黄曲霉素B1论文

黄曲霉素B1论文（精选7篇）

黄曲霉素B1论文 篇1

饲料中的霉菌毒素污染问题早在上个世纪60年代已引起各个国家和地区的普遍重视。据世界粮农组织 (FAO) 统计, 全球每年由于霉菌及其毒素污染饲料、粮食及食品所造成的损失高达数亿美元。

哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1污染的饲料或食品后, 通过羟基化作用转化成黄曲霉毒素M1, 物理化学性质相当稳定, 不被巴氏消毒法破坏, 所以在一般的巴氏消毒牛奶中残留的黄曲霉毒素对人体的危害相当严重。而牛奶中黄曲霉毒素残留的源头, 还是我们饲喂动物所用的饲料。

1实验部分

1.1实验材料发霉饲料:鸡全价配合饲料 (葫芦岛南票区沙锅屯忠成饲料厂) 。

1.2实验仪器小型粉碎机 (天津泰斯特) ;分样筛;电动震荡器 (IKA) ;移液器 (Eppendorf) ;酶标仪 (Model 680) ;黄曲霉素B1 (AFB1) 试剂盒 (北京华安麦科生物技术有限公司) ;离心机 (Throme) ;分析天平 (赛多利斯BS224S) 。

1.3实验试剂甲醇 (SIGMA) ;去离子水 (屈臣氏) 。

1.4试剂盒组成包被抗体的酶标反应板 (96T) ;标准品5瓶;AFB1酶标物;AFB1抗试剂;底物液A液;底物液B液;终止液;浓缩洗涤液。

1.5溶液的配制洗涤工作液:用去离子水将浓缩洗涤工作液按1:9体积比进行稀释。

60%甲醇:用去离子水将甲醇按3:2体积比进行稀释。

1.6样品的处理取堆放时间不同的五份饲料。每份分析测定用的样品应用大样 (有毒霉粒的比例小, 同时分布不均匀。为避免取样带来的误差必须大量取样, 并将该大量粉碎样品均匀混合, 才有可能得到确实能代表一批样品的相对可靠的结果, 因此采样必须注意) 。经粉碎与连续多次四分法缩减至0.5~1kg, 全部粉碎。样品全部通过20目筛, 混匀, 取样时应搅拌均匀。

取5g有代表性的样品置入50m L离心管中, 加入60%甲醇12.5m L与其混合;于震荡器上剧烈震荡10min, 取液体于4000r/min离心5min, 再用定量滤纸过滤;取上清液1m L, 再加入4m L去离子水, 震荡摇匀, 取50μL进行分析。样品稀释倍数为25。

1.7试样分析

(1) 将所需试剂从冷藏环境中取出, 置于室温 (20~25℃) 平衡30min以上。

(2) 取出需要数量的微孔板, 将不用的微孔板放入原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封。

(3) 编号:将样本和标准品对应微孔按序编号, 并记录标准孔和样本孔所在的位置。

(4) 加入标准品或样本50μL到对应孔中, 加入AFB1酶标物50μL/孔, 再加入AFB1抗试剂50μL/孔, 轻轻震荡混匀, 用盖板膜盖板后25℃避光环境中反应30min。

(5) 小心揭开盖板膜, 将孔内液体甩干, 用洗涤工作液250μL/孔, 充分洗涤5次, 每次间隔30s, 用吸水纸拍干。

(6) 加入底物液A液50μL/孔, 再加入底物液B液50μL/孔, 轻轻震荡混匀, 盖板后25℃避光环境中反应15min。

(7) 加入终止液50μL/孔, 轻轻震荡混匀, 设定酶标仪于450nm处, 测定每孔的吸光度值。

2结果与讨论

测得标准曲线如表1, 回收率为97.6%。

根据测得的吸光度值, 利用Ridasoft Win软件进行数据的处理和分析, 最终测得五份样品的AFB1含量, 结果如下:

根据实验结果, 得知发霉饲料堆放天数与AFB1含量的关系如下:

通过表3看到发霉饲料堆放的时间越长, 所产生的AFB1的浓度越大。所以, 在贮存饲料及运输过程中应严格控制温度和水分, 保持环境通风干燥。

黄曲霉素B1论文 篇2

1 实验目的

锦州市新鲜及陈年玉米中的AFB1 的含量。

2 实验原理

利用酶联免疫吸附法检测玉米中的AFB1 含量, 酶联免疫反应体系包括:含有aflatoxin抗体的酶标板、aflatoxin酶标结合物、aflatoxin标准液和玉米样本提取液。aflatoxin标准液和玉米样本提取液中的aflatoxin与酶标结合物竞争结合aflatoxin抗体, 将未结合的酶标结合物洗去后加入底物, 无色的底物变为蓝色, 然后后加入终止液, 颜色逐渐变为黄色, 最后利用Stat Fax 303 Plus Microstrip Reader液晶显示酶标仪测定样品中aflatoxin的含量。

3 实验材料及实验仪器

1) Agra Quant (4-4oppb) 黄曲霉素检测试剂盒。

2) Stat Fax 303 Plus Microstrip Reader液晶显示酶标仪, 230V、50Hz ~ 60Hz。

3) 70%的甲醇溶液。

4) 试管。

5) 新鲜、储存半年、1 年、1.5 年、2 年的玉米粉各5.0g。

4 取样

称取上述玉米粉各5.0g并分别加入标记有1、2、3、4 和5 的试管中, 依次加入70% 的甲醇溶液30ml, 充分震荡混匀5min后, 用滤纸过滤, 弃去渣滓。

5 检测

1) 首先将100μl酶标结合物加入稀释孔中, 然后加入50μl样品充分混匀, 最后吸取上述样品100μl至抗体包被的孔中。

2) 37℃温箱孵育15min, dd H2O清洗5 遍后加入100μl底物。

3) 37℃温箱孵育5min后加入100μl反应停止液。

4) 利用Stat Fax 303 Plus Microstrip Reader液晶显示酶标仪测定样品中aflatoxin的含量。

5) 以此类推再分别检测其他编号试管中样品中黄曲霉素的含量。

6 结果

1) 样品中黄曲霉素B1 含量 (μg/L) = 仪器读数x稀释倍数。

2) 仪器读数及实际含量

3) 散点图

4) 计算

5) 统计推断

:, 即玉米中黄曲霉素B1 的含量和玉米存储的时间无直线相关关系。

:, 即玉米中黄曲霉素B1 的含量和玉米存储的时间有直线相关关系。

确定P值, 查t界值表得P, 按P水准, 拒绝, 接受, 可以认为玉米中黄曲霉素B1 的含量和玉米存储的时间有直线相关关系, 且为正相关。

7 结论

实验数据显示:所有受试的5 种玉米中的黄曲霉素B1 的含量均已超出国家卫生标准 (玉米中的最高限量为20μg/L) 。

通过统计学分析, 可得出玉米中黄曲霉素B1 的含量和玉米的存放时间存在直线相关关系, 即玉米中黄曲霉素B1 的含量随着所玉米储存时间的延长儿增加, 两者呈正比关系。

所以我们在购买或食用玉米时, 一定要查明生产日期, 尽可能购买当年产的玉米, 以减少黄曲霉素B1 的摄入, 进而降低癌症的发病率。

摘要：食物中黄曲霉素B1的含量超标是导致癌症高发的主要原因, 国家卫生部门对食品中黄曲霉素B1含量也有明确的规定, (玉米中的最高限量为20μg/L) 。本人采用酶联免疫吸附法[1]测定辽宁锦州地区的玉米中黄曲霉素B1的含量, 从而帮助我们了解该地区玉米中的黄曲霉素B1是否超标。

关键词：玉米,黄曲霉素B1,酶联免疫吸附法

参考文献

[1]酶联免疫吸附法测定黄曲霉素B1的, 2004.

[2]Luke C, Price T, Roder D.Epidemiology of cancer of the liver andintrahepatic bile ducts in an Australian population.Asian Pac J Cancer Prev, 2010, 11 (6) :1479-1485.

[3]Milita NM, Mihaescu G, Chifiriuc C.Aflatoxinshealth risk factors.Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol, 2011, 1 (1) :19-24.

[4]Chen SY, Chen CJ, Chou SR, et al.Association of aflatoxin B (1) -albumin adduct levels with hepatitis B surface antigen status among adolescents in Taiwan.Cancer Epidemiol Biomarkers, 2001, 10 (11) :1223-1226.

仔猪黄曲霉毒素B1中毒的诊治 篇3

1 发病情况

我区某种猪场2007年10月5日从毕节市某饲料经营户购来15件某品牌仔猪浓缩饲料, 放置于拌料间内用于饲喂仔猪, 10月9日1头仔猪死亡, 到12日83头仔猪全部发病, 死亡42头, 治愈仔猪全部失去种用价值。

2 临床症状

(1) 有的仔猪在早晨观察时已死亡, 有的在运动中发生死亡。 (2) 病猪体温正常, 但精神较差, 采食较少或不吃, 走路摇摆, 粪便干燥, 有时站立一隅或头抵墙下。黏膜苍白或黄染, 皮肤有明显的出血和充血现象。有的出现间歇性抽搐, 过度兴奋, 消瘦, 可视黏膜黄染。 (3) 慢性病例精神委顿, 走路僵硬, 喜吃稀食和青绿饲料, 常离群独处, 弓背, 粪便干燥, 黏膜黄染。有的病猪眼、鼻周围皮肤发红, 以后变蓝色。

3 解剖变化

通过对1头死亡仔猪的解剖, 病理变化主要是充血和出血:胸、腹腔出血, 大腿和皮下肌肉出血。胃肠黏膜有不明显的出血点, 肠内容物呈煤焦油状。肝肿大, 呈浅黄色, 质脆, 表面有出血点。

4 诊 断

对现场饲料样品进行检查, 发现饲料有霉味。抽样送省饲料监察所检验, 饲料中黄曲霉毒素B1含量为0.25 mg/kg, 大大高于0.02 mg/kg的允许值。通过病史、临床症状 、解剖变化和实验室检验, 确诊为黄曲霉毒素中毒。

5 治 疗

立即停喂该饲料, 改用其他饲料, 饲料中添加维生素C。病情较重的, 静脉注射10%葡萄糖生理盐水250 ml, 同时用青霉素防止继发感染, 用硫酸钠减轻便秘, 连用5天, 症状明显减轻, 半个月后再无新病例出现。

6 预 防

6.1 贵州山区在梅雨季节时期, 高温高湿的气候状况容易发生饲料黄曲霉毒素中毒, 应引起养殖户的重视。浓缩饲料的保质期一般在3个月以内, 购买饲料时不要买得太多, 要买还有较长保质期的饲料。饲料保存要注意防潮、防霉, 发现霉变立即停用。

黄曲霉素B1论文 篇4

树突状细胞 (dendritic cells, DCs) 是机体内唯一能激活初始型T淋巴细胞的抗原提呈细胞, 是天然免疫和获得性免疫之间的桥梁。在家禽中, DCs的抗原递呈功能的健全是各种疫苗发挥理想保护力的关键。因此, 本研究探讨了黄曲霉素B1对鸡DCs抗原递呈功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄曲霉素B1来源于A.flavus NRRL 5518菌株 (美国国家利用研究中心) 。细胞培养试剂购自南京鼎国公司, 包括RPMI1640培养基、青链霉素、胎牛血清;重组鸡GM-CSF和IL-4分别购自美国Abcam和Kingfisher公司;CCK8细胞增殖试剂盒购自碧云天生物技术研究所。2周龄SPF鸡为江苏省农业科学院馈赠。

1.2 试验方法

1.2.1鸡骨髓DCs的培养。

按照文献方法[2], 首先无菌选取鸡股骨和胫骨, 用注射器吸取PBS将骨髓冲出, 离心清洗后, 应用密度梯度离心的方法 (Histopaque-1119, 1.119 g/m L, 25℃, Sigma) 使目的细胞与红细胞分离。随后, 应用完全培养基 (RPMI1640, 10%胎牛血清, 1%青链双抗, 50 ng/m L GM-CSF和IL-4) 重悬细胞并铺板, 放置于37℃、5%CO2培养箱。在第2天和第4天, 半量换液以去除非粘附细胞 (死细胞和粒细胞) , 第7天应用光学显微镜观察并形态学鉴定。

1.2.2混合淋巴细胞反应试验。

应用尼龙毛分离法分离T细胞。黄曲霉素B1 (10 ng/m L, 12 h或24 h) 刺激的DCs与T细胞相互48 h, 应用CCK8试剂盒对细胞增值进行检测。增值指标通过刺激指数 (Stimulation Index) 来表示:

2 结果与分析

2.1 鸡树突状细胞形态学鉴定

骨髓细胞经过7 d的诱导培养, 逐渐由圆形细胞转变为体积增大并具有多个树突状细胞 (图1) , 这些为DCs的典型特点。

注:箭头所指即树突。

2.2 混合淋巴细胞反应试验结果

由图2所示, 黄曲霉素B1刺激的树突状细胞对T细胞的增殖作用与对照组相比, 在12 h有所下降, 但不显著 (P<0.05) 。24 h后, 增殖指数极显著下降 (P<0.01) , 表明黄曲霉素B1破坏了树突状细胞的抗原递呈功能。

3 结论与讨论

鸡只摄入黄曲霉素B1水平普遍较低, 一般并不出现急性死亡。但在整个饲养周期中禽的生产和营养性能会受到显著影响。此外, 免疫系统可能也会受到严重影响。树突状细胞是重要的捕获并递呈抗原的免疫细胞。首先成功培养了典型特征的鸡树突状细胞, 与其他种属包括小鼠、人和猪体外诱导的树突状细胞相似。树突状细胞摄取抗原后逐渐由未成熟状态转变为成熟状态, 装载抗原并向引流淋巴结中淋巴细胞递呈抗原。其中, T细胞的大量增殖可以反映上游树突状细胞的活化程度。因此, 本研究通过混合淋巴反映试验来评估树突状细胞的抗原递呈能力。结果表明, 黄曲霉素B1确实影响了以上功能, 可能的原因是其能够影响树突状细胞的成熟状态。然而在对黄曲霉素B1与猪血源DC的研究中发现[3], 更主要的是上调了抗炎因子IL-10的分泌, 导致DCs进一步向耐受型方向分化, 进而抑制了下游T细胞的增殖[4,5,6,7]。

摘要：通过黄曲毒素B1作用于体外培养的鸡树突状细胞, 再与T细胞相互作用并测定增殖能力。结果表明, 黄曲毒素B1作用于树突状细胞24 h后, 极显著下调了T细胞的增殖指数 (P<0.01) , 表明黄曲霉素B1破坏了鸡树突状细胞的抗原递呈能力。

关键词：黄曲霉素B1,鸡树突状细胞,抗原递呈,T细胞,增殖指数

参考文献

[1]赵金艳, 徐春凤.蛋鸭黄曲霉素中毒病的防治[J].动物科学与动物医学, 2000 (4) :67-68.

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[3]J MEHRZADA, B DEVRIENDT.Aflatoxin B1interferes with the antigenpresenting capacity of porcine dendritic cells[J].Toxicol In Vitro, 2014, 28 (4) :531-537.

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[5]王伟雄, 陈盛强.FVB小鼠骨髓源树突状细胞的培养[J].解剖学研究, 2011 (6) :51-53.

[6]李冉, 王桂军, 王汉清, 等.鸡骨髓源树突状细胞的诱导分化及鉴定[J].中国预防兽医学报, 2011 (9) :84-87.

黄曲霉素B1论文 篇5

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

氯金酸(美国Sigma公司)、柠檬酸三钠(天津化学试剂厂)、AFB1标准抗原(美国Sigma)、AFB1单克隆抗体(英国Abcam)、羊抗鼠Ig G(美国Sigma)、卵血清蛋白(OVA,ORGANICS,USA)、牛血清白蛋白(BSA,BIOSHARP)、羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)、二甲基甲酰胺(DMF)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾(天津市科密欧化学试剂有限公司),所用试剂均为分析纯;实验用水均为Milli Q纯水、硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、吸水滤纸(上海金标生物科技有限公司);恒温磁力搅拌器、UV1601紫外可见分光光度计(日本岛津)、HC-2514高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、水浴恒温回流装置和旋转蒸发仪。

1.2 配制的溶液

1 g/L氯金酸溶液、0.1 g/L氯金酸溶液、10 g/L柠檬酸三钠溶液、0.01 mol/L,p H=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1 mol/L K2CO3溶液、金标垫处理液和硝酸纤维素(NC)膜封闭液,共7种。

1.3 胶体金的制备(柠檬酸三钠还原法[4])及鉴定

1.3.1 胶体金的制备

将玻璃器皿全部清洗干净,并用铬酸浸泡过夜,清洗干净后放入烘干机中烘干。取5份0.1 g/L氯金酸水溶液100 ml分别于250 ml锥形瓶中,标号分别为①、②、③、④、⑤,瓶中放有数粒防爆珠,于恒温磁力搅拌器中加热至沸腾,在手动晃动下逐滴加入10 g/L柠檬酸三钠溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml,继续晃动加热10 min,取下锥形瓶继续晃动10 min,期间观察颜色变化。待室温冷却后,将所得5份胶体金溶液转移至棕色试剂瓶中4℃下保存备用。

1.3.2 胶体金的鉴定

①目测法:用肉眼观察所制得的胶体金溶液,观察其颜色、均匀度和透明度。②紫外法:用紫外可见分光光度计在可见光范围内(400~600nm)对胶体金溶液进行波长扫描分析,获得胶体金可见光区吸收光谱,记录最大吸收波长。③p H值的测定:由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用p H计测定胶体金溶液的p H值,一般使用精密p H试纸。

1.4 AFB1人工抗原的制备及鉴定

1.4.1 AFB1肟(AFB1O)的制备

AFB1O的制备是根据Morgan等[5]报道的原理,参考陈福生等[6,7]的方法。具体制备方法为:1 mg的AFB1和2 mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)溶于1.5 ml吡啶甲醇双蒸水混合液中(0.25 ml吡啶+1 ml甲醇+0.25 ml双蒸水),控温(85℃)回流反应4 h,用TLC检测反应进程,室温搅拌过夜。旋转蒸发仪将溶剂旋干剩余0.25 ml体积,加入1 ml水,用2 mol/L的H2SO4调节p H=4,溶液变浑浊,用5 ml乙酸乙酯萃取二、三次,合并有机相(10 ml),并用水洗涤2次,浓缩旋干液体,得黄色油状半固态物质即是AFB1O。

1.4.2 TLC鉴定肟化

将肟化后沉淀物用少量甲醇溶解,以氯仿∶甲醇=9∶1为展开剂,Rf(TLC中溶质迁移距离与流动相迁移距离之比)值为0.20左右的是AFB1O(Rf=0.8左右的组分是没有转化的AFB1)。

1.4.3 包被抗原的合成

采用EDC法合成包被抗原,合成原理见图1。方法为1 mg AFB1O溶解于0.2 ml二甲基甲酰胺和水(DMF:H2O=6∶9)的混合溶液,加入10 mg EDC,25℃避光活化4h,再补加10 mg EDC。称3.5 mg OVA,用0.13 mol/L的Na HCO3溶液制成10%OVA活化溶液,将OVA溶液逐滴加入上述反应液中,室温搅拌反应24 h。反应产物在4℃搅拌下用PBS透析3 d,每天换液3~6次,透析后得到纯化的AFB1-OVA。

注:EDC-1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳=亚胺盐酸盐;AFB1—黄曲霉毒素B1

1.4.4 紫外扫描鉴定

用含3%甲醇的PBS稀释OVA标准溶液及AFB1-OVA溶液,用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)稀释AFB1标准溶液,利用紫外分光光度计测定其浓度和特征峰,然后调节AFB1-OVA溶液的蛋白质浓度与OVA标准溶液一致,在波长200~400 nm范围内进行紫外扫描,根据吸收峰的变化判断偶联是否成功。

1.5 胶体金-AFB1单抗复合物的制备

1.5.1 测定胶体金标记抗体最低稳定量

操作方法[9]如表1所示。取8支试管,分别加入1 ml胶体金溶液;用0.01 mol/L PBS将单抗稀释成0.1 mg/ml,各取0、2、5、7、10、11、12、14μg,按顺序加入各管中,混匀,静置5 min后,再向上述各管中加入100μl 10%的Na Cl溶液,混匀,静置30 min。

肉眼观察:根据加入抗体后胶体金颜色的变化判断,以颜色不再变化的试管的添加量初步确定为单抗最低标记量。

紫外可见分光光度计测定:测定520 nm波长处的吸光度值(A520值)。以A520值为纵坐标,试管号为横坐标做一曲线,取A520值达到最大不再变化时所对应的抗体蛋白用量为稳定胶体金的最低蛋白用量,在此基础上再加10%~20%即为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。

1.5.2 测定胶体金标记抗体最适p H值

由于试验胶体金溶液为1 ml,直接调p H值不易控制,胶体金溶液容易损坏p H计的电极,参照文献[4]方法,最终以加入0.1 mol/L K2CO3的量为标准。表2中每管胶体金为1 ml;蛋白质的量为最适稳定量。取一系列试管按照表2进行操作,当分别加入100μl 10%的Na Cl溶液后,混匀静置过夜后,弃去沉淀,测定A520值,将结果绘制成图。

1.5.3 胶体金的标记抗体及纯化[10]

根据胶体金标记抗体最适稳定量,计算出标记胶体金总量所需的抗体总量,用PBS将抗体稀释到1 ml,采用低温高速离心法纯化胶体金。

1.5.4 金标抗体的紫外扫描鉴定

用紫外可见分光光度计在可见光范围内(400~600 nm)对胶体金溶液及AFB1金标抗体溶液进行波长扫描分析,获得胶体金及AFB1金标抗体在可见光区吸收光谱,记录最大吸收波长,根据吸收峰的变化判断结合是否成功。

1.6 胶体金标记抗体的处理

1.6.1 玻璃纤维膜的处理

将剪裁好的玻璃纤维膜(长约2 cm,宽约1.2 m)浸泡于胶体金标记垫处理液中,37℃水浴30 min,取出,平铺于纱网上37℃干燥三四小时(充分干燥),放于4℃密封保存备用。在处理后的玻璃纤维膜上按每1.2 cm×1.0 cm滴加120μl胶体金标记抗体溶液,2 min后37℃干燥2 h,放于4℃密封保存备用。

1.6.2 胶体金标记抗体稀释度的确定

纯化的胶体金标记抗体作8、10、15、20、40倍5个不同稀释度后,在其他条件不变的情况下,与固定浓度的抗原组装成试纸条,观察显色情况。根据反应结果,确定最适金标记抗体稀释度。

1.7 NC膜的选择

选取3种进口的NC膜,型号分别为Millipore135、Sartorius CN140、Millipore180,均包被相同浓度的AFB1-OVA和羊抗鼠Ig G,两者相距5 mm,与同浓度金标垫组装成试纸条,测其在PBS中的结果,比较NC膜的性能和测试效果。

1.8 胶体金免疫层析试纸的初步组装及测试原理

1.8.1 组装示意图

最终组装示意图见图2。

1.8.2 测试原理

将AFB1抗体标记于胶体金的作为免疫胶体金,将AFB1-OVA包被于NC膜作为检测线,将羊抗鼠抗体包被于检测线后侧作为质控线。加样检测,若样品中含有AFB1时,首先与免疫胶体金结合形成复合物,此复合物向前涌动到检测线位置,免疫胶体金表面位点由于被AFB1占居而使其不能与检测线的AFB1-OVA结合,此时检测线位置由于不能拦截胶体金而不显色或显色弱,将此检测结果视为阳性,而当样品中不含AFB1时,免疫胶体金涌动到检测线位置时将被AFB1-OVA捕获,胶体金聚集于检测线上将呈现肉眼可见的红色条带,此检测结果视为阴性;当检测线与质控线均无红色条带出现时,说明试纸条失效。见图3。

1.9 试纸条的性能测定

1.9.1 灵敏度试验

将AFB1标准品配制为1.0 mg/ml的贮备液,用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)配制成0、100、200 ng/ml的标准系列溶液。用金标试纸条测试上述标准系列溶液,10~15min内观察,质控线显红色而检测线不显色者为阳性(+),两条红色线者为阴性(-)。

2 结果与讨论

2.1 胶体金鉴定

2.1.1 目测法

用肉眼观察所制得的胶体金溶液,观察其颜色、均匀度和透明度。良好的胶体金应该是清亮透明的,若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物,表明此次制备胶体金不成功。胶体金颗粒直径不同,其光散射作用也不同,所以制备出不同粒径的胶体金溶胶时,由于其光散射作用的不同使其在外观上呈现的颜色也会有较大差异[11,12]。微小颗粒胶体呈红色,但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体(2~5 nm)是橙黄色的,中等大小的纳米金溶胶(10~20 nm)是酒红色的,较大颗粒的纳米金溶胶(30~80 nm)则是紫红色的[13,14]。用肉眼观察本实验所制备的胶体金溶液见图4,可见②~⑤管的颜色相差不大,均为酒红色,清亮透明,无悬浮物;而①管的颜色为紫红色,亦清亮透明,无悬浮物。初步推测其粒径在10~20 nm范围,与参考文献相符,初步判断其符合实验要求,有进一步鉴定的价值。

注:①10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.0 ml,紫红色;②10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.0 ml,酒红色;③10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5 ml,酒红色;④10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.5 ml,酒红色;⑤10 g/L柠檬酸三钠溶液添加3.0 ml,酒红色

2.1.2 紫外法

扫描胶体金的吸收光谱,是一种简单有效的胶体金质量鉴定方法。金纳米微粒溶液呈现出颜色主要是因为等离子体共振吸收,而这个吸收与胶体金纳米微粒的形态以及结构等有关。所以通过紫外可见光谱,可以得到颗粒粒度以及结构等信息。将冷却后的胶体金溶液,以双蒸水作对照,用紫外可见光分光光度计在400~600 nm范围内进行扫描,测定吸收曲线和吸收峰,确定最大吸收峰。纳米胶体金溶胶在可见光范围内有一单一光吸收峰,这个光吸收峰的最大吸收波长(λmax)在510~550 nm范围内,随纳米胶体金溶胶颗粒大小而变化,大颗粒纳米胶体金溶胶的λmax偏向于长波长;反之,小颗粒纳米胶体金溶胶的λmax则偏于短波长;吸收峰宽度越小,标准偏差越小,说明颗粒越均匀;吸收峰宽度越大,标准偏差越大,说明颗粒越不均匀,可能会出现椭圆形或多三角形颗粒[15]。本实验所制备的5组胶体金溶液在400~600 nm扫描图谱见图5。

10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为529 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为518nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为518 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.5 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为517 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加3.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为517 nm。可知,10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5、2.0、2.5、3.0 ml时,最大吸收峰波长均在520 nm左右,符合做AFB1胶体金免疫层析法检测试纸条的要求。

2.1.3 p H值的测定

由于胶体金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用p H计测定胶体金溶液的p H值,一般使用精密p H试纸。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,在柠檬酸三钠还原剂的作用下,氯金酸(HCl4)水溶液中的金离子还原成金原子,并聚集成一个微小的晶体金核,同时晶核周围吸附一定的氯金酸离子、氢离子和柠檬酸离子形成吸附层,依靠静电作用形成稳定的胶体溶液。因此制备的胶体金应该呈酸性。用精密p H试纸测定胶体金的p H值为5.8。

2.2 AFB1人工抗原的制备及鉴定

2.2.1 AFB1的肟化

由于AFB1本身上没有与蛋白质偶联的活性基团,所以在制备人工抗原前,要对其进行改造,本实验在Morgan等的基础上,在复合催化剂嘧啶、甲醇、水的催化下,用CMO将AFB1改造成含有羧基的AFB1O。实验过程中,肟化改造的进行,是通过回流装置控温进行,温度始终控制在85℃,回流进行4 h,而后室温冷却过夜。

2.2.2 TLC鉴定肟化

肟化反应进程中监测反应进展情况时,采用的是TLC法,因为AFB1经过肟化后,形成的肟化物AFB1O他们在不同的展开剂下,展开的距离是不同的。利用这个性质可以判断实验过程中,反应物AFB1向反应产物AFB1O的转化程度。在以氯仿∶甲醇=9∶1为展开剂下,在Rf=0.20左右的是AFB1O,Rf=0.8左右是没有转化的AFB1,当荧光斑点在0.2左右有强荧光,而在0.8却没有或很弱的荧光斑点出现时,就能说AFB1基本全部分转化成AFB1O。通过TLC法,可以定性判断反应的进程。

本实验结果如图6所示,Rf值为0.24,故本实验肟化进程完全。

注:TCL—薄层色谱法;AFB1O—典曲霉素B1肟

2.2.3 包被原的合成及鉴定

利用紫外扫描仪在200~400 nm波长范围进行扫描,结果见图7。OVA的最大吸收峰在280.5 nm,AFB1在224、266.5、364 nm处有吸收峰,OVA与AFB1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。

注:AFB1—黄曲霉素B1;OVA—卵血清蛋白

进一步用新合成的AFB1-OVA组装试纸条,鉴定合成的人工抗原是否成功。结果见图8。以PBS作为阴性测试,质控线和测试线均显示深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原是成功的,可以为后续的实验利用。

注:AFB1—黄曲霉素B1;OVA—卵血清蛋白

2.3 胶体金-黄曲霉毒素B1单抗复合物的制备

2.3.1 胶体金标记抗体最低稳定量的确定

胶体金是一种带负电的疏水性颗粒,未加单抗或当加入的单抗量不足以吸附完胶体金时,加入Na Cl后,由于盐离子效应会改变胶体的性质,出现由红变蓝的聚沉现象。观察各管中胶体金溶液变化,加入蛋白量不足的溶液颜色依次由蓝变红,而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持红色不变。由图9可见,本实验中从每毫升胶体金溶液中单抗添加量等于或大于11μg/ml时,胶体金抗体蛋白结合物吸的光度值不再发生较大的变化,趋于平稳,说明胶体金颗粒对抗体蛋白的吸附基本达到饱和。稳定胶体金的最低蛋白用量为11μg/ml抗体蛋白,在此基础上再增加10%~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量。最终确定实际用量为13μg/ml抗体蛋白。

注:对照—AFB1单抗0μg,灰黑色;①—AFB1单抗2μg,灰黑色;②—AFB1单抗5μg,紫灰色;③—AFB1单抗7μg,紫灰色;④—AFB1单抗10μg,紫色;⑤—AFB1单抗11μg,酒红色;⑥—AFB1单抗12μg,酒红色;⑦—AFB1单抗14μg,酒红色

2.3.2 胶体金标记抗体最适p H值的确定

不同p H值条件下胶体金标记抗体的结果见图10。由图10可知在4号管时(添加0.1 mol/L K2CO3量为20μl/ml)胶体金标记抗体蛋白得到的胶体金抗体蛋白结合物的吸光度值最高,说明胶体金颗粒和抗体蛋白吸附较好,从4~7管,测得的数值基本没有变化。故而选用4号管所对应的0.1 mol/L K2CO3量调节胶体金溶液至最适p H值。

2.3.3 胶体金标记抗体鉴定

胶体金标记后,颗粒直径变大,其最大吸收波长将发生红移,所以可以通过测定标记前后胶体金的最大吸收峰来鉴定其是否标记成功;另外,可以将羊抗鼠Ig G包被到NC膜上,将金标抗体与其反应,观察结果,进而鉴定标记是否成功。

本实验采用紫外可见光扫描法对复合物进行了鉴定,最大吸收波长由原来的518 nm移至525 nm,证明胶体金标记AFB1单克隆抗体成功。见图11。

注:AFB1—黄曲霉素B1

2.4 胶体金标记抗体稀释度的确定

用稀释液将胶体金标AFB1抗体稀释不同的倍数,用其制备结合垫并组装试纸条,利用试纸条检测阴性样品,见表3。由表3可知,金标AFB1抗体以1∶8、1∶10和1∶15倍稀释时,试纸条均显示清晰条带,稀释倍数高于1∶15时,条带变淡直至消失。确定金标AFB1抗体的最适稀释倍数为1∶15。

注:AFB1—黄曲霉素B1;++显色深;+显色浅;-不显色。

2.5 NC膜的选择

选取3种进口的NC膜,型号分别为Millipore180、Millipore 135和Sartorius CN 140,其他条件均相同,测其在PBS中的结果,比较跑板速度和显色结果。若跑板速度太快会导致抗原、抗体结合不充分,使信号减弱,表现为T线不明显;若跑板速度太慢则会延迟检测结果,且胶体金标记后的抗体易滞留在膜上,使背景不干净。跑板速度和膜的固有性质有关,如孔径、疏水性等。

从试纸条展开速度和显色结果看,3种NC膜的测试结果差异不明显,但因为Millipore 135显色相对较浅,Sartorius CN 140背景色较深,脆性强,易折断;Millipore180膜显色较深,较少背景色,综合考虑,最后选择Milii Pore 180硝酸纤维素膜作为试纸条的层析材料。

2.6胶体金免疫层析试纸条的初步测试

利用本实验所制备的试纸条,检测用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)配制成0、100、200 ng/ml的AFB1标准系列溶液。结果见图12。质控线均显深红色;AFB1标准品浓度为0 ng/ml时,检测线显深红色;AFB1标准品浓度为100 ng/ml时,检测线显浅红色;AFB1标准品浓度为200 ng/ml时,检测线几乎不显色。说明本实验所制备的试纸条的检测限为200 ng/ml。须进一步优化包被抗原AFB1-OVA的量、羊抗鼠Ig G的浓度及胶体金标抗体的稀释倍数等,以提高试纸条的检测性能。并进一步检测试纸条的检测性能,包括试纸条的特异性、灵敏度、检测限、重现性、稳定性、假阳性率、假阴性率等。并进一步检测食品及谷物中AFB1,与ELISA法等其他检测方法作对比。

注:①AFB1标准品浓度为0 ng/ml,检测线呈深红色;②AFB1标准品浓度为100 ng/ml,检测线呈浅红色;③AFB1标准品浓度为200 ng/ml,检测线几乎不显色

3 结论

本课题采用自偶联完全抗原AFB1-OVA作为包被抗原,以胶体金为示踪剂标记抗体,制备了检测AFB1的胶体金免疫层析试纸条,试纸条的检测限为200 ng/ml。本课题所制备的试纸条作为一种快速筛查的手段,既可节省检测成本,又可使广大基层单位开展AFT的检测和监控工作,具有重要的经济价值,对AFT免疫检测方法的研究具有一定的推进作用。

胶体金免疫层析检测方法虽没有传统的ELISA检测法的灵敏性高,但胶体金试纸条检测速度快、灵敏性特异性相对较好,且与其他毒素无交叉反应,携带方便,适用于现场大批量的检测,是极具发展前景的一种检测方法,此方法在快速诊断中将有着广阔的应用前景。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 制备黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条。方法 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶胶,用目测法、紫外可见分光光度法及精密p H试纸对其进行鉴定表征;并采用碳二亚氨法(EDC)将黄曲霉毒素B1(AFB1)偶联于载体蛋白卵血清蛋白(OVA)上,合成包被抗原AFB1-OVA。通过目测法及紫外-可见分光光度法优化标记胶体金的最佳黄曲霉毒素B1单克隆抗体浓度和pH,最后将包被有抗原AFB1-OVA和羊抗鼠Ig G的硝酸纤维素膜和干燥的吸附有金标抗体的玻璃纤维膜组装成试纸条,初步利用竞争性免疫层析原理检测标准品黄曲霉毒素B1。结果 制备的胶体金澄清透亮,呈酒红色,无聚集现象,最大吸收波长为518 nm,呈酸性(p H=5.8)。OVA与AFB1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。进一步用新合成的AFB1-OVA组装试纸条,检测阴性样品,两线均显深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原成功;胶体金标记黄曲霉毒素B1单克隆抗体最适标记p H为1 ml胶体金溶液中添加0.1 mol/L K2CO3量为20μl,最适蛋白浓度为13μg/ml;初步组装试纸条并检测一定浓度的AFB1标准品,结果表明,试纸条的检测限为200 ng/ml。结论 制备的胶体金符合试纸条所用胶体金的要求;并成功制备AFB1胶体金免疫层析法测定试纸条,但尚须进一步优化条件以提高试纸条的检测性能。

黄曲霉素B1论文 篇6

1 样品前处理方法

样品预处理通常是将采集好的样品的提取和纯化。通过不同的净化柱和衍生处理方法, 得到的检出限是不同的。常用的前处理的方法有:乙腈水溶液萃取、甲醇水溶液萃取和二次萃取。

1.1 液液萃取法 (LLE)

在传统的液液萃取法中, 因为毒素在两种不相互溶解的溶剂中的溶解度不同, 因此能将毒素从一种溶剂中转移到另一种溶剂中, 通过重复几次萃取, 将绝大多数的AFT提取出来。于是, 一般通过使用甲醇-水、乙腈-水等有机溶剂提取[3]。吴国华等利用60%乙腈-水溶液萃取样品中的黄曲霉B1毒素作为试验前处理, 摇床混合30min后, 通过槽纹滤纸对滤液进行过滤, 然后再滤液加入0.1%的吐温/PBS稀释后使用玻璃纤维滤纸对滤液进行过滤, 直至滤液澄清为止。然后用免疫亲和柱进行净化, 得到的结果是:在线性范围内, 液相法的标准曲线相关系数R2=0.999 2, 回收率为93.7%[4]。张继斌、汪永曾等在前处理时利用甲醇+水 (70+30, V/V) 溶液萃取样品中的黄曲霉B1毒素, 并用高速均质器均质1~2 min, 用中速定性滤纸过滤, 收集滤液后用免疫亲和柱净化。使用这种前处理的方法得到的结果是:黄曲霉B1毒素的定量限为0.2μg/kg[5]。对于脂肪含量较高的样品可先加乙醚等溶剂。

1.2 固相萃取 (SPE)

固相萃取使近几年由以前的萃取技术相结合发展起来的。它的优点是较LIE法来说提高了AFT的回收率, 能更有效的将AFT与干扰组分分离, 而且操作简单, 是目前使用最广泛的萃取方法之一[6]。Quinto等将小麦粉中的AFT经过使用甲醇-磷酸缓冲溶液提取出来, 然后用柱后光化学衍生荧光进行检测, 然后净化、浓缩。通过采用这种方法发现FAB1的定量限为0.1~0.63μg/kg, 且在这个范围内有良好的线性关系[7]。

1.3 超临界流体萃取 (SFE)

CO2是超临界流体萃取最常用的提取剂, 但由于这种单组分液体中的溶解度和选择性有很大的局限性, 因此, 为了提高提取效率, 通常要加入适当的改良剂, 来增强AFT在流体中的溶解度和选择性。由liau的试验可以看出, 虽然此方法的最低检测限较好, 但是比起其它方法来说, PFE的成本高, 需要专门的设备等一系列原因, 因此不适合作为提取AFT的常规方法[8,9]。

1.4 二次提取

二次提取也可以提高复杂机制的检测效率。例如, Vega分析了花生酱中黄曲霉毒素的含量。具体的操作方法:待测物先用15%氯化钠的甲醇溶液提取, 然后再用甲醇进行二次提取, 结果发现B1的回收率是95.2%[10]。

2 衍生方法

当分析物不能及时直接检测到的, 通常需要将待测物质与衍生剂发生反应, 产生一些如荧光特性可检测的物质。当检测出带荧光的物质后, 经过检测衍生产物最后来确定待测物质。常用的衍生方法有:柱后衍生法、柱前衍生方法等。

2.1 柱后衍生法

柱后衍生方法主要包括柱后溴衍生和柱后碘衍生两种方法。龙凌云、刘胜利等在检测黄曲霉毒素的实验中通过利用ECOSIL HPLC COLUMN (250 mm×4.6mm, 5μm) 的色谱柱, 将流动相定为:乙腈-甲醇-水 (30∶60∶10) 混合溶液, 控制进样量和流速分别为:10μL和1.0 m L/min。方法采用柱后衍生检测样品溶液, 在0.05%碘溶液浓度的作为衍生物溶液, 将衍生泵流量0.3 m L/min, 和激发波长荧光检测器设置在360 nm, 发射波长设定为450 nm。得到的结果检出限和定量限分别是AFB1 0.12μg/kg和0.40μg/kg[11]。刘柱、陈万琴等人, 利用乙腈-水 (体积比86∶14) 为提取液, 将样品经提取后, 经多功能净化柱净化。以甲醇、乙腈和水溶液作为流动相对样品进行梯度洗脱, 而后在选用C18柱分离, 用C18柱分离样品溶液后, 经过在线光化学衍生, 并且需要将荧光和二极管阵列测器同时进行测定。在这种操作情况下, 发现黄曲霉B1毒素的检出限为0.02μg/kg[12]。

2.2 柱前衍生法

付成平等人发现在使用三氟乙酸的方法对中草药提取物的黄曲霉毒素B1进行柱前衍生化实验的测定, 采用柱前三氟乙酸衍生的检出限为0.1μg/kg, 回收率为80%~110%[13]。虽然柱前衍生法的灵敏度高, 但是由于这种方法的操作繁琐且稳定性不高, 因此现在使用这种方法的人越来越少了。

3 检测方法

高效液相色谱法检测黄曲霉毒素B1的方法往往有:柱后碘衍生-高效液相色谱法、柱后溴衍生-高效液相色谱法、柱后光化学衍生化荧光反应以及柱前三氟乙酸衍生-高效液相色谱法等几种不同的方法。因为不同的样品使用不同的检测方法得到的结果可能会不太一样, 所以要尽可能的避免影响试验结果的因素。尽管按照各种不同的试验发现黄曲霉B1毒素的荧光强度较弱, 可是由于荧光检测器具备高灵敏度、高选择性及干扰峰少等长处。因此, 荧光检测器的反向HPLC法亦在大量的研究当中, 成为近代检测黄曲霉毒素的主要方法。但由于黄曲霉B1毒素的荧光度较弱, 若直接测定荧光度会影响实验的灵敏度和准确度, 但是衍生可增强黄曲霉B1毒素的荧光强度。

3.1 柱后衍生荧光化荧光检测

彭志兵等人对样品经过液液萃取精华的前处理方式将黄曲霉毒分离后, 采用柱后碘衍生的处理方法, 并使用高效液相色谱荧光检测器测定粮食中的黄曲霉毒素。结果发现利用该方法不仅检测时间短, 仅在24 min内完成测试, 而且黄曲霉毒素线性关系的r值均高于0.999 5, 回收率为80.3%~97.0%, 检出限小于0.40μg/kg[14]。这种方法不仅线性关系好, 而且回收率较高, 速度较快, 更能满足于人们对黄曲霉毒素的检测所追求的快速和精准。

3.2 柱后光化学衍生化荧光检测

邱文倩、傅武胜等利用柱后光化学衍生, 将样品经提取、免疫亲和柱净化后, 以甲醇-水为流动相, 经柱后光化学衍生并通过荧光检测器定量, 结果得出:通过采用柱后衍生的方法得到的黄曲霉毒素的回收率为94.2%~97.5%, 相对标准偏差为3.6%~5.8%[15]。我们能够看出利用这种方法的重复性好, 并且有灵敏度高, 能满足食品中黄曲霉毒素基本的定性定量的检测要求。

3.3 柱前三氟乙酸衍生化荧光检测

在柱前三氟乙酸衍生荧光检测是国家标准GB/T5009.23-2006中的第三法。这种方法的原理是使用乙腈-水溶液将试样中的黄曲霉毒素进行提取, 然后将提取液过滤后, 经过装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱, 目的是为了去除脂肪、蛋白质等干扰物质。通过使用三氟乙酸溶液对净化液中的黄曲霉毒素进行衍生, 并且通过附有荧光检测器的液相色谱系统对此反应进行分析, 然后用外标法进行定量[16]。但由于其操作繁琐, 稳定性弱, 样品吹干易造成损失。因此, 人们渐渐开始使用检测黄曲霉毒素的柱后衍生化方法。

试验发现采用柱后衍生法的优点是准确、灵敏度高、简便能够满足食品中黄曲霉毒素定性定量检测要求

4 方法学分析

瑞丰等利用三氟乙酸在40℃条件下衍生15 min后定容, 在荧光检测器下检测, 发现样品的回收率在72%~82.3%, 检出限为0.002μg/kg[17]。毕瑞峰等人通过用串联质谱的检测方法发现, 样品经处理后用电喷雾离子化三重四级杆串联质谱测定, 发现在各自的线性范围内, 峰面积与其浓度的线性关系良好, 其检出限、定量限和平均回收率分别为0.009~0.04μg/kg、0.03~0.12μg/kg、63.0%~78.5%[18,19]。王新丽等人在试验中通过利用高效液相色谱柱对样液进行分离后, 将样品经过柱后衍生装置并且与碘溶液发生反应, 最后进入荧光检测, 结果发现, 使用该方法对黄曲霉毒素B1的检出限为0.03μg/kg, 定量限为0.1 ng/m L, 低、高浓度的回收率分别为:82.3%, 85.7%[20]。由前人们的大量试验及结果分析, 我们可以看出, 通过采用柱后衍生的方法在发射波长、激发波长分为440、360nm时对黄曲霉毒素B1的检出限最大。

5 结语

黄曲霉素B1论文 篇7

1 基本原理

将黄曲霉毒素B1特异性捕获抗体包备于微孔板上,加入标准品或样品溶液、酶标记黄曲霉毒素抗原(酶连接物)和黄曲霉毒素抗体,样品溶液中的AFB1和酶连接物竞争黄曲霉毒素抗体结合位点,通过加入发色剂后的颜色反应及吸光度值测定计算样品中黄曲霉毒素浓度。

2 主要仪器与试剂

2.1 黄曲霉毒素B1检测试剂盒(德国拜发公司),酶

标仪(安图斯2010型),甲醇(AR),微量振荡器,恒温培养箱,微量移液器。

2.2 标准品:0、1、5、10、20、50μg/kg黄曲霉毒素B1甲醇标准溶液(德国拜发公司)。

3 样品处理

3.1 称取5 g粉碎混匀后的样品过20目筛孔,放入

50ml磨口试管中,加入25 ml 70%(v/v)甲醇溶液,加塞震荡5min。

3.2 使用定性快速滤纸过滤,弃去约30%的初滤液,收集余液备用。

3.3 取1 ml滤液用1 ml蒸馏水稀释,取此稀释液50μl进行检测。

3.4 对酸度较高的食用醋等样品处理提取时,需用氢

氧化钠溶液调解pH值为7.0左右,再用甲醇溶液提取[4];对食用油、含脂量高的样品如花生酱、可可豆等,在提取前要进行石油醚脱脂处理[5];酱油等含盐量较高的样品,需用三氯甲烷提取脱盐,提取样品后的三氯甲烷置蒸发皿中自然挥发干,再用甲醇溶液溶解提取残渣用于检测[6]。此类特定类别样品如果不经处理,样品的酸度、脂肪、盐分等杂质会改变酶活性反应条件或阻碍抗原抗体结合,影响检测结果的准确性。

4 测定步骤

4.1 将足够标准品和样品检测所需数量的孔条插入

微孔板架,选择数孔分别加入50μl AFB1系列标准溶液(0、1、5、10、20、50μg/kg),其余孔中各加入50μl待测样品提取液。

4.2 在各孔中分别加入50μl酶连接物溶液和50μl

黄曲霉毒素抗体溶液,在微量振荡器上摇匀后在20～25℃条件下放置恒温培养箱孵育30min。

4.3 用洗涤液洗板3次,向每一个微孔中加入

100μl底物/发色剂,充分混合并在20～25℃条件下孵育15min。

4.4 随即向每一个微孔中加入100μl反应终止液,

充分混合。在加入反应终止液后15min内于450 nm波长测定各孔OD值,并绘制标准曲线,计算出样品中黄曲霉毒素B1的含量。

5 回收率和精密度测定

取市售未检出AFB1的玉米粉和脱壳花生仁样品,样品粉碎混匀后加入1μg/kg、5μg/kg和10μg/kg AFB1,按前述方法提取、测定,回收率玉米粉为81%～91%,花生仁为74%～94%,对花生仁样品加入10μg/kg AFB1,连续测定10次,RSD为6.40%,表明该方法具有较高的准确度和精密度。

6 讨论

6.1 在上述分析条件下,样品中AFB1的最低检出

量能够达到1μg/kg,此方法检出限远低于我国GB2761-2011标准中对于谷物及其制品、坚果及籽类、调味品等样品中AFB1的限值,可适用于上述样品的快速筛查和检测。使用本方法对26份市售玉米粉进行AFB1含量检测,4份检出AFB1,含量在1.4μg/kg～10.1μg/kg间,均未超出国家标准。

6.2 AFB1特有的高危害性和分布广泛性造成了其分

析检测任务量的大幅增加,我国对各类食品中的AFB1限值也在逐步严格,此方法较之国标酶免法省去了使用三氯甲烷反复提取的步骤,简化了提取过程,提高了检测效率,全部实验过程不超过90min,具有快速、低成本和适于大批量筛查检测的优势,值得推广。

参考文献

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