线粒体DNA（共9篇）
线粒体DNA 篇1
线粒体为一个双膜细胞器, 通过细胞氧化磷酸化 (OXPHOS) 产生ATP为细胞提供能量。哺乳动物的mt DNA为双链闭环状超螺旋结构, 约16.6 个碱基对, 两条链为重链 (H链) 和轻链 (L链) , L链只有一个转录起始位点, 即轻链启动子 (LSP) , 可编码一个m RNA和8 个t RNAs, H链有两个转录起始位点, 即重链启动子1 (HSP1) 和重链启动子2 (HSP2) , 从HSP2 启动的转录编码14 个t RNAs、12 个m RNAs、2 个r RNAs, 而从HSP1 启动的转录编码2 个特异的r RNAs (16Sr RNA和12Sr RNA) 。线粒体OXPHOS过程中有13 个蛋白是由线粒体合成, 其余蛋白由核基因合成。mt DNA或核基因突变可引起OXPHOS功能障碍、线粒体功能障碍, 从而引起线代谢障碍疾病、癌症、神经变性疾病、老化、年龄相关性疾病[1,2]。因此, 调节线粒体基因的表达是一潜在的预防、治疗线粒体功能障碍的途经, 而认知mt DNA的转录机制, 对开展这一途径很有帮助。
1线粒体转录的主要因子:TFAM, TFB1M/TFB2M, POLRMT
mt DNA的转录激活体系由三种因子组成, 即TFAM、POLRMT和TFB2M/TFB1M[3]。也有学者认为转录的激活体系只有两种因子, 即POLRMT和TFB2M[4], 因为在体外实验研究发现TFAM抑制HSP2 处的转录[4]。体外研究人的线粒体转录激活体系, 发现无论TFAM存在与否, 在有POLRMT和TFB2M的体系均能激活LSP和HSP1 处的转录[4]。TFB1M和TFB2M是同源体, 都有甲基化转移酶的活性, 两者都能与TFAM的C端结合, 在H链和L链的转录起始位点引发转录[5], 并能与POLRMT以1∶1 结合, 在有TFAM的体系中TFB2M与POLRMT结合后激发转录的效率是TFB1M与POLRMT结合后激发转录的10倍[3]。
1.1 线粒体转录因子A (TFAM) TFAM是第一个被发现的线粒体转录因子, 有核基因编码, 属于对DNA具有高度亲和力的高迁移率族 (HMG) 蛋白家族, 参与mt DNA的转录、复制和包装[6], 对线粒体DNA的稳定性和完整性起着重要作用[7]。TFAM含有两个串联的HMG结构域 (HMG box) 和一个25 个残基的C末尾端结构, 而两个HMG box之间被27 个氨基酸残基隔开, 能与POLRMT结合并在转录起始位点引发线粒体DNA的转录[7]。HMG box对非特异性地结合DNA是必需的[8], 它能结合、弯曲、缠绕和展开DNA[8,9], C末端是特异的DNA识别区域, 能特异性地结合LSP和HSP上游区域DNA从而激活转录。过量表达整个TFAM降低了mt DNA的D-loop量, 而过量表达无C尾端的TFAM无此现象, 说明C尾端参与了维护D-loop稳定性过程, 而去掉C尾端导致TFAM结合DNA的能力下降3 个数量级, 激活转录的能力减弱[10], 说明C末端在mt DNA转录过程中结合mt DNA是必需的。TFAM结合LSP启动位位点迫使mt DNA形成一个“U”形转折, 使DNA螺旋方向反向, 而这弯曲可能增加C末端与TFB2M之间的相互作用, 从而提高LSP处的转录效率[9]。TFAM非特异性地结合DNA时也能使mt DNA弯曲, 但是弯曲度要比在LSP和HSP1 处小。C末端均能与TFB2M和TFB1M相结合, 说明TFBM在转录启动区域与TFAM直接作用启动mt DNA的转录[11]。根据Mc Culloch等人提出的转录模型, 在转录起始区域TFBM为TFAM和POLRMT连接的桥梁[11]。
ABF2p是酵母菌的转录因子, 也是HMG-box结构家族蛋白, 其有两个HMG box, 但是没有C尾末端, 不能与酵母菌线粒体转录启动子结合激活转录[12]。与TFAM作用一样, 其维持酵母菌mt DNA的稳定性和线粒体的正常呼吸链[13]。向缺乏ABF2p的酵母菌线粒体转录体系中加入人体TFAM, 能重新恢复酵母菌线粒体mt DNA的稳定性和呼吸功能[14]。由此我们可以得出, 两种蛋白的主要结构虽有很大差异, 但它们在维持mt DNA的稳定性和线粒体的呼吸功能是相通的。采用基因敲除技术敲除小鼠的TFAM基因, 出现线粒体DNA缺失从而导致胚胎致死[15], 适当地增加TFAM基因的表达可使线粒体DNA转录效率增加, 过量地增加TFAM基因表达可相应地抑制线粒体DNA的转录和复制[16]。这些结果表明TFAM引起的线粒体DNA结构改变在线粒体转录过程中起着重要作用。我们可以得出TFAM与mt DNA (TFAM/mt DNA) 有一个合适的比值, 过量表达TFAM使比值增大, 超过最适值可导致线粒体转录和复制减弱, 而适量地减少TFAM可引起mt DNA转录增加, 这与TFAM有包装、弯曲mt DNA的功能密切相关。过多的TFAM必然引起mt DNA与TFAM广泛结合, 导致线粒体DNA结构改变, 减少了其他调节蛋白与mt DNA结合的机会, 从而导致线粒体DNA转录效率下降[17]。在研究胚胎干细胞分化阶段的过程中发现, TFAM/mt DNA比值下降与mt DNA复制增加相关[17], 说明TFAM/mt DNA随着细胞的发育阶段发生变化。在线粒体功能障碍的小鼠模型中发现, 升高TFAM的表达量与mt DNA拷贝数增加密切相关, 并能改善线粒体的功能[18]。检测成熟个体组织和胚胎的mt DNA的拷贝数, 结果表明mt DNA的拷贝数与每个的组织中TFAM的表达量成正比关系, 这点提示TFAM可能作为线粒体DNA拷贝数的限制因素[18]。因此, mt DNA转录和复制活性增加可能相应地引起细胞生长和分化过程中氧化代谢的增加, 或者说是由于人体生长, 细胞分化所需能量增加, mt DNA转录和复制必然加快, TFAM表达量上调。通过以上我们可以得出TFAM的表达量可能是根据细胞的能量代谢需求决定的, 从而调节线粒体的转录活性。
1.2 线粒体转录因子B1 和B2 (TFB1M和TFB2M) 酵母菌的线粒体转录因子B, 称为sc-mt TFB, 它有一段r RNA甲基化转移酶同源序列, 可与酵母菌的RNA聚合酶 (RPO41p) 形成异源二聚体, 识别线粒体DNA的转录启动子从而激活转录[19]。TFB1M和TFB2M为mt-TFB的同源蛋白, 具有高度同源性, 含有相似的r RNA甲基化转移酶的基本序列, 并能使核糖体小亚基3′端的茎环结构内的两个相邻的腺苷酸二甲基化[20], 且均能和TFAM、POLRMT形成重组体在H链和L链的启动区域激活转录, 但是TFB2M作用的转录效率是TFB1M作用的10 倍[3], 所以TFB1M和TFB2M具有双重功能。虽然具有双重功能, 但两者功能是独立的, 去除甲基化转移酶活性, mt DNA转录产物、mt DNA拷贝数不受影响, 说明甲基化转移酶活性与转录无关[21]。
TFB2M存在时, TFB1M存在于否不影响mt DNA的转录, 但是敲除小鼠的TFB1M基因可导致胚胎致死, 而选择地敲除心脏组织中的TFB1M基因可导致心肌细胞呼吸链功能障碍[22]。主要是由于12S RNA发夹结构区的两个相邻腺苷酸没有二甲基化, 核糖体不稳定, 从而导致线粒体翻译受损[22]。可以推测, 12S RNA甲基化对于核糖体大小亚基重组是必不可少的, 说明TFB1M参与线粒体DNA的翻译过程。Cotney等人发现, TFB1M不表达时12S RNA的表达量下降, 这说明TFB1M在线粒体翻译过程中的作用是通过调节r RNA的稳定性实现的[21]。相反, 过量地表达TFB1M基因引起12S RNA超甲基化, 导致异常的线粒体产物合成, 并增加了细胞死亡的易感性[21]。
尽管在体外研究中发现TFB1M具有线粒体转录活性, 但是过量表达的TFB1M与线粒体DNA转录增加并不一致[23]。相反, TFB2M在线粒体DNA转录过程中起着重要作用, 过量表达TFB2M与线粒体转录活性增加相一致[23], 去除其甲基化转移酶活性不影响线粒体的功能[21], 这也说明了TFB2M的甲基化转移酶功能与线粒体DNA转录无关。敲除果蝇细胞的TFB2M基因, 可导致线粒体DNA的转录和拷贝数均下降[24], 而单独敲除TFB1M基因对线粒体转录和复制没有影响, 但是线粒体翻译功能减弱[25]。所以TFB1M和TFB2M结构上具有高度同源性, 二者的功能有相同的地方也有不同之处, TFB2M主要负责线粒体DNA的转录, TFB1M主要负责线粒体DNA的翻译, 但是也不能排除在某些特殊条件下TFB1M也可能在转录调控中起作用。
1.3 线粒体RNA聚合酶 (POLRMT) 酵母菌线粒体RNA聚合酶 (RPO41) 与T7 噬菌体的RNA聚合酶具有同源性, 但又与噬菌体不同, 没有其他转录因子结合时不能激活转录[26]。人体RNA聚合酶 (POLRMT) 为DNA依赖性单亚基RNA聚合酶, 也与T3、T7 噬菌体的RNA聚合酶具有同源性[27], 不能自己结合mt DNA而激活其转录[4]。POLRMT含有一个羧端域 (CTD) , 一个氨基末端域 (NTD) 和一个氨末端延伸 (NTE) [27], 而T7 噬菌体无NTE结构[28]。CTD与噬菌体的RNA聚合酶有很高的相似性, 含有高度保守的催化结构域和引物识别区域[28]。NTD与噬菌体的RNA聚合酶的启动子结合域最相似, 包括识别启动子的重要元件, 如富含AT序列的识别环和嵌入其间的 β 发夹结构[29], 这些发夹结构有利于分离双链DNA, 维持单链DNA的稳定性[30]。研究发现, RNPO41 的NTD具有维护mt DNA稳定性的功能, 而这一功能与酶的RNA聚合作用是分开的, 去除RNPO41 的NTD序列内的185 个氨基酸, 可导致mt DNA结构不稳定和基因的丢失, 而体内mt DNA的转录基本不受这些突变的影响, 且NTD部分蛋白表达反向抑制线粒体的功能缺陷, 说明NTD内含有一个独立的与mt DNA的复制和稳定性有关的结构域[28]。NTE与TFAM结合可确保特定的启动子的转录, 去掉NTE, 在无TFAM时POLRMT能激活启动子和非特异的DNA序列转录, 有TFAM和线粒体转录启动子时, 无NTE的PORMT比正常的POLRMT具有更高的转录活性, 说明NTE为一转录抑制区[30]。POLRMT的NTE含有两个五十三肽重复[PPR]结构域[27], PPR结构域的功能仍不清楚, 但可与NTD中的AT序列识别环相互作用, 提示该结构域可能与完成启动子的特异性识别有关[27]。POLRMT在线粒体核糖体生物合成过程中表现出独立的转录功能[27], 含有PPR结构的蛋白是参与植物线粒体RNA合成的各个环节[31], 那么POLRMT的PPR结构域是否本身就含有RNA结合位点、参与线粒体DNA的转录和复制的功能还需要证明。
2 启动子的识别与激活
mt DNA的转录启动子是如何被激活的还没有被完全认识。研究发现, TFAM存在时, POLRMT能与TFB1M或TFB2M形成复合体启动转录, 无TFAM时两者不能完成这一功能, 一种可能就是TFAM改变了mt DNA的结构, 如解开启动子区域的双链DNA, 促进转录的启动[32]。TFAM特异性地结合HSP和LSP上游的DNA序列可引起启动区域结构的改变, 使部分转录起始位点展开, 这点可以说明TFAM结合位点与LSP转录位点之间有一段精确的距离[33]。体外研究发现LSP转录起始位点的上游有最强的结合位点, TFAM优先激活LSP处的转录[34]。HSP1的TFAM结合位点相对LSP处要弱些, 因此它的激活与LSP处相差很大[34]。SHUTT等用均含有LSP和HSP1 的模板在体外研究TFAM的剂量效应, 发现无TFAM时, POLRMT和TFB2M可直接有效地结合两个启动子的特定序列激活转录, 只是在HSP1 处的效率更高些[4]。向体系中加入TFAM, 均能增加LSP和HSP1 处的转录, 但在LSP处达到最大激活转录所需要的TFAM量比HSP1 处小[4], 过量表达TFAM与TFAM识别启动子的功能还有争议。已经证明, mt DNA碱基个数与TFAM分子量有一定的比例关系, 15~20 个mt DNA碱基对应1 个TFAM分子, 这样TFAM就能使mt DNA完全地弯曲缠绕[6], 又能保持一定的空间结构不影响其他调节因子与mt DNA结合, TFAM分子过多, mt DNA过度的弯曲、压缩导致转录下降。根据这点我们可以推测, TFAM不只是负责启动子的识别, 还负责mt DNA的结构变化。向小鼠的转录体系中加入含有启动子序列的人类DNA模板, 不能激活转录, 说明TFAM无识别物种特异性的作用, 因为在体外反应体系中小鼠和人类的TFAM蛋白能相互替代。类似的, 在两个反应体系内TFB2M蛋白也会相互替代, 但是小鼠的POLRMT不能替代人的POLRMT, 说明POLRMT主要负责种族特异性启动子的识别, 通过与几个紧邻转录起始位点的核苷酸相互作用完成这一功能[33]。对酵母菌的研究也支持POLRMT能识别启动区特异性位点, 因为无sc-mt-TFB时, 使用含有特定启动位点的负超螺旋模板, 酵母菌RNA聚合酶 (mt-RNAP) 也能激活启动子引发转录[35]。将模板提前解链, 加入sc-mt-TFB则抑制了mt-RNAP识别特异性启动子序列的功能。sc-mt-TFB在闭环模板中是必需的但在开环模板中不是必需的, 这一结果说明sc-mt-TFB可促进DNA解链但是不能识别启动子[35]。哺乳动物的TFB1M和TFB2M在线粒体转录过程中的详细功能还没有被完全认识, 但是哺乳动物和酵母菌的转录体系中各转录因子的功能关系是相似的。
3 线粒体转录终止因子
线粒体有3 个转录起始位点, LSP、HSP1 和HSP2, 目前只对起始于HSP1 的转录终止有明确的认识。线粒体转录终止子 (m TERF) , 包括mt TERF1、m TERF2、m TERF3、m TERF4, 为家族蛋白, 高度保守的亮氨酸拉链样结构域为该家族蛋白的特征, 能与DNA结合形成DNA- 蛋白质异二聚体[36]。HSP1 的转录在16Sr RNA下游的t RNALeu基因处终止转录, 由线粒体转录终止因子 (m TERF1) 调节[37]。m TERF1 含有一个由5 个精氨酸构成的保守序列, 对t RNA Leu (UUR) 表现出很强的亲合力[38], 能特异性地结合转录终止位点的终止序列, 引起DNA螺旋结构解链、碱基漂移[37], 进而终止转录。而起始于HSP2 处的转录不受这一因子调节, 可直接产生一与H链近长度的m RNA, HSP1 启动的转录速率比HSP2 启动的转录速率快50 倍能说明这一点[39]。敲除小鼠的m TERF1 基因, 线粒体的r RNA量及线粒体翻译并没有受到影响, 反而LSP的转录降低, 说明m TERF1 不能调节H链的转录, 而阻止L链的转录产物与L链的转录启动子相互干扰[39]。在Hela细胞中, 过度表达m TERF2 可引起mt DNA的复制和mt DNA的表达受到抑制, 而mt DNA抑制程度与m RNA、线粒体蛋白下降程度一致[40]。敲除小鼠的m TERF2基因, mt DNA转录产物减少, 引起组织细胞OXPHOS复合物缺乏, 线粒体呼吸功能障碍, 从而导致小鼠肌病和记忆短缺[41]。m TERF3 能结合mt DNA的启动子区, 去除m TERF3 增加mt DNA两条链的转录起始, 说明是转录起始的负调节因子。敲除小鼠的m TERF3 基因可导致胚胎死亡, 使心脏特有的m TERF3 基因异性地失活, mt DNA转录异常, 生成异常m RNA, 线粒体呼吸功能缺陷[42]。而敲除果蝇的m TERF3 基因, 线粒体转录的m RNA量没有明显变化而线粒体编码的蛋白减少[36], 说明m TERF3 是线粒体转录和翻译之间的调节因子。去除m TERF2 引起m RNA减少, 去除m TERF3, 异常的mt DNA转录增加但OXPHOS能力减弱, 说明二者以不同的方式影响线粒体氧化磷酸化。m TERF1 不仅调节mt DNA的转录, 它还能与转录终止序列外的其他序列结合调节mt DNA的复制, 过量表达m TERF1 增强mt DNA的复制终止[38]。同样, m TERF2 和m TERF3也参与mt DNA的复制[43]。m TERF1、m TERF2、m TERF3 都与mt DNA启动子区相同位点结合调节mt DNA的转录[41], 也都参与mt DNA的复制, 但这三种因子之间的相互作用仍不清楚, 有可能三种因子形成一复合物共同作用, 也有可能m TERF1 与m TERF2 或m TERF3 结合参与线粒体的转录与复制。m TERF4能与一5- 甲基胞嘧啶RNA甲基转移酶NSUN4 结合, 调节线粒体核糖体的合成[44]。
4 总结
目前我们已知道mt DNA转录所需的基本因子及其在转录过程中的主要作用, 但认识还不完全, 或许还有其他暂时没有发现的附加因子参与转录过程, 了解这些附加因子的结构、作用以及与主要转录因子间的相互作用, 或将成为一个新的研究热点。大多实验是在体外进行的, 而体内受能量、环境、代谢、基因突变等变化, 增加了认识线粒体转录机制的难度。体内线粒体转录的诸多调节还需要进一步研究, 例如如何根据细胞的代谢需求调节转录功能。同样, 我们也只是对HSP1 的转录终止有了明确的认识, 但对m TERF家族蛋白的特征结构仍存争议, 各转录终止因子之间的相互作用关系还没有完全明确。
摘要：真核生物的基因由核基因和线粒体基因 (mt DNA) 共同组成, mt DNA的生物合成是一个非常复杂的过程, 需要核基因和mt DNA共同协同调节完成, 大多线粒体蛋白在由核基因编码好后经特殊通道输送到线粒体内参与线粒体的各项生物合成。线粒体DNA转录需要核基因编码的几种蛋白, 包括一个线粒体RNA聚合酶 (POLRMT) , 线粒体转录因子A (TFAM) , 线粒体转录因子B1 (TFB1M) 或者线粒体转录因子B2 (TFB2M) 两者之一。本文对哺乳动物线粒体转录各因子的功能、各因子间的相互作用以及线粒体转录的调节进行了综述。
关键词：线粒体转录,TFAM,TFB1M,TFB2M,POLRMT
线粒体DNA 篇2
新疆两个民族人群线粒体DNA V区缺失多态性
目的:调查中国新疆塔吉克族和柯尔克孜族人群线粒体DNA COⅡ/tRNALys基因间小非编码V区串联重复序列9-bp缺失频率.方法:应用PCR及DNA序列分析技术.结果:研究发现,在塔吉克族及柯尔克孜族样本中只发现标准型和缺失型两种多态性,70例柯尔克孜族人群中有2例(2.86%) mtDNA 9bp缺失;70例塔吉克族人群中有1例(1.43%) mtDNA 9-bp缺失.结论:研究结果表明中国新疆塔吉克族和柯尔克孜族人群中存在很少的mtDNA 9bp缺失多态性,与其他民族或人种有一定差异.
作 者：于恩艳 张艺 董晓宇 马合木提・哈里克 YU En-yan ZHANG-yi DONG Xiao-yu Mahmut.HALIK 作者单位：新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐,830046 刊 名：生物技术 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2008 18(3) 分类号：Q987 关键词：DNA 线粒体 基因缺失 少数民族线粒体DNA 篇3
一、线粒体DNA的功能及其对遗传信息的传递
(一) 线粒体DNA的功能
线粒体是含有多个DNA分子, 分别携带自己的DNA, 即mt DNA, 研究发现, mt DNA可合成蛋白质, 但其种类相对有限, 其蛋白质组成均由核DNA编码在细胞质核糖体上合成, 然后送至线粒体内各功能位点上, 如线粒体核糖体中的12S和16S, 属于半自主性细胞器, 其遗传系统无法脱离细胞核遗传系统而存在[1]。mt DNA具有复制和遗传两大功能, 基于自身的半自主性, 其自我复制以半保留方式在细胞周期的S期和G2期进行, 复制过程仍受细胞核控制, 同时还是承载线粒体遗传密码的物质, 既不为核膜所包被, 也不被蛋白质所压缩, 其存活时间要长于DNA。
(二) 所含遗传信息的传递
线粒体所有的基因均位于一个单一的环状DNA分子上, 所包含的调控区域和“内含子”较少, 通常情况下, mt DNA都是与线粒体内膜合成在一起, 一面能够为复制自身模板, 一面还能为蛋白质和RNA提供遗传密码, 其自身存在DNA聚合酶, 在一定条件下, 离体线粒体有能力合成新的DNA。mt DNA完成复制后, 伴随着线粒体的分裂, 可实现线粒体的增值。研究发现, 线粒体有其自身的额蛋白质合成系统, 而且由mt DNA指导蛋白质的合成方式与核DNA基本一致, 包括TRNA、MRNA、核糖体等, 通过转录和翻译完成蛋白质合成, 利用抑制剂对线粒体蛋白质合成及细胞质基质蛋白质合成进行抑制, 并提供同位素标记的氨基酸, 此时线粒体内蛋白质一部分由自身合成, 一部分先在细胞质基质中合成然后传递到线粒体内[2]。再有, mt DNA与核DNA可发生相互作用, 通过两套遗传系统编码的蛋白质相互作用, 构成了线粒体的部分组成成分。
二、叶绿体DNA的结构及其对遗传信息的表达
(一) 叶绿体DNA的结构
叶绿体中含有12个cp DNA分子, 其长度因生物种类不同而存在差异, 其大小在120~217kb之间, 与噬菌体基因组大小相当, 属于半自主性细胞器, 存在传递遗传信息的表达系统, 经转录、翻译可生成蛋白质, 其蛋白质组成均由核DNA编码在细胞质核糖体上合成, 然后送至叶绿体内各功能位点上。cp DNA多用于编码与光合作用联系密切的蛋白及核糖体蛋白, 其表达调控并不在同一水平上进行, 细胞分裂素和光合作用也会影响到cp DNA的表达, 如叶绿体在进行光合作用时, 要受到遗传控制。与mt DNA相比, cp DNA的基因数更多, 编码蛋白质合成包括核糖体蛋白质、RNA聚合酶等, 有独立的遗传系统可自主进行复制, 基于半自主性特征, 仍需细胞核遗传系统提供遗传信息, 因其GC含量与核算DNA和mt DNA有明显的区别, 因此多采用Cs Cl密度梯度离心来对其进行分离[3]。
(二) 所含遗传信息的表达
cp DNA遵循每3个核苷酸编码1个氨基酸的原则, 核苷酸数量约为1.9×108个, 每一条链都具有转录信使RNA的功能, 叶绿体职工的DNA大致可编码氨基酸蛋白质的个数为3.17×107个。cp DNA有其自身的RNA、各种TRNA和MRNA, 还包括一些与蛋白质合成相关的因子, 即存在的独立的蛋白质合成系统, 其中RNA和TRNA均由自身DNA编码形成。叶绿体均有一段DNA序列的两份拷贝, 且呈反向重复序列 (1RA和IRB) , 二者之间可发生重组, 由此形成短的单拷贝序列, 其余部分即为长的单拷贝序列[4]。cp DNA缺乏组蛋白和超螺旋, 拷贝数量因物种的不同也存在一定的差异, 但全部是多拷贝的, 主要位于类核区, 相同或功能相关的基因组可合成符合操纵子结构, 更便于叶绿体基因的表达和调控, 因其调控机制的组成较为复杂, 在一定条件下, 只对特定基因起调节作用, 使生物能够适应自身的生存条件, 如环境因素对植物代谢活动的调节, 加之叶绿体基因自身的转录以及转录后的调节, 翻译以及翻译后的调节, 均对核编码的质体蛋白起到表达调节作用, 由此可见, cp DNA所含遗传信息的表达, 很难找到一个固定的模式[5]。
结论
综上所述, 线粒体和叶绿体均为半自主性细胞器, 各自的遗传系统无法脱离细胞核遗传系统而存在, 线粒体DNA和叶绿体DNA的结构较为相似, 均为裸露的DNA双链分子, 呈双链环状, 但是二者对各自所含遗传信息的传递与表达却存在一定的差异, 通过对线粒体DNA功能和叶绿体DNA结构的分析, 能够清楚地认识到线粒体DNA所含遗传信息的传递和叶绿体DNA所含遗传信息的表达。
参考文献
[1]郝海叶, 张洋, 那冬晨.景天属植物叶绿体DNA与核DNA分步提取方法研究[J].安徽农业科学, 2013, 25 (8) :10230-10231.
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[4]崔翠菊.叶绿体基因工程与植物细胞器基因组进化研究[D].华中科技大学, 2010.
线粒体DNA 篇4
运用PCR扩增、克隆、测序等技术,在获得洞庭青鲫和彭泽鲫线粒体DNA控制区全序列的基础上,对洞庭青鲫、彭泽鲫、普通鲫、红鲫、白鲫、A系和D系银鲫等7个鲫鱼品系线粒体DNA控制区的`碱基组成、变异情况、序列结构和系统进化进行了比较分析.结果表明,7个鲫鱼品系线粒体DNA控制区碱基的平均组成为A:(32.7±0.16)%,C:(20.4±0.37)%,G:(14.1±0.08)%,T:(32.8±0.36)%,序列分歧率为0-5.7%,其中红鲫和白鲫的分歧率最大(5.7%),彭泽鲫、A系和D系银鲫之间最小(0).洞庭青鲫与白鲫的分歧率为5.6%,与彭泽鲫、A系和D系银鲫为2.2%,与红鲫和普通鲫分别为0.8%和0.7%.对比哺乳动物线粒体DNA控制区结构,并参照其他鱼类序列,将7个鲫鱼品系的控制区分为终止序列区、中央保守区和保守序列区三个区域.同时识别了7个鲫鱼品系中一系列保守序列,并给出了它们的一般形式.序列差异和系统进化分析表明,在7个鲫鱼品系中,洞庭青鲫与普通鲫和红鲫的亲缘关系最近,与彭泽鲫、A系和D系银鲫亲缘关系次之,与白鲫的亲缘关系最远,而彭泽鲫、A系和D系银鲫三者在线粒体DNA控制区的相似性和分歧率上则表现为是同一个鲫鱼品系.
作 者：刘良国 杨品红 王文彬 王晓艳 谢春华 李梦军 LIU Liang-Guo YANG Pin-Hong WANG Wen-Bin WANG Xiao-Yan XIE Chun-Hua LI Meng-Jun 作者单位：刘良国,王文彬,LIU Liang-Guo,WANG Wen-Bin(湖南文理学院生命科学学院,常德,415000)
杨品红,YANG Pin-Hong(湖南文理学院生命科学学院,常德,415000;湖南省水产工程技术研究中心,常德,415000)
王晓艳,谢春华,李梦军,WANG Xiao-Yan,XIE Chun-Hua,LI Meng-Jun(湖南省水产工程技术研究中心,常德,415000)
线粒体DNA 篇5
线粒体DNA( mt DNA) 被广泛应用于物种进化研究,由于其突变速度是核DNA的10 倍,因此物种分离更为准确［2］。由于mt DNA特殊的结构特征,作为分子遗传标记在分子系统学研究中应用甚广,其中COⅠ基因在脊椎动物和无脊椎动物的系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化学研究中均得到广泛应用［3 － 4］。研究通过对吉林地区山鸡mt DNA COⅠ基因的同源序列进行分析,并结合Gen Bank中已收录的相关序列,应用系统发育分析方法从分子水平探讨吉林地区山鸡的分子生态学研究,以期为制订科学的繁育计划、合理调控野生珍禽的驯养种群结构提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 样品的采集
吉林山鸡,来自吉林市吉林农业科技学院珍禽场,共采集抗凝血20 份。置于冰瓶中带回实验室,- 20 ℃ 保存,备用。用全血基因组提取试剂盒提取基因组DNA。
1. 2 COⅠ基因的扩增和序列测定
根据Gen Bank中已发表的山鸡基因序列( 登录号为GQ922651) 利用Primer Premier 5. 0 软件设计1 对引物。引物序列: 上游引物5' - CACTCTTTATCTAATTTT CGG - 3',下游引物5' - AAATAGGTGTTGATAGAGGAT - 3',预期扩增大小为658 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应条件为: 94 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性45 s,55 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸1 min,共30 个循环; 72 ℃再延伸5 min。PCR产物的纯化、回收和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
1. 3 数据的统计分析
应用Clustal W( 1. 82) 软件进行多序列比对,通过MEGA4. 0 软件计算不同序列间的核苷酸代替、变异位点、转换颠换比率及遗传距离等。 利用DNAsp4. 10 软件计算单倍型、单倍型多样性、核苷酸多样性,利用MEGA软件计算品种间距离,采用非加权组平均法( UPGMA法) 构建品种的分子系统树。
2 结果与分析
2. 1 山鸡COⅠ基因PCR扩增( 结果见图1)
由图1 可知,CO Ⅰ 基因PCR产物大小为658 bp,与预期结果一致。
2. 2 山鸡COⅠ基因的核苷酸多态位点的突变类型
注:M.DL-2 000 Marker;1.PCR扩增产物;2.空白对照。
对28 条山鸡COⅠ基因序列( 20 条序列由本试验测定,其余的序列来源于Gen Bank) 进行分析,结果表明,所有序列全长均为658 bp,无插入和缺失,共发现19 个变异位点,包括13 个转换和6 个颠换。核苷酸的替换位点主要以转换为主,表现出较高的转换偏倚。19 个变异位点定义了4 种单倍型,单倍型多样性( Hd) 为0. 625。
2. 3 山鸡COⅠ基因系统进化分析
利用Clustal W( 1. 82) 软件对山鸡mt DNA COⅠ序列进行同源序列对比,结果表明,20 只山鸡COⅠ基因全序列由4 种单倍型组成。结合所有的群体单倍型序列,并引用Gen Bank中的部分山鸡及中国红色原鸡COⅠ基因序列,采用UPGMA法根据试验测定结果,以Kimura双参数模型构建系统发育树,见图2。
由图2 可知,吉林山鸡与美国山鸡( 登录号为JN850750) 、俄罗斯( 登录号为GQ482364 ) 亲缘关系较近,两者紧密地聚为一个分支后再与韩国山鸡聚在一起。吉林山鸡与四川山鸡( 登录号为GQ922651)亲缘关系较远,瑞典山鸡和挪威山鸡亲缘关系较近,中国红色原鸡( 登录号为AP003322) 单独聚合成另一分支。
3 讨论
山鸡是一种肉质鲜美、营养丰富的野生禽类,作为高蛋白低脂肪的野味食品倍受欢迎。山鸡肉中含10 多种人体必需氨基酸、维生素和微量元素,山鸡肉还具有一定的药用价值,能补中益气,治脾虚泄泻、腹胀、下痢、尿频等。目前,我国关于山鸡的研究主要集中在野外及动物园的生态学和行为学研究、人工饲养研究、疾病防治、饲料及营养、人工孵化及育雏等方面［5 － 6］。研究的手段比较单一,研究深度不够,这与开发山鸡这一有重要经济意义的生物资源需要不相符,导致山鸡资源的合理利用和有效保护工作难以取得突破性进展。目前,对于地方鸡种群遗传多样性分析研究报道较多,对山鸡遗传多样性研究报道较少。陈国宏等［7］对12 个中国地方鸡种群体遗传结构及遗传多样性进行了分析。屠云洁等［8］对我国部分地方鸡种COⅠ基因多态性及其分子系统进化进行了分析。试验测定和分析了吉林地区20 只山鸡样本mt DNA COⅠ基因序列,共检测到19 个多态位点,平均核苷酸多样度( Pi) 为0. 002 88,变异位点相对较少,可能是由于长期采用封闭式人工饲养、近亲繁殖,导致一些基因频率较低的等位基因没能保留下来。
线粒体DNA 篇6
泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)隶属于鲤形目、鳅科、花鳅亚科、泥鳅属,已成为具有一定经济价值的养殖对象,养殖规模越来越大,泥鳅种质的选择成为一项工作内容。目前已有应用同工酶、RAPD及SSR等技术分析泥鳅的种群遗传结构的报道[9,10,11,12],而基于mtDNA D-loop序列多态性的研究未见报道。该研究测定了怀远、范县、舒城和池州4个泥鳅地理群体的mtDNA控制区基因片段的核苷酸序列,分析了控制区结构及群体遗传多样性,探讨了泥鳅种群的遗传结构、遗传多样性,以期为今后泥鳅遗传选育工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 样本采集
研究所用泥鳅样本于2010年4月采自安徽怀远(简写为HY,下同)、安徽舒城(SC)、河南范县(FX)和安徽池州(CZ)4个地方,均为野生群体。分别随机采集活体解剖,取肌肉1～2 g于95%酒精中浸泡,在-20 ℃保存备用。分析所用样本信息见表1。
1.2 基因组DNA提取
基因组DNA的提取采用常规酚-氯仿[13]抽提法提取。
1.3 PCR扩增和测序
拟扩增D-loop基因全序列,PCR扩增所用引物序列为DL1(5′-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′)和DL2(5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′)[14]分别位于脯氨酸和苯丙氨酸的tRNA上。PCR采用100 ng的DNA为模板,反应体系为50 μL,其中预混料(premix) 25 μL,灭菌双蒸水18 μL,上、下游引物各2 μL(10 μm·L-1),DNA模板3 μL。扩增条件为94 ℃,预变性5 min,接着35个循环(94 ℃ 45 s,51 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。扩增产物经1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,凝胶成像系统拍照。PCR产物直接由上海生工生物技术公司回收、纯化、双向测序,测序引物与PCR扩增引物相同。
1.4 数据处理与分析
测得的DNA序列用ClustalX 1.81对序列进行比对,并通过Seaview 4软件进行编辑并辅以人工核查;对比GenBank中登录号为EU 697122的泥鳅线粒体DNA全序列,找到控制区的起点和终点。并以CSB-F和CSB1的起点分别作为终止序列区、中央保守区和保守序列区的分界线。在识别的保守序列中,兼并密码子的代号分别为W=A或T,R=A或G,M=A或C,Y=C或T和K=G或T。
用DnaSP 5.1软件计算多肽位点数(s)、单倍型数(n)、单倍型多样性指数(h)、核苷酸多样性指数(π)等;用Mega 4.1软件统计DNA序列的碱基组成,用Kimura双参数遗传距离(Kimura 2-parameter distance,K2-P)模型计算4个群体内和群体间的平均遗传距离,采用K2-P距离矩阵,用邻接法(NJ)构建分子系统树,系统树中节点的自举置信水平应用自引导法(bootstrap analysis,BP)重复检测,设置为1 000次重复;用DnaSP软件计算遗传分化指数(F-statistics,Fst)和基因交流值(Nm),利用Arlequin 3.1软件根据群体间的Fst进行方差分析(AMOVA)。
2 结果与分析
2.1 线粒体DNA控制区序列与变异情况
对36尾泥鳅线粒体控制区进行双向测序,通过人工拼接和序列比对分析,获得的序列与泥鳅(Genbank登录号EU 697122)的线粒体D-loop区序列在NCBI中比对后,结果表明主体部分相似度高达98%,证实所获得的序列即为泥鳅线粒体D-loop区段序列。
去除引物和部分端序列得到的36尾泥鳅线粒体DNA控制区序列(918～920 bp),共检测到32种单倍型,每个群体都有各自的单倍型,变异位点63个(包括7个插入/缺失位点和56个多态性位点),多肽位点中包含30个简约信息位点和26个单碱基突变位点。2碱基单一信息位点22个,占所有位点的2.40%;2碱基简约信息位点28个,占所有位点的3.05%;3碱基单一信息位点3个,占所有位点的0.33%;3碱基简约信息位点3个,占所有位点的0.33%。所有多肽信息位点中转换32个,颠换19个,转换与颠换同时存在的位点5个。平均转颠换比(Ts/Tv)为1.68,转换大于颠换,这个结果与其他一些脊椎动物的数值相类似[15]。控制区序列中碱基A、T、G和C平均含量分别为34.1%、31.7%、14.3%和19.9%。A+T含量(65.8%)明显高于G+C含量(34.2%),碱基组成具有明显的偏倚性,这与其他鱼类的线粒体控制区碱基组成情况类似[16]。4个群体内平均K2-P为0.004～0.012,群体间的遗传距离为0.011～0.016(表2)。此结果表明,4个群体间的平均遗传距离略高于群体内。
2.2 D-loop结构分析
参考刘焕章[17]在亚科识别出的各功能单位和给出的保守序列的普遍形式和不同区域的划分标志,笔者识别了泥鳅D-loop区的3个区域和其中的一些保守序列。
2.2.1 终止序列区(extended termination associated sequences,ETAS)
终止序列区是控制区中变异最大的区域,包含了与DNA复制终止相关的序列(termination associated sequences,TAS)。不同的物种中TAS的变异较大,但其主体的核心序列是TACAT和其反向互补序列ATGTA。该研究成功识别了泥鳅的终止序列区,全长236 bp(nt:1～236),序列为TACATATTATGCATAATWWTACATT。
2.2.2 中央保守区(cental domain,CD)
中央保守区被认为是控制区中最为保守的区域。该研究在泥鳅中识别出了几个序列,近5′端识别了被认为是区分终止区和中央保守区标志的CSB-F,全长325 bp(nt:237～561),其序列是ATGTAGTAAGAAACCACCACCAACCAGT。紧接其后的是CSB-E和CSB-D,序列分别为TCAGGGACAATAATTGT-GGGGGT和TATTACTGGCATYTGGTTCCTATTTCA-GG。
2.2.3 保守序列区(conserved sequence block,CSB)
保守区包含有重链的复制起始点、重链和轻链的启动子及3个保守序列CSB1、CSB2和CSB3。保守序列区全长358 bp(nt:562～918),其中CSB1是区分保守序列区和中央保守区的标志,变异最大且不易被识别,该研究通过一保守片段GACATA帮助识别了泥鳅的CSB1,其序列为GAWTGAATGWTGGAAAGACATAAT。CSB2和CSB3序列较为保守,容易被识别,其序列分别为CAA-ACCCCCCTACCCCC和CCTTGTCAAACCCCGAAACCAA。
2.3 群体遗传多样性和遗传分化
4个群体间遗传多样性差异不显著,所有36个序列的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.992和0.012,平均核苷酸差异数(K)为10.698(表3)。从核苷酸多样性看,池州群体最高(0.012),说明4个群体中,池州群体的遗传多样性最丰富。
利用DNASP软件估算4个群体间的Fst和Nm(表4)。结果显示,4个群体间的Fst大,Nm较小,群体分化明显。舒城和范县群体间有最高的Fst(0.663)和最低的Nm(0.130),怀远和范县群体间有最低的Fst(0.338)和最高的Nm(0.490)。分子变异分析(AMOVA)的结果见表5。群体内个体间的变异是变异的主要来源(61.02%),38.98%的变异发生在群体间(Fst=0.389 8),群体间具有较高的遗传分化,遗传变异主要来自群体内部。
2.4 个体间亲缘关系聚类分析
以32尾泥鳅个体的D-loop序列构建NJ分子进化树见图1。系统发育树显示4个群体可以分为2个谱系(lineage)和多个支系。这2个谱系的单系支持率均未超过50%,表明泥鳅线粒体控制区的变异水平不大,群体之间并未发生显著的遗传分化。范县群体独自为一个谱系,其余3个群体为一谱系且相互交叉。
3 讨论
3.1 泥鳅线粒体控制区结构组成特点
线粒体DNA控制区为非编码区,因此会有缺失、插入、串联重复等变化。研究得到泥鳅线粒体DNA控制区长度为918～920 bp,同其他鱼类基本相似,并没有大的缺失、插入、串联重复等现象。
线粒体DNA控制区其主要功能与线粒体DNA的复制、终止、转录相关。通过比对其他鱼类笔者成功识别了泥鳅线粒体DNA控制区上的主要的功能单元,如终止序列区和保守相关序列,其中变异最大的终止序列区富含A和T,A+T的含量高达73.6%。而中央保守区富含GC,含量(39.5%)较终止区(26.5%)高,这种现象可能是中央保守区最为保守的原因之一。
D-loop区又称控制区,是mtDNA的复制起点,也是变化最复杂、最快的区域,近年来成为mtDNA研究的热点。控制区分为终止序列区、中央保守区和保守序列区3个部分[18,19]。哺乳动物的D-loop区B、C、D、E和F保守序列已被识别,从LEE等[20]在鱼类中识别了CSB-D后,LIU等[14]、张燕等[21]和唐琼英等[22]又分别在鲤形目、鲿科鱼类和沙鳅亚科鱼类中识别了CSB-D、CSB-E和CSB-F 3个保守序列。在泥鳅的控制区中含有ETAS、CSB-D、CSB-E、CSB-F、CSB-1、CSB-2和CSB-3,其中CSB-F和CSB-1的起点分别是区分终止序列区和中央保守区、中央保守区和保守序列区的标志。在容易发生变异的终止序列区,发现泥鳅的终止序列区长度为236 bp,包含了6个保守的TAS(TACAT)和4个与TAS互补序列(ATGTA),推测两者可形成发卡结构[18]。CSB-1是与线粒体DNA复制相关的重要保守序列,在哺乳动物中高度保守[23,24,25],其一般形式为ATT-AATTAATG-T-GCAGGACATA。但在鱼类中变异很大,其中GACATA序列框最为保守,可以帮助识别。如(Rhodeus sinensis)[17]、大口胭脂鱼(Ictiobus cyprinellus)[26]、沙鳅亚科鱼类(Botiinae)[22]的CSB-1序列分别为TT-ATTATTGAA-GACATA、AATCGCCCAGGACATT和AGRTKAATGMTWRAAWGACATA-MCC-AYAAGA。同样在泥鳅中也发现此保守序列框。另外,泥鳅的CSB-2和CSB-3序列非常保守,同其他鱼类基本一致。
3.2 泥鳅的遗传多样性
遗传多样性是物种长期生存和进化的前提,也是物种进化潜能的保证。研究测定36尾泥鳅D-loop区的918～920 bp序列,共检测出变异位点数63个,单倍型32种,单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.992和0.012。高于青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)(π=0.006 7+0.001 56)[27]、长薄鳅(Leptobotia elongata)(0.004 50)[28]、浪白鱼(Anabarilius grahami)(0.004 34)[29]、小口白甲鱼(Onychostoma lini)(0.005 75)[30]、长江铜鱼(Coreius heterodon)(0.002 18)[7]等种群,稍低于齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)(0.019)[31],说明目前这4个泥鳅种群D-loop序列存在丰富的多样性。4个群体中池州群体隶属于长江支流,其π最高(0.012),种群遗传多样性较其他几个种群丰富。种群遗传距离的大小,能够间接反映种群遗传相似度大小,池州群体K2-P遗传距离最大(0.012),池州群体个体间存在较大的遗传差异,表明池州群体具有较丰富的遗传多样性,进一步说明长江池州江段的泥鳅多样性较丰富。由此可以考虑把此江段的泥鳅引到怀远地区,作为后备良种。从控制区的变异看,4个群体间的K2-P遗传距离为0.011～0.016,高于群体内(平均为0.007)。分子变异分析(AMOVA)结果也显示,大部分变异分布在种群内(61.02%),存在于种群间变异较少(38.98%)。说明群体间遗传分化大,基因交流较为匮乏。彼此都有各自的独立基因库,可能是长期地理隔离的结果。
3.3 泥鳅的遗传分化分析
Fst表示2个种群间的遗传分化程度。数值在0到1的范围内,Fst越大,表明2个种群的分化程度越高。而Nm则表示种群间的基因交流程度。Nm>1表明2个种群间有基因交流。Nm<1则可能预示着隔离的产生。4个群体具有较小的Nm(0.127～0.490),几乎没有基因交流,有明显的遗传分化(表4)。
以NJ构建的系统发育树显示,4个群体泥鳅相互交叉聚为2个谱系和多个支系,其中范县群体独自构成一谱系,其余3个群体构成另一谱系且群体间相互交叉。怀远和舒城个体在同一谱系,遗传距离相对较近,原因可能是淮河(怀远群体)和淮河之流的淠河(舒城群体)存在着微弱的基因交流。范县群体独成1支,与其他3个群体距离较远,可能是黄河(范县群体)与长江、淮河地理位置原因,导致地理隔离,形成独立的基因库。CZ6、CZ7与怀远群体和舒城群体存在交叉,可能因为长江池州江段部分支系与淮河支系水体是流通的。
摘要：采用PCR和DNA测序技术对4个泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)群体的线粒体DNA控制区序列进行比较,研究其遗传多样性和控制区的结构。结果显示,用于分析的线粒体DNA控制区片段序列为918～920 bp。32个序列中共发现了56个多态位点,其中32个转换位点,19个颠换位点,5个转换与颠换同时存在的位点,定义了32种单倍型。同时对控制区结构进行分析,识别了其终止序列区(ETAS)、中央保守区(CD)和保守序列区(CSB)的关键序列。4个地理群体的单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)和平均核苷酸差异数(K)分别为0.992、0.012和10.698。群体间的平均Kimura双参数遗传距离(Kimura 2-parameter distance,K2-P)、遗传分化指数(Fst)、基因交流值(Nm)和分子方差分析(AMOVA)均表明4个泥鳅群体具有较高的遗传分化,基因交流贫乏。利用核苷酸序列构建的NJ分子系统树揭示4个群体分为2个谱系,除范县群体外,其余各群体间相互交叉聚集。
线粒体DNA 篇7
由于3种鱼均属肉食性鱼类,在自然条件下有相近的食性,严重的食物竞争有可能导致资源的群落结构变化和优势种的交替。美国红鱼生长快、抗病力强、对水域环境条件要求不高,美国红鱼的逃逸势必会对自然海域的大黄鱼和鱼的资源造成一定的影响。此文对三者的线粒体DNA Cyt b基因序列进行了比较分析,旨在为大黄鱼和鱼的种质研究和资源保护提供科学数据,为美国红鱼的合理养殖与利用提供遗传学参考数据。
1 材料与方法
1.1材料来源
此研究中的大黄鱼于2007年5月30日取自象山宁波海湾苗种繁育中心当年繁育的苗种,体长为4 cm左右,活体运回实验室,取背部肌肉后在超低温冰箱(-70℃)保存,取20尾用于实验分析。鱼和美国红鱼均为海捕获得。鱼为2007年9月15日和25日在浙江南韭山调查时捕获,体重均在1 000 g左右,当场取背部肌肉,液氮中保存后带回实验室,取10尾用于实验分析。美国红鱼为2004年6月至2006年10月调查时在自然海域捕获,选体长在45 cm以上的鱼取背部肌肉于超低温冰箱中保存,取4尾用于实验。
1.2实验方法
大黄鱼、鱼和美国红鱼基因组DNA的提取方法是参照《分子克隆实验指南》[5]中DNA的提取方法。PCR所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25 μL体系:2.5 μL PCR缓冲液,DNA模版50 ng,dNTP 0.2 μmol·L-1,引物1 μmol·L-1,镁离子浓度2 μmol·L-1,Taq聚合酶1 U,超纯水补至25 μL。反应在PCR扩增仪上经94℃预变性5 min后进行30个循环,每个循环包括94℃ 1 min,56℃ 1 min,72℃ 1 min,最后于72℃延伸7 min。PCR产物由上海生工进行双向测序,并对测序结果用DNAman、DNAsp和MEGA等软件分析。
2 实验结果
此研究得到大黄鱼和美国红鱼的各1 140 bp片段的Cyt b序列,鱼的1 125 bp片段的Cyt b序列。所得序列的单倍型提交GenBank并获得序列号。分别选代表大黄鱼的单倍型EU346914(即将公布),鱼的单倍型EU363521(即将公布)和美国红鱼的单倍型EF173450(即将更新)进行序列分析,获得的遗传特征如下。
2.1碱基组成
大黄鱼、鱼和美国红鱼3种鱼序列的碱基组成见表1。从表中可以看出,大黄鱼和美国红鱼的A+T含量高于C+G的含量。鱼的A+T含量为49.9%,略低于C+G的含量。从4种碱基在密码子的分布情况看,3种鱼密码子碱基的分布情况相似,密码子第一位4种碱基的分布比较均一,密码子第二位富含T,T的碱基含量均超过41.0%,密码子的第三位均出现C含量较高,T含量较低的碱基偏倚现象,尤其是鱼,C的碱基含量高达53.6%,G的碱基含量最低,为5.1%。周发林等[6]在比较鲈形目6种笛鲷属鱼类也报道了该种情况,3种鱼Cyt b基因的碱基组成符合鱼类同源序列的特点。
%
注:表中数字1、2、3分别代表密码子的第1、2、3位Note:No.1,2and 3denotethe 1st,2ndand 3rdcodonposition,respectively.
2.2序列变异
将3种鱼的序列进行比对,3种序列的相似性为91.49%。由于鱼所得的序列为1 125 bp,除去大黄鱼和美国红鱼序列3′末端多出一段碱基,3种序列的相似性为91.90%。将3种鱼的序列进行比对,3种序列共有259个变异位点,其中有15个变异位点是由于鱼序列3′末端缺少15个碱基造成。选取3种鱼相对应的1 125 bp片段进行分析,得出3种鱼的序列间有244个多态位点,没有简约信息位点。3种序列间完全变异的位点有15个,分别为第33、75、159、210、225、387、408、444、591、732、774、786、846、921和1 093个位点。244个变异的位点中,碱基变异存在很大差异,有148个为C/T转换,有50个为A/G转换,C/T转换明显高于A/G转换,总转换数为198;有24个A/C,10个A/T颠换、8个G/C,4个G/T颠换,A/C和A/T的颠换明显高于G/C和G/T的颠换,总颠换数为46,转换/颠换率约为4.3,转换明显多于颠换。另外,在替换的碱基中,发生在第三密码子位置上占84.4%,只有6个替换发生在第二密码子位置上,密码子第三位点的变异率明显高于第一和第二位,表现出在密码子的第二位非常保守,第三位变异较大,符合密码子具有摇摆性这一特点。3种序列的碱基变异情况见图1。
通过对大黄鱼、鱼和美国红鱼的序列对比分析,虽然3种鱼具有较高的相似性,但是所测得的序列差异明显,碱基替换较多,可以将Cyt b基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记。
2.3遗传距离和系统树
利用MEGA软件中基于Kimura-双参数法计算了3种序列的遗传距离(表2),并用“NJ”法构建系统树(图2)。从表2中可以看出鱼与美国红鱼的遗传距离最近,反映在系统树上表现为鱼和美国红鱼最先聚为一支。
3 讨论
以大黄鱼、鱼为代表的石首鱼科鱼类,曾在我国水产业中占据着重要的地位。但是,大黄鱼资源严重衰退,种质严重退化,对其进行遗传结构和多样性分析、分子遗传图谱的构建、物种演化和亲缘关系研究以促进合理的资源保护,进而提出对大黄鱼的种质资源、基因库进行有目的、有策略保护的有效措施已变得势在必行。多年来对大黄鱼种质的研究报道较多,在大黄鱼的形态学方面[7,8]、在细胞学方面[9,10]、在生物化学方面[11,12]以及分子生物学方面[13,14,15]都有大量的研究报道,近年来由于大黄鱼的增殖放流工作的开展,使自然水域中的大黄鱼资源正处于恢复的趋势,但是,放流的大黄鱼对天然的大黄鱼的基因库是否产生破坏、以及破坏程度都有待于通过分子标记技术来研究,从而为政府管理部门决策提供科学依据。在大黄鱼资源衰退期间,鱼成为石首鱼科的主要捕捞对象之一,也曾面临着资源衰退的危险。对鱼的报道相对于大黄鱼较少,仅在养殖技术、育苗要点、摄食等方面有相关报道[2,16]。美国红鱼作为石首鱼科的引进物种,自1991年引进仔鱼,1995年繁殖成功起,我国已在辽宁、山东、浙江、福建、广东、海南等十几个省进行了大规模的美国红鱼繁育及养殖工作,并取得了一定的经济效益,仅浙江省2003～2005年美国红鱼的养殖产量连续达到1.1万t以上,美国红鱼已成为浙江省主要的鱼类养殖品种,产量位居第一位。但是在养殖过程中,由于管理不善和台风等非人为因素的影响,美国红鱼逃逸的现象时常发生,由于美国红鱼与大黄鱼、鱼同为肉食性鱼类,加之其生长快,对环境水域条件要求低等特点,美国红鱼的逃逸势必会对自然海域的生态系统造成不可忽视的影响。其一旦在自然水域形成规模,将破坏我国水域中现有的生物链,威胁我国的本土鱼类,破坏现有的鱼类区系,降低生物多样性,对我国的渔业资源和生产造成重大的损失。自美国红鱼引进后,有关美国红鱼的报道也涉及多个方面,1998年尤峰等[17]对美国红鱼的核型进行了报道;1999年邓岳松[18]对美国红鱼的繁育及养殖技术进行了报道;2002年刘世禄等[19]对美国红鱼养殖群体的生化遗传情况进行了初步的分析;2006年陈刚等[20]对美国红鱼的血细胞进行了报道等等。到目前为止,有关美国红鱼基因序列等方面的研究在国内也还没有见到。另外,大黄鱼、鱼和美国红鱼同属石首鱼科鱼类,2008年王晓清等[21]报道了大黄鱼与鱼进行人工杂交的遗传分析,子代只有0.65%的鱼苗成活率,而且杂交子代与母本大黄鱼之间具有极高的遗传同质性。虽然美国红鱼与大黄鱼和鱼存在地理隔离,但是引进的美国红鱼能否与大黄鱼、鱼杂交,造成基因库的污染,还有待于利用有效的遗传学手段开展遗传学背景研究。
线粒体DNA 篇8
线粒体是1898年被命名的，其实线粒体的发现却要追踪到1850年。线粒体外膜比较平滑，具有两层的膜包被，向内的折叠内膜形成嵴，两层膜中间有一个腔，基质居于线粒体的中央。基质内部有可以喝三羧酸进行循环时所需要的所有酶类，内膜上有ATP酶复合体和呼吸链酶系。线粒体其实就是细胞内形成ATP和氧化磷酸化的关键场所，因此，被形象地成为细胞的动力加工厂。
1 线粒体DNA结构特征
真核生物所呼吸所用的细胞器就是线粒体，不同物种的细胞之间，其线粒体的数目有着很大的差距，通常情况下都在100个～3 000个之间，植物细胞中一般都会含有50个～100个左右的线粒体，而动物的细胞中其线粒体的数目差异性要远远高于植物体内的线粒体数目，多的要达到1 000个，少的却只有50个左右。实验表明，植物细胞中的所有线粒体都会参与植物本身的一系列新陈代谢的全过程。植物体内的所有的线粒体通过自身的功能可以把细胞所吸收和合成的糖类、脂肪等所有的储藏能量经过进一步地氧化而生成了CO2和H2O，最后通过特定的方式将其释放出去，同时它还能将所存储的一些太阳能经过一系列的转换生成了细胞用以维持自身的生理功能的具体能量-ATP分子。正是由于植物细胞中的线粒体少于动物体内的线粒体，从而制约了能量的来源，因此植物就不可能出现和动物一样的自由活动和快速增长。由于线粒体DNA (mtDNA)相对比较小，所以它仅能决定本身最基本的一些特征，缺少多余的编码结构，因此就难以产生有效的修复功能。实验表明，只要线粒体DNA受到了不同程度的损伤，哪怕只是一个极其微小的变化，都会直接导致和引发线粒体的正常的功能，这种效应还具有一定的累加性，变异的幅度会随着损害程度的变化而不断地加大，最后就会产生连细胞核都无法具备的一些独特功能。
2 线粒体DNA的提取方法
鹿科动物的线粒体DNA的常见的提取方法有：碱变性法;柱层析法;氯化铯密度梯度离心法;DNase法柱层析法;改良碱变性法等几种。
碱裂解法是借鉴质粒快速提取法所建立，在差速离心获得线粒体后。通过高盐溶液复性、碱变性，从而分离线状的nDNA和环状的mtDNA，从而获得了mtDNA;层析分离技术属于物理的分离的方法，它是利用混合物中的每一组分物理化学性质的差别，所有的组分以不同程度进行分布在两相中，从而使所有的组分以不同速度移动而达到分离;密度梯度离心法就是将样品的粒子在密度梯度的介质中进行离心，其介质是由小分子和溶剂所组成组成，离心的过程中，离轴心越远介质的密度就会越大;DNase法是在差速离心获得线粒体后，利用具体浓度的DNase进行消化，可以有效地去除附着在线粒体表面的核DNA;改良的碱变性法是在差速离心获得线粒体后，利用DNase消化附着在线粒体表面的nDNA，再通过碱变性，高盐溶液复性，获得纯净的mtDNA。
3 线粒体DNA的序列分析
3.1 材料
新鲜鹿肝、Puc18载体、肾组织、大肠杆菌DH5a感受态细胞、MegaBACE1000测序仪。
3.2 方法
3.2.1 提取线粒体DNA
取新鲜或-80℃保存的鹿肝、肾组织，低温下打碎、匀浆1000r/min离心10min，上清重复离心2次～3次，上清15 000r/min离心10min以沉淀线粒体，重悬线粒体沉淀，RNase处理去除RNA碱裂解抽提线粒体DNA酚：氯仿抽提去除残余的蛋白质，加入1/10体积3mol/L醋酸钠及2倍体积的无水乙醇沉淀DNA, 70%乙醇洗涤，干燥，溶于TE缓冲液。
3.2.2 建立线粒体DNA文库
定量DNA后，超声波打碎，补齐末端，电泳割胶回收3kb左右片段，连接载体puc18，电转化宿主菌DH5a，短时复苏后铺板，蓝白斑筛选，挑取单克隆，96深孔板培养24h。
3.2.3 利用鸟枪法进行测序
随机挑选7板(7X96个)培养的单克隆，碱裂解提取质粒模板，电泳检测提取的模板长度和含量，挑取其中含量在100ng/μL、含3kb插入片段的3板(3X96个)模板，利用puc18多克隆位点两侧的M13通用引物进行双向测序反应，MegaBACE1000测序，测序结果以文件形式输入曙光大型计算机。
4 鹿科动物物种鉴定
因mtDNA具有结构简单、分子量小、进化速度快和母性单性遗传等特点，通常都是利用mtDNA序列进行鹿产品的检测。先后采用tRNAGlu/Cyt b、16S rRNA/tRNAVal序列，Cyt b基因序列，12S rRNA基因和D-loop区序列及12S rRNA基因序列，运用PCR-RFLP技术成功地鉴定了各种食品中的有禽类、蹄类和水产类，鉴定的灵敏度高。用三种限制性酶EcoRⅠ、BamHⅠ和ScaⅠ对梅花鹿和马鹿的肉进行了区分，并取得了成功。通过PCR扩增成功地扩增出了鹿特异性PCR产物，而其它常见伪充药材源性动物没有扩增出PCR产物或扩增片段的数量和长度不同，从而准确、快捷地鉴定出了鹿类中药材。使用PCR方法扩增赤鹿和狍毛发样品DNA提取物的一段D-loop区序列，因扩增产物的长度有差异，所以成功地区别了这两种动物的毛发。
5 结论
与GenBank中已登录的70种哺乳动物线粒体基因组全序列的比较研究表明：鹿科动物线粒体基因组序列较稳定，结构趋于一致，全长范围在16kb～17.5kb之间，大多在16.5kb左右，是理想的遗传标记之一。因此，利用线粒体DNA序列来鉴定鹿科动物物种是一种非常有效的物种鉴别方法，可以保护消费者的合法权益，促进畜牧业的健康稳定发展。
参考文献
[1]王文, 施立明.一种改进的动物线粒体DNA提取方法[J].动物学研究, 2003, 14 (2) :197-198.
线粒体DNA 篇9
1 资料与方法
1.1 研究对象
人卵巢癌细胞株SKOV3由斯隆-凯特林癌病中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)建株,本室传代保存。
1.2 样本的采集和处理
1.2.1 细胞培养
在含有10%胎牛血清 (FBS)的RPMI-1640培养基中(内含2 mmol/L谷氨酰胺、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)培养, 37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养备用。
1.2.2 选择对数生长期细胞实验
将SKOV3细胞株分为对照组、TPA组。分别以TPA 0.003、0.006、0.012、0.024、0.048 μg/ml的药物作用于细胞。对照组为未加药的SKOV3细胞株。培养时间段分别为6、12、18、24、48、72小时,收获细胞。
1.2.3 DNA提取
①各组细胞处理:将培养基倒掉,细胞用PBS液洗涤2～3次,加入1 ml Trizol,静置5～10分钟;②每1 ml Trizol加入200 μl氯仿,剧烈震摇15秒,室温下静置5分钟;③将细胞转移至1.5 ml离心管中,4℃,12000 r/min离心10分钟;④样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1 ml Trizol加0.3 ml无水乙醇混匀,室温放置3分钟,2℃～8℃不超过2000 r/min离心5分钟;⑤移去上清,用含10%乙醇的0.1 mol柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1 ml Trizol加入1 ml柠檬酸钠,室温放置30分钟,2℃～8℃ 2000 r/min离心5分钟,弃上清,重复1次;⑥用75%乙醇再洗1遍DNA沉淀,每用1 ml Trizol加入1.5～2 ml 75%乙醇,室温放置10～20分钟,2℃～8℃ 2000 r/min离心5分钟, 弃上清;⑦室温放置晾干DNA 5分钟,用8 mmol NaOH溶解DNA。
1.2.4 聚合酶链反应实验(PCR)
①ND1、ND4、ND5、Cytb、CoⅡ每条基因引物分别按照以下反应液配制:引物(15 pmol/μl) 0.5 μl;上游引物(15 pmol/μl) 0.5 μl;10 mmol 核苷酸混合物 1.5 μl;缓冲液1.5 μl;DNA聚合酶 0.3 μl;水 9.7 μl;总量 14 μl。②分装到5组PCR管中,每管加14 μl;③每管中分别加入不同样品的cDNA模板 1 μl;④将15 μl体系的混合液,放入PCR仪中;⑤反应及退火程序:95℃ 5分钟,95℃ 30秒,60℃ 30秒,72℃ 30秒,运行35周期,72℃ 7分钟,20℃终止反应。
1.2.5 水平琼脂糖凝胶电泳法(2%琼脂糖凝胶电泳)检测PCR产物
①溶解琼脂糖,配制成2%的琼脂糖溶液,加入5 μg/ml的EB溶液3 μl后摇匀。②制成厚度5～8 mm的琼脂糖胶板,放入电泳槽后加入电泳缓冲液高出胶板2～3 mm。③将样品缓冲液和上样缓冲液按5∶1的比例混匀后加样。④150伏恒压电泳 30分钟后取出胶板。⑤利用紫外线透射分析仪进行观察,并用数码相机照像。
1.2.6 引物序列
mtDNA引物序列及扩增片段,ND1-F:TCAAATTCCTCCCTGTACG;ND1-R:GGCTACTGCTCGCAGTG。CoⅡ-F:AGAAAAACCATTTCATAACTTTGTC;CoⅡ-R:CTTAAAAGGTTAATGCTAAGTTAGC。ND4-F:GATAATCATATTTACCAAATGCC;ND4-R:GAAGGGGTAGGCTATGTGTT。ND5-F:CAGCTATCCATTGGTCTTAG;ND5-R:AGGCGTTTGTGTATGATATGTTTGCG。Cytb-F:ACCATCGTTGTATTTCAACTAC;Cytb-R:GTTTACAAGACTGGTGTATTAG。
1.2.7 mtDNA序列分析
应用 ABI 3100型DNA自动测序仪和BIGDYE KIT对所有标本进行ND1、 CoⅡ、ND4、ND5、Cytb基因测序分析。登录美国国立生物信息网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi),将测序结果与NCBI、GENE、BANK 的 mtDNA剑桥序列进行相似性比较,各PCR产物测序结果与其相似性均达到95%以上。将每份标本的mtDNA突变统计出来,取其平均值。
1.3 统计学处理
应用SPSS 16.0统计分析软件进行t检验及数据处理, P<0.01为差异有高度统计学意义。
2 结 果
2.1 ND1、CoⅡ、ND4、 ND5、Cytb基因扩增产物图
电泳检测均显示单一清晰条带,有特异性扩增片段,见图1。
2.2 mtDNA 突变热点
在mtDNA突变的测试中,我们发现多个基因突变。本试验结果表明,mtDNA的突变热点依次是CoⅡ基因、ND5基因、Cytb基因和ND4基因,见表1。
2.3 mtDNA突变类型
本研究发现TPA诱导后的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞发生的高频率mtDNA基因突变中,其突变主要集中表现为A→T,T→A,G→A,T→C,A→G,C→T,其中C→T是最为多见。见表2。
3 讨 论
本研究提取人卵巢癌细胞株SKOV3细胞DNA,进行mtDNA突变的分析,比较各组细胞之间mtDNA突变率和突变类型的差异。在mtDNA突变的测试中,我们发现多个基因突变。试验结果表明,TPA诱导后的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞mtDNA的突变热点依次是CoⅡ基因、ND5基因、Cytb基因和ND4基因。ND1基因突变点明显低于其他4条测试基因,仅在337位点有一缺失。所测标本中,mtDNA核酸片段中均未发现大片段缺失现象。推测其原因,可能是人卵巢癌细胞株SKOV3细胞的增生活跃使细胞在短时间内进行了反复的多代传递,致使发生片段缺失,突变的mtDNA分子通过mtDNA复制的非随机分离机制而被有效清除。插入突变多于缺失突变,与Eimon等[3]提出的缺失不容易积累理论相符。Zhu等[4]发现D环突变是编码区的7倍,且多为C→T突变,这种突变将降低该区域的C含量,而导致mtDNA复制失控。大量变异位点出现在复制、转录区域后,必将导致线粒体复制转录的异常,致使氧化呼吸链中断,能量供给不足。李红霞等[5]研究发现,在妇科恶性肿瘤中存在mtDNA编码区的高频率变异,卵巢癌mtDNA突变率为70.6%,提示mtDNA编码区变异与妇科恶性肿瘤的形成有密切关系, mtDNA变异可能是妇科恶性肿瘤形成中的一个早期现象,并持续存在于癌症演变的全过程。mtDNA突变与细胞凋亡基因表达亦具有一定的相关性,其与bcl-2表达呈正相关,而与Bax及caspase基因表达呈负相关。
本实验通过TPA诱导人卵巢癌细胞株SKOV3 mtDNA突变的研究,发现人卵巢癌细胞株SKOV3 mtDNA编码区的CoⅡ、Cytb 、ND4、 ND5是一个具有高度多态性和突变性的区域,它与卵巢癌的发生、发展有重要关系。经TPA诱导后的人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,其mtDNA突变主要集中表现为A→T,T→A,G→A,T→C,A→G,C→T,其中C→T是突变的热点。各组细胞不同基因组的突变率中以ND5、ND4、 CoⅡ及Cytb 4条基因的突变率差异有高度统计学意义(P<0.01)。有文献报道突变最常发生于NADH脱氢酶亚单位4基因和D环区[6],与本结果有相同之处。Cytb基因的突变可能会对线粒体的氧化过程产生显著的影响[7]。而A→T,T→A,G→A,T→C,A→G,C→T等点突变可能会导致蛋白质中相应位置的氨基酸改变,从而影响基因的功能,最终导致某些疾病的发生。这种突变的后果在于突变位置对蛋白质功能影响的程度,具体基因突变与氨基酸改变之间的关系还有待深入研究。
参考文献
[1]Anderson S,Bankier AT,Barrell BG,et al.Sequence and organiza-tion of the human mitochondrial genome[J].Nature,1981,29(6):457-465.
[2]敖琳,曹佳,黄明辉,等.佛波酯对BALB/c3T3细胞转化早期基因表达的影响[J].中华预防医学杂志,2005,39(2):99-102.
[3]Eimon PM,Chung SS,Lee CM,et al.Age-associated mitochondrial DNA delettions in mouse skeletal muscle:comparison of defferent re-gions of the mitochondrial genome[J].Dev Genent,1996,18(2):107-113.
[4]Zhu W,Qin W,Bradley P,et al.Mitochondrial DNA mutations in breast cancer tissue and in matched nipple aspirate fluid[J].Carcino-genesis,2005,26(l):145-152.
[5]李红霞,钟声,李春海,等.妇科肿瘤组织中线粒体DNA基因突变的研究[J].中华妇产科杂志,2003,38(5):290-293.
[6]Jannifer SC.Peng H1Mitochondrial defects in cancer[J].Mol Cancer,2002,1(1):9-28.