组织RNA提取

2024-05-23

组织RNA提取（共7篇）

组织RNA提取篇1

哺乳动物组织样品RNA的抽提

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

关键词：抽提样品哺乳动物组织样品RNA 哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

一、实验材料：

Trizol试剂（Invitrogen公司）

研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可；

二、具体过程：

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

3、研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2-3ml Trizol试剂。由于此时研钵很冷，Trizol加入后会冻结成固体状。可以继续研磨此固体成粉末，随着研钵温度回升到室温，固体状的 Trizol逐步回复到液体状态，此时，若发现液体很粘，研杵能牵起丝状物，说明Trizol的量太少，需在此步继续补加Trizol。若 Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。

4、把此Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5min。

5、再把Trizol试剂转移到1.5ml离心管中，后续可以按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在生物冰（低于15℃即可）邮寄给我们，由我们来完成后续的抽提过程。说明：

1、研磨，匀浆过程中使用过的器具放入八四消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜，洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后，180℃烘烤4小时以备下次使用。

2、此方法看上去过程虽然比较繁琐，但得到的RNA质量好，抽提的RNA量比其他方法要高，比如米粒大的胃镜标本平均能提出约10 g总RNA，足够做一张人22K全基因组芯片了。得到的RNA的电泳检测图片如图7。

3、另外在我们的工作中，接触到一些用户在取了组织后，马上冻到-70℃冰箱来保存，然后提取RNA做反转录，这样的样品中RNA往往有较大的降解，用来做一些基因的RT-PCR还可以，但若做芯片工作就不行了。要尽量先液氮速冻。

组织RNA提取篇2

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为成熟番茄果实。RNA提取时所用的试验器材和药品均为RNase-Free。

1.2 提取方法

1.2.1 Trizol法。

取1 g新鲜组织, 在液氮中充分研磨成粉末状, 加入1 mL的RNAisoReagent匀浆, 室温静置5 min;加入1/5体积的氯仿, 振荡摇匀, 室温静置5 min;12 000 g、4℃离心15 min;将上清液转移至新的离心管中, 加入与上清液等体积的异丙醇混匀, 室温静置10 min;12 000 g、4℃离心10min;向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗;12 000 g、4℃离心5min;弃上清, 保留沉淀并干燥;加DEPC-H2O溶解沉淀。

1.2.2 CTAB-LiCl法。

取1 g新鲜组织, 在液氮中充分研磨成粉末状, 将磨好的粉末迅速转移至65℃预热的含有700μL CTAB提取液的离心管中, 立即涡旋振荡, 使其混匀;置于65℃水浴中20 min, 5 min混匀1次;待冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇, 涡旋振荡, 4℃、12 000 r/min离心10min;取上清液, 加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡, 4℃、12 000 r/min离心15 min;将上清转移到一新的离心管中, 加入1/3体积的8 moL/L LiCl, 使其终浓度为2 moL/L, 4℃沉淀2 h以上;4℃、12 000 r/min离心10 min, 弃上清;用75%乙醇洗沉淀, 室温晾干, 加DEPC-H2O溶解沉淀。

2 结果与分析

2.1 番茄果实总RNA的提取

将2种方法提取的番茄果实总RNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳, 由图1可知, CTAB-LiCl法提取的RNA (样1～3) 在点样孔下方均有明显的亮带, 说明该方法提取的RNA有较多的基因组DNA污染;28S rRNA的亮度不到18S rRNA的2倍, 说明RNA降解程度较大;5S rRNA条带较Trizol法明显, 而且伴随有其他条带出现。在Trizol提取的RNA中, 28S rRNA和18S rRNA条带清晰, 28S rRNA的亮度基本为18S rRNA的2倍, 表明提取的RNA很少降解;样5、样6基本无基因组DNA污染, 样4中有DNA污染。2种方法都需要进一步在Dnase的处理下得到纯的RNA。

注:1～3为CTAB-LiCl法提取的RNA, 4～6为Trizol法提取的RNA。

2.2 cDNA的合成及完整性检测

将2种方法提取的RNA反转录成cDNA作为模板, 并在番茄actin引物的作用下进行PCR反应, 结果见图2。由图2可知, 同条件下Trizol法提取的RNA actin条带 (样2) 较CTAB-LiCl法提取的RNA actin条带 (样1) 亮且清晰, 可以满足RT-PCR的需要。

注:M为marker。

3 结论与讨论

植物成熟组织中RNA的提取有一定的难度, 组织中杂蛋白的去除等都对RNA的得率和质量有一定的影响[3]。在进行cDNA文库建立及后续分子生物学试验研究中, 高质量RNA的获得非常重要。番茄果实在成熟后, 次级代谢产物增多, 在研磨后果实内的酚类物质很容易被氧化, 并能与RNA稳定结合影响RNA的提取[4], 要得到高质量的RNA有一定的难度。

本试验比较了2种番茄果实总RNA的提取方法效果, CTAB-LiCl提取法简便, 操作简单, 但操作时间长, 总RNA的得率不高且降解度很大, 不利于下一步试验的进行;Trizol提取法可在常温下操作, 方法简便, 花费时间短, 从总RNA得率和提取质量上看, 能够满足大部分下游操作的要求, 但试剂的价格相对偏高。在试验操作过程中所有的试验器材都要经过严格的处理, 这2种方法都有一定的DNA污染, 仍需对Trizol提取法进行一定的改进[5,6], 从而得到纯度更高、无基因组DNA污染的RNA。

参考文献

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[2]王天奎, 尚增振, 邹志荣, 等.一种从番茄果实中提取总RNA用于cDNA-AFLP分析的方法[J].西北农业学报, 2009, 18 (5) :290-293.

[3]李大志, 邓子牛, 熊兴耀, 等.番茄组织总RNA提取方法研究[J].湖南农业大学学报:自然科学版, 2007, 33 (5) :572-575.

[4]李宏, 王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报, 1999 (1) :36-39.

[5]梅晓宏, 高红岩, 罗云波.提取猕猴桃果实总RNA的新方法[J].中国食品学报, 2007, 7 (3) :55-57.

组织RNA提取篇3

关键词油棕；果实；RNA ；提取

分类号 S564+.6

A Suitable Method of RNA Extraction from Different Oil Palm Tissues

LI Jing WANG Yong YANG Yaodong LEI Xintao XIAO Yong XIA Wei

（Coconut Research Institute / Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， CATAS，

Wenchang， Hainan 571339）

Abstract High quality of RNA is the important prerequisite and guarantee to basic research related to oil palm fruit development in molecular biology. RNA extracting effects of both Trizol reagents and MRIP （Methods for RNA Isolation from Palms） method developed by our laboratory previously were compared among four oil palm tissues， i.e. mature mesocarp， endosperm， embryo and germinated plumule. MRIP can get good quality RNA.The RNA content of plumule is as high as 2 139.0 ng/μL， while that of endosperm is only 1 083.6 ng/μL. MRIP is generally better than Trizol method in respect of the integrality， content and purity of extracted RNA， which Suitable for oil palm and palm plants RNA extraction.

Keywords Oil palm ； Fruit ； RNA ； Extraction

果实发育特性研究是油棕种质资源鉴定评价及品种改良的重要环节，而油棕果实含有大量的色素、油脂、多糖、多酚等成分，尤其是成熟果肉和种子胚乳中均含约50%的脂肪酸，其RNA提取难度较大。而纯度高、完整性好、无DNA或其他杂质污染的RNA是cDNA文库构建、基因克隆、Northern杂交和mRNA差异显示等分子生物学研究的基础。目前提取植物RNA的方法有很多，如CTAB法、Trizol法等，针对植物材料的不同，提取方法也不同，有的侧重清除多糖、多酚的污染，有的侧重清除水溶性化合物与RNA的共沉淀[1]。其中Invitrogen公司的Trizol试剂在快速提取植物RNA方面应用广泛，在拟南芥[2-4]等植物组织中的提取效果也相对较好。对于油棕等生长在热带地区的木本油料植物，其果实RNA提取不仅要考虑油脂、多糖、多酚等的影响，还要防止氧化降解。本研究以油棕成熟果肉、胚乳、胚和胚芽4种组织为材料，对比了Trizol试剂和本研究室创制的棕榈科植物RNA提取方法（MRIP， Methods for RNA Isolation from Palms）[5]提取各组织总RNA的效果，以期筛选出快速、有效的提取油棕不同组织RNA的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料来自中国热带农业科学院椰子研究所油棕种质圃中的4年生油棕树。分别取成熟油棕果的果肉、胚乳、胚以及组织培养15 d的胚芽等4种组织，新鲜样品用液氮速冻备用。

相关塑料制品均用0.1% DEPC水溶液浸泡10 h以上并经高温高压灭菌，玻璃、陶瓷及金属制品均以200℃高温烘烤8 h以上，以保证无RNAase污染。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取方法

分别采用Invitrogen公司的Trizol试剂和MRIP法提取RNA。Trizol试剂提取法按产品说明书进行。MRIP提取方法如下：称取0.1 g样品用液氮研磨至细粉末状，加入到已含有1 mL裂解液的2 mL离心管中，震荡混匀后，静置10 min；加入200 μL氯仿，充分混匀后，静置10 min；以4℃，10 000 r/min离心10 min；吸取上清液至新的1.5 mL离心管中，加等体积的冰异丙醇，颠倒混匀后，静置10 min；以4℃，10 000 r/min离心10 min；去上清后加1 mL 70%的乙醇，放置10 min；以4℃，7 500 r/min离心5 min；去上清，用无菌风吹5～10 min后，加入20 μL去RNA酶的无菌水，用枪头吸打混匀后备用。

1.2.2 RNA检测方法

采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带的完整性：分别取5 μL的RNA与1 μL的溴酚蓝混合后点样，以120 V、80 A电泳20 min后用凝胶成像系统检测；分别取1 μL样品用NanoDrop核酸测定仪检测RNA的浓度和纯度。

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1.2.3 cDNA第一链合成

取MRIP法提取的果肉、胚乳、胚芽和胚的RNA进行cDNA第一链合成，方法参照Fermentas的反转录试剂盒。取5 μL的mRNA与1 μL的Oligo（dT）18混合后加入6 μL去RNA酶的无菌水，混合后于60℃下变性5 min，迅速置于冰水混合物中5 min；在混合液中加入4 μL buffer、1 μL逆转录酶、2 μL 10 mmol/L的dNTP和1 μLRNA酶抑制剂，总体积为20 μL；于42℃ 放置1 h，72℃灭活5 min。反应结束后将产物置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 内参基因PCR检测

以内参基因eIF为特异性引物，对果肉、胚乳、胚芽和胚等4种组织的cDNA进行PCR扩增。引物序列为：eIF1F：5′CCTCACCTATACTCTTCCCACCA3′；eIF1R：5′GTCATCGCCCAGGCACAG3′。20 μL反应体系中包含2 μL模版cDNA，2 μL 10×PCR Buffer，1 μL正向引物，1 μL反向引物，0.4 μL dNTP MIX，0.4 μL Taq酶（5U/μL），其余体积用13.2 μL的灭菌 ddH2O补足。PCR反应程序为：94℃预变性5 min； 94℃ 变性30 s，56℃ 复性30 s，72℃ 延伸30 s，共35个循环；72℃延伸5 min。反应结束后取7 μL PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 RNA完整性

由图1可以看出，Trizol法和MRIP提取的油棕不同组织RNA中，均是MRIP提取效果较好，条带更亮，且28S基本没有降解，其亮度约为18S的2倍，表明RNA的质量好。而Trizol法所提取的RNA中，28S、18S条带很弱，且5S条带较亮，说明降解比较严重。胚和胚芽是幼嫩组织，其所含的RNA量更高，因此电泳条带更亮，而胚乳中所含的总RNA的量较低。

2.2 RNA浓度和纯度

由表1可见，虽然2种方法均可提取到不同组织的总RNA，但是MRIP法所提取的总RNA在浓度和质量上明显优于Trizol法，且RNA得率几乎是Trizol的2倍。其中胚芽中所提取到的RNA浓度更高，可达到2 139.0 ng/μL；其次是胚（2 086.1 ng/μL）；果肉中也较高（1 954.3 ng/μL）；胚乳中所含的总RNA浓度相对较低，仅为1 083.6 ng/μL。A260/280值是评价样品纯度的，其比值在1.8到2.0之间说明RNA的纯度较高。采用MRIP法提取的总RNA A260/280值均在1.80以上，而采用Trizol法提取的总RNA A260/280均值不到1.8，表明Trizol法提取的RNA纯度较低。以上结果表明MRIP法比Trizol法更适用于提取油棕各组织的总RNA，可以得到质量及产量均更高的RNA样品。

2.3 内参基因扩增结果

本试验以内参基因eIF特异引物对MRIP法所提取的4种油棕组织RNA进行RT-PCR扩增。获得大小为250 bp的特异条带。由图2可以看出，胚乳的扩增条带不太亮，可能是提取产量较低的缘故，但仍可满足后续试验的要求；其余3种组织的扩增条带清晰、边缘整齐且亮度强，说明MRIP法提取的油棕果肉、胚芽和胚的RNA质量完好并具有很好的生物活性，大可满足后续试验要求。

3 讨论与结论

RNA提取是进行基因表达、cDNA文库构建、RNA-Seq等实验必不可少的步骤，而完整的、纯度较高的RNA是保证实验顺利完成的主要因素。从油棕中提取高质量的RNA是保证其分子生物学研究的关键。本试验表明，用MRIP法提取油棕4种组织RNA比较快速，只需1.5～2 h。虽然Trizol法也比较快速，但是其提取效果与MRIP相比较差。此外虽然杨光华等[6]比较了SDS和CTAB法提取椰子叶片和根部的RNA的效果，发现CTAB法较SDS法更好一点，但是Xiao等[5]对比了CTAB法与MRIP法提取椰子等植物RNA的效果，发现MRIP法省时省力，且RNA的得率和纯度都较高。在本研究中发现，采用MRIP法提取得到的油棕不同组织的RNA完整性好、纯度高，表明此法比Trizol法和CTAB法更适用于提取油棕等棕榈科植物的RNA。

目前提取植物RNA的方法有很多种。不同的植物（例如草本植物和木本植物）以及同一植物的不同组织，由于组织部位、发育成熟度等差异其内含物组分及含量都有一定的差异[7]。叶片和果实的RNA提取方法也不相同，这主要是由于不同组织所含的多糖、多酚及碳水化合物不同，故提取方法的侧重点也不一样。例如张玲等[8]对比了6种RNA提取方法，最终发现CTAB氯化锂法提取的RNA得率和纯度更高。姚世响等[9]采用Invitrogen Trizol法提取的灰绿藜RNA完整性较好，经mRNA纯化后可成功用于抑制消减文库的构建。袁贞等[10]采用Trizol法提取了番木瓜果实总RNA，结果发现所提取的RNA完整性好，受多糖、多酚影响较小，且无DNA和蛋白质污染。吴凯朝等[11]利用Trizol改良法提取了甘蔗、水稻、玉米等3种禾本科作物不同组织的RNA，提取效果良好。Trizol法虽然适用于提取以上物种RNA，却不适用于椰子。Xiao等[5]对比了CTAB、天根的RNA植物提取试剂盒、Trizol试剂和MRIP等4种方法提取椰子叶片RNA的效果，发现MRIP法提取的叶片总RNA的纯度和得率均优于另外3种方法。在本实验中也得到同样的结果，用MRIP法提取油棕果肉等各组织RNA的效果优于Trizol法。说明MRIP法适用于提取椰子和油棕不同组织的RNA，这为以后提取槟榔、海枣、蒲葵等棕榈科植物RNA提供参考。

本试验结果也存在不足之处，例如在表1中可以看到，MRIP法提取的RNA的A260/230值偏低，均在2以下。A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，可根据其值的大小判断样品中污染物存在的情况，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230应小于2.2大于2.0。一般A260/230小于2.0说明RNA样品中可能存在其他干扰物质（如萜类化合物等次生代谢物）；A260/230大于2.0说明RNA水解为单核酸。本试验所提取的不同组织RNA其A260/230均在2以下，说明其RNA样品中还存在一定的干扰物质；此外，从图1中可以看到，点样孔附近有亮带，说明其含有多糖和蛋白质等杂质。

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笔者分析了油棕各组织的成分，发现油棕胚乳、果肉、胚、胚芽中富含脂肪酸、多糖、多酚等物质，这些物质与RNA结合在一起，使结果很难得到完整纯净的RNA。Sangha等[12]采用改良CTAB法和二氧化硅过滤柱法，从富含脂肪酸、多糖、蛋白等的麻风树种子中提取得到完整的RNA，其A260/230达到1.91。孙德权等[13]对传统的Trizol操作步骤进行优化，即加入10%的PVPP与材料共研磨，并在Trizol提取液中加入1% β-巯基乙醇，可以完全排除酚类物质、色素等杂质的干扰。刘海等[14]通过在裂解液中加入聚乙烯吡咯烷酮去除多酚类化合物及利用水饱和乙醚去除多糖的方法，在香蕉果实中提取到了完整性较好的RNA。笔者认为MRIP法应该借鉴前人的研究成果，改进裂解液的配方（例如添加抗氧化成分PVPP等），完善提取步骤，以便在棕榈科植物不同组织中提取更完整、纯度更高的RNA。

参考文献

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[10] 袁贞，沈文涛，周鹏. 番木瓜果实总 RNA提取方法比较[J]. 广东农业科学，2008（10）：76-79.

[11] 吴凯朝，黄诚梅，李杨瑞，等. Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总RNA[J]. 南方农业学报，2012，43（12）：1 934-1 939.

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[14] 刘海，林德球，徐杰，等. 一种适合于富含多糖和酚类物质的香蕉果实RNA提取方法[J]. 果树学报，2006，23（1）：136-137.

组织RNA提取篇4

何首乌总RNA提取方法的比较及改进

目的:探讨不同提取方法对提取何首乌总RNA的`质量影响,寻找适于何首乌成熟叶组织RNA的提取方法.方法:以何首乌成熟叶组织为材料,采用SDS/酸酚法、常规CTAB法及改良的TRIzol试剂法分别进行实验,并对所提取RNA的质量进行验证.结果:采用3种方法都能提取出RNA,但质量差异较大.其中改良的TRIzol试剂法能有效抑制次生物质的影响,提取的RNA产量可达70～110μg/g,纯度高于其他2种方法,D260nm/D280nm值为1.85～1.97.结论:改良的TRIzol试剂法操作简便,提取的RNA完整性和纯度较高,可以满足下一步实验的要求.

作者：谭雪梅申彦晶严萍赵树进 TAN Xue-Mei SHEN Yan-Jing YAN Ping ZHAO Shu-Jin 作者单位：谭雪梅,申彦晶,严萍,TAN Xue-Mei,SHEN Yan-Jing,YAN Ping(华南理工大学,生物科学与工程学院,广东,广州,510640)

赵树进,ZHAO Shu-Jin(广州军区广州总医院药学部,广东,广州,510010)

刊名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 19(3) 分类号：Q522 关键词：何首乌 RNA提取次生物质 RT-PCR

全蛋白提取组织裂解液配方篇5

10% Triton X-100

Triton X-100 蒸馏水

10ml 90ml

混合后37℃-40℃水浴中2-3hr，使其充分混匀

10% 去氧胆酸纳

去氧胆酸纳蒸馏水避光保存

200mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氯)

PMSF

174.2mg 5ml

1g 10ml

异丙醇

分装，-20℃保存

100mmol/L EDTA

EDTA

372.24mg 10ml

蒸馏水

1mg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)

亮抑酶肽蒸馏水

2mg 2ml

分装，-20℃保存

1mg/mL 抑蛋白酶肽(Aprotinin)

抑蛋白酶肽蒸馏水

2mg 2ml

分装，-20℃保存

1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)

胃蛋白酶抑制剂甲醇

2mg 2ml

分装，-20℃保存

2. 工作液

Tris-base (50mmol/L，pH 7.4)：

Tris-base NaCl

605mg 900mg 75ml

蒸馏水

用HCl调整pH值为7.4

10% Triton X-100 10% 去氧胆酸纳 100mmol/L EDTA 用前加入：

1mg/mL亮抑酶肽 1mg/mL 抑蛋白酶肽

100?l 100?l 100?l 500?l

10mL 2.5mL 1mL

1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂 200mmol/L PMSF

各成分的终浓度

Tris-base

50mmol/L，pH 7.4 1% 0.25% 150mmol/L 1 mmol/L 1?g/mL 1?g/mL 1?g/mL 1mmol/L

Triton X-100 去氧胆酸纳 NaCl EDTA

亮抑酶肽

抑蛋白酶肽

狗尾草总RNA提取方法研究篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料:狗尾草新鲜叶片。试剂与仪器:QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒、液氮、研钵、离心机、电泳仪。

1.2 试验方法

称取新鲜狗尾草叶片组织不超过100 mg, 在预冷的研钵中研磨成细粉, 转移到2 mL EP管中。 (1) 待液氮挥发完毕, 在样品未解冻状态下加入450 mL提取缓冲液RLT, 立即剧烈震荡, 充分涡旋。注意RLT应加入1/100体积的14.5Mβ-巯基乙醇, 该过程也可在56℃温育1～3 min; (2) 将裂解液全部转移到淡紫色柱子中, 全速离心2 min, 小心吸取上清至新管中。注意该步中裂解液被均质化, 细胞碎片、蛋白质等大分子物质吸附在柱膜上, 小分子在上清中, 故应小心吸取上清, 勿吸到沉淀; (3) 在新管中加入1/2样液体积的无水乙醇, 立即吹打混合。将混合后的约650μL样液, 包括形成的所有沉淀转移到粉红色管中, 轻柔的盖上离心管盖子, ≥10 000 r/min, 离心15 s, 弃掉下清液; (4) 向粉红色管中加入350μL RW1缓冲液, ≥10 000 r/min, 离心15 s, 冲洗离心柱, 弃下清; (5) 向粉红色管中加入700μL RW1缓冲液, ≥10 000 r/min, 离心15 s, 冲洗离心柱, 弃下清; (6) 将离心柱转移到一新的2 mL收集管上, 加入500μL RPE液, ≥10 000r/min离心15 s。弃去管内液体, 重复使用收集管。注意:试剂盒提供浓缩的RPE洗脱液, 使用前必须加入4倍体积的96%～100%乙醇; (7) 向柱中加入500μLRPE液, ≥10 000 r/min离心2 min, 冲洗滤膜, 干燥离心柱, 弃掉下清液。注意该步需保证无乙醇残留, 否则影响后面的试验; (8) 将吸附柱放入新的1.5 mL回收管中, 加入30～50μL的RNase-free water到柱中, ≥10 000 r/min离心1 min, 释放RNA。注意若RNA产量在20μg以上, 用30～50μL无RNase水再洗脱1次。RNA样品存于-20℃或-80℃冰箱; (9) 用高精度无需比色皿分光光度计测定RNA的含量;琼脂糖凝胶电泳检测[1,2,3]。

2 结果与分析

采用高精度无需比色皿分光光度计测定RNA的含量, QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取的狗尾草RNA含量为6 080 ng/μL, Trizol法提取的狗尾草RNA含量为1 004ng/μL。由图1可以看出, 1、2泳道的条带比后面泳道的条带要亮, 且少有降解。由此表明, 用QIAGEN RNeasy Plant Min试剂盒提取简单植物组织RNA确实比较有效。

3 结论与讨论

通过对比2种方法提取出的RNA产量和纯度, 发现用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取简单植物组织RNA确实比Trizol法有效。该方法是通过裂解液裂解细胞, 该裂解液含有RNase抑制剂, 不含有氯仿、苯酚等有毒物质。通过离心分离细胞碎片, 过淡紫色柱子过滤出多糖及蛋白质, 分离出RNA与DNA结合相, 继而通过粉红色柱吸附RNA, 对RNA和DNA进行分离, 达到抽提RNA的目的。该方法添加去多糖多酚代谢产物的成分, 在一定程度上提高了RNA的产量, 较Trizol法避免在多糖多酚下对DNA和RNA分离的干扰。另外, 由于DNA和RNA同时结合在柱膜上, 所以除去DNA也是一个要点[4,5,6]。

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组织RNA提取篇7

关键词：人参；根；叶片；总RNA；提取方法；反转录酶

中图分类号： S567.5+10.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0034-04

人参为五加科人参属植物，素有“东北三宝”的美誉，人参皂苷为人参的主要药效成分，具有较好的抗肿瘤、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制细胞凋亡等药理活性 [1-3]，目前人们已经从人参中分离到了约90个人参皂苷单体 [4-5]。人参皂苷的含量是判断人参质量的主要标准，但是目前对人参功能基因和次生代谢生物合成途径的研究相对较少，人参皂苷的产率较低，次生代谢产物人参皂苷尚未实现人工合成，对于一些含量甚微的单体皂苷的新药开发还较为困难 [6]。人参皂苷的生物合成途径与功能基因表达量之间的关系仍处于探究阶段 [7]，因此深入了解人参皂苷的生物合成途径及其调控机理，并在分子水平上实现人参皂苷的人工合成，这是利用生物技术手段大量生产人参皂苷的必要前提。

为了探究人参皂苷生物合成途径与功能基因表达量之间的关系，首要的问题是提取完整性好、纯度高的总RNA。由于植物细胞组成成分复杂多样，使得植物组织总RNA的提取难于其他生物材料。成熟的人参组织中含有大量的酚类、糖类，人参组织的研磨过程破坏了酚类物质与多酚氧化酶的平衡分布，酚类极易被氧化成醌，并易与RNA分子发生不可逆结合，产生褐化反应 [8]，从而影响RNA的提取，导致RNA的产量、质量较差。本研究比较了7种提取人参根、叶片总RNA的方法，筛选出适合提取人参根、叶片总RNA的提取方法，并用该方法提取出完整性好、纯度高的总RNA。反转录可以检测提取的总RNA质量，反转录酶的不同直接决定反转录效果，本试验比较了3种反转录酶对总RNA的转录情况，筛选出转录效果较好的方法，为人参皂苷合成途径中功能基因的克隆与功能研究奠定了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

五年生人参取自吉林省抚松县抚南林场（42°03′06″N，127°33′21″E，海拔903 m），用刀将根部切成小块，放入冻存管迅速用液氮冷冻，于-80 ℃保存待用，叶片进行同样处理，试验所用部位为人参根、叶片。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒（TaKaRa，大连）；多糖多酚植物总 RNA快速提取试剂盒、RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒（BioTeke，长春）；RNeasy Plant Mini 试剂盒（Qiagen，德国）；EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱，北京）；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、PrimeScript Reverse Transcriptase 2个反转录试剂盒（TaKaRa，大连）；GoScript TM Reverse Transcription System反转录试剂盒（Promega，北京）；异硫氰酸胍；DEPC（焦磷酸二乙酯）；CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa，大连）；生化试剂酚、三氯甲烷、异戊醇等均为国产分析纯。试验中所用的塑料制品如 Eppendorf 管、枪头等均为RNase free制品，玻璃器皿、研钵等于180 ℃干热灭菌8 h。

1.2.2 仪器 ND 2000超微量核酸蛋白测定仪（德国K&A公司）；Eppendorf Mastercycler nexus PCR仪（西班牙Cene Amp）；DYY-8C琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）；GIS-2010凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；HC-2518R 高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；MDF-382E超低温冰箱（日本SANYO）等。

1.3 总RNA提取

1.3.1 改良CTAB法 [9] 取约100 mg材料，加液氮研磨成粉后转移至预冷的1.5 mL离心管中，加入10×质量浓度的 CTAB（临用时加入1% β-巯基乙醇），充分悬浮，于65 ℃水浴10 min；加入等体积三氯甲烷 ∶ 异戊醇（体积比=24 ∶ 1），轻轻混匀，14 000 r/min 离心10 min；取上清，加入等体积三氯甲烷 ∶ 异戊醇（体积比=24 ∶ 1），轻轻混匀，14 000 r/min 离心10 min；取上清，加入1/4体积3 mol/L LiCl，-80 ℃ 放置2 h；从冰箱中取出，[JP2]待液体在冰上溶解，于4 ℃、14 000 r/min 离心10 min；弃上清，加入适量TE，沉淀溶解混匀后，于4 ℃、14 000 r/min离心10 min；取上清，加入等体积饱和酚，充分混匀，于室温、14 000 r/min 下离心10 min；取上清，加入等体积酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇（体积比=25 ∶ 24 ∶ 1），充分混匀，于室温、14 000 r/min下离心10 min；取上清，加入等体积三氯甲烷 ∶ 异戊醇（体积比=24 ∶ 1），充分混匀，于室温、14 000 r/min下离心10 min；取上清，加入1/4体积LiCl，于 -80 ℃ 放置2 h；从冰箱中取出，待液体在冰上溶解，于4 ℃、14 000 r/min 下离心15 min；弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，于4 ℃、14 000 r/min下离心10 min；弃上清，待乙醇挥发后加入40 μL灭菌的DEPC水溶解沉淀，将所得的RNA溶液于 -80 ℃ 保存。

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1.3.2 酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法取100 mg材料，加液氮研磨成粉，将粉末状组织转移至装有1 mL变性溶液D（在293 mL水中加入250 g异硫氰酸胍、17.6 mL 0.75 mol/L 柠檬酸钠、26.4 mL 10%十二烷基肌氨酸钠溶液，在可加热的磁力搅拌器上于65 ℃下搅拌，直到所有成分溶解后于室温存放）的[JP2]Eppendorf管中，在1 mL溶液D中按顺序加入0.1 mL 2 mol/L 乙酸钠（pH值4.0）、1 mL苯酚、0.2 mL三氯甲烷 ∶ 异戊醇=49 ∶ 1，盖紧离心管，颠倒数次，充分混匀；漩涡振荡器上剧烈振荡10 s，然后将离心管于冰上放置15 min，于 4 ℃、9 000 r/min 下离心20 min；取上清，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20 ℃放置至少1 h，于4 ℃、9 000 r/min下离心 30 min；小心将异丙醇倒掉，第1步中每用1 mL溶液D，就用0.3 mL溶液D；将溶液转移到1个离心管中漩涡振荡，加入等体积的异丙醇，于-20 ℃放置至少1 h；于4 ℃、12 000 r/min 下离心10 min，用 75%乙醇洗涤沉淀2次，再次离心，用移液器吸去残留的乙醇，将离心管敞口在工作台上放置数分钟，使乙醇挥发；加入40 μL DEPC处理过的水，将RNA溶液于-80 ℃保存。

1.3.3 相关试剂盒的操作 Takara MiniBEST总RNA提取试剂盒、多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒、RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒、EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒、RNeasy Plant Mini 试剂盒的操作分别参照相应的说明书进行。

1.4 总RNA质量的检测

1.4.1 总RNA完整性的检测取5 μL从上述方法中提取的总RNA样品，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，180 V 恒压 10 min，于凝胶成像仪中成像，在紫外灯下观察RNA条带，并照相记录。

1.4.2 总RNA纯度与产率检测取2 μL用以上方法提取的总RNA样品，于ND2000超微量核酸蛋白测定仪上检测，记录总RNA浓度值、D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，并计算产率。

1.5 cDNA的合成

Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒、PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒的操作均参照相应的试剂盒说明书进行。

1.6 cDNA的检测

用PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒、GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒对RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒提取的根总RNA进行反转录，得到cDNA [10]。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：7.4 μL 去离子水，10 μL 2×Taq PCR Mix，各0.8 μL上、下游引物，1 μL模板RNA 。反应程序：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min。取4 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳上检测。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳总RNA完整性检测

由图1可见，用不同方法从人参根部、叶片提取的总RNA中，除改良CTAB法、酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法没有清晰的条带，其余方法均可见28S、18S等2条电泳条带。与其他几种方法相比，RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒法提取的根部、叶片总RNA条带清晰明亮、稳定，28S条带的宽度约为18S的2倍，说明该方法提取的总RNA质量较高、完整性较好。酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取的根部总RNA电泳结果中基本上没有看到RNA条带，而这2种方法提取的人参叶片总RNA电泳图谱的亮度较弱，获得率较低，有明显的DNA、蛋白污染；Takara MiniBEST总RNA提取试剂盒法图谱条带亮度较弱、获得率低，存在蛋白污染，但是它对DNA的消除较彻底；多糖多酚植物总RNA快[CM（25]速提取试剂盒法图谱较为清晰、明显拖带，有明显的

降解现象，对多酚多糖的消除效果较好；EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒法图谱模糊、明显拖带，存在DNA、蛋白污染，有明显的RNA降解现象；RNeasy Plant Mini 试剂盒法图谱较为清晰、明显拖带，存在DNA污染，有明显的RNA降解现象。

2.2 总RNA纯度检测

将用TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒、多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒、EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒、RNeasy Plant Mini 试剂盒、RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒、酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取的总RNA在超微量核酸蛋白检测仪上检测，结果如表1所示。

当D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0时，D260 nm/D230 nm值接近2.0，表明RNA样品较纯净。由表1可见，用TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒、多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒、EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒、RNeasy Plant Mini 试剂盒、酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取的根或叶片总 RNA D260 nm/D280 nm值都有接近20[JP2]的。TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒、EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒提取的叶片以及改良CTAB 法提取的根总RNA D260 nm/D280 nm的值≥2.2，说明有核苷酸降解。

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RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒提取的根、叶片总RNA D260 nm/D280 nm分别为187、2.02，在1.8～2.0之间，说明可以去除蛋白质和酚类物质的干扰。用 RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒提取的根、叶片总RNA D260 nm/D230 nm分别为2.06、1.88，用RNeasy Plant Mini 试剂盒提取的叶片总RNA D260 nm/D230 nm为212，接近2.0，说明RNA纯度高，不存在多糖、蛋白质、酚类物质等杂质。而其余方法提取的根、叶片总RNA D260 nm/D230 nm均低于2.0，说明受到基因组DNA的干扰，不能有效地去除其中的萜类化合物等次生代谢物，这与电泳结果相符。

TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒、多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒、EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒、酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法5种方法获得的根、叶片总RNA浓度都较低（表1），RNeasy Plant Mini 试剂盒、RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒获得的根、叶片总RNA浓度相对较高，用RNeasy Plant Mini 试剂盒提取，获得根、叶片的浓度分别为117.8、170.4 ng/μL，而RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒获得的根、叶片产率分别为351.8、287.4 ng/μL（表1）。后者浓度之所以相对较高是因为它独有的裂解液可以有效地消除基因组污染、稳定性好，而且没有异丙醇、乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱，避免了过去干燥不易溶解的问题，因此其RNA产率相对较高。

2.3 不同反转录酶合成cDNA的检测

以PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒、GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒对RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒提取的人参根总RNA进行反转录得到的cDNA为模板，采用[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]基因的引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

经PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒、GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒对人参根总RNA进行反转录得到cDNA，根据已报道的人参[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]基因设计引物：[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]F，5′-

AAATGGGAAGTTTGGGGGC-3′；[WTBX][STBX]PgSS1 [STBZ]R，5′-GGGTTCTCACTGTTTGTTCAG-3′；在PgSS1基因的引物下进行的PCR均能得到1条碱基数在1 000～2 000 bp之间的片段，且条带清晰；而经GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒反转录的cDNA扩增出的片段亮度明显高于PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒，而且没有拖带现象，证明其专一性比较强，反转录效率较高，但是3种方法得到的cDNA均可用于后续的分子研究。

3 结论与讨论

提取完整性好、纯度高的RNA是进行Northern杂交分析、基因克隆、逆转录PCR（RT-PCR）、建立cDNA文库、基因功能分析等分子生物学研究的关键。本试验通过对几种不同提取人参根、叶片总RNA的方法进行比较，以期找出1种高效、快速且适合提取人参总RNA的方法，为后续的研究提供一定的理论基础和技术经验。

由于人参中含有多糖、酚类的影响，采用改良CTAB法和酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法从人参中提取的总RNA质量不好。随着人参的生长和成熟，多糖、多酚的含量也随之提高，这些都会给人参总RNA的提取及后续试验造成很大的障碍，成熟的人参中含有大量的酚类物质，在有氧的条件下，酚类极易被氧化成醌并易与RNA分子产生不可逆的结合，进而干扰RNA的提取过程 [11-12]。RNase 是一种核酸内切酶，对RNA有水解作用，但对DNA不起作用，RNase非常稳定，在试验中研磨破碎细胞的过程中，内源RNase会造成RNA的酶解；试验过程中操作的速度、手法对RNA的降解也较严重。因此，无论是内源RNase还是外源RNase都会使提取的RNA发生降解，它是导致RNA降解最主要的物质，给试验带来很大的困难 [13]。人参中还含有较多的多糖、蛋白质，而多糖的结构与 RNA相近，很难将它们分离开，所以在去除多糖的同时RNA也会被带走，造成RNA产量下降 [14]，而在沉淀RNA时，可能形成多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA很难溶于水，或溶解后产生黏稠状溶液，而且多糖抑制了许多酶的活性，因此人参根的含糖量比叶片高，所以同种方法提取的叶片RNA明显好于根 [15]。蛋白质对RNA的污染也是一个重要因素，因而要获得高质量的 RNA就要尽可能地去除蛋白质，在沉淀蛋白质环节中尽量不要吸附到沉淀，因为污染了多糖、蛋白质的RNA样品很难用于进一步的分子生物学研究。

本试验采用酸性-异硫氰酸胍-三氯甲烷法、改良CTAB法提取人参根、叶片的总RNA质量较差，而TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒的提取过程中加有DNase1消化，有效地去除了基因组DNA的干扰，多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒可有效地去除多糖多酚对RNA的影响，EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒独有的DNA消除柱可有效地去除基因组DNA的干扰，RNeasy Plant Mini 试剂盒使用了硅基质膜，以增强对RNA的吸附能力。以上方法虽然能得到完整性较好的RNA，但含有的杂质较多，并且降解较多，说明其不适用于人参材料总RNA的提取。而 RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒简单、便捷，其独有的裂解液可有效地裂解组织液，使其得到纯度高、完整性好、产率高的总RNA，是提取人参材料总RNA比较理想的方法。本试验比较了PrimeScript Reverse Transcriptase试剂盒、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒、GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒对人参根总RNA反转录得到 cDNA 的效果，结果表明，GoScript TM Reverse Transcription System试剂盒对RNA的反转录效果较好，比较适用于人参根部材料，为后续分子试验奠定了一定的理论基础。

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