119.
[9]Kalendar R，Antonius K，Smkal P，et al. iPBS：a Universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121（8）：1419-1430.
[10]Smkal P，Bacˇová-Kerteszová N，Kalendar R，et al. Genetic diversity of cultivated flax （Linum usitatissimum L.） germplasm assessed by retrotransposon-based markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，2011，122（7）：1385-1397.
[11]张潇玉，郭大龙，郭明晓，等. 葡萄iPBS-PCR反应体系的优化[J]. 果树学报，2014（3）：508-513.
[12]林旗华，卢新坤，张泽煌. 杨梅SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J]. 中国农学通报，2012，28（1）：294-297.
[13]汪尚，索娜娜，赵红燕，等. 反转录转座子分子标记及其在植物研究中的应用[J]. 杭州师范大学学报：自然科学版，2012，11（5）：410-415，442.刘广志，陈炳佑，侍福梅. MAP18参与了脱落酸调控的拟南芥气孔关闭及根生长[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：55-57.
铁皮石斛RAPD反应体系的优化 篇4
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 是1990年美国科学家Williams和Welsh等发展起来的, 采用l0bp随机引物通过PCR扩增基因组DNA;自1994年Cheng等首次将任意引物PCR (arbitrarily primer PCR, AP-PCR) 技术引入中药鉴定学以来, 分子标记技术在药用植物研究中被广泛应用。本实验采用改良SDS法获得了高质量的铁皮石斛基因组DNA, 然后考察了PCR反应体系中dNTPs、MgCl2 、引物、模板等4个因素各自对RAPD-PCR扩增结果的影响, 并在此基础之上, 进行了4因素3水平的系统研究, 对铁皮石斛RAPD-PCR反应系统进行优化, 获得了适合铁皮石斛RAPD-PCR扩增的最适反应体系, 从而对铁皮石斛品种鉴定提供了稳定的分子标记方法。
1 材料与方法
1.1 材料
以铁皮石斛种子在附加0.2mg/L NAA的MS培养基上萌发形成的幼苗为实验材料。RAPD-PCR扩增引物S505购自上海生物工程技术服务有限公司, 序列为:5′-GACCTAGTGG-3′;dNTPs、250bp DNA Ladder Marker、Ex Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;NaCl、Tris、EDTA、SDS、醋酸钾、醋酸钠、巯基乙醇为进口分装试剂;其他试剂为国产分析纯试剂。
DNA提取缓冲液为500 mmol/L NaCl、100mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 、50mmol/L EDTA (pH 8.0) 、2%的α-巯基乙醇, TE缓冲液为l0mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 、1mmol/L EDTA (pH 8.0) 。
1.2 DNA 提取
取1g幼嫩的铁皮石斛叶片, 液氮研磨破碎细胞使之成为粉末;将冷冻粉末转入含7.5ml提取缓冲液的50mL离心管中, 加入10%SDS使其终浓度为1.5%, 迅速混匀后于65℃水浴保温15min, 保温期间间歇晃动离心管数次;冰浴冷却离心管5min-10min后加入2.5ml 5M KAc, 再颠倒混匀后放置于4℃冰箱中30min;4℃ 8000 rpm离心20min, 上清用双层200目尼龙网过滤后用等体积的“酚:氯仿:异戊醇=25∶24∶1”抽提2—3次使上清清亮;然后用等体积的“氯仿:异戊醇=24∶1”抽提一次, 上清加入0.7倍体积异丙醇并混匀后于-20℃沉淀10min;离心收集沉淀, 沉淀用70%乙醇漂洗2-3次, 风干沉淀并将之溶于300μl TE中, 待其完全溶解后再加入3μl RNase A (10 mg/ml) , 37℃保温1h;用等体积的“酚:氯仿:异戊醇=25:24:1”及“氯仿:异戊醇=24:1”各抽提1次, 上清加入1/10倍体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇, -20℃沉淀3h;离心收集沉淀, 沉淀用70%乙醇漂洗2—3次, 风干后溶于300μl无菌水中并储存于-20℃冰箱备用。
1.3 DNA 纯度及完整性的鉴定
取1μl DNA样品用无菌水稀释50倍, 用Eppendorf核酸蛋白定量仪测定波长在230、260、280、320 nm处的光吸收值 (A) , 根据A260计算DNA产率, 根据A260/A280、A260/A230以及A320的值来鉴定DNA的纯度。
取1μl DNA样品加入到2μl 6×含溴酚蓝的上样缓冲液及9 μl TE溶液中, 混匀后点入含1 μg/ml溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶中, 用1×TBE电泳缓冲液, DYCP-33A 型电泳槽 (北京六一厂) , 在50 V电压下电泳3h, 于凝胶成像系统下观察照相, 检测所提基因组DNA的完整性。
1.4 RAPD-PCR反应体系的优化
在25 μl RAPD-PCR反应体系中, 除2.5μl 10×PCR Buffer、适量无菌水及0.75U Taq DNA聚合酶外, dNTPs、MgCl2、引物及模板分别为0.25 mmol/L、2.00 mmol/L、0.32 μmol/L、0.60 ng/μl。当对单个因素进行试验考察时, 其余3个因素的用量不变。在四种单因素实验结果基础之上, 设计了dNTPs、MgCl2、引物及模板等4因素3浓度的L9 (34) 正交组合实验 (如表1所示) , 进一步考察各因素组合对RAPD-PCR扩增效果的影响。当25μl RAPD-PCR反应体系中各成分添加完成后, 混匀离心, 然后在反应液液面上加一滴无菌矿物油, 并将PCR管放入PCR仪 (BIO-RAD PTC-100TM) 中, 按如下设定程序继续进行PCR反应:98℃5 min;80℃2 min (在进行到1min 57s时暂停, 加入Taq DNA 聚合酶) ;94℃1 min, 36℃1 min, 72℃ 1min, 45个循环;72℃延伸5 min。
反应完成后, 取PCR产物9 μl, 加入1μl 10×含溴酚蓝的电泳上样缓冲液, 混匀后点入含1μg/ml溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中, 按前述方法进行电泳检测。
2 实验结果
2.1 DNA纯度及完整性的鉴定
采用改良SDS法提取铁皮石斛基因组DNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图1所示, 在23kb位置附近有一条清晰的条带且无弥散现象, 说明提取的基因组DNA完整、无降解且无RNA。经核酸蛋白定量仪检测, A260/A280=1.80±0.08, A260/A230=2.58±0.45, 表明获得的基因组DNA较为纯净, 无蛋白、多糖等杂质污染, 可以满足后续PCR实验要求。
2.2 dNTPs、MgCl2、引物、模板单独对PCR扩增效果的影响
在25μl PCR反应体系中分别改变dNTPs、MgCl2、引物、模板的用量, 其它成分保持不变, 结果如图2所示, 结果表明, PCR反应体系中各因素均对PCR扩增效果有较大影响。当反应体系中无dNTPs时, 无扩增无条带 (图2a-1) ;dNTPs浓度为0.10-0.15 mmol/L时扩增条带较少, 无明显特异性扩增条带 (图2a-2-3) ;dNTPs浓度为0.20-0.40 mmol/L时出现特异性扩增条带 (图2a-4-7) ;然而随dNTPs用量增加, 虽然主带明显增亮, 但总条带数减少, 非主带亮度减弱, 且小于主带大小的条带有从小到大逐渐消失及出现新的大片段条带的现象, 从而降低了扩增结果的多态性;因而, 在25μl PCR反应体系中dNTPs的适宜用量为0.20～0.30 mmol/L较为合适。
在a、b、c、d各图中左侧泳道M为250bp DNA Ladder Marker, 各条带分子量大小见图左所;各泳道编号代表反应体系中各因素的用量。a.dNTPs影响RAPD-PCR扩增结果电泳图 (1:0;2:0.10mmol/L;3:0.15mmol/L;4:0.20mmol/L;5:0.25mmol/L;6:0.30mmol/L;7:0.40mmol/L) 。b.MgCl2影响RAPD-PCR扩增结果电泳图 (1:0;2:0.50mmol/L;3:1.00mmol/L;4:1.50mmol/L;5:2.00mmol/L;6:2.50mmol/L;7:3.00mmol/L;8:3.50mmol/L;9:4.00mmol/L;10:4.50mmol/L;11:5.00mmol/L) 。c.引物浓度影响RAPD-PCR扩增结果电泳图 (1:0;2:0.08μmol/L;3:0.16μmol/L;4:0.24μmol/L;5:0.32μmol/L;6:0.40μmol/L;7:0.48μmol/L;8:0.56μmol/L;9:0.64μmol/L) 。d.模板浓度影响RAPD-PCR扩增结果电泳图 (1:0;2:0.20ng/μl;3:0.40ng/μl;4:0.80ng/μl;5:1.20ng/μl;6:1.60ng/μl;7:2.00ng/μl;8:2.40ng/μl;9:2.80ng/μl;10:3.20ng/μl;11:3.60ng/μl;12:4.00ng/μl)
当反应体系中MgCl2浓度较低 (0—1.00mmol/L) 时, 无扩增条带 (图2b-1-3) ;当MgCl2浓度增加至1.50—2.50mmol/L时, 扩增条带数目明显增加, 且条带较为清晰, 无明显拖尾现象 (图2b-4-6) ;当MgCl2浓度继续再增加至3.00—5.00mmol/L时, 扩增条带弥散而不尖锐 (图2b-7-11) 。由此可以看出, 在PCR反应体系中添加1.50-2.50mmol/L MgCl2较为适合RAPD-PCR的扩增。这与王和勇、罗恒等报道的MgCl2在PCR反应体系中的终浓度范围1.5-2.0mmol/L基本一致。
引物浓度对RAPD-PCR扩增的影响也是十分明显。当反应体系中无引物时, 无扩增条带 (图2c-1) ;随着反应体系中引物浓度的增加条带数逐渐增多, 但是低浓度的引物无法与所有的模板结合位点结合, 因而扩增出的产物相对较少, 从图中可以看出当引物浓度在0.08-0.16μmol/L时, 扩增条带数少且亮度较低 (图2c-2-3) ;当PCR反应体系中引物浓度增加至0.24μmol/L时, 条带数较多且扩增主带清晰 (图2c-4) ;当引物浓度逐渐增高时, 引物竞争性地结合模板, 虽然主带更加清晰, 但扩增条带数减少 (图2c-5-9) 。因此, 在25μl PCR反应体系中添加0.24μmol/L引物较为适合PCR的扩增。
在PCR反应体系中, 模板浓度也是影响扩增条带以及假阳性的一个重要因素, 由图2d可以看出, 如果在扩增体系中不添加模板, 则不能有效地完成PCR扩增, 无扩增条带 (图2d-1) ;随着反应体系中模板浓度的逐渐增加, 扩增条带数增加, 模板浓度为0.40ng/μl时, 条带数较多且清晰 (图2d-3) ;当反应体系中模板浓度大于0.40ng/μl时, 扩增条带的多样性未增加, 但少数大片段带增亮, 而较多中间带变弱。因此, 此结果表明, 在25μl PCR反应体系中模板浓度在0.40ng/μl时较为合适。
2.3 多因素组合对PCR扩增效果的影响
9个正交组合的RAPD-PCR扩增结果如图3 (a) 所示, 各组合扩增出的条带数量经统计分别为9、9、3、8、1、8、8、5、3。对扩增结果的统计分析如表2所示, 在表2中, R表示极值, 其大小反映了某因素对扩增结果影响的大小。从表2也可以看出, 在所实验的四个因素中模板浓度对RAPD-PCR扩增体系的影响最大, 其次是引物浓度, 引物浓度和dNTPs浓度这两项的效应相差不大, MgCl2浓度的影响最小。从图3 (a) 上也不难看出, 泳道1、2的条带最多, 但泳道2的条带较之泳道1更为清晰, 所以选取泳道2的组合更为恰当。此结果与上述所筛选的四种单因素的结果基本完全一致, 即在25μl PCR反应体系中dNTPs浓度选为0.25mmol/L, MgCl2浓度选为1.50mmol/L, 引物浓度为0.32μmol/L, 模板浓度选用0.40ng/μl。
注:T:某浓度全部电泳泳道的中PCR条带数的总和;undefined:某浓度电泳泳道中平均PCR条带数; R:某因素实验浓度范围内, 最大平均PCR条带数与最小平均PCR条带数的差值。
(M同图2;泳道1-9号同表1中实验编号) 。b.铁皮石斛多种引物的RAPD指纹谱图 (M同图2;泳道1-8号表示不同的引物, 分别为S505、S46、S2099、S430、S1201、S318、S1120、S1392)
3 讨论
本实验中铁皮石斛的DNA提取方法采用的是改良SDS法, 所提DNA的纯度较高, A260/A280基本在1.8-2.0之间, 这一结果与肖鲲、葛晓军等报道的用改良CTAB法所提取的石斛DNA纯度 (OD260 /OD280= 1.83±0.07) 相接近, 这说明本法也是基因组DNA提取、纯化的较好方法。
将本实验所筛选的RAPD-PCR反应体系分别应用于S505、S46、S2099、S430、S1201、S218、S1120、S1392引物的RAPD-PCR扩增, 结果如图3 (b) 所示, 结果表明本实验所筛选的RAPD-PCR扩增体系能有效地应用于铁皮石斛, 所扩增出的指纹丰富、条带清晰、无拖尾现象。多因素组合实验表明, 各因素对PCR扩增结果的影响程度不同, 而且相互之间有互作影响, 其中模板与引物是最主要的因素, 这可以说明筛选出的实验体系与白音、包英华等所筛选的美花石斛的RAPD-PCR体系结果不一致的原因可能是由于物种间本身的差异性所致。
在DNA提取和PCR反应过程中, 实验条件的稳定性和实验环境的洁净度也是影响RAPD实验结果准确性与重复性的重要因素。因此, 在实验过程中要求保持所用的RAPD反应体系和反应程序一致, 使用同一台PCR仪或同一型号PCR仪, 凝胶电泳条件保持一致。另应注意保持实验室中各种环境因素比如温度、湿度等的恒定, 操作台面必须洁净、无污染。要想保持RAPD实验结果的准确性与重复性, 就必须建立RAPD技术的标准化体系。
参考文献
[1]J.G.K.Williams, A.R.Kubelik, K.J.Livak et al.DNApolymerphisms amplified by arbitrary pri mers are useful as genet-ic markers.Nucleic Acid Res, 1990, (18) :6351.
[2]J.Welsh, M.McCleuand.Fingerprinting genomes using PCRwith arbitrary pri mers[J].Nucleic Acid Res, 1990, (18) :7213.
[3]Cheng K S, Kwan HS, But P P H, et al.Pharmacognostical i-dentification of a merican and oriental ginseng roots by genomicfingerpringting using arbitrarily pri mer polymerase chain reaction (AP-PCR) .J Ethnopharmacol, 1994, (42) :67-69.
[4]顾红雅, 瞿礼嘉.植物分子生物学——实验手册[M].北京:高等教育出版社, 1998.
[5]王和勇, 罗恒等.RAPD在中药材鉴别中的稳定性和可靠性[J].中药材, 2004, 27 (1) :63-66.
[6]肖鲲, 葛晓军等.改良CTAB法提取石斛总DNA[J].贵阳医学院学报, 2007, 32 (2) :213-214.
反应体系 篇5
员工对企业建立职业健康安全管理体系反应调查研究
为了解和评价企业建立OSHMS后,员工的主观反应和正、负两方面评价意见,对已建OSHMS 64家企业中的1602名职工(观察组)和未建OSHMS 的` 61家企业中的1517名职工(对照组)做了标准化问卷调查,调查采用随机抽样、标准化问卷、统一调查程序和系统质量控制等技术方法.问卷中设置了经过专家筛选的12个问题,分A、B两组每组6个问题,其中5个为正面,1个为负面反应问题,依据回答问题的程度不同划出a、b、c和d四个级别,分别赋予不同分值.问卷调查结果表明:观察组在企业职工全员参与、职业安全卫生教育培训、作业环境整改和搞好安全生产信心与能力等多个方面都得到明显改善与提高,与未建OSHMS企业的对照组相比较,差异非常显著.同时分析结果也提示:企业推行OSHMS过程中可能增加员工心理压力和给工作带来一些不便,一小部分职工对职业安全健康管理工作发生的一些变化还不能完全适应,应引起注意.作者认为,企业通过建立和运行OSHMS可以提高企业安全生产管理水平和获得显著职业安全卫生绩效,企业职工在OSHMS建立后安全生产的意识能力和自信心都得到了明显加强.建议应进一步在企业推行应用并在实际工作中不断改进和完善.政府对于企业自主采取的先进的管理体系应予一定的支持和鼓励,如给与某些政策上的支持.
作 者：邢娟娟 XING Juan-juan 作者单位：中国安全生产科学研究院,北京,100029刊 名：中国安全生产科学技术 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SAFETY SCIENCE AND TECHNOLOGY年，卷(期)：20051(2)分类号：X92关键词：职业健康安全管理体系 问卷调查 安全生产 职业安全卫生
反应体系 篇6
摘 要：药品不良反应监测体系能够对药品风险进行有效的管理，这也是我国药品监督管理的一项重要的工作内容。通过药品不良反应监测能够对上市药品的风险信号进行监测，并且对风险事件的蔓延进行控制。然而我国的药品不良反应监测体系制度仍然存在着一些问题，本文对此进行了简要的分析，并提出了相应的完善措施。
关键词：药品不良反应监测体系；制度；建设
要做好药品不良反应的监测工作，充分发挥药品不良反应监测的警戒作用，就必须建立和完善药品不良反应监测体系制度。本文对我国现有的药品不良反应监测体系制度进行了简要的介绍，并分析了其中存在的不足，提出了相应的建设和完善措施。
1 我国的药品不良反应监测体系制度
我国非常重视药品不良反应的监测工作，通过一系列的法律法规对药品不良反应监测体系进行了完善，当前我国的药品不良反应监测模式结合了技术监督管理和行政监督管理。
1.1 法律依据
药品不良反应监测体系制度主要的法律依据有《药品管理法》《药品不良反应报告和监测管理办法》。《药品管理法》第71条，《药品不良反应报告和监测管理办法》第3条、第9条、第10条都明确规定本行政区域内的食品药品监督管理局负责本区域内药品不良反应报告的上报、反馈、评价、核实、收集等方面的工作。
1.2 药品不良反应监测体系的建设模式
我国的药品不良反应监测体系主要分为行政管理体系和技术体系。行政工作管理体系主要由国家级、省级、市级、县级食品药品监督管理局组成，全面履行监督管理工作。
技术体系主要有三级药品不良反应监测中心，分别为国家级、省级和省级以下药品不良反应监测中心，地市级药品不良反应监测机构共200多个，还有一些省建立了部分县级药品不良反应监测机构。
2 当前我国药品不良反应监测体系制度建设存在的问题
2.1 法律层面的支持不足
在技术体系的建设层面，我国的药品不良反应监测体系的制度缺乏相应的法律支持。《药品不良反应报告和监测管理办法》没有对省级以下的检测机构进行具体的要求，导致一些地区在建立省级以下的药品不良反应监测机构时存在一定的理解差异，各机构在进度和形式方面存在差异，没有体现出药品不良反应监测机构的专职化和专业化。
2.2 机构设置模式不够规范
正是由于缺乏必要的法律依据，导致省级药品不良反应监测机构设置的模式不够规范，造成了一定的管理困难。例如在职能履行方面省级，药品不良反应监测中心未能将药品滥用监测、医疗器械不良事件监测、药品不良反应监测3个主要职能进行合并。在办公管理方面，存在着挂靠其他单位、与审评认证机构合署办公和独立办公3种形式的并行。在单位性质方面，既有挂靠形式，也有非独立法人事业单位和独立法人事业单位形式。
2.3 省级以下的监测机构设置不合理
我国幅员辽阔，人口众多，有15个省份的人口数量数超过2000万，9个省份的人口数量超过5000万，然而我国省级及以下的药品不良反应监测机构不能满足药品不良反应监测工作的需求，存在着机构规模小、工作人员数量少、监测力量薄弱的问题。省级以下的市级、县级药品不良反应监测机构更是如此。大多数的省级以下药品不良反应监测机构均不是独立机构，技术人员大多为编外兼职，工作力量比较薄弱。在职务晋升、职称评定方面还存在很多矛盾，高水平、高层次的专业人员技术人员很少能够进入省级以下的药品不良反应监测机构。
3 我国药品不良反应，监测机构的制度建设和完善
药品不良反应的监测工作对于保障药品安全发挥着非常重要的作用，针对当前我国药品不良反应监测体系制度建设中存在的问题，应该对其进行进一步的完善。
3.1 完善法律法规
由于药品不良反应监测工作对于专业技术有着较高的要求，涉及的工作面较广，受到的社会关注度也较高，因此我国的药品安全监管要将建立药品不良反应监测技术体系作为一项重要的工作内容，将其加入法律范畴，对相关的法律法规进行完善。在当前的《药品管理法》中应该加入药品不良反应监测技术体系建设的相关内容，从而使各级政府能够统一认识，加强对药品不良反应监测技术机构的建设。通过修订《药品不良反应报告和监测管理办法》，对省级及省级以下的药品不良反应监测机构的工作职责、工作要求和工作程序进行明确规定。
3.2 建立完善的药品不良反应监测机构体系
我国应该建立县级、市级、省级和国家级四级药品不良反应监测机构，形成完善的药品不良反应监测机构体系。特别是加强省级以下的药品不良反应监测机构的建设。
从我国的人口结构上来看，绝大部分人口生活在市、县和农村地区，建立省级以下药品不良反应监测机构有利于将基层用药人群纳入监测范围。根据我国以往收集的药品不良反应监测报告情况来看，大部分的病例报告都发生在市、县之中，省级和国家级的药品不良反应监测机构要对其进行跟踪调查具有较大的难度。这也需要通过市级和县级药品不良反应监测机构来对其进行长时间的跟踪调查。当前我国已经有部分省市开始设立市级和县级药品不良反应监测技术机构，并取得了一定的成效，这也充分说明建立市级和县级药品不良反应监测技术机构是完全可行的。
3.3 对药品不良反应监测技术机构进行规范
在建设完善的四级药品不良反应监测体系之后，还要对其进行统一的管理和规范。应该由卫生部或者编制委员会下发相应的建设规范，对省级、市级和县级的药品不良反应监测机构的管理要求、工作职责、设置模式进行统一的指导和规范，从而做到统一管理、高效运作。这样能够使我国的药品不良反应监测体系制度更加完善，整个体系的运作更加规范。
4 结语
本文对我国当前的药品不良反应监测体系的制度建设进行了简要的介绍，当前我国的药品不良反应监测体系制度建设还存在一些问题，需要对其进行进一步的改进和规范。我国必须通过建立高效、统一的药品不良反应监测体系，来提高药品安全监管的水平，保障公众的用药安全。
参考文献：
水运危险品应急反应体系构建研究 篇7
近年来, 我国与海外国家的商业贸易越来越多, 水路运输业的发展也越来越迅猛, 水上交通成为了我国与海外国家交流和发展的重要交通要道。随着我国对危险品的需求量不断上升, 水路运输危险品的船舶流量也在直线上升, 而水上交通安全事故的发生频率也在增加。为保证我国水上交通的安全, 中央政府针对水运危险品已经建立了一定的应急反应体系。在全国, 共有14个直属海事机构, 98个分支机构和366个派出机构, 有27个地方海事管理机构, 多个海上搜救中心等。
2 我国水运危险品应急反应体系现存问题
我国现有的水上应急反应体系仍然存在着很多问题, 如法律、法规方面, 对水运事故的惩罚等方面均有不足, 又如水上搜救人员方面, 从业人员的专业素养差等。
2.1 法律、法规方面
针对许多水上交通事故, 我国的惩罚制度不够严谨, 存在处罚对象混乱, 惩处力度不够的现象。水上运输危险品其实存在很多安全隐患, 一旦危险品泄漏, 则污染事故将成为最重要的法律事故, 但目前我国的法律, 在预防此类事故的规章中, 并没有高效的法律效力。而由于各部门的规章制度过于分散复杂, 在处理水运事故时存在冲突和重复。
2.2 应急体系工作人员方面
水上运书危险品的危险性极大, 所以在挑选应急反应体系人员方面应该着重人员的专业培养和素质锻炼, 但当前的从业人员缺乏相应的专业培训, 对危险品运输的安全常识了解不彻底, 常出现反应慢、安全意识浅等问题。现在, 有很多个体经营户的存在, 由于经营户本身的安全认识就不高, 对危险品的了解比较片面, 故其聘用的从业人员缺乏对危险品的安全认识, 在出现事故时不能及时作出应急反应, 容易造成更大的污染损失。
2.3 应急设备设施方面
由于目前很多码头上所用的应急设备大多还是七八十年代遗留下来的旧设备, 水上危险事故应急资源也还很匮乏, 所以在危险品意外事件发生时, 相应的应急反应无论是在质量上还是在效果上都存在很多问题和漏洞。码头不能及时更新应急器材和应急设备, 也没有配备充足的消防灭火器、垃圾回收设备等, 大多数地区码头没有国家级的应急设备库, 在出现大型的危险物泄漏时, 不能及时进行回收处理。
3 危险品水上运输应急反应体系构建的完善
除了上文提到的几点, 我国目前的水运应急体系还存在着很多问题, 针对这些问题, 下文提出了几点改善的小方案, 期待可以完善我国水运危险品应急反应体系。
3.1 加强法律建设
我国有关部门应该积极修订《中华人民共和国海上交通法》、《中华人民共和国海洋环境保护法》、《中华人民共和国防止船舶污染海域管理条例》等相关法律法规, 不管完善我国在法律方面的缺陷, 使得水上运输业有法可依。
3.2 加强专业人员培训
在选拔执行应急反应的人员时, 应该从专业、学历、生活阅历、工作经验、人品素质等多个方面进行人员评估, 选择最优秀、最优责任心的人担任应急反应工作。此外, 还应该针对工作人员的工作类型做专业培训, 锻炼其专业技能, 加深其对危险品性质的了解, 保证在事故发生最初, 应急人员可以做到最快的反应, 将损失降到做小。可以定期针对相关人员进行抽查考试, 考察其专业知识是否扎实, 一旦发现人员不足, 可及时加以补充。
3.3 建立危险品信息网
建立危险品信息网, 可以有助于人们咨询危险品的属性和预防信息, 帮助人们了解更多的安全常识。在危险品信息网中, 可以开设论坛, 讨论近期出现的危险品事故问题, 从多个角度思考事故的缘由和解决方案, 为今后的水运事业积累经验和知识。还可以开设技术咨询平台, 为更多的人提供危险品信息咨询服务。
3.4 开设预警和预防体系
借助监测仪器搜索水运中危险信息, 做好预警工作, 可以提前分析预测事故的发生, 并提前做出合理有效的预防手段。如在应急指挥中心, 对水运路线进行风险评估和分析, 做到早发现早预防。预警和预防体系包含了风险评估、信息监测和预警预防行动三个方面。
4 结语
本文通过分析我国水运危险品应急反应体系的现状和现存问题, 从法律、人员管理、信息咨询等多个方面提出了几点改善方案, 希望可以在完善我国水运危险品应急反应体系的构建中贡献一份力量。
摘要：危险品即是具有易燃易爆、污染、有毒、放射性等危险特性的物品。随着我国社会经济的深入发展和我国国力的日益强盛, 我国对于危险品的需求和使用越来越多, 但是由于危险品有着诸多的危险特性, 在制作、运输和存放等方面均有很大的危险性。为此, 针对危险品运输构建出相应的应急反应体系非常重要。本文将就水路运输危险品应急反应体系的构建做简要研究探讨, 期待可以建立一个完整的、有效的水运安全系统。
反应体系 篇8
集群通信为城市化保驾护航
对于城市管理者来说, 他们在保障城市健康运转时需要将每一项命令及时地转达到每一个分支机构。比如在遇到重大路况问题时, 交通部门需要将这个消息及时让相关人员知道, 并下达相应应对措施;公安部门在必要时可以进行全市警察联动来制止犯罪行为以维护城市安全;而在遇到重大自然灾害时, 政府部门则需要全市各个部门的应急联动, 以最大限度地确保城市正常运行。
除了上述针对应急的响应, 在大型集会或运动会进行的时候, 特殊的环境和需求也需要特殊的通信保障。在这些过程中, 多信道、多用户、共用网络并具备调度功能等特点让公用通信网无法满足需求, 特别是在应急情况下, 如地震、台风、雨雪灾害等环境中, 公用通信网络的稳定性更是无法保证。
集群通信网络很好地满足了上述要求, 并得到迅速推广, 在政府部门、铁道、水利、电力、民航、出租、物流等行业和单位得到了大量的部署和应用, 有效保证了城市化进程。
在我国, 集群通信近年来更是得到重视, 有数据显示, 3年前, 我国就已经建成并运行的基于4种标准的集群通信系统共计58个网络、55个交换机、1500个基站、165000个用户终端。北京奥运会数字集群通信成功应用的影响以及各地“数字城市”建设的需求下, 目前我国数字集群通信网络正在蓬勃开展, 不久的未来, 集群通信将为我国城市建设发挥更大的作用。
从模拟到数字
集群通信早期是专用移动通信网, 早在20世纪80年代就有所应用, 当初主要是由点对点无线电对讲机来完成, 在80年代初发展成为单频道、单基地台的模拟系统, 但只能提供语音通信功能, 此后经过引入多频道共享技术之后, 在1985年诞生了第一代模拟集群通信系统, 即多频道共享的单基站或多基站系统, 每个频道可提供的用户数较多且效率也很高。
但是, 模拟集群通信只能提供语音通信, 对数据、图像等通信服务不能支持, 且在安全性、频谱利用率以及通信容量等方面不能适应用户的需求, 在城市化进程加速的形势下, 城市管理者希望集群通信能够更高效、准确、安全地提供语音、图像甚至视频等信息, 因此, 随着数字技术的成熟, 数字集群通信系统应运而生。
我国引入数字集群通信是在1993年～1994年之间, 首先是摩托罗拉的MIRS, 后改为iDEN, 随后TETRA进入中国, 2003年前后, 在集群通信市场的巨大潜力和为了摆脱国外厂商对国内集群通行市场垄断的情况下, 中兴通讯和华为分别推出了基于CDMA的GoTa和基于GSM的GT800, 目前这四大技术代表了我国市场的主流。
共网与专网并行
频率资源是集群通信网运行之本, 我国集群通信频率开始分配为8 0 6～8 2 1M H z和851～866MHz, 共有600个信道, 由于使用集群通信的部门越来越多、范围越来越大, 在频率紧张的情况下, 我国又分配了350MHz专门供公、检、法、海关、军队和武警等8个部门使用。
但是需求是无止境的, 特别是在经济发达的地区, 城市化的步伐让每个城市中需要建立集群通信专网的部门和单位日益增加, 频率还是不够分配。于是, 集群通信出现了一种新形势的网络形态, 即集群通信共网, 与传统移动通信公网所不同的是, 集群通信共网是指挥调度系统, 是集群通信专网的共用形式。
除了通过频率共用来解决频率紧缺问题之外, 相对集群通信专网, 共网形式在城市建设中更显得符合城市管理者的需求, 甚至可以提升到国家利益层面。
经济全球化促进了先进统一的通信手段的发展, 对移动通信的容量、服务质量及覆盖范围提出了高要求。因此, 欧洲经济一体化推动了GSM的发展, 在集群通信方面推动了TETRA的发展, 全球经贸合作的全球化推动了IMT-2000第三代移动通信系统标准的制定。在集群通信领域, 一个城市的不同行业如交通、旅游、公安等专网各自发展的同时, 随着业务的发展, 必然需要统一的数字集群系统, 以便实现跨行业、跨地区的联动。再如, 城市的应急联通体系需要公安、医疗、交通、气象等部门的联合行动。因此数字集群共网是时代发展的方向。
数字集群共网是数字集群发展而形成的, 但是数字集群专网也不能放弃, 有些特殊的部门如安全、警务等集群通信专网还将长时间存在, 这些专网信息的保密对城市化的安全运转至关重要。国家无线电频谱管理研究所高级顾问何廷润就表示:“数字集群共网虽然可以促进网络的规模化、市场化运作, 但是担负应急、安全、救灾等的集群通信网络是政府公共服务的重要组成部分, 是为保障国家和人民财产安全而存在的, 不能以盈利为目标, 必须让这个专网更专。”工信部无线电管理局谢飞波也表示:“我国通信业应更加关注专业无线应用需求, 不能简单地认为共网可以替代专网, 汶川地震等救灾经验表明, 要改变共网包容专网的思维, 让专网独立存在, 对于专网里的关键业务, 一定要让其更‘专’。”因此, 为了我们的城市更加美好, 数字集群通信必将共网和专网并行。
link北京无线政务网
反应体系 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
番茄为野生种醋栗番茄 (Lycopersicon pimpinellifolium) 和栽培种 (共120份) 由西北农林科技大学园艺学院番茄课题组提供。
引物根据茄科数据库 (http://solgenomics.net/) 公布的番茄SSR引物序列, 由上海生工合成。
供试试剂有Master Mix (康为世纪公司) , 产品编号为CW0682、琼脂糖 (Sigma公司) 、四甲基乙二胺 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) 、甲基乙二胺二钠盐 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) 、异丙醇 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、硝酸银 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、异戊醇 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、乙醇 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、三羟甲基氨基甲烷 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 、丙烯酰胺 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 、β-巯基乙醇 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 、聚乙烯吡啶烷酮 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 。
主要仪器设备有电泳仪:ECP3000, 北京君意东方电泳设备有限公司;水平电泳槽:DYCP-32A, 北京六一;垂直电泳槽:JY-SCZ8, 北京君意公司;水浴锅:BG25, 杭州朗基科学仪器有限公司;冷冻离心机:5424R, 德国Eppendor公司;PCR仪:MYCYCLER, 美国BIO-RAD公司;凝胶成像系统:GBDX-HR, 英国SYNGENE公司。
1.2 方法
试验于2014年3月在西北农林科技大学园艺学院试验教学中心进行。
1.2.1 基因组DNA的提取
将试验番茄种子播种于96孔育苗穴盘, 采用无土育苗基质, 气候室内培养番茄幼苗, 待番茄长出幼苗后, 取番茄的鲜嫩叶片, 参照方宣钧等[18]的CTAB法并略加改进提取番茄基因组DNA, 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, DNA保存在-80℃备用。
1.2.2 PCR反应各因素水平的确定和正交方案的设计
Mix中包含了Mg2+、dNTPs和Taq酶, 可综合评价其对番茄PCR反应体系的影响。反应中各个因素的水平见表1, 该试验采用L9 (33) 正交设计, 具体信息见表2。试验所用样本DNA浓度为50ng·μL-1, 引物浓度为1μmol·L-1。
1.2.3 SSR-PCR扩增产物及产物检测
PCR反应体系为25μL, 各反应如表2所示, 不足部分用ddH2O补足。PCR反应体系为94℃预变性5min, 94℃变性4min, 55℃退火45s, 72℃延伸1min, 35个循环, 然后72℃延伸10 min, 最后4℃保存。
PCR反应产物首先在1.5%琼脂糖上检测扩增产物, 然后利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.4 反应体系的验证
以野生种和栽培种等8份材料DNA为模板, 随机选取番茄数据库中30对引物验证反应体系的可靠性, 用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试验结果。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果检测
为保证及验证DNA提取质量, 该试验一批次同时提取了6份样。由图1可以看出, 样品DNA提取效果较好, 条带清晰无杂带, 且浓度较高。
2.2 PCR扩增产物检测结果
为减少试验误差, 该试验中每个反应均设置3个重复, 9个处理 (见表2) 。从琼脂糖凝胶电泳图 (见图2) 中可以看出, 27个反应均出现目的条带, 大小在100~250bp, 与SSR-PCR反应预期得到的条带大小相近, 且条带差异比较明显, 其中处理3、6、8效果最好, 2、5、9次之, 1、4、7最差。另外, 同一处理不同重复之间差异较小, 试验结果表明, 该方法具有较高的可重复性。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明 (见图3) , 其和琼脂糖凝胶电泳效果一致, 且具有更高的分辨率。综合比较可知, 最优的反应体系为处理6。
A, B, C为3个重复结果A, B and C mean three repeats
2.3 对各处理及因素间的综合比较分析
结合琼脂糖凝胶电泳结果和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果, 综合分析后对各个处理进行评分, 最优记为9, 最差记为1, 依此得到各个处理的具体分数 (见表3) 。
2.3.1 评分结果及分析
根据表3的信息对各个处理进行极差分析和方差分析, 结果见表3、表4。通过对模板、Master Mix和引物的极差分析可知, 极差由大到小的顺序为引物>模板>Mix, 表明引物用量对反应结果影响最大, 模板用量次之, Master Mix对PCR结果影响最小。
通过利用SPSS数据分析软件对各个处理进行分析 (见表3与表4) , 发现处理6和处理8之间无显著差异, 且评分最高, 是最好的处理组合;处理8和9之间存在极显著差异, 而处理9和处理3差异不显著;处理3和处理5之间存在极显著差异, 而处理5和处理2之间差异不显著;处理1、4、7之间差异不显著。
注:不同大、小写字母表示差异极显著或差异显著 (P<0.01, P<0.05) 。Note:Different capital letters and lowercases mean significant difference at 0.01and 0.05level respectively.
注:Ki指每个重复的相应得分和, Xi指相应重复的总得分均值。Note:Ki means corresponding scores of each repeat, Xi means average total score accordingly repeat.
结合琼脂糖凝胶电泳结果和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果, 发现最好的组合为处理6, 处理8次之, 且两者之间无显著差异。所以Master Mix所加量在8~10μL时均是可以的, DNA的量在2~3μL均可以, 但在2μL左右效果较好, 引物浓度可控制在2~3μL, 最好为3μL。
2.3.2 对反应体系的验证
通过对30对SSR引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明, 80%以上的引物条带都比较清晰 (见图4) , 个别条带比较模糊, 整体效果较好;从30对引物中共筛选出有多态性的引物11对, 占全部引物的36.7% (见表5) 。
为进一步验证引物的多态性和反应体系的可靠性, 分别选取引物SSR306、LEaat003和120份番茄材料, 对反应结果进行进一步验证。结果见图5和图6。图5中竖向的3个箭头从左到右分别表示3种不同大小的带型, 说明引物SSR306在这120份材料中有3种带型, 且没有杂合体。图6中前两个竖向箭头表示两种不同的带型, 而第3个竖向箭头所指示的材料同时具有两种带型, 表明其为杂合体。通过验证结果表明, 这120份番茄材料在不同引物之间的多态性较大, 且不同的引物的反应结果均较好。
3 结论
反应体系 篇10
1. 维生素E简介
维生素E (Vitamin E) , 是生育酚类化合物的总称, 外观呈金黄色或淡金黄色粘稠油状液体, 具有温和特殊的气味, 遇空气或光易发生氧化而变成暗红色, 可与丙酮、乙醚或植物油混溶, 几乎不溶于水, 它是重要的脂溶性抗氧化剂, 不但广泛用于食品、化妆品、饲料等, 在其它领域也有许多重要用途。
2. 维生素E的生产现状
近年来维生素E合成的两种关键原料三甲基氢醌和异植物醇的生产技术取得了很大突破, 使维生素E合成得以迅速发展, 企业的年产量可以超过万吨。传统的工艺是采用卤化物的混合物作为合成反应的催化体系, 精制提取时需用水洗涤, 产生大量的废水, 而且废水中含有大量的卤化物重金属离子, 且废水因含有机溶剂, 导致COD高, 故合成反应催化体系循环利用, 将是维生素E大规模产业化的关键。
二、维生素E合成反应催化体系循环利用
1. 维生素E合成反应催化体系的回收方法
维生素E合成反应后, 维生素E包含于有机溶剂中, 而催化体系溶于水中, 且卤化物在水中的溶解度很大, 用一般的沉淀结晶法很难提取。废水的成份由卤化物及有机溶剂组成。实验室在减压条件下进行回收, 回收至釜温120℃以上, 升气管出口无水分滴出, 回收出的水分接收待用。
回收过程终点的控制是关键, 若水分没有回收完, 无法进行正常合成反应, 产生大量杂质, 收率也很低。若回收过干则能耗增加, 回收时间延长, 且回收后的产物无法输送。反应回收产物取样检测, 现场可用简单直观的物理方法—密度测定法, 达到相应密度, 就可停止回收, 若能配备水分测定仪, 或用化学方法测定催化剂含量则更加可靠。
废水中有酸, 在回收过程中易挥发, 酸性强, 工业化生产中腐蚀性很大, 故必须采用防腐蚀的回收设备, 如搪玻璃的贮槽、反应釜、搅拌浆、管道等, 输送系统和减压系统也必须采用防腐蚀设备。
2. 维生素E的合成催化体系的循环利用
维生素E合成反应催化体系回收过程、回收参数都简单可控, 但套用的温度、补充的数量、加入后的混合时间, 对合成反应影响很大, 各影响因素进行了实验比对。
(1) 套用温度的控制:
实验1:催化体系回收后直接加入:
负压回收完毕, 在温度120℃以上时, 直接加入反应物中, 搅拌冷却至适宜的反应温度后, 进行反应, 因温度太高, 反应物三甲基氢醌被氧化, 产生了大量的副产物, 与新的催化系统相比, 得到的产物杂质多, 收率低, 经多次实验, 无法得到纯度较高的维生素E;
实验2:催化体系回收后在负压条件下冷却再加入:
负压回收完毕, 仍在负压条件下, 进行搅拌冷却, 待低于合成反应温度后加入反应物中, 进行反应, 得到的产物与采用全新的催化系统含量和收率一致;
实验3:催化体系回收后在常压条件下冷却再加入:
负压回收完毕后, 改为无保护常压条件进行冷却, 待相应的温度后加入反应物中, 进行反应, 得到的产物与采用全新的催化系统相比, 杂质也有明显增加, 因该回收产物中夹带有维生素E, 在高温有氧存在时被氧化, 产生了杂质;
小结:维生素E的合成催化体系回收后, 在负压条件下冷却至低于合成反应温度时加入, 进行反应, 含量和收率与采用全新催化体系一致。
(2) 套用时新催化剂补充量的控制:
催化体系在反应、洗涤、回收等过程中都有部分损失, 需补充一定的新催化剂量。采用的小试实验条件为:三甲基氢醌20g, 异植物醇40g, 反应温度:30-70℃, 反应时间:3-6小时, 在相同的条件下, 由全新催化剂单批回收后采用不同的补充量, 实验结果如表1:
备注:表中收率为摩尔收率, 含量为气相面积归一法
小结
从表1的实验结果可得出:
1、不补充或只补充2%新催化剂, 催化体系不够, 反应不完全, 产生的杂质多含量低, 收率也低不能用于生产;
2、补充10-20%新催化剂, 催化体系太强, 导致副产物增加, 不适合生产;
3、补充4-6%新催化剂, 得到的收率和含量正常, 可用于生产。为确保产品质量, 也从生产成本考虑优选补加5%, 且该条件下实验结果稳定, 重现性好。
(3) 催化体系循环利用时, 与反应物的混合程度
催化体系循环利用时, 与反应物的混合也很关键, 若加入后直接进行反应, 催化剂没有和反应原料充分混合, 开始时就反应比较慢, 易产生杂质;若长时间搅拌, 反应物又不惰化保护, 就不但延长了生产周期, 还易氧化产生杂质。经实验比对最佳时间为30-60分钟。
(4) 维生素E的合成催化体系重复循环利用后对产品质量的影响
维生素E的合成催化体系只有进行多次重复套用, 才有可行性, 在相同的反应条件下, 第1号实验采用全新催化剂, 以后每个实验单独回收后, 补加5%新催化剂, 共进行了10个实验, 结果如表2:
备注:表中收率为摩尔收率, 含量为气相面积归一法。
小结:从表2实验结果可得出, 重复多次套用后, VE含量稳定, 有关杂质也无明显变化, 套用的9个实验平均收率为95.7%, 催化体系中夹带的维生素E也经回收, 进入产品中, 收率明显提高。
(5) 维生素E的合成催化体系循环利用后获得的收益
维生素E合成催化体系循环利用可用于企业规模化大生产, 获得的直接和间接收益都十分巨大, 以年产10000吨维生素E计:
催化剂只需补加5%, 节约资源, 降低消耗;
循环利用后平均收率至少可提高0.5%, 一年可增产50吨, 以100元/kg计, 可增收500多万元;
催化体系回收时收集水分, 可套用于合成反应的提取, 工艺用水量减少, 一年可节约用水3万多吨;
催化体系废水中重金属含量高, COD又高, 溶于水中的有机溶剂很难回收, 必须经多级处理才能达到污水排放标准, 处理工作量大, 处理成本高。催化体系和回收水分循环利用后, 不但降低了污水处理中心的工作量, 同时也降低了废水处理费。
结论
现如今环保已成为一个高频的词汇, 工业生产能否实现安全环保是评价一个企业的重要的考虑因素之一。节约资源, 节能减排将是维生素E生产者一直追求的目标, 维生素E合成催化体系采用循环利用, 适合工业化大生产, 回收工艺简单可控, 回收设备投入不大, 新催化剂单耗大幅下降, 产品收率提高, 工艺用水量也大大降低, 节约了资源, 使生产的成本明显降低.......将节能减排的理念贯穿到维生素E生产的每一个环节去, 这将是维生素E生产企业抢占维生素E市场的唯一有效的出路, 任何一个物品的生产若不能够融入进环保潮流将注定被潮流淘汰。
摘要：随着科学技术的进步, 加之国民经济的增长, 维生素E已经成为全球市场容量最大的维生素类产品之一。但是, 传统的合成制造方法资源消耗大, 三废处理成本高, 使维生素E的可持续发展面临着挑战。因此节能减排, 绿色环保是维生素E做到可持续发展的必选之路。本论文介绍了维生素E合成反应催化体系循环利用的必要性、可行性、及循环利用的收益。
关键词：维生素E,合成反应,催化体系,循环利用,节能减排,安全环保
参考文献
[1]Helv.Chim.Acta, 301911 (1997) .
[2]维生素E工业合成的进展.
[3]Indian Journal of Chemistry, Vol30B, January 1991, -59-62.
反应体系 篇11
关键词：思茅松；SRAP；体系建立；引物筛选
中图分类号：S722.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0027-03
思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）是我国云南省特有树种，以大面积纯林或针阔混交林的形式集中分布于云南省思茅市、临沧地区、红河州、西双版纳州和德宏州的部分县市[1]。思茅松木材广泛用于建筑、家具制造等行业；其树干富含树脂、而且品质优良，已成为除马尾松、湿地松之外我国重要的松脂资源。近年来，思茅松已成为云南省特别是滇南地区人工造林的主要树种，在云南省林业产业结构中占有重要地位[2]。
20世纪80年代思茅松的遗传改良工作就已经开展：种源试验及优良林分和种源的选择，为思茅松种子调拔区划提供科学依据；无性繁殖技术的不断改良，加速了思茅松良种化的进程[3]；优树选择及种子园的建立，为生产提供了宝贵的资源[4]。随着分子生物学的高速发展，对思茅松的研究也从宏观进入了分子水平。21世纪初思茅松的遗传多样性在同工酶水平得到了研究，并提出了相关的遗传资源保护策略[5]；随后，思茅松RAPD、ISSR、AFLP等分子标记的反应体系相继得以建立[6-8]。
SRAP分子标记技术因操作方便快速、产率高、多态性丰富、易从条带中得到分离条带等特点已经在植物遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建中得到广泛的应用[9-10]，但在思茅松中的研究未见报道。本研究的目的在于对思茅松的 SRAP-PCR 反应体系的各参数进行分析，在此基础上建立和优化一套适合思茅松的SRAP-PCR反应体系，并筛选出适合思茅松SRAP反应的引物组合，为思茅松的遗传多样性研究及遗传连锁图谱的构建提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
研究材料为云南省普洱市思茅区、景谷县、墨江县及孟连县的4个思茅松自然分布群体。从每个群体中随机采集5株长势茂盛、植株健壮的思茅松新鲜松针。采集后置于-80 ℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取和检测 采用改良的CTAB法对采集样本的基因组DNA进行提取[11]。利用琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白检测仪2种方法对提取的思茅松DNA进行纯度和浓度的检测。
1.2.2 引物的合成 参照Li等序列[12]，由北京华大基因科技有限公司合成引物，引物编号和序列见表1。
1.2.3 PCR扩增程序 扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。
1.2.4 SRAP-PCR反应体系的优化 在25 μL的反应体系中模板DNA用量依次设置了30、45、60、75、90 ng 5个梯度；Mg2+浓度依次设置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5个梯度；dNTPs浓度依次设置了0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L 5个梯度；Taq DNA聚合酶用量设置了0.25、0.50、0.75、100、1.25 U 5个梯度；引物浓度依次设置了0.25、0.50、075、100、1.25 μmol/L 5个梯度。反应结束后，扩增产物用 15% 琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2.5 引物筛选 利用建立的思茅松SRAP反应体系，采用不同地区的思茅松种源对100对SRAP 引物组合（表1）进行筛选，筛选出条带清晰、带型质量好、多态性丰富的引物组合。
2 结果与分析
2.1 DNA检测
思茅松松针中含有蛋白质、松脂等不利DNA提取的杂质。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，通过改良的CTAB法基本排除了蛋白质和其他杂质的干扰，且在RNA酶作用下，将RNA也去除干净，经过琼脂糖凝胶电泳基本能得到整齐、清晰、含杂质较少的DNA条带，所得DNA纯度高（图1）。核酸蛋白检测仪检测后，所有思茅松DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0之间，浓度均达到100 ng/μL以上（表2），表明其纯度和浓度均能满足思茅松SRAP-PCR反应的要求。
2.2 模板DNA用量的优化
电泳结果表明，模板DNA的用量对于PCR扩增结果影响较大，当模板DNA的用量小于60 ng时，扩增产物相对较弱，扩增出的条带模糊不清晰；当模板DNA用量为60～90 ng 时，扩增出的条带带型清晰、稳定、分辨率较高（图2）。DNA浓度过高会导致模板与引物的直接配对概率降低、模板变性不彻底而引起弥散现象。考虑到节约模板和试验操作稳定性，在25 μL体系中DNA最佳用量为60 ng。
2.3 Mg2+浓度的优化
试验结果表明，当Mg2+浓度小于1. 5 mmol/L时，扩增出的条带较弱、不清晰；当Mg2+浓度大于1.5 mmol/L时，扩增出的条带相对清晰稳定（图3）。但考虑到较高Mg2+浓度会产生非特异性扩增，产生非特异性条带，而且会出现条带不稳定的弥散现象，在保证特异性PCR产物质量较高、特异性较强的情况下，在25 μL体系中Mg2+最佳浓度为2.0 mmol/L。
2.4 dNTPs浓度的优化
nlc202309051057
试验结果表明，dNTPs的浓度小于0.15 mmol/L时，扩增条带较弱，PCR产物较少，可能是因为dNTPs过早的消耗完而使产物单链化导致扩增效果不佳。当dNTPs的浓度为 0.2 mmol/L 时，扩增的条带稳定、清晰，扩增产物较佳；当浓度为0.25、0.3 mmol/L时条带明显增亮（图4）。最终确定在25 μL体系中dNTPs最佳浓度为0.25 mmol/L。
2.5 Taq DNA聚合酶的优化
试验结果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U时，合成产物量较少，条带扩增不明显；当用量在0.75～1.25 U 之间时，扩增的条带明亮、清晰（图5）。考虑到高用量的Taq DNA聚合酶会出现非特异性扩增现象，导致假阳性，甚至出现亮的通带，Taq DNA聚合酶用量为1 U时， 条带最清晰稳定、
扩增效果最好，所以在25 μL体系中Taq DNA聚合酶最佳浓度为1 U。
2.6 引物浓度
引物的浓度在一定程度上影响扩增产物的产量。结果表明：引物浓度在0.25～0.50 μmol/L之间时，其扩增产物产量较少，条带明显较暗。只有在1.0 μmol/L时条带清晰稳定，扩增效果最好（图6）。由于引物浓度过高会产生非特异性扩增和错配，导致引物二聚体的产生，最终确定1.0 μmol/L引物浓度为最佳反应浓度。
2.7 引物筛选
根据建立和优化的SRAP-PCR反应体系，采用4个群体共20个个体对100对SRAP引物组合进行筛选，最终筛选出Me1-Em3（图7）等24对多态性好、扩增结果稳定的引物组合（表3）。
SRAP 标记不需要知道任何基因的序列信息即可进行 PCR 扩增，具有共显性简便、稳定、操作简单、重复性强等优点，因此SRAP 技术在林木遗传育种中得到了广泛的应用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子标记技术受到反应条件的影响，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+浓度以及反应程序等，因此在利用SRAP分子标记时首先应对其反应体系进行优化，以保证分析结果的可靠性。本研究对PCR反应中的各影响因子都设计了5个梯度，通过反复试验，最终确定了优化后的思茅松SRAP反应体系，该体系总体积为25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+浓度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。
SRAP分子标记多态性产生的原因在于上游引物与下游引物分别与外显子区域和内含子、启动子区域结合，而内含子和启动子区域在不同个体、物种中又存在差异。可见，SRAP分子标记中多态性条带的获得取决于引物与基因组的结合状态。本研究建立的SRAP-PCR反应体系，与太行菊[13]、茶树[14]、柱花草[15]、华山松[16]等都有不同，说明不同物种的SRAP-PCR反应体系有一定差异。在此基础上利用建立的思茅松SRAP-PCR体系成功地从100对引物组合中筛选出24对条带清晰、多态性丰富的引物组合。表明这套思茅松SRAP-PCR反应体系稳定、可靠，为后续的思茅松遗传多样性研究及遗传连锁图谱构建奠定了技术基础。
参考文献：
[1]耿树香，尹晓兵. 思茅松树脂酸热异构反应的研究[J]. 林业实用技术，2011（6）：58-60.
[2]陈 伟，唐社云，陈宏伟，等. 思茅松优树收集区营建关键技术[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：288-289.
[3]唐红燕，许玉兰，唐海英，等. 思茅松嫩枝扦插育苗技术研究[J]. 西南林业大学学报，2011，31（2）：24-28.
[4]段安安，许玉兰，王秀荣.思茅松无性系种子园雌雄球花分布特性及人工辅助授粉的研究[J]. 云南林业科技，2002，32（4）：22-26.
[5]Chen S Y，Zhao W S，Wang J. Genetic diversity and genetic differentiation of natural populations of Pinus kesiya var. langbinanensis[J]. Journal of Forestry Research，2002，13（4）：273-276.
[6]姜远标，吴 涛，陈少瑜，等. 思茅松RAPD反应体系的优化[J]. 东北林业大学学报，2007，35（9）：16-19.
[7]王曙光，杨文武，普晓兰.思茅松大配子体DNA的提取及ISSR反应体系的建立[J]. 四川林业科技，2012（2）：90-95.
[8]姚鹏强，李 培，王曙光，等. 思茅松AFLP分子标记体系的建立[J]. 西南林业大学学报，2012，32（6）：30-33.
[9]周冬琴，莫海波，芦治国，等. 基于SRAP标记的墨西哥落羽杉优良单株的遗传多样性分析[J]. 植物资源与环境学报，2012，21（1）：36-41.
[10]齐 兰，王文泉，张振文，等. 利用SRAP标记构建18个木薯品种的DNA指纹图谱[J]. 作物学报，2010，36（10）：1642-1648.
[11]王大玮，李 煜，周 玮，等. 杜仲AFLP反应体系的建立及优化[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（6）：88-94.
[12]Li G，Quiors C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455-461.
[13]高亚卉，朱广龙，姬志峰，等. 太行菊SRAP-PCR反应体系的建立与优化[J]. 实验室科学，2012，15（1）：81-84.
[14]刘 振，赵 洋，杨培迪，等. 茶树SRAP反应体系优化及引物筛选[J]. 茶叶通讯，2012，39（4）：18-21.
[15]张伟丽，刘凤民，刘 艾. 柱花草SRAP-PCR体系优化及其遗传多样性分析[J]. 草业学报，2011，20（4）：159-168.
[16]赵 杨，李玉璞，代 毅. 华山松SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 西北林学院学报，2012，27（5）：87-90，173.
反应体系 篇12
关键词：岩白菜,ISSR-PCR反应体系,优化
0 引言
岩白菜[Bergenia purpurascens (Hook.f.et Thoms.) Eng1.]是虎耳草科(Saxifragaceae)岩白菜属(Bergenia)的一种多年生草本植物[1],具有很高的药用、观赏和食用价值,由于长期过度利用,岩白菜已处于濒危状态[2],关于岩白菜资源的遗传多样性研究至今未见报道。Inter simple sequence repeat(ISSR)是Ewa Zietkiewicz等于1994年发明的1种显性分子标记,具有操作简单、成本低、快速灵敏、多态性高、所需DNA量少、无需预知研究对象的基因组序列等优点,同时也具有SSR的稳定性,已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系鉴定等方面的研究[3,6]。为了获得可靠的ISSR扩增结果以揭示岩白菜资源的遗传多样性,作者采用正交试验设计法对岩白菜ISSR-PCR的反应体系进行了优化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
18份岩白菜材料(经云南农大郭凤根教授鉴定)被种植于云南农业大学教学农场。
1.1.2 试剂
ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学公布的序列设计,由全式金生物技术有限公司合成。Easy Taq DNA Polymerase、dNTPs(各2.5mmol·L-1)、10×Easy Taq Buffer、DL2000 DNA Maker、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、琼脂糖均购于上海生工有限公司,国产分析纯。
1.1.3 仪器
Eppendorf 5333 PCR仪,德国Eppendorf公司生产;JY600C电泳仪和JY02S紫外分析仪由北京君意东方电泳设备有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 岩白菜基因组DNA的提取
采用改良CTAB法[7]提取岩白菜幼叶的基因组DNA,用于反应体系的优化和验证。
1.2.2 岩白菜ISSR-PCR反应体系的配制
选用16号岩白菜的基因组DNA作模板,855号引物(TCTCTCTCTCTCTCTCC)作体系优化的引物,根据5因素(A:dNTPs;B:引物;C:Mg2+;D:Taq DNA聚合酶;E:模板DNA)4水平正交设计表[8]配制总体积为25μL的16个PCR反应体系处理(见表1),每处理设2次重复。
1.2.3 扩增和检测
扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,55℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,进行38个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后在1.0%琼脂糖凝胶中电泳,电泳缓冲液为1×TBE,电泳电场强度为5 v/cm。电泳结束后在JY02S紫外分析仪下观察并拍照。
1.2.4 电泳图谱的统计分析
根据扩增条带的强弱赋值[9]:明亮记3分,亮记2分,暗记1分,无条带记0分。先统计16个处理的各级亮度的条带数并求取总分,再计算出5个因子4个水平的总分和极差,由此推导出最佳处理组合。
1.2.5 最佳反应体系的验证
以18份岩白菜DNA为模板,以引物848(CACACACACACACACATG)作为ISSR分析的引物,用最佳反应体系配制反应液,扩增和检测方法同1.2.3。
2 结果与分析
2.1 16个处理的电泳检测结果和赋值
图1是采用正交设计所得的16个反应体系处理的凝胶电泳图谱,从中可以看出:虽然DNA模板和引物种类一致,但16个处理间在条带数量和条带亮度上均存在显著差异。在条带数量上,8、10、12、13等处理的条带较多,而3、4、5、14等处理的条带较少;在条带亮度上,处理12的最亮,3、4等处理的最暗。这说明Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物和模板DNA等5个因子的不同水平处理对扩增结果影响极大,因此对ISSR-PCR反应体系进行优化是十分必要的。
依据扩增条带的强弱赋值,16个处理的分数统计结果见表2。
从表2可以看出不同处理的条带数和总得分均不同,总得分最高的是处理12(19分),总得分最低的是处理14(2分)。
2.2 16个处理的直观分析和极差分析
根据表2中各处理组合的得分分别计算出5个因子的4个水平的得分,进而求取极差,结果见表3。
反应体系中5个因子对ISSR-PCR扩增的影响程度可以通过极差来反映,某因子的极差越大表示该因子对扩增效果的影响越大。从表3可知5个因子从大到小的影响力排序结果为dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物=Taq酶。比较同一因子的4个水平的得分,得分最大的水平为该因子的最优水平。从表3可知,A、B、C、D、E五个因子的最优水平分别为3、4、3、4、4,因此最佳反应体系的处理组合应该是A3B4C3D4E4,即:总体积25 μL,内含10×PCR缓冲液2.5μL、2.5 mmol·L-1 Mg2+、2.0 U Taq DNA聚合酶、0.20 mmol·L-1 dNTP、0.48 μmol·L-1引物、125 ng 模板DNA。在表3中没有最佳处理组合,但处理组合12(A3B4C2D4E4)最接近最佳处理组合,区别是在C因子上选用了第2水平,但C因子的3水平与2水平间得分仅差1分;而从图1也可看出在16个处理组合中处理12是最好的。
2.3 最佳反应体系的验证结果
图2是用最优反应体系,以引物848对18份岩白菜DNA的ISSR-PCR扩增结果。从图2可以看出,用此反应体系得到的扩增效果很好,条带多而清晰,而且在岩白菜的不同材料间呈现出丰富的多态性。
3 讨论
由于ISSR-PCR的扩增结果受到了Mg2+浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA用量等多个因素的影响,并且因植物种类不同而有差异,所以必须要对反应体系进行优化以便得到可靠的结果。关于ISSR-PCR反应体系优化的报道较多[7,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20],但至今未见岩白菜属植物的相关报道。有些学者采用单因素梯度试验法优化反应体系[10,11,12,13,14],但这种方法不仅耗费时间、增加成本,而且不能反映各因素间的互作关系。正交设计法根据正交性从全因子实验中挑选出部分有代表性的因子进行实验,是一种经济、高效的实验设计方法[8],近年来已被用于ISSR-PCR反应体系的优化[15,16,17,18,19,20]。申洁等人[17]、李嵘等人[18]和杜欣等人[19]采用4因子3水平正交实验设计分别优化了枣、丹参和喜盐鸢尾的ISSR-PCR反应体系,认为Mg2+浓度和dNTPs浓度是4个因子中最重要的2个因子,但他们的设计中没有模板DNA用量这一因子,因为一般认为模板DNA浓度对扩增结果的影响最小。谢运海等人采用5因子4水平正交设计优化了水曲柳的ISSR-PCR反应体系,认为Taq酶和引物是最具影响力的两个因子[20]。本研究采用L16(45)正交设计表在4个水平上对影响岩白菜ISSR-PCR扩增效果的5个因子进行优化,发现dNTPs 浓度的影响最显著,Mg2+浓度的影响次之,这一结果与前述文献[17,18,19]基本一致,而与谢运海等[20]的结果不同;但模板DNA浓度的影响排第三,超过引物浓度和Taq酶用量对扩增结果的影响,这与前述文献[17,18,19,20]不同,原因可能是植物材料间有差异,因此将模板DNA浓度纳入正交设计加以优化还是有必要的。用最优反应体系和引物848对18份岩白菜DNA进行扩增,条带清晰、重复性好、多态性高,说明该反应体系适于岩白菜的ISSR分析,这为用ISSR标记揭示岩白菜资源的遗传多样性奠定了基础。
4 结论
4.1 五个因子从大到小的影响力排序结果为dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物=Taq酶。