线粒体Cytb（精选4篇）
线粒体Cytb 篇1
关中奶山羊是我国培育的优良奶山羊品种,它由莎能羊和陕西本地山羊杂交选育而成,主要分布在关中川塬地区。因其抗病力强,耐粗饲,易于饲养管理,产奶性能稳定,产奶量高,奶质优良而被广泛饲养于陕西省富平、临潼、三原等县,是山区农民以草换肉、发家致富、重要的山羊品种资源。该研究通过测定10头关中奶山羊线粒体DNA(mt DNA)细胞色素b(Cytochrome b,Cytb)基因的全序列,分析比较序列的变异特点,以期从分子水平揭示关中奶山羊遗传特征,为该品种的选育和利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从陕西省富平、临潼2县采集关中奶山羊10个个体肌肉组织样本,冰盒运回实验室,-40℃冰箱保存备用。
1.2 总DNA提取和PCR扩增
采用Chen等[1]的方法提取细胞中总DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测后于-40℃保存备用。PCR引物用从Gen Bank上检索到的山羊mt DNA全序列(Gen Bank序列登录号为AF533441)进行设计,引物序列为:正链引物(GCR)为:5′-AATAGGCGAAGGTTTTGAA-3′;反链引物(GCF)为:5′-GCT TTGGGTGCTGATAGTG-3′。
PCR反应在PC818 PCR仪上进行,扩增反应体积为50μL。反应程序为:95℃预变性5min,94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,并进行35个循环;72℃延伸10min,于4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外线检测后于-20℃保存。
1.3 纯化与测序
扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切下目标块采用柱式回收试剂盒纯化回收。并设计测序引物3对(表1)。将纯化回收后的PCR产物送于上海英骏生物技术有限公司测序。
1.4 数据处理
所得序列采用DNASTAR软件中的Seq Man程序进行拼接。用Bio Edit进行序列合并,用Clustalx 1.83软件作多序列比对后,用DNASP4和MEGA3.1[2]软件包计算不同序列间的变异位点、统计单倍型,转换/颠换数等指标;以绵羊(Gen Bank序列号:AF034730)用MEGA软件包基于Kimura[3]双参数模型构建分子系统树,系统树各分枝的置信度由1 000次自举法(Bootstrap)重复检验。
2 结果与分析
2.1 关中奶山羊Cyt b基因序列的变异特点
所测得的关中奶山羊10条序列,经与Genkank所检索到的山羊Cyt b序列(Gen Bank序列号:EU350121)同源比对并剪切后得到1 140bp的同源基因序列。经研究后得知,10条序列均以起始密码子ATG开始,中间没有插入/缺失,以终止密码子AGA结束。A、T、C、G的平均含量为31.9%、26.8%、28.2%、13.1%。A+T含量为58.7%,C+G含量为41.3%,符合桂建芳[4]提出的脊椎动物mt DNA碱基组成G+C百分比在37%~50%的结论。在Cyt b基因中,密码子碱基的使用也存在一定差异,在密码子的第1位上4种碱基除A稍高(31.6%)外,其余使用较为均衡;密码子第2位上碱基T的使用比率高达41.8%,碱基G的使用比率低至13.7%;密码子第3位上碱基A的使用比率高达43.9%,而碱基G的使用比率仅为3.9%(表2)。
在所测得的10个关中奶山羊个体cyt b基因序列中,总共发现10个变异位点(图1),分别位于136、174、303、435、594、852、855、960、1 005、1 086;全部为T←→C间的转换。观察到5种单倍型,其中有5个个体共享单倍型GZM2,2个个体共享单倍型GZM3,而单倍型GZM1、GZM10、GZM18各只观察到1个个体。
注:T-1、C-1、A-1、G-1、T-2、C-2、A-2、G-2、T-3、C-3、A-3、G-3中1、2、3分别代表密码子第1、2、3位。GZM为关中奶山羊(Guanzhong Milk goat)。
2.2 构建邻接树(Neighbor-Joining Tree)
将测序结果用Mega3.1软件以绵羊(Ovis)为外群,基于Kimura双参数模型,采用NJ法构建分子系统进化树(图2)。图中的拓扑结构显示关中奶山羊可分为2个支系即支系A(Lineage A)和支系B(Lineage B),支系A包括GZM1、GZM2、GZM3、GZM5、GZM6、GZM8、GZM14、GZM18、GZM19。支系B包括GZM10。
3 讨论
3.1 关中奶山羊mt DNA Cyt b基因变异特点
对于编码重要功能蛋白质的线粒体DNA Cyt b基因来说,由于在DNA水平上受自然选择压力的影响,密码子第3位点的突变率高于第1位点和第2位点,而且密码子第3位点的突变绝大多数是同义突变,受自然选择压力较小,突变后易固定,第1、2位点则相反[5]。对该次所测定的序列分析表明,群体的一个显著特点就是转换率较高,在10个变异位点中全部为T-C间的转换,没有观察到T-G或A-C间的颠换。在观察到的17次T-C转换中除136位点的突变发生在密码子的第1位以外,其余都发生在密码子的第3位,均表现为同义突变。在10个样本上就观察到5种单倍型,单倍型多样度为0.756,核苷酸多样度为0.189%,说明关中奶山羊群体线粒体DNA Cyt b基因的突变未达到饱和状态,品种内表现出很高的遗传多样性,且该群体核苷酸的变异主要以转换为主,表现出较高的转换偏奇。
3.2 关中奶山羊的起源
mt DNA的研究已成为分析家畜系统发育的理想模式,在探讨品种起源及分化、种间的系统演化、种内母系演化、地方品种资源与地理分布的关系等方面有广泛的应用[6]。已经证实,Cyt b基因序列在解决亲缘关系很近的阶元间的系统关系方面非常有用,被认为是解决系统发育问题最可信的mt DNA标记之一[7]。该文通过测定关中奶山羊mt DNA Cyt b基因的全序列,采用NJ法以绵羊为外群构建分子系统进化树,从得出的拓扑结构来看,该群体可分为2个支系,即支系A(90%,9/10)和支系B(10%,1/10),说明关中奶山羊在形成过程中有2个母系起源。
摘要：测定了关中奶山羊品种10个个体的细胞色素b基因全序列(1 140bp),比较分析了群体中细胞色素b基因的碱基组成和序列间碱基的变异情况,结果表明:在该品种(群体)中细胞色素b基因序列中10个变异位点上观察到17次T-C间的碱基转换,除了有1次T-C间碱基转换发生在密码子第1位点以外,其余的16次碱基转换都发生在密码子第3位点,均为同义突变;观察到5种单倍型,单倍型多样度为0.756。并以绵羊为外群构建系统发生树(NJ树),结果显示:关中奶山羊有2个母系起源,其中支系A占90%(9/10),支系B占10%(1/10)。
关键词：奶山羊,线粒体DNA,细胞色素b基因,遗传多样性
参考文献
[1]CHEN H,LEIBENGUTH F.Studies on multilocus fingerprints,RAPD markers and mitochondrial DNA of a gynogenetic fish(Carassius auratusgibelio)[J].Biochem Genet,1995(33):297-306.
[2]KUMAR S,TAMURA K,NEI M.MEGA:molecular Evolutionary Ge2netics Analysis.Version1101[M].UniversityPark:The Pennsylvania State Uni-versity,1993.
[3]Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rate of basesu-bstitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J].J MolEvol,1980(16):111-120.
[4]桂建芳.脊椎动物线粒体DNA的进化遗传学[J].动物学杂志,1990,25(1):50-55.
[5]张传生,耿立英,万海伟,等.4个绵羊品种线粒体细胞色素b基因的序列差异和系统进化研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(4):313-317.
[6]耿荣庆.湖羊、同羊起源及系统地位研究[D].扬州:扬州大学,2002.
[7]MANNEN H,NAGATA Y,TSUJI S.Mitochondrial DNA reveal that domestic goat(Capra hircus)are genetically affected by two subspecies of Benzoar(Capra aegagurus)[J].Biochem Genet.2001,39(5-6):145-154.
线粒体Cytb 篇2
由于动物线粒体DNA(mtDNA)具有绝大多数母系遗传、进化速度快、结构简单等优点,已经广泛应用于动物遗传多样性及系统进化的研究。在水产动物中,进化速度适中的Cyt b基因序列被广泛用于分析其遗传结构和探讨物种间及群体间的系统发生关系[2,3,4,5,6,7,8]。笔者克隆了4种舟山海域常见鲷科鱼类的线粒体Cyt b基因全序列,并利用其他近缘物种的Cyt b基因全序列进行系统发生关系分析,以期为鲷科鱼类的遗传种质资源研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
真鲷、黑鲷、黄鳍棘鲷和二长棘鲷的野生个体收集于舟山海域,剪取尾部肌肉后用液氮速冻,-80 ℃冰箱保存。另外,研究中用于系统发生关系分析的鲈总科其他物种的Cyt b基因数据来源于GenBank数据库(表1)。
1.2 基因组DNA的提取
采取常规苯酚氯仿提取法,每个样本取50 mg左右的尾部肌肉,剪碎后加入300 μL组织匀浆缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-HCl,pH 8.0;50 mmol·L-1 EDTA,pH 8.0),混匀后加入终浓度为1%的SDS和200 μg·mL-1的蛋白酶K,55 ℃水浴3 h。等体积的Tris-饱和酚、Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤2次,TE溶解。紫外分光光度计测定样品DNA的OD260和OD280值,确定其浓度和纯度,4 ℃保存备用。
1.3 PCR扩增和产物鉴定
用于扩增鲷科鱼类Cyt b基因全长序列的引物为cytb-F:5′-GTGACTTGAAAAACCACCGTT-3′和cytb-R:5′-CTCCATCTCCGGTTTACAAGAC-3′,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为50 μL,包括:模板DNA 50～100 ng,10×Buffer 5 μL,dNTP各0.2 mmol·L-1,上、下游引物各0.2 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶2 U,MgCl2 1.5 mmol·L-1。反应在Bio-Rad Mycycler PCR仪上进行。反应条件如下:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s。经30个循环后再在72 ℃延伸10 min。每次反应都设不含模板的空白对照。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳缓冲液为0.5×TBE(pH 8.0),电压为5 V·cm-1,常温电泳,EB染色,Bio-Rad GD2000型凝胶成像系统下观察并拍照记录。
1.4 产物的纯化及重组后测序
PCR产物利用凝胶纯化试剂盒(Tiangen)纯化回收,回收产物与pGEM-T载体(Promega)连接后,转化Top10感受态细胞,利用IPTG/X-gal蓝白斑筛选阳性克隆子,利用T7/SP6引物进行阳性克隆子的鉴定后,利用质粒提取试剂盒抽取质粒(Tiangen),T7/SP6引物在ABI 3730测序仪上进行双向测序,每个物种选择3个个体进行测序。
1.5 序列的数据处理与系统发生关系分析
获得的序列利用SEQMAN程序[9]经双向拼接后剪去载体序列,经过人工校正后通过NCBI中BLAST同源检索[10]后确认所得的序列为Cyt b基因序列,并剪去两端的tRNA序列后用于后续分析。从GenBank数据库中下载近缘物种的Cyt b序列以用于系统发生关系的分析。利用MEGA 4.1软件[11]进行不同物种的序列比对、碱基计算和构建系统发生树。
2 结果与讨论
2.1 4种鲷科鱼类Cyt b基因序列的特征
4种鲷科鱼类的Cyt b扩增产物经测序剪切后获得了线粒体Cyt b基因全序列(GenBank登录号GU131149-GU131152),进行比对排序后长度均为1 141 bp(图1),含起始密码子ATG;终止密码则是在转录成mRNA时在3′端的T碱基上加上AA而形成TAA终止密码子,编码380个氨基酸。在4种鱼类Cyt b基因的比较中没有发现插入和缺失,存在292个核苷酸变异位点,占全部序列的25.6%,其中有186个信息位点,密码子第3位点的突变率明显高于第1、2位点。氨基酸序列中发现22个氨基酸变异位点,序列中转换大于颠换,这是分歧较近的物种间编码区DNA序列较多发生同义突变的结果[12]。对氨基酸残基进行分析后发现,20种氨基酸均有分布,但其平均含量却差异很大,例如丙氨酸和亮氨酸的平均含量分别为8.42%和16.12%,而半胱氨酸和谷氨酸的平均含量仅为1.05%和1.45%,说明氨基酸的使用存在差异性。
4种鲷科鱼类Cyt b基因序列的碱基组成见表2。可以看出T、C、A和G碱基在4种鲷科鱼类中的平均含量分别为30.2%、29.6%、24.9%和15.3%,其中C的含量约为G含量的2倍。A+T平均含量为55.1%,高于G+C的含量44.9%。这一特征和在5种石鲈科鱼类中观察到的Cyt b基因部分序列的碱基分布具有相同的结论[5]。此外,密码子第3位存在显著的碱基偏倚性,C-3含量为36.9%,而G-3的含量仅为5.6%,密码子第3位反G碱基偏倚分布在其他物种中也被发现[7,13,14],而在一些进化高级的物种细胞色素b基因则发现密码子第3位具有对A和C极强偏倚特征[12,15],这种碱基分布的差异是由功能的差异引起还是不同的选择压力造成目前还没有明确的定论。
注:表中数字3表示密码子的第3位 Note:The number 3 indicates the 3rd codon position.
2.2 鲷科鱼类间的遗传距离
根据12种鲷科鱼类的Cyt b基因全序列,利用MEGA软件根据Kimura 2-parameter模型计算了物种间的遗传距离(表3)。从表中可以看出,鲷科12种鱼类的遗传距离在0.096 7～0.235 4之间,其中真鲷与二长棘鲷之间遗传距离最小,为0.096 7,金鲷与赤鲷之间遗传距离最远,为0.235 4,12种鱼类的平均遗传距离为0.186 7。此外,12种鲷科鱼类之间的序列碱基转换与颠换比值在2.079 7～7.358 7之间,平均为3.269 1,说明12种鲷科鱼类的Cyt b基因序列变异非常显著。另外,将研究获得的4种鲷科鱼类的Cyt b全序列与其他海域这4种鱼类获得的Cyt b全序列(表1)比较后发现碱基差异不大,核苷酸突变位点数在1～5之间。一般认为所分析序列的转换颠换比值小于2.0时,此基因序列突变已经达到饱和状态,受到进化噪音的影响可能性较大,在进行系统分析时必须进行加权分析[16],而研究中的Cyt b序列平均转换颠换比为3.269 1,远大于2.0,因此,Cyt b基因序列适宜用于鱼类的系统发生关系分析。
2.3 系统发生关系分析
基于25种鲈总科鱼类的Cyt b基因全长序列,利用DAMBE软件评测了遗传距离与对应的转换和颠换数的关系,根据对核苷酸变异的预测,所分析序列的核苷酸转换和颠换数随着遗传距离的增加而呈递增关系,核苷酸变异没有达到替换饱和,适宜进行系统发生关系的分析[17]。利用MEGA软件进行系统发生关系分析,建立NJ分子系统发生树(图2)。从图2看出,利用线粒体Cyt b序列可以准确地将鲈总科各个科的鱼类区分开,每个科的鱼类首先聚成独立的分支,而后根据亲缘关系聚成类群。25种鱼类聚成2个类群,类群1由雀鲷科、石鲷科、石鲈科、笛鲷科及梅鲷科的13个物种构成,类群2完全由鲷科的12个物种构成,说明鲷科与其他5个科之间存在较远的遗传距离,其他5个科的鱼类之间存在相对较近的遗传关系。其中笛鲷科和梅鲷科鱼类亲缘关系非常近,在系统树中混合聚在一起。在文章研究的鲷科鱼类中,真鲷与二长棘鲷亲缘关系最近,首先聚在一起,而黄鳍棘鲷与黑鲷遗传距离也相对较小,属于在进化过程中较晚分化的2个物种。
研究通过克隆舟山海域4种常见鲷科鱼类的Cyt b基因全序列,结合近缘物种的Cyt b基因序列进行了遗传信息的分析,旨在为鲷科鱼类分子系统发育、进化关系及遗传多样性研究提供依据。
摘要：克隆测序了分布于舟山海域的真鲷(Pagrus pagrus)、黑鲷(Sparus macrocephalus)、黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)和二长棘鲷(Parargyrops edita)4种鲷科鱼类的线粒体Cyt b基因1141bp的全序列。通过对4种鲷科鱼类Cytb基因序列的比对分析,发现了292个核苷酸变异位点,其中存在186个信息位点,序列中的转换大于颠换,碱基替换多发生于密码子第3位。遗传距离分析表明,4种鲷科鱼类的遗传差异在0.0967～0.2275之间,其中真鲷与二长棘鲷之间遗传距离最小,为0.0967,黄鳍棘鲷与二长棘鲷的遗传距离最大,为0.2275;序列变异的转换/颠换比值在2.2930～7.3587之间。以25种鲈总科鱼类构建的系统树表明鲷科鱼类与其他科的鱼类存在较远的遗传亲缘关系。
线粒体Cytb 篇3
由于3种鱼均属肉食性鱼类,在自然条件下有相近的食性,严重的食物竞争有可能导致资源的群落结构变化和优势种的交替。美国红鱼生长快、抗病力强、对水域环境条件要求不高,美国红鱼的逃逸势必会对自然海域的大黄鱼和鱼的资源造成一定的影响。此文对三者的线粒体DNA Cyt b基因序列进行了比较分析,旨在为大黄鱼和鱼的种质研究和资源保护提供科学数据,为美国红鱼的合理养殖与利用提供遗传学参考数据。
1 材料与方法
1.1材料来源
此研究中的大黄鱼于2007年5月30日取自象山宁波海湾苗种繁育中心当年繁育的苗种,体长为4 cm左右,活体运回实验室,取背部肌肉后在超低温冰箱(-70℃)保存,取20尾用于实验分析。鱼和美国红鱼均为海捕获得。鱼为2007年9月15日和25日在浙江南韭山调查时捕获,体重均在1 000 g左右,当场取背部肌肉,液氮中保存后带回实验室,取10尾用于实验分析。美国红鱼为2004年6月至2006年10月调查时在自然海域捕获,选体长在45 cm以上的鱼取背部肌肉于超低温冰箱中保存,取4尾用于实验。
1.2实验方法
大黄鱼、鱼和美国红鱼基因组DNA的提取方法是参照《分子克隆实验指南》[5]中DNA的提取方法。PCR所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25 μL体系:2.5 μL PCR缓冲液,DNA模版50 ng,dNTP 0.2 μmol·L-1,引物1 μmol·L-1,镁离子浓度2 μmol·L-1,Taq聚合酶1 U,超纯水补至25 μL。反应在PCR扩增仪上经94℃预变性5 min后进行30个循环,每个循环包括94℃ 1 min,56℃ 1 min,72℃ 1 min,最后于72℃延伸7 min。PCR产物由上海生工进行双向测序,并对测序结果用DNAman、DNAsp和MEGA等软件分析。
2 实验结果
此研究得到大黄鱼和美国红鱼的各1 140 bp片段的Cyt b序列,鱼的1 125 bp片段的Cyt b序列。所得序列的单倍型提交GenBank并获得序列号。分别选代表大黄鱼的单倍型EU346914(即将公布),鱼的单倍型EU363521(即将公布)和美国红鱼的单倍型EF173450(即将更新)进行序列分析,获得的遗传特征如下。
2.1碱基组成
大黄鱼、鱼和美国红鱼3种鱼序列的碱基组成见表1。从表中可以看出,大黄鱼和美国红鱼的A+T含量高于C+G的含量。鱼的A+T含量为49.9%,略低于C+G的含量。从4种碱基在密码子的分布情况看,3种鱼密码子碱基的分布情况相似,密码子第一位4种碱基的分布比较均一,密码子第二位富含T,T的碱基含量均超过41.0%,密码子的第三位均出现C含量较高,T含量较低的碱基偏倚现象,尤其是鱼,C的碱基含量高达53.6%,G的碱基含量最低,为5.1%。周发林等[6]在比较鲈形目6种笛鲷属鱼类也报道了该种情况,3种鱼Cyt b基因的碱基组成符合鱼类同源序列的特点。
%
注:表中数字1、2、3分别代表密码子的第1、2、3位Note:No.1,2and 3denotethe 1st,2ndand 3rdcodonposition,respectively.
2.2序列变异
将3种鱼的序列进行比对,3种序列的相似性为91.49%。由于鱼所得的序列为1 125 bp,除去大黄鱼和美国红鱼序列3′末端多出一段碱基,3种序列的相似性为91.90%。将3种鱼的序列进行比对,3种序列共有259个变异位点,其中有15个变异位点是由于鱼序列3′末端缺少15个碱基造成。选取3种鱼相对应的1 125 bp片段进行分析,得出3种鱼的序列间有244个多态位点,没有简约信息位点。3种序列间完全变异的位点有15个,分别为第33、75、159、210、225、387、408、444、591、732、774、786、846、921和1 093个位点。244个变异的位点中,碱基变异存在很大差异,有148个为C/T转换,有50个为A/G转换,C/T转换明显高于A/G转换,总转换数为198;有24个A/C,10个A/T颠换、8个G/C,4个G/T颠换,A/C和A/T的颠换明显高于G/C和G/T的颠换,总颠换数为46,转换/颠换率约为4.3,转换明显多于颠换。另外,在替换的碱基中,发生在第三密码子位置上占84.4%,只有6个替换发生在第二密码子位置上,密码子第三位点的变异率明显高于第一和第二位,表现出在密码子的第二位非常保守,第三位变异较大,符合密码子具有摇摆性这一特点。3种序列的碱基变异情况见图1。
通过对大黄鱼、鱼和美国红鱼的序列对比分析,虽然3种鱼具有较高的相似性,但是所测得的序列差异明显,碱基替换较多,可以将Cyt b基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记。
2.3遗传距离和系统树
利用MEGA软件中基于Kimura-双参数法计算了3种序列的遗传距离(表2),并用“NJ”法构建系统树(图2)。从表2中可以看出鱼与美国红鱼的遗传距离最近,反映在系统树上表现为鱼和美国红鱼最先聚为一支。
3 讨论
以大黄鱼、鱼为代表的石首鱼科鱼类,曾在我国水产业中占据着重要的地位。但是,大黄鱼资源严重衰退,种质严重退化,对其进行遗传结构和多样性分析、分子遗传图谱的构建、物种演化和亲缘关系研究以促进合理的资源保护,进而提出对大黄鱼的种质资源、基因库进行有目的、有策略保护的有效措施已变得势在必行。多年来对大黄鱼种质的研究报道较多,在大黄鱼的形态学方面[7,8]、在细胞学方面[9,10]、在生物化学方面[11,12]以及分子生物学方面[13,14,15]都有大量的研究报道,近年来由于大黄鱼的增殖放流工作的开展,使自然水域中的大黄鱼资源正处于恢复的趋势,但是,放流的大黄鱼对天然的大黄鱼的基因库是否产生破坏、以及破坏程度都有待于通过分子标记技术来研究,从而为政府管理部门决策提供科学依据。在大黄鱼资源衰退期间,鱼成为石首鱼科的主要捕捞对象之一,也曾面临着资源衰退的危险。对鱼的报道相对于大黄鱼较少,仅在养殖技术、育苗要点、摄食等方面有相关报道[2,16]。美国红鱼作为石首鱼科的引进物种,自1991年引进仔鱼,1995年繁殖成功起,我国已在辽宁、山东、浙江、福建、广东、海南等十几个省进行了大规模的美国红鱼繁育及养殖工作,并取得了一定的经济效益,仅浙江省2003～2005年美国红鱼的养殖产量连续达到1.1万t以上,美国红鱼已成为浙江省主要的鱼类养殖品种,产量位居第一位。但是在养殖过程中,由于管理不善和台风等非人为因素的影响,美国红鱼逃逸的现象时常发生,由于美国红鱼与大黄鱼、鱼同为肉食性鱼类,加之其生长快,对环境水域条件要求低等特点,美国红鱼的逃逸势必会对自然海域的生态系统造成不可忽视的影响。其一旦在自然水域形成规模,将破坏我国水域中现有的生物链,威胁我国的本土鱼类,破坏现有的鱼类区系,降低生物多样性,对我国的渔业资源和生产造成重大的损失。自美国红鱼引进后,有关美国红鱼的报道也涉及多个方面,1998年尤峰等[17]对美国红鱼的核型进行了报道;1999年邓岳松[18]对美国红鱼的繁育及养殖技术进行了报道;2002年刘世禄等[19]对美国红鱼养殖群体的生化遗传情况进行了初步的分析;2006年陈刚等[20]对美国红鱼的血细胞进行了报道等等。到目前为止,有关美国红鱼基因序列等方面的研究在国内也还没有见到。另外,大黄鱼、鱼和美国红鱼同属石首鱼科鱼类,2008年王晓清等[21]报道了大黄鱼与鱼进行人工杂交的遗传分析,子代只有0.65%的鱼苗成活率,而且杂交子代与母本大黄鱼之间具有极高的遗传同质性。虽然美国红鱼与大黄鱼和鱼存在地理隔离,但是引进的美国红鱼能否与大黄鱼、鱼杂交,造成基因库的污染,还有待于利用有效的遗传学手段开展遗传学背景研究。
线粒体Cytb 篇4
鹅喉羚( Gazella subgutturosa) 又叫长尾黄羊,属偶蹄目( Artiodactyla) 牛科( Bovidae) 羚羊亚科( Antilopinae) 瞪羚属( Gazella) ,为国家二级保护动物,1994年被IUCN红色名录列为LR级( 低危种) ,2006年被列为VU级( 易危种)[1]。鹅喉羚是典型的荒漠、半荒漠中有蹄类动物,主要分布于乌兹别克斯坦、哈萨克斯坦、土耳其、阿富汗、阿塞拜疆、伊朗、蒙古和中国,在我国境内主要分布于新疆、甘肃、青海和内蒙古。20世纪90年代,由于盗猎和鹅喉羚栖息地的丧失等原因,导致该物种陷入濒危状态,种群数量一度下降[2]。近年来,随着保护政策的加强和保护区的建立,鹅喉羚的数量又趋于回升。目前,国内外学者已经对鹅喉羚开展了许多研究,国外的研究主要涉及形态与分类学[3]、季节性迁移[4]、觅食生态[5]、生理学[6]、繁殖生态[7]、遗传多样性和群体遗传关系[8]等。国内对鹅 喉羚的研 究主要包 括种群生 态学[2,9,10]、濒危原因与保护对策[11]等,我国分布着3个亚种的鹅喉羚,但至今未见鹅喉羚遗传多样性方面的报道,本研究通过分析17只鹅喉羚线粒体DNA D - loop区和Cytb序列来揭示该群体的遗传多样性, 从而对我国部分地区鹅喉羚的遗传现状有初步的认识。
动物mt DNA是动物体内唯一的核外遗传物质, 以母系遗传的方式遗传,由于其不仅结构简单稳定、 进化速度较快,而且能直观保存群体突变的发生[12], 但是线粒体基因比核基因更容易受遗传漂变的影响[13]。因此分析线粒体DNA的多态性不仅在一定层面能了解该种群的遗传结构,还可以探讨该群体的起源与地理分布原因[14],是分子研究一种常用的遗传标记,适合于检测种群内及种群间的遗传多样性。 本研究通过分析该群鹅喉羚的遗传多样性,了解其亲缘关系,并根据我国鹅喉羚的地理分布,对该群体的来源进行了探讨,研究结果对鹅喉羚的保护和人工驯养具有重要的科学意义。
1材料与方法
1.1材料
1. 1. 1样品采集: 17只鹅喉羚样品于2014年3月采自新疆天山野生动物园,颈静脉采血,EDTA抗凝,20℃ 保存。
1.2方法
1. 2. 1 DNA提取: 采用生工生物工程( 上海) 股份有限公司的EZUP柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取。
1. 2. 2PCR扩增: D - loop区引物序 列为: 5' CCACTATCAACACCCAAAGCTG - 3' 和5'GCATTTTCAGTGCCTTGCT - 3'[9],扩增片段长度985 bp,Cytb区引物采用Primer Premier 5. 0设计,引物序列为5' - ATCAACACCCGAAAGACC - 3'和5' - AATGAAGTGGAAGGCAAA - 3',扩增片段长度549 bp,引物由上海生工股份有限公司合成。PCR扩增采用德国biometra PCR仪,反应体系为: 基因组DNA 1μl( 约100 ng) ,10 μmol / L的上、下游引物各1μl,10 × buffer 2. 5μl,Tap酶0. 5μl,dd H2O为17μl。整个反应体系25μl,PCR扩增程序为: 94℃ 变性3 min,94℃ 变性1 min,59℃ 退火1 min,72℃ 延伸1 min,进行35个循环,4℃保存。
1. 2. 3测序及数据分析: PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后,送上海生工股份有限公司纯化和测序,测序结果用Clustal X1. 81软件进行序列比对,采用Dna SP v5( version5. 10. 01) 软件计算各碱基组成, 多态位点、单倍型数目和核苷酸多样性,平均核苷酸差异数( k) 。D - loop区测序结果用chromas Pro( version1. 7. 4) 进行拼接,拼接好的序列在NCBI中进行blast比对,确保得到 的序列是 目标序列; 然后用Clustal X1. 81进行多重比对,并对比对结果进行筛查与纠正; 用MEGA5. 05计算群体内个体间的遗传距离( 采用Kimura双参数模型进行计算) ,利用NJ法 ( Bootstrap抽样重复次数为1 000次) 构建同源性聚类图。
2结果与分析
2.1PCR扩增结果
试验以17只鹅喉羚的基因组DNA为模板分别对D - loop区和ctyb区进行扩增,经1% 琼脂糖凝胶电泳检测,得到与预期目标片段大小一致、整齐而清晰的条带,送生工生物工程公司测序。
2.2D-loop区和cytb序列基因片段特征分析
共测定了17只鹅喉羚的mt DNA D - loop区和cytb基因片段,D - loop区经过拼接组装后,经比对, 得到长度为978 bp的同源序列,已提交Gen Bank( 登录号为KJ499822 ~ KJ499838 ) ,平均碱基 含量C 23. 6% 、T 28. 0% 、A 33. 0% 、G 15. 4% ,Cytb经比对得到543 bp的同源序列,平均碱基含量C 25. 9% 、T 27. 3% 、A 30. 9% 、G 15. 9% ,A + T含量明显高于C + G含量,符合线粒体DNA碱基的组成特点。根据已报道鹅喉羚D - loop序列 ( Gen Bank登录号为: HQ185440 ) 和Cytb序列 ( Gen Bank登录号为: AF036282) 为对照,结果D - loop序列共检测到变异位点31个,占全序列的3. 2% ,简约信息位点27个, 单态突变位点4个,分别位于302 bp、307 bp、308 bp、 467 bp。31个变异位点中A / G转换位点17个,C / T转换位点11个,缺失位点1个( 图1) 。Cytb序列变异位点2个,简约信息位点2个,两个变异位点1个A / G转换、1个C / T转换。
2.3群体遗传多样性
用Dnasp软件计算17只鹅喉羚D - loop区和Cytb的遗传多样性参数见表1。
群体扩张性分析,ajima's D值为0. 59971和0. 4983 ( p > 0. 01) ,Fu' s Fs值为0. 90211和0. 81535 ( p > 0. 01) ,符合中性进化模型,没有经历群体扩张。
2.4遗传距离与聚类分析
采用MEGA5. 05计算17只鹅喉羚 个体之间Kimura - 2参数校正的遗传距离,该群体内个体平均遗传距离0. 011,最大遗传距离0. 024,最小遗传距离0. 001。基于D - loop和Cytb基因序列,分别以数据库中HQ185440和AF036282为对照,构建个体同源聚类图,从图2可看出,以D - loop区系统构建的聚类图中种群体内所有个体聚为两个大的分支,12号和21号聚为一支,再和HQ185440聚为一个大支,另一个大支中又有包含3个分支。从图3可以看出,以Cytb单倍型构建的聚类图中群体内所有个体聚为3个大的分支,12号和21号聚为一支,其余个体聚为一支,AF036282单独为一支。
3讨论
3.1鹅喉羚的遗传多样性分析
鹅喉羚作为国家二级保护动物,近年来,由于保护管理的加强,数量已经有所增加,新疆北部卡拉麦里山有蹄类自然保护区内鹅喉羚的密度春季已经达到1头/km2[15],高于20世纪90年代许可芬[16]等的报道,而且增长趋势仍在继续,说明卡拉麦里山有蹄类自然保护区内鹅喉羚资源得到恢复。对物种的保护,不但要维持一定数量的种群,而且该种群还必须保持继续进化的潜力。鹅喉羚群体以母子群和公兽群为主[17],线粒体DNA作为母系遗传的方式,在研究鹅喉羚的群体多样性上是一种非常适合的遗传标记。本实验中鹅喉羚D - loop和Cytb区序列的序列中A + T含量明显高于C + G含量,这与其它的研究报道一致[18]。在所有的变异位点中均为转换位点, 这也符合线粒体基因组DNA进化过程中转换频率高于颠换频率的规律。
衡量群体mt DNA变异程度的重要指标有: 单倍型多样度、核苷酸多样度和遗传距离,单倍型多样度、 核苷酸多样度的值越大,说明群体的多样性越丰富, 对环境变化的适应能力也就越强[19]。核苷酸多样度由于考虑了群体中单倍型所占的比例,因此在反应遗传多样性时比遗传距离更精确[20]。由于本实验中通过D - loop区分析鹅喉羚群体的单倍型个数( H) 为8,单倍型多样度 ( Hd ) 0. 863,核苷酸多样性 ( Pi ) 0. 0102,通过Cytb区序列得到的鹅喉羚群体单倍型为3,单倍型多样度0. 330,核苷酸多样性0. 00077,造成这种差异的原因是因为mt DNA的不同区域进化速度不同,D - loop是线粒体碱基序列和长度变异最大的区域,由于不编码蛋白,受到的选择压力最小,所以进化速度 最快[21],适合研究 亲缘关系 较近的群 体[22]。Cytb基因由于编码线粒体细胞色素b蛋白, 其进化速度适中,适合研究种内到种间甚至科间的系统发育关系。根据Grant WS等[23]将mt DNA序列遗传变异分成4个类型,鹅喉羚D - loop区属于高的单倍型多样度( Hd < 0. 5) 和低的核苷酸多样度( pi < 0. 005) ,而cytb序列属于低的单倍型多样度 ( Hd < 0. 5) 和低的核苷酸多样度( pi < 0. 005) 。说明该鹅喉羚群体在进化中产生了许多突变,积累了丰富的单倍型,但是没有足够时间积累核苷酸的变异。另外,对D - loop区和Cytb序列的群体扩张分析显示群体没有经历扩张。这一方面说明了对鹅喉羚保护的效果显著,目前鹅喉羚的遗传多样性较丰富,另一方面还要继续坚持保护政策,特别是保护好鹅喉羚的栖息地,使不同的鹅喉羚群体之间有更多的基因交流。根据Patrick E[24]等报道,鹅喉羚有6个亚种,其中新疆境内分布着3种,叶尔羌亚种( G. S. yarkandensis) 、准噶尔亚种 ( G. s. sairensis) 和柴达木亚种 ( G. S. reginae) ,其中,叶尔羌亚种分布于新疆南部塔里木盆地, 准噶尔亚种分布于新疆北部准噶尔盆地、东部的吐鲁番盆地和哈密地区[25],哈密地区位于准噶尔盆地和塔里木盆地的东缘,随着保护力度的增强,鹅喉羚的生产环境正在逐渐变好,在新疆,冬季非常寒冷,缺少饲草,分布在准疆准噶尔盆地的鹅喉羚会从北部迁徙到南部,亚种之间的基因交流的可能性大为增加。根据Groves CP[26]等将鹅喉羚分为4个亚种,波斯亚种 ( Persian gazelle) 、土库曼亚种( Turkmen gazelle) 、叶尔羌亚种 ( Yarkand gazelle) 、沙漠亚种 ( Sand gazelle) 。这些亚种大多分布在中亚地区,新疆也与中亚接壤,目前,各国都对鹅喉羚进行了有效保护,这些亚种之间是否有基因交流,还需要更深入的研究。
3.2遗传距离和同源性聚类分析
从群体遗传距离看,该群体内个体平均遗传距离0. 011,最大遗传距离0. 024,最小遗传距离0. 001。 根据Nei M[27]报道,同一物种不同地区种群间D值范围在0 ~ 0. 05之间,亚种间D值在0. 02 ~ 0. 20之间。12号和21号与其它个体的遗传距离最大,不排除具有亚种的区别。线粒体是母性遗传的,一个个体就能代表一个母系群体,从D - loop区聚类图可看出,12号和21号聚为一支后又和HQ185440聚为一起,HQ185440属于波斯亚种( Persian gazelle) ,波斯亚种主要分布在土耳其南部、阿塞拜疆、伊拉克东北部、阿富汗南部、巴基斯坦。说明12号和21号个体与HQ185440亲缘关系更近。从Cytb聚类图也可以看出,12号和21号个体也聚为一支,由于线粒体是从母系起源上确定品种间遗传关系,可以认为12号和21号是一个独立的母系起源,其余的个体又聚为一起,属于另一个母系起源。本实验的鹅喉羚样本是自动物园,这些鹅喉羚是来自新疆哈密地区,具体在野外分布在什么地方、来自几个群体,已无从考证。 从本实验的结果看,这些个体可能来自两个相对独立的母系遗传群体。当然,mt DNA的多态性与核DNA的多态性不一定正相关[28,29],有时会出现mt DNA的多态性与核DNA多态性低或高的情况[30],因此,分析群体遗传多样性时最好核基因和mt DNA基因结合,本实验根据17只鹅喉羚的D - loop区序列和Cytb序列,发现其mt DNA具有丰富的多态性,但核基因多态性水平如何,下一步我们将采用微卫星标记的方法,从整个基因组对鹅喉羚的遗传多样性进行分析,为鹅喉羚现状提供科学数据,为鹅喉羚的保护提供科学依据。
4结论