细胞线粒体

细胞线粒体（共8篇）

细胞线粒体 篇1

鱼类具有同其它脊椎动物一样的基因序列且较为保守[1]。鱼类mtDNA具有基因组小、分子结构简单、呈母系遗传、进化速度快,编码效率高,复制方式相对简单、不同区域进化速度存在差异,使之易于检测,适合不同水平的进化研究等独特的遗传特性,是系统遗传学理想的分子标记,从20世纪80年代初起国内外学者就陆续开展对鱼类mtDNA的研究工作[2,3,4,5]。

近年来,随着PCR技术的广泛应用,特别是全自动序列分析技术的推广,鱼类分子系统学研究开始集中于DNA全序列或基因片断分析。Cyt b基因进化速度适中,不仅容易用一些通用引物扩增和测序,而且它还是线粒体上唯一的结构和功能被了解得较为清楚的蛋白编码基因[6],因而,和其它脊椎动物一样,Cyt b基因成为鱼类分子系统学研究中应用较多的分子标记[7]。

驼背鲈(Cromileptes altivelis),俗名老鼠斑、鳘鱼、锐首拟石斑,隶属于科、石斑鱼亚科、驼背鲈属[8]。目前国际上已知的驼背鲈仅1种,分布于印度太平洋的炎热地区,西至非洲,东至菲律宾,北至日本,南至澳大利亚海域,中国见于南海。由于其资源量极少,在一些国家,已将该鱼列为保护鱼类。驼背鲈为高级海产经济鱼类,也是世界上最名贵的海水鱼之一。在国际上,其生物学资料极少,区又君等[8,9,10,11,12]研究了驼背鲈的形态和生物学性状、引种驯养及人工诱导性腺发育和繁殖、胚胎发育,陈福华等[13]报道了驼背鲈寄生线虫的研究。此文用分子技术对驼背鲈的细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)基因进行扩增及全序列测定,以期为驼背鲈种质资源的合理开发提供核苷酸序列方面的基础资料,同时也为深入探讨驼背鲈的进化及其分类位置提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源

试验用的野生驼背鲈采自印度尼西亚。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

取0.1 g鱼的背部肌肉或尾鳍,用95%酒精保存的肌肉组织以提取基因组DNA,按照常规的酚/氯仿抽提方法进行[14]。

1.2.2 PCR扩增

采用PCR扩增mtDNA Cyt b全序列,引物[15]分别为,上游引物:5′-GTG ACT TGA AAA ACC ACC GTT G-3′,下游引物:5′-CTC CAT CTC CGG TTT ACA AGA C-3′。PCR反应体系:总体积25 μL,包含1×PCR Buffer,1.5 mmol·L-1 MgCl2,2 mmol·L-1 dNTP,引物各2 μmol·L-1,模板约100 ng,1.5 U TaqDNA聚合酶。循环参数:94℃热变性1 min 20 s;94℃变性42 s、47℃退火48 s、72℃延伸1 min,共30个循环;最后72℃延伸5 min。

1.2.3 扩增产物克隆与测序

直接用扩增产物与PUCm-T载体进行连接反应,16℃ 3 h;转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于含氨苄青霉素的LB平板上生长过夜,进行蓝白斑筛选,挑取单一白斑菌落置于液体LB培养,菌液PCR检测。把含转化子的液体LB送上海生工生物工程技术服务有限公司做双向测序,仪器为ABI 3700 DNA测序仪。

2 结果

2.1 线粒体DNA Cyt b基因全序列PCR扩增结果

驼背鲈线粒体DNA Cyt b基因PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示有一条清晰的条带,约1.3 kb(图1)。

2.2 Cyt b基因全序列测序结果

经测序得到的碱基序列由DNA Star软件包的SeqMan拼接,Megalign比对,辅以手工校正,去除载体序列和Cyt b基因两端外侧tRNA-Glu和tRNA-Thr片断,得到1 141 bp的Cyt b基因全序列(图2),经BLAST显示同其它石斑鱼类的Cyt b基因序列有很好的同源性[16]。将驼背鲈Cyt b基因全序列递交到GenBank,取得序列号DQ486928。

2.3 mtDNA Cyt b基因推测的氨基酸序列

根据驼背鲈mtDNA Cyt b基因序列推导,翻译成为氨基酸后,共有380个氨基酸(图3)。

2.4 mtDNA Cyt b基因的密码子碱基使用

驼背鲈mtDNA Cyt b基因的密码子碱基使用情况见表1。从表1可知,驼背鲈mtDNA Cyt b基因序列平均碱基组成T为29.1%,C为32.3%,A为23.2%,G为14.0%;其中C的含量约为G含量的2.3倍;此外,第3密码子的碱基组成存在较大反G偏倚偏离,第3密码子C和G的平均碱基组成C-3为40.8%,G-3为3.2%。A+T的碱基百分比总体上略大于C+G,平均值分别是52.3%和46.3%。

2.5 mtDNA Cyt b基因中20种氨基酸的使用频率

驼背鲈mtDNA Cyt b基因中20种常见氨基酸的使用频率见表2。由表2可见,在由核苷酸推导的氨基酸中,亮氨酸所占的比例最高,为16.03%;蛋氨酸和色氨酸所占比例最少,都为0.003%。20种氨基酸的使用频率由高至低按次序为亮氨酸>丙氨酸>异亮氨酸>甘氨酸>苯丙氨酸>丝氨酸>缬氨酸>苏氨酸>天门冬酰胺>脯氨酸、酪氨酸>天门冬氨酸>谷氨酰胺>赖氨酸>精氨酸、谷氨酸>半胱氨酸、组氨酸>蛋氨酸、色氨酸。

3 讨论

此试验克隆测序的驼背鲈线粒体Cyt b基因全序列经BLAST比较,与其它石斑鱼类的Cyt b基因均有较高的同源性。该鱼的Cyt b基因共1 141个碱基,含起始密码子ATG;终止密码则是在转录成mRNA时在3′端的T碱基上加上AA而形成TAA(UAA)终止密码子。在其它一些鱼类如大西洋鲑Salmo salar(GenBank NC001960)、尼罗尖吻鲈Lates niloticus(GenBank AB117106)、似鲱月眼鱼Hiodon alosoides(GenBank AP004356)等也可见这种现象。这与剑尾鱼Xiphophorus hellerii(GenBank AY056056)等线粒体Cyt b基因的1 140个碱基中含有起始密码子ATG和终止密码子TAA有所不同。

驼背鲈Cyt b基因全序列1 141 bp中,没有发现碱基的缺失或插入,驼背鲈线粒体Cyt b基因的碱基组成在第3密码子位置出现较大反G偏倚偏离,明显高于第1和第2位点。对于编码重要功能蛋白质的Cyt b基因来说,由于在DNA水平上受自然选择压力的影响,密码子第三位点的突变率高于第一和第二位点,而且密码子第三位点的突变绝大多数是同义突变,受自然选择压力较小,突变后易固定,第一、第二位点则相反。这与编码蛋白质的基因密码子第三位点进化最快,第二位点最保守的规律相一致[17]。其它鱼类[18]及爬行类中[19]也有发现,尤其在第3密码子显示强烈反G偏倚。鸟类[20]和哺乳类[17]在细胞色素b基因第三位具有对A和C的极强偏倚。这些差异是系统发育决定的还是在功能上受制约,目前还不清楚。

激活老教师的“线粒体” 篇2

点燃火种，“老”有所为

临近退休的教师，在工作中积累了丰富的经验，为学校作出了应有的贡献，如果一下子就“清闲”起来，其身体和心理上就会有很大的不适感。因此，我们十分有必要鼓励他们发挥余热，积极为学校的发展作出贡献。发挥临近退休老教师的积极作用，除了领导的尊重、信任和真诚以外，还要点燃他们积极上进的火种，激发原动力。

2010年，“并校”后，有的老教师由于长时间脱离一线教学，不能胜任小学的教学工作，而且小学已经“人满为患”了。在征得他们的同意后，分到了中学工作。校长请了四位临近退休的教师谈话，然而，他们竟然说出同样的话：“校长，我们还有三四年就退休了，能不能让我们提前退啊？况且，中学也不需要我们啊！”校长笑着说：“呵呵，如果是提前退休，上级部门没有这方面的规定啊，我当然不能这样做。在你们来之前，我已经了解你们的情况，张老师和乔老师都勤劳、能干，爱校如家啊；孙老师是老校长了，五桥小学的院墙都是您领着老师砌的，是位实干家；付老师在原学校当工人，你们的老师对你的工作是十分满意的！中学需要你们，更需要你们引领啊！”听罢校长的肺腑之言后，四位老教师都高兴地笑了。付老师说：“校长真了解我们啊，看看我们能干点啥？”经过商量后，张老师、乔老师和付老师分配到学校后勤，孙老师管理宿舍。

在以后的日子里，校长有事没事都和他们一起聊聊天，唠唠家常，问寒问暖，征求学校管理的意见和建议，也正因为这样的交心，让四位老教师鼓足了工作干劲，兢兢业业地干好本职工作，成为学校教师的榜样！

在2012年4月份，学校宿舍大楼竣工了。可是，还有很多平垫场地、铺砖路等收尾工作需要去做。四位老教师主动找校长，他们说，看到学生能够住上这么好的楼，心里非常高兴，铺砖甬路的活就由我们来干，不用其他教师干了，否则，会耽误老师备课的！就这样，他们利用工作之余的时间，顶着东北乍暖还寒、风沙的天气，平整场地，用小车推砖，铺设砖地，起早贪黑地干活，没有一句怨言，只是不断和老师们重复这句话：“学校需要我们啊，能做点啥，咱就做点啥吧。”经过他们一周的努力，一条100多平方米的甬路赫然展现在师生面前，引来了啧啧赞叹声。

燃烧激情，“退”有所乐

退休教师是一“老”，如同家里有一“宝”。如果说，学校对临近退休老教师的“重用”是奠基的话，那么对已经退休老教师的“再用”就是“器重”。学校的前期“奠基”工作，会让临近退休教师产生对学校恋恋不舍的情愫，会有“我还有很多工作没做”的心理需求，产生“我离不开学校”的情感体验。基于此，当这部分教师退休后，学校要充分考虑到他们的需求，积极搭建有利于他们再发展的平台，让老教师继续乐于从教。

2011年9月，我校的李老师光荣地退休了。李老师堪称学校的“老学究”，带徒弟无数，并把我校家长学校创办得红红火火，深受家长们的欢迎。临退休之际，我们举行一次“恳谈会”。会上，校长充分肯定李老师对学校及家庭教育所作出的贡献，再由十几位青年教师以“我向李教师学什么”为主题，进行座谈。校长充满激情的讲话，年轻教师以敬仰之情的热情洋溢的发言，感动了李老师。随即，李老师动情地说：“没想到，也非常感谢大家给了我这么高的评价！可是，我总感觉还没有做好，尤其是家长学校，还有很多事情没有做……”言语之间，不乏伤感之情。聪明的校长接着说：“您可以继续做啊，我们一定会鼎力支持的，呵呵，最好是退休教师‘组团’啊！”李老师当即表态：学校离不开我，我更离不开学校，我们退休教师“组团”搞好家长学校。

李老师说做就做，很快就成立了老教师团队，我们称之为“铿锵三人组”。为了便于开展工作，李老师受聘为中心学校关心下一代副主任。三位老教师开始了“新”的工作：搞家长培训、读书讲座、家长问卷调查，有时还会进行有关家长教育的班主任培训……“铿锵三人组”和着学校教育的节拍，时而独立开展工作，时而参与学校的工作，忙得不亦乐乎。有一天，在家长讲座即将结束时，李老师动情地说：“本来以为，我退休之后，就闲置在家里，没想到继续得到学校领导的偏爱，让我的老年生活很精彩！由衷地感谢学校领导，证明了我仍然是有用的，这让我重新焕发青春！”

人文关怀，激活“线粒体”

退休老教师最需要的是什么？笔者就此问题走访了8位即将退休和已经退休的老教师，他们的回答，可谓林林总总，但绝大多数答案是“需要学校的精神关怀！”

学校要发挥“能量转换器”的作用，积极为老教师提供“营养物质”。校长要给予老教师工作上的重视，精神上的鼓励，多些真诚的问候、多些由衷的鼓励、多些嘘寒问暖、多些可亲的笑脸、多些中肯的评价……你的赞美就是给予他们最好的精神食粮。在老教师无论家庭还是生活上有困难时，校长要想在先，冲在前，及时为其排忧解难，尽可能地帮助他们解决实际困难。

激活“线粒体”，让老教师释放正能量。老教师是一座“活火山”，蕴藏着巨大的能量，当得到校长的激活后，他们的工作就会由被动变为主动，精神状态就会由“堪忧”转为“活力四射”，其本身的价值得以实现，成就感、归属感和幸福感就会溢于言表，给自己带来生命再拔节的原动力和精神饱满的战斗力，给年轻教师带来的是榜样般的无穷动力，给教育带来的是勃勃生机。这些，更是把教育从小庭落走向大旷野的需要。

编辑 穆国库

细胞线粒体 篇3

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠50只, 雌雄不拘, 体重200g~250g, 购自河北医科大学动物中心, 随机分为5组:对照组、假手术组、 SAD30d组、SAD 60d组、SAD 90d组, 每组10只。

1.2 SAD大鼠的制备和检验大鼠用盐酸氯胺酮50mg/kg加地西泮5mg/kg腹腔注射麻醉, 同时腹腔注射硫酸阿托品0.5mg/kg以抑制呼吸道腺体分泌。麻醉后大鼠仰卧位固定, 颈部正中切开, 分离双侧主动脉神经及喉上神经并切断, 暴露颈动脉窦区并去除该区的神经支配, 用10%苯酚乙醇溶液涂擦, 最后缝合切口。后肢肌内注射青霉素钠6×10４U, 完成整个SAD手术［２］。假手术组不作神经分离和切除, 其余步骤与SAD手术相同。术后3个组大鼠分别饲养30d、60d、90d。

SAD大鼠按以上方法麻醉后行股静脉插管和经股动脉的低位腹主动脉插管, 24h后在清醒自由活动状态下静脉注射去氧肾上腺素 (深圳沃兰德药业) 3μg/kg~5μg/kg, 血压升高≥ 50mmHg, 心率减慢<20次/min, 则认为SAD完全。实验组全部合格。假手术组大鼠检验时, 心率减慢为60次/min~100次/min。

1.3清醒、自由活动大鼠的血压监测术后4周, 在大鼠一侧腹股沟处切开, 分离股动脉和静脉, 用肝素化的聚乙烯导管分别进行动脉插管和静脉插管。插管另一端用引针经背部皮下至顶部穿出, 用“马鞍”固定, 术后大鼠置于隔音实验室内单独饲养。 恢复24h后置于有机玻璃圆筒内, 动脉导管经转动装置和灌注三通管与压力换能器连接, 灌注三通管与恒速推注泵连接, 1 mL/h推注20IU/mL肝素化等渗葡萄糖溶液。每搏血压信号经压力换能器转换为电信号, 由分析系统 (成都泰盟BL-420) 实时记录并处理收缩压 (SBP) 、舒张压 (DBP) 。以每搏血压为基础, 计算每个动物在24h内SBP、DBP的均数及标准差, 标准差表示血压波动性 (BPV) 。分别计算24hSBPV及DBPV［３］。

1.4线粒体的制备大鼠快速断头取出全脑, 加入含有225 mmol/L甘露醇、75mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、25mmol/LTris、0.25%牛血清白蛋白的分离介质10mL (pH 7.4) , 冰上匀浆, 800g离心10min, 取上清液, 12 000g离心15min, 取沉淀。 以上过程重复2次。取第2次沉淀物加入200μL分离介质, 制成线粒体悬液, 以Lowrry法测定蛋白质浓度［４］。

1.5指标测定Na＋-K＋-ATP酶、Ca２＋-ATP酶活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所。用超声细胞粉碎仪将线粒体破碎, 按试剂盒说明进行Na＋-K＋-ATP酶、Ca２＋-ATP酶的活性测定。

1.6数据处理计量数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 应用SPSS13.0软件包, 组间比较采用t检验。

2结果

2.1 SAD大鼠动脉血压及血压波动性变化SAD30d组、 SAD60d组、SAD90d组、假手术组与对照组比较, 24hSBP、 DBP、SBPV、DBPV以及收缩压和舒张压波动性差异无统计学意义;SAD 30d组、SAD 60d组、SAD 90d组24hSBPV、DBPV均显著高于对照组 (P<0.01) 。详见表1。

mmHg

2.2 SAD大鼠脑细胞线粒体Na＋-K＋-ATP酶、Ca２＋-ATP酶的变化假手术组与对照组比较Na＋-K＋-ATP酶、Ca２＋-ATP酶均无变化;SAD30d组、SAD60d组与对照组比较, SAD90d组与SAD30d组、SAD60d组比较, Na＋-K＋-ATP酶和Ca２＋- ATP酶活性明显降低 (P<0.01) 。详见表2。

3讨论

线粒体是真核细胞中重要的细胞器, 具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca２＋、能量代谢、抗氧化等重要生理作用, 为细胞的生命活动提供能量, 甚至可以决定细胞的存亡, 起调控中心的作用［５］, 其功能的实现依赖于膜结构的完整性。本实验结果说明手术创伤对大鼠脑细胞线粒体的结构和功能无损害。SAD使线粒体膜流动性下降, 引起Na＋-K＋-ATP酶、Ca２＋-ATP酶活性降低, 线粒体发生Na＋、Ca２＋超载和水积聚, 结构被破坏, 进而使线粒体主要功能区内膜的完整性被破坏, 从而导致氧化磷酸化解偶联, 此时质子直接通过线粒体内膜回到基质, 导致贮存在质子电-化学势能中的自由能消耗。这种变化可能参与了脑细胞能量代谢, 进而导致神经系统功能障碍, 而且随时间的延长日益严重。SAD使线粒体膜流动性遭到破坏的机制有待进一步研究。

综上所述, SAD引起的血压波动和神经元损伤可引起脑细胞内线粒体损伤, 因此, 维持血压稳定是维持大脑功能正常的重要方面, 但SAD对大脑功能的损害机制尚待进一步研究。

参考文献

[1]王进, 王敏伟, 苏定冯.尼群地平和卡托普利协同降低去窦弓神经大鼠血压波动性的作用[J].沈阳药科大学学报, 2007, 24 (2) :98-101.

[2]史克勇, 马秀娟, 曹颖林, 等.动脉压力感受性反射对盲肠结扎穿孔致脓毒症大鼠生存率的影响[J].第二军医大学学报, 2007, 28 (7) :705-707.

[3]李慧, 孙宁玲.动脉压力感受性反射受损后血浆血管紧张素Ⅱ和内皮素1水平的明亮-黑暗周期变化[J].中华高血压杂志, 2006, 14 (8) :656-659.

[4]Clark JB, Nicklas WJ.The metabolism of rat brain mitochondrin.Preparation and characterization[J].J Biochem, 1970, 245 (18) :4724-4731.

细胞线粒体 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源

新生3d内清洁级SD大鼠的乳鼠[动物质量许可证号:SYXK(辽)2003-0011],雌雄不限,由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂

低糖DMEM(Gibco公司,美国);胎牛血清(杭州四季青公司);Ⅱ型胶原酶、Ⅱ型分散酶(Sigma公司,美国);α-平滑肌肌动蛋白、Caspase-9抗体、二抗试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);活性氧检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);Pifithrin-α(p53抑制剂)、抗氧化剂NAC(碧云天生物技术研究所);线粒体提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器设备

荧光显微镜(NIKON OPTIPHOT,日本);倒置相差显微镜(OLYMPUS IMT-413,日本);Thermo高速低温离心机型(Heraus公司,德国);CO2培养箱(Scientific.Inc 3731型,美国);医用超净工作台(江苏吴县市净化技术研究所);电子分析天平(FA2104型,中国);高压蒸汽消毒锅(GYZ-2000型,中国);Coulter Elite ESP型流式细胞仪(SD公司,USA)。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养

取日龄三天内的SD大鼠乳鼠,浸入75%的医用酒精中消毒,无菌条件下剪取心脏,仔细剥离心房及大血管组织,用PBS液漂洗2-3次,将心脏移入一小平皿,用眼科剪剪成乳糜状1mm×1mm×1mm;加入混合酶(Ⅱ型胶原酶和Ⅱ型分散酶)2m L于37℃消化,60min,每隔10min吹打5min;加入1m L胎牛血清终止消化,反复吹打后200目筛网过滤,收集滤液,1000 r/min离心8min,室温静置5min弃上清液,细胞团块用生长培养基(含15%胎牛血清的低糖DMEM)重悬,移入培养瓶中。37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h后,差速贴壁,将细胞悬液移入另一培养瓶,于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2细胞培养孵箱中培养。每2-3d换液一次。

1.2.2 实验分组

将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为四组:对照组(甘露醇25mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)、高糖+抗氧化剂组(抗氧化剂浓度为10mmol/L)和高糖+p53抑制剂组(p53抑制剂浓度为50μmol/L)。1.3统计学分析采用SPSS16.0统计软件包,所有计量数据均径正态性检验,符合正态分布、方差齐的数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞流式细胞仪检测结果

应用Annexin V-PI双染法检测各组心肌细胞凋亡的情况。与对照组相比,高糖培养基作用24h后,高糖组心肌细胞凋亡率明显增高[(5.66±0.31)%比(9.04±0.18)%,P<0.01]。而与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组的心肌细胞凋亡率明显降低[(7.71±0.28)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞凋亡率也明显降低[(7.83±0.30)%,P<0.01](附表)。

2.2 细胞内ROS的检测

与对照组相比,高糖培养基作用24h后,高糖组心肌细胞产生的ROS明显增高[(163.77±10.98)比(207.84±8.13),P<0.01]。而与高糖组相比,高糖+抗氧化剂的心肌细胞ROS明显降低[(180.98±9.44),P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞产生的ROS明显降低[(192.58±4.77),P<0.05](附表)。

2.3 细胞培养上清液中SOD的含量

与对照组相比,高糖培养基作用24h后,高糖组上清液中的SOD含量明显降低[(2.38±0.17)比(1.77±0.13),P<0.01]。而与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组的上清液中SOD明显升高[(2.21±0.09),P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的上清液中SOD也升高[(1.97±0.07),P<0.05](附表)。

2.4 心肌细胞p53和Casepase 9蛋白的表达

高糖作用24h后,提取线粒体蛋白,Western blot分析p53的细胞定位。与对照组相比,高糖组p53蛋白表达增多[(32.12±2.07)%比(67.94±2.18)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组p53蛋白表达明显降低[(41.96±2.47)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+P53抑制剂组p53蛋白表达明显降低[(42.39±2.16)%,P<0.01]。

提取总蛋白,Western blot分析Casepase 9的表达。与对照组相比,高糖组Casepase-9表达增多[(26.41±1.37)%比(67.89±2.51)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组Casepase 9表达明显降低[(36.82±1.73)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组Casepase 9表达明显降低[(42.37±2.35)%,P<0.01]。

3 讨论

DCM是糖尿病患者致死致残的主要原因之一,研究表明,多种因素参与了DCM的发生发展,其中ROS是诱导心肌细胞凋亡的一个重要的信号分子。已经有研究发现,高血糖可以诱导氧化应激产生ROS,介导心肌细胞凋亡[5]。SOD是人体防御内外环境中超氧负离子对自身侵害的重要的抗氧化酶,它可催化超氧负离子氧化还原生成水与分子氧,是线粒体内对抗活性氧的关键酶,其活性的高低可间接反映出机体清除氧自由基的能力。本研究发现:高糖作用后,心肌细胞产生的ROS升高,而SOD降低,说明高糖诱导产生ROS,SOD清除氧自由基的能力下降。其机制可能为高糖可通过引起蛋白质的非酶氧化作用,激活醛糖还原酶进入多元醇途径,激活蛋白激酶C,激活已糖胺途径等引起氧化应激,导致细胞凋亡。

P53是一个重要的抑癌基因,它调控着细胞周期和凋亡信号通路,与细胞凋亡的发生密切相关[6]。在本研究中,给予高糖24h后,Western blot检测发现心肌细胞线粒体p53蛋白表达增多,心肌细胞的凋亡率增加。这说明高糖可能通过影响P53转位到线粒体,引起心肌细胞的凋亡。而抗氧化剂不仅减少了ROS的产生,同时也抑制了P53的线粒体转位,这说明ROS可能了介导p53转位到线粒体。

那么转位到线粒体的p53是如何引起细胞凋亡的呢?P53作为一个重要的促凋亡因子,主要通过转录依赖和转录非依赖两种途径促进细胞凋亡。一方面,作为转录因子,P53特异诱导细胞凋亡的靶基因的表达,如Bax,Noxa,PUMA,p53AIPI等,并通过这些蛋白参与内源和外源凋亡途径;另一方面,转录非依赖的方式于1994年首次发现,P53蛋白能够从细胞浆转位到线粒体,通过激活内源性的线粒体途径发挥促凋亡作用。高糖作用后,Western blot还发现Caspase-9蛋白表达增多。给予P53抑制剂后,Caspase-9表达降低。线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞内凋亡途径之一。许多凋亡刺激能够诱导线粒体释放细胞色素C,释放到细胞质中的细胞色素C与Apaf-1结结合激活Caspase-9,再激活下游的Caspase-3,-6,-7等,启动线粒体凋亡通路。因此Caspase-9是由线粒体凋亡通路所激活。所以我们认为p53转位到线粒体后,激活了线粒体凋亡通路,引起心肌细胞凋亡,是否通过转录非依赖的方式引起细胞凋亡,这还需要进一步的研究。

本实验结果还发现,给予P53抑制剂提前干预后,不仅抑制了P53的线粒体转位,同时活性氧的水平亦有所降低,这说明ROS介导了P53的线粒体转位,P53也影响到了心肌细胞内ROS的累积,对ROS有一个负反馈作用,我们推测ROS可能也参与了P53介导的心肌细胞凋亡,有报道认为p53可通过调节线粒体SOD的表达部分地影响线粒体ROS的产生,但是具体机制尚不清楚,还需要进一步的研究。

综上所述,本实验结果揭示了ROS和P53在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用,为糖尿病心肌病发病机制的研究和防治提供了实验基础。

摘要：目的 探讨氧化应激和p53介导的线粒体凋亡通路在高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡的作用。方法 将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为四组:对照组、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)、高糖+抗氧化剂组(抗氧化剂浓度为10mmol/L)和高糖+p53抑制剂组(p53抑制剂浓度为50μmol/L)。荧光分光光度计检测细胞内的活性氧,分光光度计检测上清液中的超氧化物歧化酶,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞p53和Caspase-9进行半定量分析。结果 与对照组相比,高糖组心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显升高(P<0.01),上清液中的SOD含量明显降低(P<0.01),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达增多(P<0.01)。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显降低(P<0.01),上清液中SOD明显升高(P<0.01),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达减少(P<0.01)。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显降低(P<0.05),上清液中SOD含量升高(P<0.05),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达减少(P<0.01)。结论 高糖可能通过产生的活性氧介导p53转位到线粒体激活线粒体凋亡通路,引起心肌细胞凋亡。

关键词：高糖,活性氧,p53,心肌细胞

参考文献

[1]Leung AA,Eurich DT,Lamb DA,et al.Risk of heart failure in pa-tients with recent-onset type 2 diabetes:population-based cohortstudy[J].J Card Fail,2009,15(2):152-157.

[2]Bergner DW,Goldberger JJ.Diabetes mellitus and sudden cardiacdeath:what are the data?[J].Cardiol J,2010,17(2):117-29.

[3]Aharinejad S,Andrukhova O,Lucas T,et al.Programmed cell deathin idiopathic dilated cardiomyopathy is mediated by suppression ofthe apoptosis inhibitor Apollon[J].Ann Thorac Surg,2008,86(1):109-114.

[4]Gottlieb E,Vousden KH.p53 regulation of metabolic pathways[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(4):a001040.

[5]Mohammad MD,Dimitri PM,Mohamed AH,et al.Oxidative stressas a commom mediator for apoptosis induced-cardial damage indiabetic rats[J].Open Cardiovasc Med J,2008,2:78.

[6]Pietsch EC,Sykes SM,McMahon SB,et al.The p53 family and pro-grammed cell death[J].Oncogene,2008,27(50):6507-6521.

细胞线粒体 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康成年SD大鼠30只,雌雄不拘,体重240~280 g,由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂

谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所,Rh123购自Sigma公司,TUNEL凋亡试剂盒购自Roche公司,Cytochrome C抗体购自Sigma公司,Bcl-2抗体购自SANTA CRUZ公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型

术前12 h禁食,自由饮水。缺血再灌注损伤模型的建立:乙醚吸入麻醉,参照Pringle法建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,缺血后处理组于缺血30 min后再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环,然后再灌注90 min;假手术组肝门只穿线、不结扎。各组均于再灌注90 min后心腔取血,同时切取肝组织进行各项指标检测。

1.2.2 实验分组

按随机数字表法分成三组:(1)假手术组(Sham):完成模型全部操作,只穿线不结扎肝门;(2)缺血再灌注组(IR):采用进入腹腔后肝门下穿线,拉紧丝线后阻断肝门造成肝脏缺血,松开丝线后给予再灌注的方法建立肝脏缺血再灌注损伤的动物模型,缺血30 min,再灌注90 min;(3)缺血后处理组(IPo):缺血30 min后,再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环,然后再灌注90 min。动物实验方法符合动物伦理学要求。

1.2.3谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性检测

每组大鼠缺血再灌注后于左心室取血,采集血液标本后,加入Eppendorf管中,置入离心机,以4℃,800 r/min离心10 min左右分离血浆,采用日立7060全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。

1.2.4 TUNEL法检测肝细胞凋亡

取新鲜肝组织,4%多聚甲醛固定过夜,常规石蜡包埋并作肝组织切片,常规二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水后,在末端脱氧核苷酸转移酶介导下,使生物素化的d UTP标记至DNA断裂后形成的3′-OH末端,借助生物素与亲和素的特异结合,使过氧化物酶连接至DNA断点,最后加入底物,通过DAB显色,可在光镜下观察到细胞核棕黄色的凋亡细胞。每例标本随机选取5个400倍视野,计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数,并以百分数表示作为凋亡率。

1.2.5 线粒体膜电位测定

参照Emaus等的罗丹明123荧光法。取100 ml线粒体悬液,加入反应介质1 ml,然后加入棕榈酸使其终浓度为100 mmol/L,37℃反应5 min,5 000 g离心5 min,取上清液于488 nm激发波长、525 nm吸收波长下测线粒体外罗丹明123浓度。线粒体膜电位按下式计算:线粒体膜电位=591 g([X]in/[X]out),单位以m V表示。

1.2.6 Western blot检测Cytochrome C表达

实验各组提取蛋白经Bradford法定量后上样,内参使用β-actin。各组上样量为40μg,SDS-PAGE电泳后,半干法将蛋白转移至PVDF膜上,4℃封闭过夜,加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗Cytochrome C,购自Sigma公司;兔抗Bcl-2,购自SANTA CRUZ公司)37℃杂交1 h,TBST漂洗后,加入1∶2 000稀释的二抗(鼠抗兔Ig G抗体,购自北京中山金桥生物有限公司),37℃杂交1 h,TBST漂洗,显色5 min,放射自显影。

1.3 统计学处理

采用SPSS 15.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差表示,各组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性变化

IR组血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性显著高于Sham组(P<0.01);与IR组比较,IPo组的血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平明显降低(P<0.01)。见表1。

注:与Sham组比较,*P<0.01;与IR组比较,△P<0.01Note:compared with the Sham group,*P<0.01;compared with the IR group,△P<0.01

2.2 肝细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化

与Sham组相比,IR组肝细胞凋亡率增加了37.98%(P<0.01);与IR组比较,IPo组肝细胞凋亡率降低了21.43%(P<0.01),表明缺血后处理能抑制由缺血再灌注导致的肝细胞凋亡的发生。缺血前各组线粒体膜电位比较,差异无统计学意义。再灌注90 min后,与Sham组比较,IR组线粒体膜电位明显降低(P<0.01);与IR组比较,IPo组线粒体膜电位显著升高(P<0.01)。见表2。

注:与Sham组比较,*P<0.01;与IR组比较,#P<0.01Note:compared with the Sham group,*P<0.01;compared with the IRgroup,#P<0.01

2.3 缺血后处理对Cytochrome C、Bcl-2蛋白表达的影响

Western blot分析结果显示,经再灌注90 min后,IR组的Cytochrome C蛋白表达比Sham组显著升高(P<0.01),IPo组Cytochrome C蛋白表达比IR组显著降低(P<0.01);与Sham组比较,IR组Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01);与IR组相比,IPo组Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)。β-actin为内参。见图1。

3 讨论

缺血后处理是由Zhao等[1]于2003年提出,他发现在心肌缺血结束后再灌注时先给予多次短暂停灌、复灌处理,具有与缺血预处理相似的心脏保护作用。因其具有可控制性、操作简单,所以缺血后处理具有更直接的临床应用价值[5]。肝细胞凋亡与肝脏缺血再灌注损伤存在着密切的关系。细胞凋亡主要通过两条途径,即死亡受体途径和线粒体途径。其中,线粒体结构与功能的改变尤其是线粒体跨膜电位的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。有研究表明,IPo通过多次循环复灌、复停减少了突然再灌注时活性氧自由基的爆发性产生,保护线粒体超微结构[6]。抑制细胞凋亡的线粒体途径可有效地治疗肝脏缺血再灌注损伤。

既往研究表明,缺血再灌注时Cytochrome C大量释放触发凋亡蛋白酶级联反应,导致细胞凋亡。一旦Cytochrome C释放,可通过快速凋亡机制,与凋亡蛋白酶激活因子-1(A-paf-1)、caspase-9结合,形成Cyt C-Apaf-1-caspase-9复合物,导致caspase-9活化,继而顺序激活caspase-3,启动凋亡的瀑布级联反应。另外,细胞亦可进入一种慢速的死亡过程,通透性转化孔(PTP)开放,线粒体基质由于高渗而膨胀破裂,线粒体跨膜电位(△ψm)迅速崩溃,电子传递呼吸链受阻,细胞发生凋亡[7]。本研究结果显示经缺血再灌注后,大鼠肝脏Cytochrome C蛋白含量显著升高而线粒体跨膜电位迅速降低,缺血后处理可有效改善缺血再灌注损伤后大鼠肝细胞线粒体的功能,减少Cytochrome C的释放,提高线粒体跨膜电位。另外,为了解线粒体在凋亡调节通路中作用,我们在实验中还测定了肝组织中Bcl-2蛋白含量的变化。Bcl-2蛋白作为Bcl-2家族中凋亡抑制蛋白的主要代表,通过其羧基端的信号锚定序列横跨线粒体膜而发挥作用。Bcl-2蛋白可通过调节线粒体膜的通透性,从而影响细胞的凋亡。Tsujimoto等[8,9]研究表明,Bcl-2蛋白通过改变线粒体膜上原有的孔道或通道,而维持线粒体内膜跨膜电位的稳定并抑制细胞色素C等促凋亡物质的释放,从而抑制胞质中caspase的激活,阻断了细胞凋亡的瀑布级联反应。本研究结果表明经过IPo后肝组织中Bcl-2蛋白表达明显高于IR组,而凋亡指数亦显著下降,说明IPo可通过上调跨线粒体膜Bcl-2蛋白表达而减少肝脏缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生,从而抑制肝细胞凋亡,减轻肝脏缺血再灌注损伤,保护肝脏功能。

综上所述,在肝脏缺血再灌注过程中多种因素可激活线粒体介导的凋亡通路,导致肝细胞凋亡增加,肝脏组织结构和功能受到损害。IPo可保护再灌注后线粒体超微结构和功能,上调线粒体膜电位和Bcl-2蛋白表达从而抑制细胞凋亡,减轻肝脏缺血再灌注损伤。

参考文献

[1]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by is-chemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemicpreconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):579-588.

[2]Liu XH,Zhang ZY,Sun S,et al.Ischemic postconditioning protects my-ocardium from ischemia/reperfusion injury through attenuating endoplas-mic reticulum stress[J].Shock,2008,30(4):422-427.

[3]Kim YK,Leem JG,Shin JW,et al.Ischemic postconditioning may notinfluence early brain injury induced by focal cerebral ischemia/reperfu-sion in rats[J].Korean J Anesthesiol,2010,58(2):176-183.

[4]Giovanardi RO,Rhoden EL,Cerski CT,et al.Ischemic preconditioningprotects the pig liver by preserving the mitochondrial structure anddownregulating caspase-3 activity[J].J Invest Surg,2009,22(2):88-97.

[5]Vinten-Johansen J,Zhao ZQ,Jiang R,et al.Myocardial protection inreperfusion with postconditioning[J].Expert Rev Cardiovasc Ther,2005,3(6):1035-1045.

[6]Sun K,Liu ZS,Sun Q.Role of mitochondria in cell apoptosis duringhepatic ischemia-reperfusion injury and protective effect of ischemicpostconditioning[J].World J Gastroenterol,2004,10(13):1934-1938.

[7]Anderson CD,Pierce J,Nicoud I,et al.Modulation of mitochondrial cal-cium management attenuates hepatic warm ischemia-reperfusion injury[J].Liver Transpl,2005,11(6):663-668.

[8]Tsujimoto Y.Cell death regulation by the Bcl-2 protein family in themitochondria[J].J Cell Physiol,2003,195(2):158-167.

细胞线粒体 篇6

1 材料与方法

1.1 试验样品

从贵州省清镇市红枫湖镇养鸡场随机抽取30只贵妃鸡的血样样品。翅静脉采血0.4～1.0 mL, 肝素钠抗凝, 4 ℃保存, 备用。采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒提取血样中的DNA, -20 ℃保存, 备用。

1.2 引物设计及PCR扩增

根据贵妃鸡mtDNA Cyt b基因序列, 设计线粒体Cyt b引物1序列为5′-AAATCTTACCTGGGTTCCT-3′, 5′- GAAGGTGAGGTGGATGATAG-3′;线粒体Cyt b引物2序列为5′-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3′, 5′-ACTAGAGCTTGTGCGTGGG-3′。

PCR扩增反应体系 (50 μL) :10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL, 模板DNA 2.5 μL, ddH2O 17.5 μL, 2×Taq PCR Master Mix (含染料) 25 μL。

PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 54 ℃、58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环;72 ℃再延伸5 min, 4 ℃永久保存。采用2%琼脂糖 (美国FMC公司生产) 经小量胶回收试剂盒 (加拿大BBI公司生产) 回收目的片段。

1.3 测序

分别取回收产物2.5～5.0 μL, 利用PCR引物进行测序反应, 由上海英俊生物技术有限公司进行纯化测序。采用LICOR 4200 DNA 自动分析仪进行序列分析。

1.4 统计分析及软件应用

对原始序列分别进行人工矫正和拼接, 再利用Clustal X 软件进行多重比对后, 用DNASP4.0 软件[8]提取变异位点序列, 合并单倍型, 分析序列的多态性。利用MEGA5.0软件[9]构建单倍型间的邻接法 (NJ) 分子系统树, 计算基于Kimura双参数模型的遗传距离, 以红色原鸡 (登录号为AP003322) 、白洛克 (登录号为AP003318) 、丝羽乌骨鸡 (登录号为AB086102) 、来航鸡 (登录号为AP003317) 为外群构建贵妃鸡的NJ分子系统树, 分析它们的起源及系统进化。

2 结果与分析

2.1 贵妃鸡线粒体Cyt b基因全序列的核苷酸多样性

试验测定了贵妃鸡30个个体的mtDNA Cytb基因全序列, 分2段进行扩增, 线粒体Cyt b引物1长度约为967 bp, 线粒体Cyt b引物2长度约为667 bp, 经人工矫正和拼接后约为1 143 bp。其中A、C、G、T 这4种核苷酸的平均比例分别为27.4%、36.3%、12.2%、24.1%。A+T含量为51.5%, G+ C含量为48.5%。A+T含量高于G+C含量, 说明贵妃鸡线粒体Cyt b基因全序列富含A+T, 表现出碱基组成的偏倚性。

试验测定了贵妃鸡共30条序列, 以其中任一单倍型H1作为标准进行比较分析, 确定了5 种单倍型, 单倍型类型及其变异位点见图1。

H1～H5.单倍型的编号, 数字表示单倍型的变异位点, 圆点表示与第1个单倍型 (H1) 有相同的碱基组成。

由图1可知:共发现4 个变异位点, 约占分析位点总数的0.04 %, 其中没有缺失和插入, 均为转换, 未发生颠换。编码381个氨基酸;发生在密码子1st 的多态位点有1个, 2nd的有1个, 3rd的有2个。其中单一多态位点3个, 分别位于375, 550, 560 bp处;简约信息位点1个, 位于543 bp处。

2.2 贵妃鸡 mtDNA Cyt b基因全序列的遗传结构

贵妃鸡群体核苷酸多样度为 (Pi) 为0.000 45, 单倍型变异度 (Hd) 为0.386±0.020, 群体平均核苷酸差异数 (K) 为0.515。由此可见, 贵妃鸡群体单倍型多样度和群体核苷酸多样性均不高。对贵妃鸡30个群体mtDNA Cyt b 基因全序列进行中性检验的Tajima′s D值为-1.620 49, 差异不显著, 符合中性突变。

2.3 贵妃鸡 mtDNA Cyt b基因单倍型的NJ分子系统树

从GenBank中获得红色原鸡、绿色原鸡、灰原鸡、来航鸡、白洛克、丝羽乌骨鸡等mtDNA D-loop区序列, 利用MEGA5.0软件构建NJ分子系统树, 见图2。同时构建无根 (MP) 树以及非加权组平均法 (UPGMA) 树, 得到的拓扑结构一致。

由图2可知:所有个体被分成3个分支, 贵妃鸡的所有单倍型及来航鸡、白洛克和丝羽乌骨鸡均与红色原鸡聚为1个分支, 同时在红色原鸡这个大的分支内部, 贵妃鸡的H1～H3单倍型与红色原鸡、来航鸡、白洛克在同一分支上, H4和H5单倍型相对独立, 可以认为贵妃鸡起源于红色原鸡, 而且贵妃鸡有多个母系起源。

3 讨论

Cyt b基因是线粒体13个蛋白质编码基因中结构和线粒体功能研究得最清楚的基因之一, 且进化速度适中, 适合用于种群水平差异的检测[10]。由于线粒体Cyt b基因相对于D-loop 环更保守, 因此线粒体Cyt b标记的研究结果显示:测定贵妃鸡共30个个体, 经人工矫正和拼接后获得贵妃鸡mtDNA Cyt b全基因序列 (约1 143 bp) , 共发现4个变异位点, 这一结果与杨志松等[11]报道的石鸡 (106个样本共发现2个变异位点) 相比较, 变异位点较丰富, 约占分析位点总数的0.04%, 其中没有缺失和插入, 均为转换, 未发生颠换。

贵妃鸡mtDNA Cyt b全基因序列共编码381个氨基酸;发生在密码子1st 的多态位点有1个, 2nd 的有1个, 3rd的有2个, 与刘文娟等[12]报道的雉鸡线粒体Cyt b基因的变异位点多集中在第3密码子的结果一致。研究还发现, 测定贵妃鸡30条序列, 共获得5 种单倍型。其中, Hd为0.386±0.020, 贵妃鸡Pi为0.000 45, K为0.515。由图2可知:贵妃鸡群体单倍型多样度和群体核苷酸多样性均不高, 这与刘文娟等[12]报道的雉鸡甘肃亚种的种群遗传结果基本相同。

由图2可知:所有个体被分成3个分支, 其中贵妃鸡的H4和H5单倍型各自独立在1个分支上;H1～H3单倍型与红色原鸡在1个大分支上, 并且可以看出贵妃鸡所有个体起源于红色原鸡。由此可知, 贵妃鸡虽然是由欧洲等国家野生驯化而来, 但它也共同起源于红色原鸡。另外, 聚在1个分支上的个体间的亲缘关系最近, 均由共同祖先进化而来, 但它们之间的进化又显得相对独立。今后, 可通过增加贵妃鸡养殖地区和培育品种来源采样区域, 进一步研究贵妃鸡起源和培育过程, 探索是否有新的区域存在杂交现象及其遗传多样性是怎样变化的, 同时拟揭示一些反映在进化上的新问题以供对贵妃鸡进行进一步研究。

摘要：为了利用线粒体细胞色素b (Cyt b) 基因全序列分析贵妃鸡的遗传多样性, 试验采用PCR和直接测序法分析贵妃鸡的种群遗传结构, 共获得了30个样本的线粒体Cyt b基因全长 (约1 143 bp) 序列。结果发现:4个变异位点, 界定了5种单倍型, 无插入、缺失和颠换, 并且变异位点多发生在密码子的第2位点;贵妃鸡群体核苷酸多样度 (Pi) 为0.000 45, 单倍型变异度 (Hd) 为0.386±0.020, 群体平均核苷酸差异数 (K) 为0.515;由邻接法 (NJ) 分子系统树可知, 贵妃鸡所有个体均起源于红色原鸡。

关键词：线粒体细胞色素b (Cytb) 基因,贵妃鸡,遗传多样性,单倍型

参考文献

[1]张亚平.从DNA序列到物种树[J].动物学研究, 1996, 17 (3) :247-252.

[2]MINDELL D P.Avian moiecuiar evolution syst mallcsr[M].San Di-ego:Callforman Acadenuc Press, 1997.

[3]向余劲攻, 杨岚, 张亚平.白腹锦鸡和红腹锦鸡的遗传分化[J].遗传, 2000, 22 (4) :225-228.

[4]MORITZ C, DOWLNG T E, BROWN W M.Evolution of animalmitochondrial DNA:relevance for population biology and system atics[J].Anna Rev Ecol Syst, 1987, 18:269-292.

[5]吴婵, 李敬瑞, 李辉, 等.贵妃鸡生长发育性状的测定与分析[J].广东农业科学, 2010 (16) :96-98.

[6]肖喜东, 顾洁, 郑季, 等.贵妃鸡的饲养管理[J].河南畜牧兽医, 2002, 23 (1) :42-43.

[7]吴婵, 李辉, 李敬瑞, 等.贵妃鸡体尺及屠宰性状的测定与相关分析[J].河南农业科学, 2011, 40 (11) :148-151.

[8]ROZAS J, SANCHEZ-DELBARRIO J C, MESSEGUER X, et al.DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and othermethods[J].Bioinformatics, 2003, 19 (18) :2496-2497.

[9]TAMURA K, DUDLEY J, NEI M, et al.MEGA4:Molecular evolu-tionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].Mol BiolEvol, 2007, 24 (8) :1596-1599.

[10]GRAY M W.Origin and evolution of mitochondrial DNA[J].AnnuRev Cell Biol, 1989, 5:25-50.

[11]杨志松, 刘迺发.基于细胞色素b基因研究两种石鸡的渐渗杂交[J].重庆师范大学学报, 2009, 10 (26) :33-37.

细胞线粒体 篇7

线粒体DNA( mitochondrial DNA,mt DNA) 为核外基因, 由于大体上呈进化中性、分子小、结构简单、演化速度快、 母系遗传、无重组、检测方便等,而被作为有效的分子标记广泛应用于鱼类进化生物学和群体遗传学研究中[7,8]。 mt DNA基因组内不同的区域进化速度存在差异,适合不同水平的进化研究。线粒体细胞色素b( Cytochrome b,Cyt b) 基因因其结构和功能在mt DNA的13个蛋白质编码基因中被了解得最为清楚,其进化速度适中,在一定的进化尺度内不受饱和效应的影响,且易为保守引物扩增,已被许多研究证明适合应用于鱼类的种内遗传差异和不同的科、属、 种的系统发生关系研究[9,10,11,12,13,14]。而一般认为在线粒体基因组中控制区( control region,D-loop) 变异速率是最快的,因此D-loop被认为相对线粒体Cyt b等编码基因,更适于种内或近缘种水平群体遗传结构及系统进化分析[7,15,16,17,18,19,20]。因此, 结合线粒体Cyt b和D-loop 2种分子序列标记研究鱼类种内的遗传变异 和不同的 科、属、种的系统 进化关系 更可靠[21,22]。

该研究以滁州鲫为对象,通过分析其线粒体Cyt b基因和D-loop序列,结合Gen Bank数据库中其他鲫属鱼类的同源序列进行系统进化分析,旨在为滁州鲫遗传背景的研究及种质资源的保护和合理利用提供基础资料。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用滁州鲫采自安徽省滁州市水产所滁州鲫原种场,彭泽鲫( C. auratus in Pengze) 采自安徽农科院水产所鲫鱼试验基地。随机选取14尾滁州鲫和4尾彭泽鲫鲜活鱼个体,解剖取其背部肌肉保存于无水乙醇中备用。

1.2总DNA的提取、PCR扩增与测序

采用天根生化科技( 北京) 有限公司的普通动物基因组提取试剂盒( Universal Genomic DNA Extraction Kit) ,按照提示的操作步骤提取总DNA。

目的片段的扩增采用常规PCR法。Cyt b扩增引物为L14724和H15915[9]。下载鲫( Carassius auratus) 线粒体全基因组序列( Gen Bank登录号AB111951) ,设计D-loop扩增引物为La: GGACAA ATCGCATCCGTCCT; Ha: TTCGCACTGTTCCTTGTTCTC。PCR反应体系为10 × Taq Buffer 5. 0 μL, Mg Cl2( 25 mmol·L- 1) 4 μL,d NTP( 10 mmol·L- 1) 4. 0 μL,引物1和2( 10 mmol·L- 1) 各2 μL,模板DNA( 50 ~ 100 ng· L- 1) 2 μL,Taq DNA酶( 5 U·μL- 1) 0. 3 μL,灭菌超纯水30. 7 μL,总体积为50 μL。扩增程序为94 ℃ 预变性5 min; 然后在94 ℃ 变性35 s、53 ℃ ( Cyt b) 或51 ℃ ( D-loop) 退火45 s、72 ℃ 延伸1 min,共35个循环; 最后在72 ℃ 延伸8 min。

每次PCR反应均设不含模板DNA的空白对照。扩增产物经1% 的琼脂糖凝胶电泳检测后,委托上海生工生物工程有限公司纯化并双向测序,测序引物与同扩增引物。

1.3序列分析与系统进化树构建

结合Chromas、Seaview[23]和Clustal X[24]软件对相关序列进行比对、拼接,并经人工 校对。采用MEGA 4. 0软件[25]计算序列的碱基组成,并将蛋白质编码基因核苷酸序列转化为氨基酸序列。

为了探讨滁州鲫在鲫属鱼类中的系统进化关系,从Gen Bank数据库下载下列鱼类的Cyt b基因和D-loop区全序列,包括方正鲫( C. auratus gibelio in Fangzheng) 、淇河鲫 ( C. aurutus in Qihe River) 、日本银鲫( C. auratus langsdorfi) 、 日本白鲫( C. auratus cuvieri) 、鲫( C. auratus auratus) 、黑鲫 ( C. carassius) 和鲤( Cyprinus carpio haematopterus) ,序列登录号依次 为JF496198、 KJ476998、 NC002079、 AB045144、 AB11195、NC006291和NC018037。以鲤为外类群,结合试验中滁州鲫和彭泽鲫的线粒体数据,采用MEGA 4. 0软件的邻接法 ( neighbor-joining,NJ) 和最大简 约法 ( maximum parsimony,MP) 构建分子系统进化树,置信度( bootstrap) 均经1 000次重复抽样检验。

2结果与分析

2.1序列分析

经整理后得到长度为1 141 bp的线粒体Cyt b基因全序列和长度为924 bp的D-loop全序列,且所有同源序列核苷酸全部一致,没有多态位点。Cyt b基因全序列包含起始密码子ATG,终止密码则是在转录成mRNA时在3'端的T碱基上加上AA而形成TAA终止密码子,共编码380个氨基酸。

序列碱基组成见表1。Cyt b基因中T、C、A和G的平均含量分别为29. 2% 、27. 8% 、28. 5% 和14. 5% ; D-loop序列的T、C、A和G含量分别为33. 2% 、20. 1% 、32. 6% 和14. 1% 。2种序列中A + T含量( 57. 7% ,65. 8% ) 均明显大于G + C含量( 42. 3% ,34. 2% ) ,G含量显著低于其他3种碱基。这种明显的AT偏好和很强的反G偏倚是许多脊椎动物线粒体基因的共同特征[26,27]。而在密码子不同位次上碱基组成差异也很大,Cyt b基因的密码子第1至第3位, 4种碱基组成从第1位的均衡到第2、第3位上碱基T或A含量的偏高 ( > 40% ) ,而碱基G的含量则 逐渐降低 ( 24. 9% > 13. 2% > 5. 3% ) 。

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2.2线粒体D-loop序列结构

参考已研究鱼类的线粒体控制区结构[28,29,30,31],以tRNAPro终点作为控制区的起点,以tRNA-Phe的起点作为控制区的终点,以扩展的保守序列CSB-F、CSB1的起点分别作为终止序列区 ( extended termination associated sequence domain,ETAS) 、中央保守区 ( central conserved sequence domain,CD) 和保守序列区( conserved sequence blocks domain, CSB) 的分界线分析鲫属鱼类线粒体控制区序列结构。结果显示: 鲫属鱼类线粒 体控制区 结构与已 研究生物 相似, ETAS( 左区) 、CD和CSB( 右区) 和保守序列区 ( 右区) ( 图1) 。

由于ETAS包含与DNA复制终止相关的序列元件TAS, 线粒体主要的变异一般出现在该区域,故将这部分序列进行分析。鲫属鱼类的终止序列区的长度不一致: 淇河鲫和彭泽鲫为251 bp,日本银鲫为250 bp,其余为252 bp,均没有明显的重复、长片段的插入和缺失。该区T、C、A和G含量分别为34. 4% 、17. 6% 、37. 3% 和10. 7% ,共有31个核苷酸替换位点,6个核苷酸插入/缺失位点,包括1个位点既有替 换又包含 插入 /缺失,核苷酸变 异率约为14. 3% 。核心序列为TACAT的TAS在淇河鲫、日本白鲫发现3个,其余鲫属鱼类均发现4个; 1个TAS的反向互补序列( ATGTA) 也被发现,因此确定鲫属鱼类的ETAS序列为TACATATATGTATTATCACCATATCATTA-TTAACC( “ - ”表示发生变异的碱基,即转换、颠换或缺失) 。另外,还发现1或2个核心序列为TGCAT的TAS。

CD被认为是控制区中最为保守的区域。方正鲫、彭泽鲫和日本白鲫的该区序列长度为320 bp; 其余鲫属鱼类为319 bp。该区T、C、A和G含量分别为34. 7% 、17. 9% 、 28. 3% 和19. 1% ,共有28个核苷酸替换位点,1个核苷酸插入/缺失位点,核苷酸变异率约为9. 1% 。该区从5'端至3'端依次包括CSB-F( 关键序列ATGTAGTAAGA-ACCACC) 、 CSB-E( 关键序列TGAT-GAATCA-GGACA-) 和CSB-D ( 关键序列TTATACTGGCATCTG) 3个关键保守序列,同时还有一些短的保守重复序列,包括TCAT( 2个) 、GCAT( 3个) 、 TTCC( 2个) 。

CSB中淇河鲫长度为353 bp,其余鲫属鱼类均为352 bp,该区T、 C、 A和G含量分别 为30. 0% 、 24. 9% 、 33. 3% 和11. 8% ,共有22个核苷酸替换位点和1个核苷酸插入/缺失位点( 变异率约为6. 5% ) 。该区包括保守序列CSB-1、CSB-2、CSB-3和复制相关启动子序列。这些保守序列的一般形式分别 为CSB-1: ATATAAATGAATTATCGTAAGACATA,CSB-2: CAAACCCCC-TACCCCC, CSB-3: TGTCAAACCCCGAAA CCA。

2.3序列相似性和系统进化树

用BLAST分析了滁州鲫与下载的鲫属鱼类及鲤的Cyt b基因和D-loop序列相似性 ( 表2 ) 。结果显示,这些鱼类间均具有较高的序列相似性。滁州鲫与其他鲫属鱼类线粒体Cyt b基因长度序列的相似率在93% ~ 100% ,包括鲤在内的所有序列的长度均为1 141 bp。其中滁州鲫与方正鲫A系、D系均具有完全相同的序列,相似率高达100% ; 与日本白鲫( AB045144) 具有最低的序列相似性( 93% ) 。 滁州鲫与其他鲫属鱼类线粒体D-loop区的序列相似率在94% ~ 99% ,滁州鲫与方正银鲫间也具有最高的的序列相似率( 99% ) ; 而与日本银鲫( AB045144) 具有最低的序列相似性( 94% ) 。滁州鲫与鲤的序列相似率为88% ( Cyt b) 、 89% ( D-loop) 。

滁州鲫相关分子系统进化树分别见图2。综合2种序列的分析结果表明,滁州鲫与中国银鲫类群亲缘关系较近,尤其与方正鲫的亲缘关系最近,而与来自日本的鲫类群间亲缘关系较远。

* . 相同的核苷酸位点; - . 缺失位点; 中央保守序列( CSB-F,CSB-E,CSB-D) 和保守序列( CSB-1 ,CSB-2 ,CSB-3 ) 用下划线表示; 终止相关序列( TAS) 和其反向互补序列( ATGTA) 用阴影表示; 短小重复序列用方框表示; 删除线表示启动子序列* . the same base site; - . gaps required for alignment; the conserved blocks ( CSB-F,CSB-E,CSB-D) in central conserved sequence domain and conserved sequence blocks ( CSB1 ,CSB2 ,CSB3 ) in conserved sequence blocks domain are underlined; TAS motifs ( TACAT) and palindromic motifs ( ATGTA) are shadowed; short repeated sequences are framed; promoters are indicated with strikethroughs.

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a,c 为 NJ 树; b,d 为 MP 树; 节点数字表示支持率a and c are NJ-trees; b and d are MP-trees; node numbers are bootstrap values.

3讨论

3.1序列组成与控制区结构

线粒体基因组的特性使其已成为进化生物学和群体遗传学研究中重要的分子标记[7,8]。目前,研究最多的是Cyt b、12S rRNA、16S rRNA、COI基因和D-loop区。线粒体不同基因的进化速率存在差异,一般认为D-loop区进化速度最快,Cyt b基因的进化速度适中[7,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]。该研究获得了滁州鲫的线粒体Cyt b( 1 141 bp) 基因和D-loop区( 924 bp) 全序列。试验结果显示14个个体的2种线粒体核苷酸序列在滁州鲫群体内均表现出高度的一致性,没有任何碱基差异。 由于采用线粒体Cyt b基因和D-loop区全序列均没有检测出遗传差异,说明该研究所用的滁州鲫群体遗传多样性较差。 滁州鲫2种序列的碱基组成均符合脊椎动物线粒体“高A + T含量、低G + C含量及G含量最低 ”的组成特征[26,27]。 尤其在Cyt b基因三位密码子的不同位置上,4种碱基的含量具有更加不平衡的特性。Cyt b基因的密码子第1至第3位,4种碱基组成从第1位的均衡到第2、第3位上碱基T或A含量的偏高( > 40% ) ,而碱基G的含量表现出越来越低的趋势( 24. 9% > 13. 2% > 5. 3% ) 。

线粒体DNA控制区的主要功能与线粒体DNA的复制、 终止、转录相关。通过比对其他鱼类识别了滁州鲫mt DNA控制区的主要结构,包括扩展的ETAS、CD和CSB 3个区域。鲫属鱼类中ETAS变异最大,其序列变异率为14. 3% , 大于CD( 9. 1% ) 和CSB( 6. 5% ) 。ETAS还富含A和T,A + T的含量高 达71. 7% , 明显大于CD ( 63% ) 和ETAS ( 63. 4% ) 的A + T含量。滁州鲫包含与DNA复制终止相关序列TAS或扩展的ETAS在许多鱼类中大致相同,识别了1个终止相关序列ETAS和若干个TACAT或TGCAT的重复。 刘焕章[28]认为由于很多类群中ETAS的拷贝数只有1个, 因此一般情况下只有1个ETAS行使功能,其他的是复制的结果,不行使功能。

3.2系统进化关系

经过与鲫属鱼类中方正鲫、淇河鲫、日本银鲫、日本白鲫、鲫及黑鲫的同源序列相比较显示,滁州鲫与它们均具有高度的序列相似性。滁州鲫与这些鲫属鱼类基于线粒体Cyt b基因的序列相似率为93% ~ 100% ,基于D-loop区的序列相似率为94% ~ 99% 。2种线粒体序列中,滁州鲫与方正鲫均具有最高的序列相似率( 100% ,99% ) 。同时, 基于线粒体Cyt b和D-loop区2种序列共4种分子系统进化树结果一致表明,虽然滁州鲫与彭泽鲫均来自于长江水系, 且与彭泽鲫、淇河鲫地理分布上相距较近,远远小于滁州鲫与方正鲫间的地理距离,但滁州鲫与来自黑龙江水系的方正鲫却具有最近的亲缘关系。这与姚纪花等[5]、凌武海等[6]的研究结果相一致。马明发等[32]比较研究了滁州鲫、 方正鲫和彭泽鲫3种群银鲫的形态特征,结果发现滁州鲫与方正鲫在形态上也较滁州鲫与彭泽鲫间更相近。由于鲫种在中国分布极其广泛,各水域群体间在形态、体色、倍性和生殖方式上存在差异,一些地方种群还常有二倍体与三倍体共存的情况,再加上鲫属鱼类的分布受人为影响较大以及从鲫种中选育出的金鱼在各地方的扩散,使鲫属鱼类尤其是鲫种的遗传背景更加的复杂[33,34]。鲫不同地理群体间这种遗传上的亲缘关系与其地理距离、水系格局不相一致的现象可能是历史上人类主动或被动引种的结果,但进一步的证据还需要更深入的研究。

细胞线粒体 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

健康纯系雄性SD大鼠40只,质量250 g左右(泸州医学院动物科提供,Ⅰ级动物,许可证号:川实动管质第17号);Annexin V-FITC和PI细胞凋亡检测试剂盒(Beckman公司);JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(Biovision公司);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司),Trizol(美国MRC公司);Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(立陶宛MBI公司);EPICS-XL型流式细胞仪(美国Beckman公司);FTC2000实时荧光定量基因扩增仪(加拿大FUNGLYN公司)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型建立

参考文献方法[3],以血糖持续一周≥16.9 mmol/L为造模成功。(1)一般指标:测进食量、饮水量、尿量等,每周测体重1次,取材前1d再测体重。(2)血糖测定:造模后3 d及第1、4和8周采尾血测空腹血糖,取材前再测血糖1次。

1.2.2 胃肠动力学指标

造模成功10周,两组大鼠禁食不禁水24 h,将1 mg/mL的美蓝溶液0.4 mL经口胃管灌入,30 min后处死大鼠:(1)取全胃,将胃内残留物用4 mL生理盐水冲洗并收集冲洗液,低速离心机3 500 r/min,离心15 min,取上清液,用722分光光度计在640 nm波长检测吸光度值(OD)。大鼠胃排空情况用胃内色素的残留率表示,胃内色素残留率=测定管OD值/标准管OD值×100%。

1.2.3 流式细胞术

取胃体部平滑肌,机械与胶原酶消化混合法获单细胞悬液,调整细胞悬液密度为1×106/mL。Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡率。JC-1荧光检测线粒体膜电位(△φm)。△φm正常时,JC-1以聚合物形式在线粒体内,发红色荧光,被FL-2(PI)通道纪录;△φm降低时,JC-1以单体形式留在胞浆内,发绿色荧光,被FL-1(FITC)通道纪录。

1.2.4 荧光定量RT-PCR检测ANT1

mRNA(1)取材:取胃体部平滑肌组织,每块1 cm3,迅速至-196℃液氮冻存。(2)引物设计合成及染料:从Genbank中调出ANT的c DNA序列,根据引物设计原则,上游引物序列为5'-TAGGCAATAGCATAA-GAGCGGC-3',下游引物序列为5'-GTCCAGTGGGT AGACGAAGC-3'。引物由四川大学华西分子遗传实验室合成。(3)组织总RNA的提取:按照RNA抽提试剂盒的操作步骤,取冻存大鼠胃平滑肌组织50 mg提取总RNA,并制备cDNA。(4)荧光定量RT-PCR法检测胃平滑肌细胞ANT mRNA。经过最后循环后,用PCR扩增仪自带软件进行荧光定量分析,并计算出△ct值。荧光定量RT-PCR结果使用比较阈值法进行定量分析,其计算方法是:目的基因相对量=2-△△Ct,Ct值是热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数,△△Ct=实验组△Ct(目的基因Ct-管家基因Ct)-对照组△Ct(目的基因Ct-管家基因Ct)。

1.2.5 免疫组织化学检测Cyt C

取胃体部组织常规石蜡包埋、切片,免疫组织化学步骤参考说明书。Cyt C阳性结果判断:胞质着棕黄(褐)色。每组取10个标本,每个标本3张切片,显微数码照像,image-proplus5.0软件计算阳性细胞百分率。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 14.0软件包进行分析,计量资料以均数±标准差表示,各组均数间比较采用t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 动物一般情况

对照组一般状况良好;模型组于造模后3 d开始出现多饮、多食及多尿,至10周时模型组体重明显低于对照组(t=12.097,P<0.01),见附表。

2.2 血糖浓度测定

造模3 d后,模型组空腹血糖始终维持在16.7mmol/L以上,对照组低于7 mmol/L(t=43.434,P<0.01),见附表。

2.3 胃内色素残留率

模型组大鼠胃内美蓝残留率明显高于对照组,(53.49±4.33)vs(38.96±4.97),t=7.733,P<0.01。

2.4 细胞凋亡率测定

模型组胃SMC凋亡率显著高于对照组,(11.32±2.84)%vs(2.27±0.81)%,t=9.699,P<0.01,见图1。

2.5 线粒体膜电位(△φm)

与对照组相比,模型组红荧光强度显著减少,(3.169±0.519)vs(1.706±0.331),t=7.509,P<0.01);绿荧光强度显著增加,(2.529±0.084)vs(2.790±0.115),t=5.768,P<0.01)。

2.6 ANT mRNA测定

用比较阈值法进行半定量分析,模型组大鼠胃平滑肌细胞的线粒体ANT mRNA含量是对照组的2倍,见图2。

2.7 Cyt C表达测定

模型组Cyt C阳性细胞百分率显著高于对照组,(18.20±5.09)%vs(5.10±2.77)%,t=7.145,P<0.05)。

3 讨论

本实验造模10周后检测糖尿病大鼠胃排空减弱,证实糖尿病胃轻瘫造模成功。DGP确切发病机制尚未完全阐明,目前认为与神经病变、胃肠道Cajal间质细胞(ICC)缺失或病理损害、微血管病变和微循环障碍等因素有关。近年来大量研究发现,糖尿病可致不同部位细胞凋亡。糖尿病可致大鼠视网膜神经元凋亡增加[4,5]。糖尿病大鼠心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病变中扮演重要角色[6]。糖尿病可导致大鼠肾小管细胞凋亡增加[3]。前期研究及本实验均显示,糖尿病可致大鼠胃SMC凋亡增加,后者则引起正常SMC数量减少,进而减弱胃运动,可见凋亡导致的胃平滑肌损伤可能参与了DGP的发生。目前认为,凋亡主要信号通路是死亡受体信号通路和线粒体信号通路[7]。线粒体通路是20世纪后期提出的。1996年,有学者[8]发现Cyt C具有激活caspase的作用,为线粒体参与凋亡提供了直接证据。目前,已逐渐认识到线粒体是细胞凋亡的“中心执行者”[9]。