超声波辅助提取（共12篇）
超声波辅助提取 篇1
香薷( Elsholtzia ciliata( Thunb) Hyland. ) 属于唇形科石荠芋属植物,又名香菜、香茅、香绒、石香茅、蜜蜂草、小叶香薷等[1,2]。香薷是直立草本中最常用且重要的中药之一,具有发汗解表、祛暑化湿、利水消肿等功效[3],同时它也是一种野生油料植物。我国香薷资源丰富,仅西南地区( 云南、贵州、四川、西藏) 就分布有30 种。据研究,香薷全草中含有7 - 甲基黄芩素( 7Methylbaical - en) 、芹菜素( Apigenin) 、木犀草素( Luteolin) 、咖啡酸( Caffeic acid) 和槲皮素( Quercetin) 等黄酮化合物[4]。目前,对香薷的研究主要集中在香薷茎叶挥发油[5,6]和茎叶黄酮成分的提取[7,8]及香薷油脂肪酸的组成[9,10]。而对香薷籽油粕的研究较少,其主要用作动物饲料并未得到综合利用。本研究以丽江野生香薷籽榨油后的油粕为原料,研究了溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度对香薷油粕中黄酮提取率的影响,并采用正交试验优化了提取工艺。
1 材料与方法
1. 1 原料与试剂
香薷籽油粕( 丽江先锋食品开发有限公司提供) ,芦丁标准品( 国药集团化学试剂有限公司) ;石油醚、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。
1. 2 主要仪器与设备
KH - 500TDB超声波清洗器( 昆山禾创超声仪有限公司) ,AR224CN电子天平( 奥赛斯仪器( 上海) 有限公司) ,722 风光光度计( 天津冠泽科技有限司) ,JJ - 2 组织捣碎机( 金坛市岸头良友实验仪器) 。
1. 3 黄酮标准曲线的绘制
分别吸取质量浓度为0. 204 mg /m L的芦丁标液0、2、4、6、8 m L至25 m L的比色皿中,分别加入5% 的亚硝酸钠溶液0. 3 m L,摇匀,放置6 min。然后分别加入10% 硝酸铝溶液0. 3 m L,摇匀,放置6 min。再分别加入1 mol/L氢氧化钠溶液4m L。最后用60% 乙醇溶液定容至25 m L,放置15min。分别测定不同浓度标样溶液在508 nm处的吸光值,绘制标准曲线,见图1。以标准曲线计算样品中与芦丁等当量的总黄酮含量。
1. 4 香薷黄酮含量的测定
将机械压榨后的香薷籽油粕粉碎,过0. 246mm( 60 目) 筛。通过石油醚脱脂3 次,干燥备用。
准确称取1 g处理过的香薷油粕粉末,加入一定浓度的乙醇,辅以超声波。在一定温度下,一定时间内提取3 次。提取液过滤定容后按1. 3 显色,测定A值,计算出样品黄酮的含量。
1. 5 香薷黄酮的提取
1. 5. 1 单因素实验
准确称取一定量处理过的香薷油粕,分别进行乙醇体积分数、超声时间、提取温度、料液比的单因素实验,提取液定容至50 m L。取2 m L按照1. 3 中的方法测定吸光度,计算提取率。
1. 5. 2 正交试验
根据单因素实验的分析,以提取率为指标,设计43正交因素表,见表1。
1. 5. 3 验证试验
以正交试验的最佳条件进行验证。
2 结果与分析
2. 1 香薷黄酮的单因素实验
2. 1. 1 乙醇体积分数对香薷黄酮提取率的影响
提取时间为20 min,温度为50 ℃,料液比为1∶ 20 g / m L时,分别改变乙醇体积分数,以提取率为指标,结果见图2。
由图2 可知,香薷总黄酮提取率先随乙醇体积分数增大而升高,当乙醇体积分数达到60%时,提取率达到最大值,之后随着乙醇体积分数的增加,提取率反而降低。这可能是因为香薷提取物主要以苷元和糖苷的形式存在,苷元能溶于乙醇。当乙醇体积分数超过一定量时,苷元溶于乙醇量大于总黄酮提取量,反而导致提取率降低。
2. 1. 2 料液比对香薷黄酮提取率的影响
提取时间为20 min,乙醇体积分数为60% ,温度为50℃ 时,分别改变料液比,以提取率为指标,结果见图3。
由图3 可知,香薷黄酮提取率随溶液倍数增大而增大。一般情况下,提取溶剂量越大,提取率就越高。当料液比为1∶ 20 g /m L时,提取率趋于稳定,即一定比例的溶剂已将黄酮化合物基本溶出。考虑到提取效果、减少溶剂用量和后续工作等,选用1∶20 g /m L的料液比比较适宜。
2. 1. 3 温度对香薷黄酮提取率的影响
提取时间为20 min,乙醇体积分数为60% ,料液比为1∶20 g /m L时,分别改变温度,以提取率为指标,结果见图4。
由图4 可知,香薷总黄酮提取率先随温度升高而增大,并在60℃ 时达到最大值,之后随着温度增高,提取率开始小幅度下降。这可能是温度过高引起黄酮类化合物被氧化,结构破坏,而导致提取率稍有降低,故60℃为最佳提取温度。
2. 1. 4 提取时间对香薷黄酮提取率的影响
在为乙醇体积分数60% ,提取温度为60 ℃,料液比为1∶20 g /m L时,分别改变提取时间,以提取率为指标,结果见图5。
由图5 可知,香薷黄酮提取率随提取时间的增加而增大,但是,在提取时间超过30 min之后提取率反而下降,这有可能是其他杂质溶出增多导致的; 但提取时间对提取率的影响不大,从时间效率来考虑,所以最佳超声时间为30 min。
2. 2 正交实验优化结果
根据正交试验因素表,以提取率为指标,得到数据见表2。
由表2 可知,各因素影响香薷黄酮提取率的的次序为: 料液比> 超声时间> 乙醇体积分数> 超声温度; 最佳组合方案为A2、B3、C2、D2,即香薷黄酮提取的最佳条件是: 乙醇体积分数60 % ,料液比1 ∶ 30 g / m L,温度60 ℃ ,提取时间30 min。
2. 3 验证试验
在最佳工艺条件下,做3 组平行试验,结果见表3。
由表3 可知,香薷黄酮的平均提取率为4. 17% ,大于正交实验的最大提取率3. 95% 。
3 结论
采用超声波辅助有机溶剂萃取法提取香薷中的黄酮化合物,提取率较高,时间短,节约成本。影响香薷黄酮提取率的因素主次顺序是: 料液比> 超声时间> 超声温度> 乙醇体积分数。香薷黄酮提取的最佳条件是: 乙醇体积分数60% ,料液比1∶30 g /m L,温度60 ℃,提取时间30 min。
参考文献
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超声波辅助提取 篇2
超声波提取苹果渣中果胶的工艺研究
本研究用盐酸作为提取溶剂,采取超声波辅助提取苹果渣中果胶,对料液比、超声波功率、提取温度、处理时间四个影响因素进行正交试验,得到苹果渣中提取果胶最佳工艺条件.正交试验L9(34)结果表明:超声波处理的最佳条件为料液比1∶10,超声处理时间60min,温度70℃,功率80%,得率达到7.53%.
作 者：徐文秀 丁学儒 作者单位：运城学院生命科学系,山西,运城,044000刊 名：农业与技术英文刊名：AGRICULTURE & TECHNOLOGY年，卷(期)：29(4)分类号：Q539+.8关键词：苹果渣 果胶 超声波 提取
超声波辅助提取 篇3
关键词：癞葡萄；黄酮；超声波辅助提取；响应面分析
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0340-03
收稿日期：2015-01-08
基金项目：河南省科技攻关计划（编号：142102110177）。
作者简介：袁晓晴（1977—），女，江苏泰州人，博士，副教授，主要从事农产品深加工研究。E-mail：yxq_yrd@163.com。癞葡萄（Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.）别称名金铃子，是葫芦科苦瓜属（Momordica）的栽培种之一，其果实呈纺锤状，果面呈不规则尖刺状，长约4 cm、宽约3 cm、单果质量25～30 g，未成熟果实呈浅绿色，成熟后呈金黄色。目前关于癞葡萄中活性肽、皂苷的研究较多[1-2]，而对癞葡萄中黄酮的研究较少。癞葡萄的果实、叶中均富含黄酮，黄酮是一种强抗氧化剂，具有清除自由基、抗衰老、抗炎抑菌、降低胆固醇含量等多种生理功效[3-5]。
提取植物中总黄酮的传统方法是热回流提取法。近年来，随着提取技术的不断发展，许多学者使用超声波辅助法分别从黄花菜[6]、马齿苋[7]、苦荞[8]等植物中提取总黄酮。超声波提取是利用超声波破碎细胞（空化）和强化传质（机械）作用，使溶剂分子渗透到组织细胞中与溶质分子充分接触，从而使细胞中的可溶成分更快释放出来，该方法具有提取速度快、得率高、对热不稳定物质破坏少等特点[9]。本研究通过单因素试验、响应面分析法优化超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的工艺，以期为癞葡萄黄酮的开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
癞葡萄采自南京市郊区，于70 ℃下烘干，冷却后粉碎过40目筛，置于干燥器中保存备用。芸香苷购自中国医药（集团）上海化学试剂公司；无水乙醇（AR）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。
XA-1型高速万能粉碎机（江苏省姜堰市银河实验仪器厂产品），WFJ7200型可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司产品），KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司产品），SHZ-D型循环水式真空泵（郑州市长城科工贸有限公司产品）。
1.2试验方法
1.2.1标准曲线的制作精确称取芸香苷标准品0.01 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。分别准确吸取芸香苷标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀并静置6 min，加入0.5 mL质量分数为10%的Al（NO3）3溶液，摇匀并静置6 min，再加入 4.0 mL 质量分数为4%的NaOH溶液，最后添加70%乙醇至刻度，摇匀并静置15 min，于波长510 nm处测定吸光度，到得芸香苷浓度C（mg/mL）与吸光度D之间的回归方程：
C=0.085 3D+0.002 5，r2 =0.998 8。
1.2.2癞葡萄总黄酮的提取及测定精确称取脱脂后的癞葡萄粉1.0 g，加入一定体积分数的乙醇溶液，按相应条件进行超声波辅助提取，减压抽滤并将滤液移至烧杯中待测。吸取1.0 mL待测液于10 mL容量瓶中，按照“1.2.1”节的方法测定黄酮质量，黄酮提取率的计算公式为：
黄酮提取率=C×10×Vm×100%。
式中：C为总黄酮浓度（mg/mL）；m为癞葡萄粉质量（mg）；V为癞葡萄提取液体积（mL）。
1.2.3单因素试验分别考察乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时间、超声功率对癞葡萄黄酮提取率的影响。试验中各考察因素的设定水平分别为：乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%；液固比（mL ∶g）10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1；提取温度40、50、60、70、80、90 ℃；提取时间10、20、30、40、50 min；超声功率120、140、160、180、200 W。除考察因素外，其他因素的条件为：乙醇体积分数70%、液固比30 mL ∶1 g、超声功率180 W、提取温度70 ℃、提取时间30 min。
1.2.4响应面优化试验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、提取温度、提取时间为因素，采用Design-Expert软件的中心组合试验Box-Behnken设计3因素3水平（表1）的中心旋转组合试验。
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1乙醇体积分数的影响当乙醇体积分数低于70%
时，癞葡萄黄酮提取率随乙醇体积分数的提高逐渐增大；当乙醇体积分数高于70%时，黄酮提取率反而下降（图1）。可见，乙醇体积分数为70%左右时，溶剂与溶质极性最相似；乙醇体积分数过高则叶绿素等脂溶性物质的溶出量增多，不利于黄酮的提纯[10]，因此确定乙醇体积分数为70%。
2.1.2液固比的影响当液固比小于30 mL ∶1 g时，癞葡萄黄酮提取率随液固比的增加显著提高；当液固比大于 30 mL ∶1 g 时，黄酮提取率的增幅降低（图2）。液固比过高将增加溶剂成本，并加重后续的浓缩和干燥工作，因此确定液固比为30 mL ∶1 g。
nlc202309012344
2.1.3提取时间的影响在提取的前30 min内，癞葡萄黄酮提取率随提取时间的延长显著提高；当提取时间继续延长时，黄酮提取率的增幅降低（图3）。为提高工作效率，确定提取时间为30 min。
2.1.4提取温度的影响当温度低于70 ℃时，癞葡萄黄酮提取率随温度的升高显著增大；当温度高于70 ℃时，黄酮提取率反而降低（图4）。温度升高会加剧溶剂和溶质分子运动，有利于黄酮浸出；而温度过高会增加其他物质的溶出，并可能破坏黄酮活性成分，因此确定提取温度为70 ℃。
2.1.5超声功率的影响当超声功率低于180 W时，癞葡萄黄酮提取率随超声功率的增加而增大；当超声功率高于180 W时，黄酮提取率反而下降（图5）。超声功率增大则空化作用大，总黄酮传质速率高；超声功率过高会使分子运动加剧、溶剂温度升高，从而破坏黄酮组分并增加其他杂质的溶出[11]，使癞葡萄黄酮提取率降低，因此确定超声功率为180 W。
2.2响应面优化提取工艺条件
2.2.1响应面试验设计与结果确定超声功率、液固比后，以乙醇体积分数（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）为变量，开展3因素3水平的响应面试验。本次提取工艺优化试验采取中心旋转组合设计，试验设计和结果见表2。
2.2.2回归模型的建立及方差分析以黄酮提取率为响应值，经回归拟合，各试验因子对响应值的影响可用回归方程表示：
Y=2.450+0.024X1+0.055X2+0.056X3-0.15X12-0.20X22-0.18X32+0.095X1X2-0.083X1X3-0.005X2X3。
对该回归方程进行方差分析及显著性评价（表3），此模型的P<0.000 1，表明响应面回归模型达到极显著水平；失拟项P值大于0.05，呈不显著，表明该方程拟合3个参数与黄酮提取率之间的关系是可行的；较高的R2值（0.998 6）进一步表明，试验方程式与实际数据之间具有非常好的拟合性。
回归方程系数的显著性分析表明，乙醇体积分数、提取温度、提取时间均对黄酮提取率具有显著性影响（P<0.001），影响效果大小依次为：提取时间>提取温度>乙醇体积分数。这3个因素的二次项X12、X22、X33对黄酮提取率也有显著性
影响（P<0.001）。
显著（P<0.001），表明乙醇体积分数与提取温度、乙醇体积分数与提取时间的交互作用对黄酮提取率的影响极显著；X2X3项的回归系数不显著（P= 0.197 3），表明提取温度与提取时间的交互作用对黄酮提取率的影响不显著。
提取条件对癞葡萄黄酮提取率影响的响应面见图6，其作用均为上凸曲面，表明本试验所选择的区域范围合理。随着乙醇体积分数、提取温度、提取时间的增大，黄酮提取率均呈先升高、后下降的变化趋势，表明乙醇体积分数、提取温度、提取时间对黄酮提取率的影响效果明显。通过分析计算得到最佳提取条件： 乙醇体积分数72%、 提取温度68 ℃、 提取时间34 min，此条件下黄酮提取率的理论值为2.53%。
为检验响应面分析法的可靠性，采用上述优化参数进行提取试验，实际测得癞葡萄黄酮提取率为2.54%，与理论预测值的相对误差为0.4%，表明采用响应面分析法优化得到的提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。
3结论
为探讨超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的工艺条件，首先通过单因素试验确定乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取表3回归模型方差分析及显著性检验
温度、超声功率的最适水平范围，再通过响应面分析法对乙醇体积分数、提取温度、提取时间进行优化。结果表明，超声波辅助提取癞葡萄总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数72%、提取温度 68 ℃、提取时间34 min，此条件下的黄酮提取率为253%。验证试验表明，黄酮提取率为2.54%，与理论值相符合。
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超声波辅助提取 篇4
超声波提取是利用超声波产生的空化作用、机械作用、热效应等,加速细胞内物质的穿透和传输,提高有效成分的得率,是一种实现省时、节能、高效的现代高新技术手段[4]。本试验优化了超声波辅助提取牛膝多糖的工艺,为牛膝药用资源的继续研究开发及应用提供参考。
1实验部分
1.1实验原料及仪器
牛膝药材,购于临海市方一仁药店,产于河北。
葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、 乙醚、丙酮等均为分析纯; 试验用水为蒸馏水。
SB - 5200D型超声波清洗机,宁波江南仪器厂; DF - 101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司; UV - 2450PC型紫外分光光度计,日本岛津公司; SHZ - D ( Ш) 型循环水式真空泵,巩义予华仪器有限责任公司; RE 52AA型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。
1.2试验方法
1.2.1多糖的提取方法
牛膝经干燥、粉碎过60目筛,用80% 乙醇在60 ℃ 下回流2次( 每次1 h) ,除去单糖、低聚糖和皂苷等小分子物质,残渣干燥后即得牛膝粉末。精确称取牛膝粉末5. 0 g,加入一定量蒸馏水,进行超声波提取,滤液经减压浓缩后加入无水乙醇调至一定的含醇量,在5 ℃ 冰箱内静置12 h,分离多糖沉淀。 沉淀物加入少量蒸馏水溶解,用Sevag法脱蛋白,经预试验, 确定加入样液1 /2体积量的三氯甲烷 - 正丁醇( 体积比4∶1) 混合液,振摇20 min,静置分层,收集清液,再重复操作2次, 加入4倍体积的无水乙醇沉淀多糖,用乙醚、丙酮反复洗涤, 然后把沉淀转移到蒸发皿上,60 ℃ 恒温干燥,即得牛膝粗多糖。
1.2.2多糖含量的测定及得率的计算
采用苯酚 - 硫酸法测定牛膝多糖含量[5]。精确称取牛膝粗多糖0. 02 g,用蒸馏水溶解定容于100 m L容量瓶中。再精密吸取牛膝粗多糖溶液1. 0 m L,置10 m L容量瓶中,加入5% 苯酚溶液1. 0 m L,混匀,冰浴下再加入7. 5 m L浓硫酸,混匀后室温下放置30 min,以蒸馏水补至刻度,混匀。在最大吸收波长482 nm处测吸光值。同法测定系列葡萄糖标准溶液,以吸光值对葡萄糖浓度( mg/L) 作线性回归,得标准曲线回归方程y = 0. 03962x + 0. 09311( n = 7 ) ,r = 0. 99974。根据标准曲线回归方程,计算多糖含量。
1.2.3单因素试验
分别考察料液比、超声时间、提取温度和醇沉浓度对牛膝多糖得率的影响。
按照料液比 ( g∶m L) 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、 1∶60分别提取牛膝多糖,在40 ℃ 下超声浸提30 min,醇沉浓度80% ( V/V) ,确定料液比对得率的影响。
按照料液比1∶50提取牛膝多糖,在40 ℃ 下分别超声浸提20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,醇沉浓度80% ,确定超声时间对得率的影响。
按照料液比1∶50提取牛膝多糖,在30 ℃ 、40 ℃ 、50 ℃ 、 60 ℃ 、70 ℃ 、80 ℃ 下超声浸提50 min,醇沉浓度80% ,确定提取温度对得率的影响。
按照料液比1 ∶50提取牛膝多糖,在50 ℃ 下超声浸提50 min,醇沉浓度 分别为70% 、 75% 、 80% 、 85% 、 90% 、 95% ,确定醇沉浓度对得率的影响。
1.2.4正交试验
根据单因素试验的结果,采用L9( 34) 正交设计,优选最佳提取条件。
2结果与讨论
2.1单因素试验
料液比 ( 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60) 、 超声时间 ( 20、30、40、50、60、70 min) 、提取温度 ( 30、 40、50、60、70、80 ℃ ) 和醇沉浓 度 ( 70% 、75% 、80% 、 85% 、90% 、95% ) 等各因素对牛膝多糖提取效果的影响如图1所示。
牛膝多糖的得率随着料液比的增加而增加。溶剂用量少时,物料黏度大,浓度梯度小,扩散速度慢。溶剂用量过多则会增加杂质的掺杂量,并且太多的溶剂会增加后续工艺中提取液的浓缩成本。所以最优的料液比为1∶50。
随着超声时间的延长,多糖得率开始增加,但长时间超声提取会使液体过热,多糖分子反而发生降解,另外在醇沉和脱蛋白时多糖黏附着产生的过多杂质一起被去除,这些都导致多糖得率变低。所以最佳的超声时间为50 min。
多糖得率随着提取温度的升高先增加后减少。温度过低, 扩散系数小,提取速度慢; 而温度太高,会使糖苷键断裂多糖结构被破坏,多糖部分降解,使多糖的得率下降。所以最佳的提取温度为50 ℃ 。
醇沉浓度对多糖得率影响显著。乙醇浓度过低致使大量多糖无法沉淀分离,多糖的得率低; 但当乙醇浓度太高时,杂质会被包裹在沉淀物内,分离沉淀时容易将多糖也除去。所以最佳的醇沉浓度为90% 。
2.2正交试验
根据单因素试验结果设计L9( 34) 正交试验,以多糖得率为考察指标,对牛膝多糖提取工艺进行优化,并对最优条件进行验证。因素与水平设计见表1。
正交试验结果及分析见表2。由表2可知,各因素对牛膝多糖得率的影响主次顺序为: 醇沉浓度 > 提取温度 > 超声时间 > 料液比。而且正交表显示的最优提取条件与单因素试验结果一致。从正交试验结 果看,超声提取 牛膝多糖 最佳条件 为A2B2C2D2,即料液比1∶50,超声时间50 min,提取温度50 ℃, 醇沉浓度90% 。
2.3验证实验
按最佳提取条件进行三次平行试验,如表3所示,多糖平均得率为( 11. 70 ± 0. 15) % ,RSD = 1. 31% 。结果表明,该方法具有良好的重复性。
3结论
通过单因素试验和正交试验,确定了牛膝多糖的最佳提取条件为: 超声时间50 min,料液比1∶50,提取温度50 ℃ ,醇沉浓度90% ,此时多糖得率为11. 7% ,比文献值提高了近一倍[6],纯度达77. 1% ,该工艺重复性良好。
摘要：采用超声波辅助提取法对牛膝中水溶性多糖的提取工艺进行了研究。考察了料液比、超声时间、提取温度、醇沉浓度等四个因素对牛膝多糖提取效果的影响。通过正交试验得出超声提取的最佳工艺条件为:料液比1∶50、超声时间50 min、提取温度50℃、醇沉浓度90%,此时多糖得率达到11.7%,结果可为牛膝多糖的深入研究提供一定的依据。
关键词：牛膝,多糖,超声波,提取
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超声波辅助提取 篇5
目的 提取杜梨果实多糖,并测定其含量.方法 采用超声-微波协同萃取法和常规水浴提取杜梨果实多糖,并用蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量.结果 超声波-微波协同萃取法比较常规水浴法提取杜梨果实多糖效果更好,两种方法提取多糖的含量分别是13.91%和12.74%;葡萄糖浓度在25.15～100.6 μg・ml-1范围内呈良好的.线性关系,平均回收率为100.5%,RSD1.59%(n=5).结论 超声-微波协同萃取法可作为杜梨果实多糖提取的首选方法,蒽酮-硫酸比色法测定多糖含量的方法准确,重复性好.
作 者：赵小亮 白红进 吴翠云 王彦芹 王星军 李雨潇 ZHAO Xiao-liang BAI Hong-jin WU Cui-yun WANG Yan-qin WANG Xing-jun LI Yu-xiao 作者单位：赵小亮,白红进,王彦芹,ZHAO Xiao-liang,BAI Hong-jin,WANG Yan-qin(新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆,阿拉尔,843300)
吴翠云,王星军,李雨潇,WU Cui-yun,WANG Xing-jun,LI Yu-xiao(塔里木大学植物科技学院,新疆,阿拉尔,843300)
超声波辅助提取 篇6
关键词：蓝莓酒渣；花色苷；超声波辅助；提取工艺；抗氧化活性
中图分类号： Q946.91+9；O657.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0242-05
收稿日期：2014-08-29
基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK2012786）；南京市生物农业项目。
作者简介：刘晨（1990—），女，山东乐陵人，硕士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：jgee39@sina.com。
通信作者：马艳弘，博士，副研究员，主要从事发酵食品与副产物综合利用研究。Tel：（025）84391287；E-mail：ma_yhhyy@126.com。蓝莓为杜鹃花科越橘属（Vaccinium spp.）植物，是21世纪的功能性保健浆果，被联合国粮农组织（FAO）列为人类五大健康食品之一，富含花青素、黄烷醇、酚酸等多种活性物质[1-3]，有抗氧化、抗炎、抗癌、护肝、抗衰老、软化血管、保护视力、增强人机体免疫力等多种药理保健功效[4-8]，具有极高的经济价值和开发前景。蓝毒花青素（anthocyanins）是蓝莓药理活性的主要物质基础，属黄酮类化合物，常以半乳糖苷、葡萄糖苷、阿拉伯糖苷、芸香糖苷等花色苷形式存在[9-10]。
随着消费者对蓝莓营养保健功能认识的增强，蓝莓汁、蓝莓酱、蓝莓酒等相关产品风靡世界，其中蓝莓酒由于具有营养丰富、酒体醇厚、色泽艳丽、口味绵长、香气宜人等特点而备受消费者推崇。但是在蓝莓酒酿造过程中产生的大量酒渣却并未得到充分利用，而研究认为，蓝莓酒渣中仍含有大量花色苷，利用合理的方法提取蓝莓酒渣中的花色苷、提高蓝莓酒渣资源的综合利用率是当前加速蓝莓产业发展的重要途径之一。
国内外许多学者对花色苷的提取方法做了大量研究，采用的方法主要有溶剂萃取法、酶法辅助法、微波辅助法等[11-13]。借助超声波进行辅助提取是近年来色素提取研究中发展的新技术，这种方法可有效破碎植物细胞壁，具有色素溶出快、提取时间短、萃取效率高等优点[14-19]。众多的研究主要集中在蓝莓果实中花色苷的分离提取，而对于蓝莓酒渣中花色苷的高效提取技术还鲜见报道，因此本试验利用超声波辅助提取法，通过响应面分析法对提取条件进行优化，并探讨其抗氧化活性，以期为提高蓝莓酒渣综合利用率提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
蓝莓酒渣，由江苏省句容市万山红遍生物科技有限公司提供；25%蓝莓花色苷标准品，陕西森弗天然制品有限公司；DPPH，上海源叶生物科技有限公司；羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；无水乙醇、柠檬酸、盐酸、氯化钾、醋酸钠等均为分析纯试剂。
1.2仪器设备
DHG-9070电热鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；HJ-6A多头磁力搅拌器，常州国华仪器有限公司；KH-500E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；D-B分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-5220型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ZD-F12真空冷冻干燥机，南京载智自动化设备有限公司。
1.3试验方法
1.3.1蓝莓酒渣花色苷超声提取工艺将蓝莓酒渣平铺于鼓风干燥箱内，于45 ℃烘干至恒重，用高速粉碎机粉碎后过80目筛。取干粉按一定比例加入柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3），浸泡10 min后置于超声波清洗器中进行不同时间的超声处理。然后置于不同温度磁力搅拌器中避光提取1 h，抽滤，回收滤渣，加入同体积提取液，在相同温度下再提取1次，合并2次上清液，50 ℃旋转蒸发后，选用AB-8大孔树脂进行纯化[20]，流速2 mL/min，待回收液吸光度值达上样提取液吸光度值10%时停止上样。用蒸馏水洗去树脂未吸附杂质，并采用考马斯法和硫酸苯酚法分别测定回收液中蛋白质含量和还原糖含量，当二者无检出时，用柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3）进行洗脱。收集洗脱液于50 ℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，真空包装后于4 ℃避光贮藏备用。
1.3.2蓝莓酒渣花色苷提取率的测定采用pH示差法[21]测定花色苷含量。准确吸取1mL待测提取液于具塞试管中，再分别加入4 mL pH值为1.0、4.5的缓冲液，避光条件下放置60 min达平衡，利用分光光度计分别测量520、700 nm处的吸光度值。
提取液花色苷含量计算公式：
C=ΔD×M×n×Vε×1×m×1 000；
ΔD=[（D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0）-（D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5）]
式中：C为花色苷含量，mg/g；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；ε为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；m为样品质量，g；l为光程，1 cm。
实际测定后，将计算结果换算为1 g蓝莓酒渣中含有花色苷的质量（mg）。
nlc202309040104
1.3.3单因素试验设计以蓝莓酒渣花色苷提取率为考察目标，以柠檬酸酸化的70%乙醇溶液（体积含量，pH值为3）为提取液，在超声功率500 W的条件下，考察不同超声时间、液料比、提取时间对花色苷提取率的影响，提取条件的单因素设计见表1。 表1蓝莓酒渣花色苷提取单因素试验设计
因素水平其他提取条件超声时间10、20、30、40、50、60 min液料比20 mL ∶1 g，提取温度50 ℃，提取1 h，提取2次液料比
5 mL ∶1 g、10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g超声时间30 min，提取温度50 ℃，提取1 h，提取2次
提取温度30、40、50、60、70、80 ℃超声时间30 min，液料比20 mL ∶1 g，提取1 h，提取2次
以上试验均进行2次平行试验，结果取平均值。
1.3.4Box-Behnken试验设计及响应面分析根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计方案，以超声时间A、液料比B、提取温度C为考察因素，以花色苷提取率为响应值，利用Design-Expert8.0.5b软件优化蓝莓酒渣花色苷提取工艺。试验因素水平编码见表2。
表2Box-Behnken试验因素水平编码
水平因素因素A：超声时间
（min）B：液料比
（mL ∶g）C：提取温度
（℃）-14020 ∶15005030 ∶16016040 ∶170
1.3.5蓝莓酒渣花色苷抗氧化活性检测[22-23]
1.3.5.1DPPH自由基清除能力测定配置0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL的蓝莓酒渣花色苷溶液，各取2 mL于具塞试管中，每管加入2 mL 2×10-4 mol/L DPPH溶液，摇匀后避光放置30 min。以同浓度维生素C和25%蓝莓花色苷标准品为阳性对照，分别测定517 nm处的吸光度D517 nm。
DPPH·清除率=[1-（D517 nm（i）-D517 nm（j））/D517 nm（o）]×100%。
式中：D517 nm（i）、D517 nm（j）、D517 nm（o）分别为测定条件为2 mL样品溶液+2 mL DPPH溶液、2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇、2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇的吸光度。
1.3.5.2抗超氧阴离子自由基能力测定配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL的样品溶液，按试剂盒说明书操作，取同浓度维生素C溶液和25%蓝莓花色苷标准品溶液作对照，无水乙醇作空白对照。超氧阴离子自由基清除能力计算公式如下：
抗超氧阴离子活力单位（U/L）=（D550 nm（对照组）-D550 nm（试验组））/（D550 nm（对照组）-D550 nm（标准组））×标准品浓度（mg/mL）×1 000 mL。
1.3.5.3清除羟自由基能力的测定分别取0.01、0.02、004、0.08、0.16 mg/mL样品溶液，按试剂盒说明书操作，其呈色与OH·的多少成正比关系，即吸光度越小，样品对羟自由基的清除能力越强。取同浓度维生素C溶液和25%蓝莓花青素标品溶液作阳性对照，以无水乙醇作空白对照。羟自由基抑制能力计算公式如下：
抑制率=（D对照组-D试验组）/D对照组×100%。
2结果与分析
2.1单因素试验结果与分析
2.1.1超声时间对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图1所示，随超声时间的延长，蓝莓酒渣花色苷提取率逐渐增大，当提取时间超过50 min以后，提取率基本趋于稳定。这可能是因为当时间达50 min时，在超声作用下酒渣基本完全破壁，继续延长超声时间反而会使部分花色苷分解，因此，50 min 为适宜的超声时间。
2.1.2液料比对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图2 所示，在液料比30 mL ∶1 g以内，随液料比逐渐增大，花色苷提取率逐渐增加；当液料比达30 mL ∶1 g后，继续增大提取溶剂量，提取率增加极其缓慢。结果说明，增加溶剂量会增大花色苷扩散速度，使提取速度加快，但过量的提取溶剂会导致物料吸收的超声能减少、花色苷溶出不充分，而且过高溶剂量既增加了成本，又加重了后续浓缩负担，因此综合考虑可以确定 30 mL ∶1 g 为最佳液料比。
2.1.3提取温度对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响如图3所示，提取温度低于60 ℃时，随着提取温度的增加，花色苷的提取率逐渐增大；60～70 ℃之间，花色苷提取率相对平稳；超过70 ℃后，花色苷提取率反而下降。这是因为花色苷的溶解度会随温度升高而提高，但温度过高会使少部分花色苷结构发生变化，使得提取率下降，因此综合比较可选60 ℃为蓝莓酒渣花色苷适宜的提取温度。
2.2响应面试验设计与结果
2.2.1回归模型建立及方差分析采用Box-Behnken设计方案，以提取率为响应值，优化蓝莓酒渣花色苷提取工艺。试验设计与结果见表3，其中实测值为3次平行试验结果的平均值。
应用Design Expert8.0.5b软件对试验结果进行多元回归
表3响应面试验设计及结果
序号A：超声时
间（min）B：液料比
（mL ∶g）C：提取温
度（℃）提取率（mg/g）实测值预测值10-115.8355.85201-15.9835.973-10-15.7955.84-1105.9325.9551016.1026.106-1015.9375.947-1-105.6545.6481-105.9235.9190006.0216.01100006.0326.01110005.9846.01120116.0756.061310-16.0186.02141106.0566.07150-1-15.7125.72
nlc202309040104
分析，得到以蓝莓酒渣花色苷提取率为响应值的回归方程为：
花色苷提取率（mg/g）=2.017 42+0.053 071A+0085 525B+0.037 237C-3.62 500×10-4AC-1.450 00×10-4AC-7.750 00×10-5BC-2.966 67×10-4A2-9.141 67×10-4B2-1.966 67×10-4C2。
式中：A为超声时间，min；B为液料比，mL ∶g；C为提取温度， ℃。
对模型进行显著性分析，由表4可知，回归模型极显著（P=0.000 2<0.01），失拟项（P=0.645 7）不显著，实际试验值与预测值具有高度相关性（R2=0.989 8，R2Adj=0.971 5），表明模型与试验值拟合良好[24]，试验方法可信度高，试验得到的2次回归方程能够很好地对响应值进行预测。由表4还可知，3个自变量对响应值的影响程度大小依次为液料比（B）>超声时间（A）>提取温度（C），其中3个因素以及液料比的 2次项（B2）对花色苷提取量影响极显著（P<0.01），超声时间和料液比的交互作用（AB）对花色苷提取量影响显著（P<0.05）。表4方差分析结果
参数平方和自由度均方F值P值显著性模型0.246 366 01790.027 374 00254.036 522 820.000 2极显著A：超声时间0.076 245 12510.076 245 125150.508 554<0.000 1极显著B：液料比0.106 260 510.106 260 5209.759 170 9<0.000 1极显著C：提取温度0.024 310 12510.024 310 12547.988 402 70.001 0极显著AB0.005 256 2510.005 256 2510.375 8841 90.023 4显著AC0.000 84110.000 8411.660 141 4710.254 0BC0.000 240 2510.000 240 250.474 255 6340.521 7A20.003 249 64110.003 249 6416.414 820 2510.052 4B20.030 856 64110.030 856 64160.911 283 490.000 6极显著C20.001 428 10310.001 428 1032.8190871470.154 0残差0.002 532 91750.000 506 583失拟项0.001 268 2530.000 422 750.668 555 6140.645 7不显著纯误差0.001 264 66720.000 632 333总和0.248 898 93314R20.989 8R2Adj0.971 5
2.2.2响应面图分析与优化图4至图6反映了几个因素间的交互作用对蓝莓酒渣花色苷提取率的影响。响应曲面图中曲面的陡峭程度可以表明变量对提取率的影响程度，曲面较陡表明影响较大，反之则较小；等高线图反映了因素间交互作用的强弱，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著[24]。由图4可见，超声时间与液料比交互作用的响应面坡度陡，等高线密集，说明二者交互作用显著；同一超声时间下，随液料比增加，提取率显著增加；与之相比，在同一液料比水平下，随着超声时间的增加，提取率增加幅度较缓。由图5、图6看出，2个因素间交互作用的响应面坡度缓，等高线稀疏，说明二者交互作用不显著，这一结论与方差分析中3个自变量F值大小排序所反映的趋势一致。
2.2.3最优提取工艺条件及验证试验通过软件分析得到蓝莓酒渣花色苷超声辅助法最佳提取工艺为：超声时间4996 min、液料比33.48 mL ∶1 g、提取温度65.15 ℃，在此条件下，蓝莓酒渣花色苷提取率可达6.110 95 mg/g。为了操作方便，修正最佳提取工艺条件为：超声时间50 min、液料比 33 mL ∶1 g、提取温度65 ℃。在此条件下，进行3次平行试验，所得提取率平均值为6.092 mg/g，实测值与预测值相对误差仅为0.31%，说明该优化设计方案可以较好地预测蓝莓酒渣花色苷提取情况。
2.3蓝莓酒渣花色苷抗氧化活性分析
2.3.1DPPH自由基清除能力如图7所示，随着溶液浓度的增加，3种样品清除DPPH自由基能力不断增强，同浓度条件下，维生素C清除DPPH自由基能力高于25%蓝莓花色苷标准品和蓝莓酒渣花色苷。当蓝莓花色苷标准品溶液和蓝莓酒渣花色苷溶液浓度为0.01～0.02 mg/mL时，前者对DPPH
自由基的清除率高于后者；随浓度逐渐增大并大于 0.04 mg/mL 后，前者的清除率低于后者；当蓝莓酒渣花色苷溶液浓度达0.08mg/mL时，清除率达78.59%；浓度达 0.16 mg/mL 时，清除率达81.70%。
2.3.2抗超氧阴离子自由基能力由图8可见，随着溶液浓度的增加，3种样品抗超氧阴离子自由基能力不断增强；相同浓度条件下，维生素C抗自由基能力高于25%蓝莓花色苷标准品和蓝莓酒渣花色苷。25%蓝莓花色苷标准品抗自由基能力在一定浓度内略高于蓝莓酒渣花色苷，当蓝莓酒渣花色苷溶液浓度达0.16 mg/mL时，抗自由基能力达220.89 U/L。
2.3.3羟自由基抑制能力如图9所示，随着3种样品溶液浓度增加，羟自由基抑制率不断提高。同浓度时抗维生素C对羟自由基的抑制能力大于25%蓝莓花色苷标准品、蓝莓酒渣花色苷。当蓝莓花色苷标准品溶液和蓝莓酒渣花色苷溶液浓度为0.01～0.02 mg/mL时，前者自由基抑制率低于后者；随浓度增大为0.04～0.16 mg/mL时，后者自由基清除率低于前者；当蓝莓酒渣花色苷浓度达0.08 mg/mL时，羟自由基清除率达66.54%；浓度达0.16 mg/mL时，羟自由基清除率达82.40%。
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综合分析以上3组试验结果可知，蓝莓酒渣花色苷具有较好抗氧化能力，与25%蓝莓花色素苷标准品抗氧化能力接近。
3结论
在单因素试验基础上，通过响应面分析法优化了蓝莓酒渣花色苷最佳提取工艺，建立了可靠的预测模型，得到蓝莓酒渣花色苷最优提取条件为：柠檬酸酸化70%乙醇（体积含量，pH值=3）为提取液，浸泡10 min，液料比33 mL ∶1 g、超声时间50 min、提取温度65 ℃、连续提取2次。此条件下蓝莓酒渣花色苷提取率为6.092 mg/g，与理论预测值基本一致。通过DPPH自由基清除能力、抗超氧自由基能力、羟自由基抑制能力测试发现，所提酒渣花色苷具有较强的抗氧化活性，0.16 mg/mL 的花色苷提取液对DPPH自由基清除率达8170%，抗超氧阴离子自由基能力达220.89 U/L，羟自由基抑制率为82.40%。由此可见，超声辅助提取的蓝莓酒渣花色苷得率较高、抗氧化能力较强，既为节能环保、提高蓝莓酒渣资源的利用率提供了很好的思路，又为蓝莓酒渣花色苷工业化生产提供了试验依据。
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超声波辅助提取 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
本研究采用的薯莨产自湖南永兴。
1.2 仪器及试剂
主要仪器:紫外分光光度计UV2550型,7220型分光光度计,医用数控超声波清洗器,微波炉,旋转蒸发器,离心机(0~4000r·min-1),恒温干燥箱,梅特勒分析天平(万分之一),索氏提取仪。
主要试剂:甲醇,石油醚,无水乙醇,丙酮,乙腈等,均为分析纯。
1.3 原料预处理
选用新鲜,无病虫害,无腐烂的薯莨,用水洗净,切成1mm左右颗粒,70℃烘干,粉碎,过0.25mm筛,干燥避光保存。
1.4 薯莨最适吸收波长的选择
称取2.0g薯莨粉于小烧杯中,加20m L 95%乙醇,预先浸泡2h,然后超声10min,分3次进行,所得提取液全部转移至100m L容量瓶中并定容到刻度。离心分离后取上清液,在300~600nm波长范围内扫描,测其最适波长为450nm(图1),因此确定本次研究的最大吸收波长为450nm。
1.5 薯莨红色素提取及测定
称取2.0g薯莨粉于小烧杯中,加20m L 50%乙醇,预先浸泡2h,然后超声10min,分3次进行,所得提取液全部转移至100m L容量瓶中并定容到刻度。将色素提取液放入离心机中,在4000r·min-1下离心5min,得到色素上清液,待其冷却到室温后,用对应的提取溶剂定容至100m L,提取溶剂作参比,在525nm下,用1cm比色皿测其吸光度值。
1.6 实验设计
选择不同的提取溶剂与浓度、超声功率、液料比、提取时间、提取温度等进行单因素实验,并分析各因素对薯莨红色素提取效果的影响,同时选择影响因素大的进行正交优化实验,以探索最佳的提取工艺条件。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
称取2.0g薯莨粉6份,分别加入蒸馏水、50%甲醇、50%乙醇、50%乙腈、50%丙酮及50%石油醚,固定超声波功率为100W,在料液比1∶10,温度50℃下超声提取30min,离心机离心5min(4000r·min-1)后,取上清液,用100m L的容量瓶定容,并测定A450值。结果见图2,有机溶剂的提取效果更好,其中乙醇和丙酮的吸光值都相对较高,分别为0.768和0.750。虽然乙腈和乙醇的提取率相差不大,但是考虑到价格和毒性,本次实验选用乙醇作提取剂。
2.2 单因素实验与分析
实验过程中发现,薯莨浸泡时间超过2h,再延长浸泡时间对色素提取率影响不大;超声提取次数多于3次后,对色素提取率的提高作用甚微。因此本实验主要研究乙醇浓度、料液比、超声功率和超声时间对色素提取的影响。
2.2.1 不同乙醇浓度对色素提取的影响
准确称取薯莨样品6份,分别采用30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇浓度,按1.5的步骤提取并测定色素吸光值,选取最佳的乙醇浓度。结果见图3,随着乙醇浓度增大,薯莨色素吸光值随之增加,但当浓度达到60%以后,吸光值增大趋势变缓,甚至有下降趋势。60%和70%的提取效果相差不大,但考虑到生产成本,同时乙醇浓度升高,终产品中非色素成分增加,影响色素纯度,因此,最佳乙醇浓度为60%。
2.2.2 料液比对薯莨色素提取的影响
准确称取薯莨样品5份,用50%乙醇分别以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50,按1.5的步骤提取并测定薯莨色素吸光值,确定提取最佳的料液比,结果见图4。实验结果表明色素提取率随着料液比的增加而变大,当料液比为1∶30时提取率呈下降趋势,考虑生产成本,最佳料液比为1∶30。
2.2.3 时间对薯莨色素提取的影响
准确称取5份薯莨样品,分别提取10min、20min、30min、40min、50min、60min,然后按1.5的步骤提取并测定薯莨色素吸光值,结果见图5。随着时间的延长,薯莨色素吸光值增大,但在30min之后增幅不明显,考虑到生产成本,同时提取时间过长,产品中非红色素成分增加,影响红色素纯度,因此,最佳超声时间为30min。
2.2.4 超声波功率薯莨色素提取的影响
准确称取6份薯莨样品,设置超声波功率为100W、200W、300W、400W、500W、600W,按1.5的步骤测定色素吸光值。结果表明,在功率为200W时,色素提取率达到最大,之后随功率的增加呈现下降的趋势。其主要原因是超声波的物理震动对细胞膜产生空穴作用,使其结构破坏,色素得以释放,提取效果明显增加。但是功率过大的话可能也使薯莨色素结构被破坏,导致提取效果下降,故采用超声功率为200W。具体结果见图6。
2.2.5 提取温度对薯莨色素提取的影响
准确称取6份薯莨样品,分别将温度设置为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃,按1.5的步骤提取并测定薯莨色素吸光值。结果表明,温度升高,有利于色素的提取,在50~70℃间提取效果相差不大,温度为60℃,提取效果最好。温度继续升高,可能造成提取剂的蒸发损失,增加提取成本,因此,将提取温度选为60℃。具体结果见图7。
2.3 正交实验结果与分析
根据以上单因素试验结果,采用L9(34)正交试验表,分别以乙醇浓度、超声功率、液料比及提取时间作为试验因素,各设置3水平试验,以确定薯莨色素的最佳提取条件。实验结果见表1。
由表1的极差分析可知,利用乙醇超声提取薯莨色素的影响因素依次为:超声功率>料液比>乙醇浓度>超声时间。4种因素的最佳组合为A1B2C2D3。正交表的结果表明,最佳提取工艺条件为:乙醇浓度50%,料液比1∶40,超声功率200W,超声时间20min。同时对最佳提取条件进行验证实验,在此条件下,薯莨色素提取后吸光度值可达0.952,RSD=2.16%。实验重现性好。
3 结论
通过单因素实验和正交实验,确定薯莨色素最佳提取工艺条件为:在样品浸泡2h,采用50%乙醇,料液比1∶40,超声功率200W,温度为60℃,提取时间25min的条件下,薯莨色素的提取效果最佳。
超声波辅助提取技术是近年来兴起的一种天然产物物理提取方法,操作简便,条件温和可靠,经济且容易实现,相对于传统浸提法,利用超声波产生的空化效应,可增加细胞通透性,从而大大缩短提取时间,提高提取率。因此,超声波辅助提取技术的应用前景广阔。
参考文献
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超声波辅助提取 篇8
关键词：大米蛋白,超声波,提取
中国是世界上100多个水稻生产国中的“稻米王国”, 但稻米的深加工利用率很低。每年我国将产生3 000多万t可再利用的稻米副产品 (这些副产品集中了64%的稻米营养素) , 却都未得到有效利用, 多以干粉的形式廉价卖给饲料厂, 造成蛋白质资源的极大浪费。
大米蛋白质含有较高的赖氨酸, 不含任何抗营养因子, 具有良好的消化性和低过敏性。因此, 大米蛋白作为一种低敏性蛋白, 在婴幼儿食品中添加是非常有益的。除此之外, 大米蛋白质可用做饲料, 还可加工成酱油、高蛋白粉、蛋白饮料、蛋白胨和蛋白发泡粉等, 若将大米蛋白质水解, 则可制成营养价值极高的氨基酸营养液, 用于加工保健饮料、调味品、化妆品和洗涤剂等。因此, 提取和合理利用大米中蛋白质具有重要的社会和经济意义。
大米、米糟和米糠等原料都可用来制备大米蛋白, 目前的制备方法主要有:碱法提取、酶法提取、溶剂提取、物理提取和复合提取法。本文采用超声波辅助表面活性剂法提取大米蛋白。
1 试验材料与方法
1.1 材料与仪器
大米, 市售粳米;十二烷基苯磺酸钠 (分析纯) 、氢氧化钠 (分析纯) 、浓盐酸 (分析纯) 。
KQ-200VDE型三频超声清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;p HS-3C型酸度计, 上海虹益仪器厂;BT124S电子分析天平, 赛多利斯科学仪器 (北京) 有限公司;GL-20G-II高速离心机, 上海市安亭科学仪器厂;101-3型干燥箱, 上海市试验仪器总厂;洛贝榨汁机, 东莞市乐邦电子有限公司。
1.2 大米蛋白的提取
1.2.1 大米粉的预处理
大米浸泡2h→湿磨粉碎→50℃下烘干→过90目筛→密封保存
1.2.2 大米蛋白的提取
准确称取过90目筛大米粉5g, 按一定比例加入十二烷基苯磺酸钠溶液→在一定超声功率、超声频率下处理→离心 (3 000r/min, 20min) →保留上清液, 沉淀加50m L蒸馏水清洗→离心 (3 000r/min, 20min) (此过程重复2~3次) →合并上清液→调等电点 (p H值5.5) →离心 (3 000r/min, 20min) →收集沉淀、烘干 (50℃) 并计算提取率。
1.2.3 大米蛋白提取的计算
2 结果与讨论
2.1 等电点的确定
准确称取过90目筛的大米粉5g, 加入30m L 1%的十二烷基苯磺酸钠溶液。在超声功率为140W、超声频率为80k Hz条件下处理30min后, 离心 (3 000r/min) 20min, 保留上清液, 沉淀加50m L蒸馏水清洗, 再离心 (3 000r/min) 20min (此过程重复2~3次) 。合并上清液共120m L, 将合并后的上清液分成6等份, 每份20m L。分别用0.1mol/L Na OH溶液或0.1mol/L HCl溶液调p H值为5.1、5.2、5.3、5.4、5.5和5.6, 再分别进行离心 (3 000r/min) 20min, 收集沉淀、于50℃下烘干后分别称重。结果如图1所示。
由图1可知:随着等电点p H值的增大, 大米蛋白提取量先增大后减小。当等电点p H值在5.1~5.5范围内, 大米蛋白提取率呈增加趋势, p H值>5.5后, 大米蛋白提取量开始下降。因此, 试验确定大米蛋白的最佳等电点p H值为5.5。
2.2 十二烷基苯磺酸钠浓度对大米蛋白提取率的影响
由图2可知:随着十二烷基苯磺酸钠溶液浓度的增大, 大米蛋白提取率先增大后减小。当十二烷基苯磺酸钠溶液浓度为1%时, 大米蛋白提取率最大。因此, 试验确定十二烷基苯磺酸钠的最佳提取浓度为1%。
2.3 固液比对大米蛋白提取率的影响
由图3可知:随着固液比的增大, 大米蛋白提取率先增大后减小。这是由于大米蛋白从细胞到溶剂是一个由浓度差推动的过程, 溶剂用量越多细胞内外的浓度差就越大。当溶剂增加到一定程度之后再增加溶剂用量并不会明显提高大米蛋白的提取率。当固液比为1∶6时, 大米蛋白提取率最大。因此, 试验确定最佳固液比为1∶6。
2.4 超声功率对大米蛋白提取率的影响
由图4可知:随着超声功率的增加, 大米蛋白提取率先增大后减小。这是因为加大超声功率, 超声空化作用加强, 机械剪切作用也加强, 有助于大米蛋白的溶出。但当功率达到一定程度 (140W) 时, 功率再进一步提高, 大米蛋白提取率反而呈下降趋势。因此, 试验确定最佳超声功率为140W。
2.5 超声时间对大米蛋白提取率的影响
由图5可知:随着超声时间的增加, 大米蛋白提取率先增大后减小。当超声时间为30min时, 大米蛋白提取率达到最大值。因此, 试验确定最佳提超时间为30min。
2.6 超声频率对大米蛋白提取率的影响
由图6可知:随着超声频率的增加, 大米蛋白提取率先减小后增大。当超声频率为100k Hz时, 大米蛋白提取率达到最大值0.95%。因此, 试验确定最佳超声频率为100k Hz。
2.7 正交试验
为优化提取工艺条件, 以大米蛋白提取率为指标, 选择十二烷基苯磺酸钠浓度、固液比、超声功率、超声时间和超声频率5个因素, 采用L18 (37) 正交表进行正交试验, 结果见表1。
由表1可知:各因素对大米蛋白提取的影响程度依次为:十二烷基苯磺酸钠浓度 (A) >超声频率 (C) >超声时间 (E) >物料比 (B) >超声功率 (D) 。最佳提取条件组合为A3B1C1D1E3, 即十二烷基苯磺酸钠浓度为1.5%、物料比为1:5、超声频率为45k Hz、超声功率为120W和超声时间为35min。
通过验证试验, 以该最佳组合为条件进行提取时, 大米蛋白提取率为1.08%, 高于正交试验的任何一组。
2.8 外延试验
由于正交试验确定最佳提取工艺为A3B1C1D1E3, 各因素均在边缘水平, 所以需要对其进行外延试验。其中超声频率 (C) 在1水平, 已达到仪器的最小频率, 无法对其外延;而由极差分析RA>RC>RE>RB>RD可知, 物料比 (B) 和超声功率 (D) 对大米蛋白提取率的影响较小, 可以忽略其外延。因此, 本文只对十二烷基苯磺酸钠浓度 (A) 和超声时间 (E) 进行外延试验。
由表2可知:分别对十二烷基苯磺酸钠浓度 (A) 和超声时间 (E) 进行外延时, 大米蛋白提取率均低于正交试验确定的最优条件下大米蛋白的提取率 (1.08%) 。因此, 可以确定十二烷基苯磺酸钠浓度 (A) 和超声时间 (E) 在第三水平为最佳。
3 结论
本文以过90目筛的大米粉为原料, 研究了超声波辅助表面活性剂法 (十二烷基苯磺酸钠) 提取大米蛋白的工艺。在确定大米蛋白等电点=5.5的情况下, 通过单因素与正交试验, 得出最佳工艺条件为:十二烷基苯磺酸钠浓度为1.5%、物料比为1∶5、超声频率为45k Hz、超声功率为120W和超声时间为35min, 此条件下大米蛋白提取率为1.08%。
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超声波辅助提取 篇9
1 实验部分
1.1 材料和试剂
缬草:采自铜仁市江口县。采摘,洗净晒干,剪碎后于50℃的电热恒温鼓风干燥箱内烘烤2h,万能粉碎机粉碎,过0.150 mm(100目)筛,得其粉末装瓶备用。
蒽酮,上海中秦化学试剂有限公司;浓硫酸,成都金山化学试剂有限公司;无水乙醇,天津市富宇精细化工有限公司;石油醚(30~60℃),天津市科密欧化学试剂有限公司;30%双氧水,成都金山化学试剂有限公司;葡萄糖,江苏强盛功能化学股份有限公司;氯仿,成都科龙化工实验厂;正丁醇,衡阳市凯信化工试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
PL602-5型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DHG-9140A型电热鼓风干燥箱,上海精密实验设备有限公司;KQ-C型玻璃仪器气流烘干器,巩义市予华仪器有限责任公司;SHZ-DIII循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司;DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;BO-250T型250 g多功能粉碎机,永康铂欧五金厂;KR-800型台式低速离心机,江苏省常州市康仁医疗器械有限公司;新世纪T6紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;SG5200HPT型台式超声波清洗器,上海冠特超声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 缬草多糖提取的工艺流程
预处理后的缬草根粉末→水浸提取(不同条件)→离心→取滤液→双氧水去色素→Sevag法除蛋白→醇沉→离心→取沉淀→定容→蒽酮-硫酸法测定多糖含量。
1.3.2 缬草多糖提取的工艺优化
准确称取已经处理好的缬草根粉末5份(各1.0 g),将乙醇作为浸提剂,按照如下条件进行单因素实验,即:提取时间分别为35、45、55、65、75min;料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/m L;提取温度分别为40、50、60、70、80℃。分别考察提取时间、料液比、提取温度对缬草多糖提取率的影响。在单因素实验的基础上进行L9(33)的正交实验[4,5,6]。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的制作
准确称取于98℃下恒重的葡萄糖标准品0.010 8 g,定容于100 m L的容量瓶中,备用。分别移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 m L配好的葡萄糖标准溶液于干燥洁净的小试管中,加蒸馏水补齐于2 m L,然后在冰水浴中加入4 m L的蒽酮-硫酸溶液,振荡均匀后于沸水浴加热10 min。另取2 m L蒸馏水,按上述方法,在冰水浴中加入4 m L的蒽酮-硫酸溶液,振荡均匀后于沸水浴加热10 min。待溶液冷却至室温后,以加蒸馏水的溶液为空白对照,用紫外分光光度计在620 nm处测上述各溶液的吸光度[7,8]。
标准曲线如图1所示。用蒽酮-硫酸法在620 nm波长下测定其吸光度,以葡萄糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得出回归方程y=9.1 187 x-0.017,R2=0.999。
2.2 时间对提取率的影响
提取时间对缬草多糖提取率的影响见图2。由图2可知,开始时缬草多糖的提取率随提取时间的增加而增加,在45 min出现最大值。后随提取时间的增加,多糖提取率呈下降趋势,可能是因为随着提取时间的延长,部分多糖发生了水解[9]。在55~65min处出现了部分回升,可能是因为随着加热时间的增长,部分溶剂挥发导致溶液浓缩。所以,最佳超声浸提时间为45 min。
2.3 料液比对提取率的影响
料液比对缬草多糖提取率的影响见图3。
由图3可知,在料液比较低时,溶解不完全,多糖的提取率较低,但随着料液比的增加而增加。以后随料液比的增大而降低,可能是料液比较大,溶出杂质较多,有效成分较少而多糖含量较少[10]。因此,确定最优的料液比为1∶25(g/m L)。
2.4 提取温度对提取率的影响
提取温度对缬草多糖提取率的影响见图4。由图4可知,在60℃之前,随着温度的增加,缬草多糖的提取率也逐渐增加,60℃处取得最大值。在其之后,随着温度的升高,多糖提取率有所下降,可能是因为部分多糖随着温度升高发生了水解。所以,最佳浸提温度为60℃。
2.4 正交实验
为了确定提取缬草多糖的最佳工艺[11,12],根据单因素实验结果,选择提取时间、料液比、提取温度3个因素水平(表1),采用L9(34)正交表进行实验,以多糖提取率(%)为指标,实验结果见表2。
由表2可知,影响缬草多糖提取率的因素依次为:提取时间>料液比>提取温度,提取的最佳方案为A2B2C2,即提取时间为45 min、料液比为1∶25(g/m L)、提取温度60℃。
2.5 验证性实验
为了考察上述提取工艺的稳定性[13,14],在最佳条件下进行3次重复性实验,分别测定其多糖提取率,再计算其RSD,实验结果见表3。
由表3可知,在最佳提取工艺条件下,缬草多糖的平均提取率为13.56%,优于正交实验中的任何一组,且RSD为0.84%,说明该工艺稳定。
2.6 超声波辅助提取法与常规浸提法的比较
超声波辅助提取与常规浸提取的比较结果见表4。
由表4可知,超声波辅助提取比常规浸提所用时间短,具有温度低,料液比少,提取率高等特点。
3 结论
超声波辅助提取 篇10
目前,工业上单宁的提取方法多采用溶剂提取法,以水为溶剂的煎煮法,操作简便和成本低,但容易造成多酚类成分的破坏。与水提法相比,水-乙醇提取法具有提取条件温和、提取物中多酚类成分含量高等优点[4]。超声波辅助提取既是对超声波进行利用,其可产生强烈的振动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,提高了有效成分进入溶剂中的速度,从而有效地促进提取效率的提高及提取时间的缩短,该方法的另一个优点是可有效地避免高温条件下对提取成分的影响[5]。本研究中的溶剂选择乙醇—水溶液,利用超声波辅助提取法对白桦树皮中的桦树单宁进行提取,并采用均匀设计方法,考核的指标主要选择单宁的收率,以对桦树单宁的超声波辅助提取工艺条件进行优化。
1 材料与方法
1.1 供试材料与仪器
供试的原料为白桦树皮,采自大兴安岭塔河林业局。其采回后应进行一定的处理,即将白桦树皮晒干,粉碎后过筛。仪器:KQ-500DB超声波仪(江苏昆山超声仪器公司);AB104型电子天平(瑞士);752紫外-光栅分光光度计(上海振科有限公司);旋转蒸发仪RE-5(上海亚荣生化仪器);ZF-6030A真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)。试剂:没食子酸标准品(中国药品生物检定所);乙醇、浓硫酸、香草醛、碳酸钠等(均为分析纯)。
1.2 试验方法
1.2.1 桦树单宁提取方法。
(1)水提法。准确地称取重量为10.00 g的白桦树皮粉末,置于容量为250 mL的带回流冷凝管的圆底烧瓶中进行提取,提取前应加入150 mL蒸馏水。提取的温度控制在80℃,提取时间为4 h。待提取液冷却至室温,抽滤,将滤液在50℃下真空浓缩后,于60℃下真空干燥至质量恒定,得到桦树单宁提取物,称重待测。
(2)水—乙醇提取法。准确称取质量为10.00 g的白桦树皮粉末,置于容量为250 mL的带回流冷凝管的圆底烧瓶中进行提取,提取前应加入150 mL乙醇水溶液。提取的乙醇浓度控制在35%,提取的温度应达到80℃,提取的时间一般为1 h即可。待提取液冷却至室温,抽滤,将滤液在50℃下真空浓缩后,于60℃下真空干燥至质量恒定,得到桦树单宁提取物,称重待测。
(3)超声波辅助水—醇提取法。准确称取质量为10.00 g的白桦树皮粉末,置于容量为250 mL的带回流冷凝管的圆底烧瓶中按均匀设计的试验条件进行提取(表1),提取前应加入150 mL不同体积比的乙醇/水溶液。待提取液冷却至室温后抽滤,滤液50℃下真空浓缩后,60℃下真空干燥至质量恒定,得到桦树单宁提取物,称重待测。
1.2.2 单宁含量的测定。测量单宁含量的方法主要为Folin-Ciocalteau法[6]。
(1)标准曲线的绘制。精确称取质量为25.00 mg的没食子酸标准品进行溶解,溶解应选择蒸馏水进行,溶解后进行定容,使总体积达到250 m L,得到对照品标准溶液,浓度为0.10 mg/mL。精密吸取对照样品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 m L容量瓶中,再加入1 m L Folin-Ciocalteu显色剂,将之充分地摇匀后再加入浓度为15%的Na2CO3溶液2 mL,最后将混合液的体积定容至10 m L,在室温的条件下进行反应,一般2 h后即可进行吸光值A760的测定,每样重复测定3次,取平均值。以A760(x)为横坐标,没食子酸质量浓度(y,μg/mL)为纵坐标,绘制标准曲线。得回归线性方程为:y=0.105 8x+0.001 4,相关系数R=0.998 5,没食子酸含量在0.5～5.0μg/m L范围内具有很好的线性关系。
(2)桦树单宁提取物中单宁含量的测定。精密称取质量为25.00 mg的桦树单宁提取物,用一定量的蒸馏水进行溶解,过滤后将之最终体积定容至250 mL,充分摇匀后,精确吸取1.0 mL于10 m L容量瓶中,依次加入1 mL FolinCiocalteu显色剂及浓度为15%的Na2CO3溶液2 mL并定容,按上述标准曲线测定方法对吸光值进行测定,根据标准曲线计算没食子酸的含量。提取物中单宁的含量用没食子酸含量表示,计算单宁的收率与纯度。
2 结果与分析
2.1 超声波辅助水—乙醇提取工艺优化
均匀设计试验结果见表1。自变量分别选择乙醇浓度(X1)、提取时间(X2)、提取温度(X3)、超声波功率(X4),因变量选择单宁收率(Y),用均匀设计软件(2.0版)对均匀设计的试验结果进行逐步回归分析,得到回归方程为:
各因素对桦树单宁收率影响的逐步回归分析结果表明,随着超声波功率的提高,单宁收率逐渐增加,而随着提取时间延长和乙醇浓度及提取温度的提高,单宁收率的收率呈下降的趋势。根据回归方程计算,最佳乙醇浓度为15%,提取时间为30 min,提取温度为35℃,超声波功率为500 W。利用此条件提取桦树单宁,单宁得率达到6.44%,纯度达到45.68%。
2.2 不同提取方法的比较
以均匀设计试验优选出的工艺条件为试验组,以水提法及水—乙醇提取法作为对照组,进行试验,结果见表2。由表2可以看出,超声波辅助提取法单宁的提取率明显优于水提法,也优于水-乙醇提取法。可见,超声波辅助提取法提取时间短且提取率高,具有较优越的应用前景。
3 结论
试验结果表明,选择白桦树皮作为原料,溶剂选择水—乙醇溶液,运用均匀设计法对桦树单宁的超声波辅助提取工艺条件进行了优化,确定了桦树单宁的超声波辅助提取的最佳工艺条件:最佳乙醇浓度为15%,提取时间为30 min,提取温度为35℃,超声波功率为500 W。利用此条件提取桦树单宁,单宁收率为6.44%,纯度达到45.68%。采用3种不同的提取方法进行比较,结果表明,超声波辅助提取法与水提法、水—乙醇等提取方法进行比较,其不仅提取时间短,且提取率高,应用前景较为广泛[6]。
参考文献
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超声波辅助提取 篇11
关键词：鱼腥草；多糖；超声提取；响应面法
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0252-03
收稿日期：2013-12-16
基金项目：贵州省自然科学基金（编号：黔科合J字[2010]2263号）；贵州民族大学引进人才科研项目。
作者简介：姚秋萍（1978—），女，陕西渭南人，博士，副教授，从事食品化学研究。E-mail：wonderyqp@aliyun.com。鱼腥草为三白草科（Saururaceae）蕺菜属植物蕺菜（Houttuyniacordata Thunb.）的新鲜地上、地下部分以及干燥花期地上植株，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋的功效[1]。鱼腥草既是一种传统的中药材，又是特味野菜，极具开发潜力，临床上用于治疗肺炎、上呼吸道感染、流感、肝炎等疾病，被推荐为抗严重急性呼吸综合征（SARS） 的8种中药之一以及抗禽流感的3种中药之一[2-3]。近年来，鱼腥草中很多天然活性成分得到开发利用，多糖是鱼腥草的主要有效成分之一。研究表明，鱼腥草多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抑菌等作用[4-8]。目前，鱼腥草多糖的提取多采用热水提取工艺，采用超声法提取的报道较少[9-11]。本研究以鱼腥草地下部分为原料，采用超声波、水溶醇沉法提取鱼腥草多糖，通过单因素试验确定鱼腥草多糖提取的最佳超声功率、时间、液料比，并通过响应面分析确定鱼腥草多糖提取的最优工艺，以期为鱼腥草的进一步开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
将鱼腥草在40 ℃下进行热风干燥，粉碎，过60目筛，密封好后置于4 ℃冰箱中保存。无水乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇等均为分析纯。
1.2主要仪器
DTY-ZBJ-15A型台式全自动制冰机（北京天佑科技发展有限公司），RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵（上海亚荣生化仪器厂），101-1 型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司），756PC型紫外分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。
1.3方法
1.3.1总糖、还原糖含量测定采用苯酚-硫酸法[12]测定鱼腥草中总糖含量，采用DNS法[13]测定鱼腥草中还原糖含量。鱼腥草多糖含量、多糖得率计算公式如下。
多糖含量=总糖含量-还原糖含量；（1）
多糖得率=多糖含量/鱼腥草干粉质量×100%。（2）
1.3.2鱼腥草多糖的超声波提取方法称取一定质量的鱼腥草干粉，按一定液料比加入去离子水，在冰水浴中超声提取一定时间，离心，取上清液测定鱼腥草总糖、还原糖含量。
1.3.3鱼腥草多糖样品的制备按照“1.3.2”节的方法，将沉淀物加蒸馏水再超声提取1次，离心，合并2次上清液，在旋转蒸发仪上浓缩至一定体积，加入3倍体积的95%乙醇，放入4 ℃冰箱中静置12 h。离心，沉淀加入适量的蒸馏水溶解，滤除不溶物，上清液加入3倍体积的95%乙醇，4 ℃冰箱中静置过夜，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，干燥后即得鱼腥草多糖粗提物。
1.3.4单因素试验优化鱼腥草多糖超声波法提取采用单因素试验方法考察超声波提取时间、超声波功率、液料比3个因素对鱼腥草多糖得率的影响。
1.3.5中心组合试验设计在单因素试验基础上，进行3因素3水平Box-Benhnken中心组合试验设计，采用响应面法对试验结果进行分析，优化鱼腥草多糖超声波法提取条件。
2结果与分析
2.1鱼腥草总糖、还原糖标准曲线
采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，得回归方程：y=2.555 6x-0005 7，r=0.999 0 。采用DNS法测定还原糖含量，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，得回归方程：y=0.758 5x-0.031，r=0.998。
2.2单因素试验优化鱼腥草多糖超声波提取条件
2.2.1超声波提取时间对鱼腥草多糖提取率的影响鱼腥草干粉在液料比为30 mL ∶1 g、提取功率为400 W的条件下，在冰水浴中分别超声波提取10、20、30、40、50、60、70 min，测定鱼腥草多糖提取率。由图1可以看出，超声时间50 min时，鱼腥草多糖的提取率最大。超声时间低于50 min时，多糖提取率随时间的增加而增大，超声时间大于50 min时鱼腥草多糖得率稍有下降，这可能是由于超声时间过长导致多糖结构遭到破坏，从而导致多糖得率降低。
2.2.2超声波功率对鱼腥草多糖提取率的影响鱼腥草干粉在液料比为30 mL ∶1 g，超声波功率分别为180、270、360、450、540、630、720 W条件下，在冰水浴中超声波提取50 min后，测定鱼腥草多糖提取率。由图2可以看出，超声功率为540 W时，鱼腥草多糖提取率最大，由于功率在540～720 W之间多糖得率变化不大，因此选择超声波功率为540 W进行下一步试验。
2.2.3液料比对鱼腥草多糖提取率的影响鱼腥草干粉在功率为540 W，液料比（mL ∶g）分别为10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1条件下，冰水浴中超声提取50 min，测定鱼腥草多糖的提取率。从图3可以看出，当液料比为 40 mL ∶1 g 时，多糖提取率最大。因此，选择液料比为 40 mL ∶1 g 进行下一步试验。
2.3鱼腥草多糖超声提取响应面优化结果
在单因素试验基础上，以超声时间、功率、液料比作为自变量，进行3因素3水平Box-Benhnken的中心组合试验设计（表1）。
为了验证模型预测的可行性，在最佳提取条件下提取鱼腥草多糖，进行3 次平行验证试验，3次平行试验得到鱼腥草多糖实际平均提取率为16.31%，与理论预测值相比相对误差为0.32 %，预测值与试验值吻合得很好。因此，采用响应面法对鱼腥草多糖超声提取条件进行优化是可行的。
3结论与讨论
本研究在单因素试验基础上，采用响应面分析法优化了超声提取鱼腥草多糖工艺，建立了回归模型。在各因素水平
范围内，超声提取对鱼腥草多糖提取率的影响顺序为：液料比>超声功率>超声时间。鱼腥草多糖超声提取的最佳工艺条件为：超声时间为50 min、功率606 W、液料比42.5 mL ∶1 g，多糖提取率验证值为16.31%，与预测值16.372%的相对误差为0.32%。响应面法优化超声提取条件准确可靠、 提取率
较高，适合于鱼腥草多糖的提取。
参考文献：
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超声波辅助提取 篇12
紫苏茎叶中挥发油含量丰富,用水蒸气蒸馏法得到的紫苏精油作为天然香料和风味剂广泛应用于食品、化妆品和医疗行业。紫苏除含多种维生素、矿物质外,还含有紫苏醛、丁香酚、苏烯酮、紫苏醇、柠檬烯、柠檬醛、多酚类等多种生物活性物质[2],具有广泛的抑菌、抑酶、抗氧化活性。
超声波破碎原理是利用超声技术特有的性质和原理进行提取的新工艺。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应,当热效应在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热,以破坏植物的细胞,使溶剂渗透到细胞中,以便使大量内容物溢出,具有速度快、效率高等优点。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
紫苏叶;福林酚试剂,上海如吉生物科技发展有限公司;乙醇、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、DPPH,均为分析纯。
1.2 仪器与设备
超声波细胞粉碎机JY92-ⅡN,宁波新芝生物科技股份有限公司;724 型分光光度计、低速离心机、电热鼓风干燥箱、HH-4数显恒温水浴锅,上海博泰实验设备有限公司。
2 实验方法
2.1 原料预处理
新鲜紫苏叶→剪碎→60 ℃烘约2天至恒重为止→放入可封口保鲜袋中并封口→置于冰箱中低温保存、备用。
2.2 紫苏中多酚类化合物的提取
称取1.000 g紫苏叶放入烧杯中,按一定料液和酒精浓度加入溶液,调节pH值为3,置于超声波细胞粉碎机中,于一定功率、温度下提取一定时间后,4500 rpm离心20 min,将上清液倒进量筒中测量其体积,然后取上清夜用于总酚含量的测定。按照2.3步骤进行。
2.2.1 单因素试验
以pH为3的乙醇水溶液为提取剂提取紫苏中多酚类物质,研究不同超声波功率(200 W、250 W、300 W、350 W、400 W)、超声波作用时间(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、酒精浓度(0%、20%、40%、60%、80%)以及料液比(1:20、1:30、1:40、1:50、1:60)对其得率的影响。
备注:本实验的超声时间指工作时间和间歇时间的总和,其中工作时间为4 s,间歇时间为6 s。
2.2.2 正交试验
在单因素实验的基础上,采用L9(34)正交表,以总酚提取得率为参考指标,对超声波功率、超声时间、酒精浓度以及料液比4个主要因素进行正交实验。
2.3 总酚含量的测定(福林酚法)
取上清液0.2 mL稀释50倍,再用移液管取10 mL,加入到25 mL容量瓶中,加入5 mL浓度为0.2 mol/L的福林酚试剂,混匀后加入10 mL15%的碳酸钠溶液,混匀后放入25 ℃水浴锅中水浴60 min。然后再加蒸馏水定容至25 mL,于750 nm下测吸光值。空白为以10 mL稀释50倍的提取溶剂代替提取液按以上步骤反应所得的试样。福林酚法测定总酚[3],总酚含量用没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)表示。
计算如下:
总酚含量
3 结果与讨论
3.1 单因素试验结果与讨论
3.1.1 超声波作用功率的影响
准确称取1.000 g 紫苏叶, 按料液比1:30加入浓度为40%的酒精,调节pH值为3, 分别在200 W、250 W、300 W、350 W、400 W功率下超声30 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。结果如图2所示。
从原理上来看,超声波功率越高越容易获得较大的声强,但超声功率对物质的提取率的影响不总是呈正比关系,这与超声波与介质相互作用的程度和提取物性质有关系,从图2可以看出,在功率为200～300 W的范围内,多酚类物质的提取率随功率的增加而增加,功率大于300 W的时候,提取率反而下降。可能的原因是过高的功率使分子运动加剧,紫苏叶细胞内的其他物质大量溶出,影响多酚类物质的提取,功率过高还会导致局部高温,破坏多酚类物质的稳定性,使其得率下降,故选择300 W为最佳提取功率。
3.1.2 超声波作用时间的影响
准确称取1.000 g 紫苏叶,按料液比1:30加入浓度为40%的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下,分别超声20 min、30 min、40 min、50 min、60 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。实验结果如图3。
由图3可知,总酚提取率在开始的40 min内呈明显上升趋势,,并且在超生作用为40 min时,总酚的提取率最高,达到23.67 mg/g,这是由于超声波的机械作用和空化作用增大了分子运动频率和速度增加了溶剂穿透能力,从而提高了多酚类物质的溶出速度和数量,但随着超声波作用时间的继续增加,提取率呈下降趋势。这是因为超声时间太长会导致其他物质大量溶出和局部温度过高,多酚类物质被部分破坏,且随着时间的增加破坏得越严重,当超声时间为60 min时,提取率降到为16.00 mg/g,故选择超声时间40 min为最佳超声时间。
3.1.3 酒精浓度的影响
准确称取1.000 g 紫苏叶,按料液比1:30加入分别加入浓度为0%、20%、40%、60%、80%的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下作用40 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。结果如图4所示。
乙醇体积分数变化会引起提取剂物理性质,如密度、粘度、介电常数等的变化,从而影响提取率。从图4中可以看出,多酚类物质的提取率随酒精浓度的升高而增加,在60%处得到最大值,总酚含量由8.97 mg/g增加到25.41 mg/g,这是因为加入一定量的乙醇与水形成复合体系更适合多酚的提取,但继续增加酒精浓度,提取率略有下降,其原因是高浓度的乙醇会引起蛋白质等大分子物质的沉淀,从而带动了多酚类物质的共同沉淀,导致总酚含量下降.故选择酒精浓度60%为最佳提取条件。
3.1.4 料液比的影响
准确称取1.000 g 紫苏叶,分别按料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60加入浓度为60%、的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下作用40 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液,用福林酚法测其多酚含量。结果如图5。
从图5可以看出,总酚的提取量随料液比的增加而增加。料液比的增加提高分子扩散速率、缩短浓度平衡时间,因而使溶解在溶剂中的酚类物质含量增大。图5表明,当料液比为1:50时,总酚提取率最高,达到21.33 mg/g,因而选择料液比为1:50。
3.2 正交试验结果与讨论
在单因素实验探讨的基础上, 利用正交试验设计研究超声波辅助提取紫苏叶酚类物质的最佳提取条件。利用L9(34)表进行正交试验设计, 并得到下表所示实验结果。
由表1可知,超声波辅助提取紫苏多酚类物质的最佳工艺条件为A2B3C1D3,即超声功率为300 W,超声时间为50 min,酒精浓度为40%,料液比为1:60。各因素对总酚提取率影响的主次顺序为B(超声波作用时间)>A(超声波功率)>D(料液比)>C(酒精浓度)。可见,超声时间对紫苏总酚提取率的影响最为显著,而酒精浓度的影响最小。
综合各因素、各指标可知较优超声波提取条件为:超声波功率为300 W,超声时间为50 min,乙醇为40%、料液比为1:60。在此条件下,总酚的提取含量为27.79 mg/g。
4 DPPH清除自由基实验测定抗氧化能力
准确称取1.000 g 紫苏叶,按料液比为1:60加入浓度为40%的酒精,调节pH值为3,在超声波功率为300 W的条件下作用50 min,然后在4500 rpm离心20 min,取上清液6 mL(约16.67 mg/mL),用蒸馏水定容于500 mL容量瓶中。分别配制浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL样品溶液,各取4 mL 于12支比色皿中,其中6支加入浓度为0.5 mmoL/mL的DPPH溶液1 mL作为实验组,另外6支加1 mL乙醇。在黑暗中37 ℃ 放置20 min。以乙醇为空白在517 nm测定Ai,Aj的吸光度。配制等浓度梯度的抗坏血酸,步骤与样品液测法一致,作为对照组。
自由基抑制率(%) =[1-(Ai-Aj)/A0]×100
式中:A0——未加药DPPH溶液的空白吸光度
Ai——加药后DPPH溶液的吸光度
Aj——样品溶液自身的吸光度
将试验重复2次,求得平均抑制率(%)。
4.1 数据结果(图6)
由图6可以看出,样品液的抗氧化能力跟VC比较接近,在浓度为0.04 mg/mL时,样品液的抗氧化能力约为VC的0.94倍。
5 结 论
超声波提取紫苏叶中酚类物质的最佳条件是:超声波输出功率为300 W,超声时间为50 min,酒精浓度为40%,料液比为1:60。在此最佳工艺条件下,多酚提取得率为27.79 mg/g,提取液抗氧化能力与相同浓度下VC抗氧化能力接近。
摘要：以新鲜紫苏叶为原料,采用超声波辅助技术提取紫苏叶酚类物质,并通过正交试验确定紫苏叶多酚的最佳提取条件。实验结果表明:紫苏叶多酚的最佳提取工艺条件为:超声波输出功率为300 W,超声时间为50 min,酒精浓度为40%,料液比为1∶60。在此最佳工艺条件下,多酚提取得率为27.79 mg/g,提取液抗氧化能力是相同浓度下抗坏血酸的0.94倍。
关键词：紫苏叶,多酚,超声波提取,抗氧化能力
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