红色走读调查报告（通用4篇）
红色走读调查报告 篇1
我们的“激扬青春探寻红色初心，走读历史领略传统文化”红色走读团队横幅于清晨在“映山红”广场拉开，跟随着党旗，我们出发啦！
为深入学习贯彻党的十九大和习近平总书记系列重要讲话精神，深化“两学一做”学习教育，让广大学子实地体会老一辈革命先烈的艰苦奋战历程，切实增强“四个意识”，改进学风，真切实地接受红色教育。是传承红色基因的摇篮，是激发广大党员干部永葆革命青春的加油站，更是我们心之向往的地方——井冈山。
在“映山红”广场集合后，10个人的队伍，我们身着正装，前往了我们的目的地。
经过了40多分钟的公交车程，我们终于到达了主要打卡的第一站，坐落于中国革命摇篮井冈山茨坪风景区内的“井冈山革命博物馆”。
井冈山革命博物馆，是中国第一个地方性革命史类博物馆，主要担负井冈山革命斗争历史陈列展览、宣传井冈山精神、管理保护井冈山革命纪念地旧居遗址等职责。在参观了朱德题名手稿，钟步全的党徽，王佐的青龙剑，横街合作社印，党会的记录本等展览品之后，更是切实的了解道路井冈山斗争史和感悟到了井冈山精神，并对开展革命传统和爱国主义教育的活动带着愈发浓烈的情感。
“红米饭那个南瓜汤哟咳罗咳，挖野菜那个也当粮罗咳罗咳！”耳熟能详的歌词，自然是我们必不可少的尝试。在午饭时分，我们特意尝试红米饭和南瓜汤。加工出来的大米都非常粗糙，难以下咽。但是为了革命之火，可以燎原，红军战士们开始把红米饭当做主食。吃红米饭，喝南瓜汤，追忆革命先烈的足迹，才懂得今天的幸福生活来之不易！致敬革命先烈，牢记井冈精神。
在饭桌上忆苦思甜之后，我们悠悠转下，欣赏这雄伟壮丽的瀑布景观。沿着石砌小道盘旋而下，一路斑驳的岩石像是在诉说着历史的沧桑感。山间的风声仿佛在呢喃着一首首红色歌谣，思绪纷飞，龙潭景区坐落在井冈山北面，黄洋界南麓，距茨坪7公里。这是一个以群瀑集聚为显著特色的景区，素有“五潭十八瀑”之称。
井冈山龙潭瀑布的壮丽之景，回想着当年红军在此所走所看的心境定是不同，没有这么悠闲的心境，有的只是为党和人民大无畏的牺牲和坚定的理想信念，这一片红色的故事更是感动并激励着一代又一代人。此刻心中多了一份敬畏之心，感谢那些为我们奉献青春与生命的革命烈士。
在夜幕即将降临之际，我们也来到了这一天的最后一站，井冈山革命烈士陵园。陵园于1987年始建，同年10月建成并开放参观游览。1997年10月，由邓小平题字的“井冈山革命烈士纪念碑”落成剪彩。陵园整体建筑包括陵园门庭、纪念堂、碑林、雕像园、纪念碑五大部分。每一部分都显得庄重而肃穆。庄严无比的纪念堂，与远山错落的碑林，每一尊都栩栩如生的雕像园，在肃然起敬时，又感悟到了先烈们艰苦朴素，不畏牺牲的光荣传统和不息的革命斗争精神。
在休整了一晚之后，我们决定穿过茫茫大雾，去看那巍峨的五指峰，但是可惜的是，在登顶之后，不见高山，只见云烟雾海。虽然在上山之前，可能会预料到这样的情况，但我们依然觉得向上，有些悻悻，但上山时，互帮互助的团队精神，不放弃，坚持不懈的精神，不都也是井冈精神嘛。
下山之后，我们直接奔赴前往了小井中国红军第四军医院旧址，1928年5月，毛泽东、朱德两支部队在井冈山胜利会师后，在井冈山的大小五井，建立了取名叫“红军医院”的后方医院。
在听闻了小井中国红军第四军医院旧址的先烈事迹之后。先烈们倒下后，隐蔽在深山密林里的井冈山群众冒着生命危险，将他们的遗体掩埋在这块稻田中。在这，不禁更加肃然起敬，在面对木屋时，先烈们虽然已逝去，但艰苦卓绝的品性，忠贞不屈、誓死如归的意志却留在旧址中每一处斑驳的岁月痕迹中。
既然上了井冈山，那必然少不了的就是“黄洋界”。黄洋界位于井冈山市西北面，海拔1343米，是当年井冈山通往宁冈、湖南的要隘，也是井冈山斗争时期红军修建的五大哨口之一；
汽车沿环山公路盘旋而上，公路四周重峦叠幛，绿树成阴，漫山遍野的杜鹃花在绿岭青翠之中泛着闪闪红光……
黄洋界地势雄伟险峻，举目远眺，群山起伏，云雾弥漫，白茫茫如同汪洋大海，而黄洋界就像是大海中的一个孤岛，因此人们把黄洋界叫作“汪洋界”或“望洋界”。由于地形和山谷环流等自然条件的影响，黄洋界气候多变，风大、雾多、云奇。那妖娆的迷雾和翻滚的密云。一眼望去如同奔腾的大海，呈现出群山奔涌、白云填谷的气象，蔚为奇观，让您不觉得是在人间。黄洋界看日出黄洋界是井冈山观日出的极佳地点。这里的日出景象极其壮观。
每一段旅程定有终章，最后，我们来到井冈山山顶的火炬广场。广场的火炬发挥这一平台的红色景观的标志作用，引导和集聚人们开启红色之旅、接受革命传统的洗礼；
要发挥这一平台的展览展示带动作用，探索革命精神在当今时代的传承形式；
这传承红色基因，继承井冈山精神的“弘扬跨越时空的井冈山精神”主题，让“不忘初心、继续前进”有效地落实到行动中。
红色走读调查报告 篇2
1 梁弄镇红色基地现状
梁弄，位于浙东四明山陵，姚江之南，自古就是兵家必争之地，在20世纪40年代，这里也成为全国19块抗日根据地之一的浙东根据地的领导中心，曾有无数仁人志士在这里抛头颅洒热血，留下了10余处红色遗迹，创造了中国共产党带领人民抗日救国、拯救民族危难的光辉历史。岁月易逝，史迹尚存，这些集中保存的大量红色基地，构成了内涵丰富而全面的浙东革命史迹网络，彰显着梁弄镇的历史功绩。
梁弄镇红色基地是回顾我党在浙东地区的的关荣历史、学习先进个人、发扬并传承红色精神的良好载体，自国务院于2004年部署红色旅游项目以来，梁弄镇红色基地的发展速度也相应的提升，但是由于其红色基地大多都远离余姚市区，衣食住行皆有所不便，更由于其展出内容单调，配套设施不够完善等原因制约着梁弄镇红色基地的发展。
2 对现状的调查与分析
本次调查主要以面向游客的问卷调查为主，访谈梁弄镇红色基地相关负责人为辅，调查的主要内容包括梁弄镇红色基地的基本概况、宣传方式、游客组成、整体规划、配套设施和免费开放后的相关情况。本次抽样调查共发放问卷300份，回收问卷257份，问卷回收率为85.7%，其中有效问卷236份，问卷有效率为91.9%。通过对调查资料的收集整理，本文对梁弄镇红色基地发展现状做出以下分析和总结：
2.1 宣传模式
结果显示，大部分游客是通过政府宣传了解到梁弄镇红色基地的，以上数据也说明政府的宣传力度影响着当地红色基地的知名度。实地考察可知，梁弄镇多处张贴和悬挂相关红色基地的宣传标语和横幅。从当地政府营造的浓厚红色氛围可见其狠抓红色文化建设，重视红色文化的宣传。同时梁弄镇红色基地中的多处革命遗址由于其特殊性，一般不会通过广告、广播、报纸等方式对外宣传。表格中有32%的旅客是通过旅行社了解到梁弄镇红色基地的，说明该红色基地管理部门通过加强与旅行社之间的相互联系，实现了互利双赢局面。
2.2 发展策略
“红色”为主，“绿色”为辅，主辅并进
结果显示，梁弄镇红色基地有两大特色吸引游客，其一是由于红色基地蕴含的红色文化和纪念意义。其二，由于红色基地远离余姚市区处在风景宜人的梁弄镇，环境优雅。曾任梁弄镇的党委副书记吴国富同志指出，“只有搞活红色旅游才是梁弄镇红色基地的新出路，像杭州的宋城、绍兴的鲁镇一样。梁弄今后会在开发红色旅游的的基础上，开展‘绿色’旅游。近年来，我们也大力开发了四明湖生态农庄、盆景园等以‘绿色’为主题的景区，力求全面建设一个融革命传统教育与风景旅游揽胜为一体的新型旅游区。”
2.3 整体规划
结果显示，67%的游客认为梁弄镇红色基地景区的整体规划合理，13%的游客认为该景区的整体规划分散。就实地考察而言，该景区由于革命遗址占多数，整体布局规划受到一定的限制，但梁弄镇上几个主要的红色基地相互联系密切，道路及导标设施完善。
2.4 管理与维护
结果显示，超过一半的游客认为梁弄镇红色基地景区内遗址和文物保存完好，3%的游客认为该景区内的遗址和文物保存效果很差。实地考察可知，自从梁弄镇红色基地逐步免费对外开放以来，游客量的急剧增加对该景区内遗址和文物的维护带来很大的压力。讲解员李玲认为，“一方面，我们要逐步更新管理设备，提高相关硬件设备的性能，比如引进现代化的室内电子监控系统等。另一方面，我们讲解员要努力提高自身素质，在引导游客旅游的同时加强他们对景区内遗址和文物的保护意识。”
2.5 游客规模与组成
实地访谈得知，自2004年国务院部署红色旅游以来，梁弄镇的红色旅游得到迅猛发展，尤其在梁弄镇多处红色基地施行“免费不免票”制度后，游客数量急剧增加，游客规模逐渐扩大。游客类型主要集中在中小学生，政府官员以及老一辈革命家。
2.6 配套设施
结果显示，大多数游客对梁弄镇红色基地的配套设施都存在看法，其中最为突出的一项为旅游交通，46%的游客认为景区内的交通状况需要改进，其次分别是旅游饭店、旅游购物、红色基地和旅行社。数据表明，梁弄镇红色基地景区内相关旅游配套设施应该还有较大的提升空间。
3 对梁弄镇红色基地可持续发展的建议
3.1 加强对外宣传
一是借助当地政府宣传部门，坚持行政手段和经济手段并重，充分发挥地方政府和社会各界的积极性。
二是契合国内重要节日庆典，红色基地的客流量总体上呈波浪式发展态势，其高潮主要集中在纪念日前后和黄金周期间，梁弄镇红色基地的发展应该尊重市场规律，适时营造氛围，加大宣传力度。
3.2 丰富旅游项目，增强游客参与性
梁弄镇红色基地应该结合当地环境综合发展，突出以“红色”为主，整合生态基地、民俗文化等特色旅游项目共同发展，综合规划，使各项目之间相互促进，共同繁荣，从而打破该红色基地游客面狭窄的局面，建立可持续发展模式。同时，目前该红色基地的大多红色资源开发简单，以静态观光的内容较多，容易产生视觉疲劳，与市场需求差距较大。对此，该红色基地在开发设计过程中应增强体验，参与，互动等元素的挖掘，充分调动游客积极性，提高对游客的吸引力。
3.3 加强基地管理，提升服务质量
一是优化该红色基地的旅游路线，加强各景点之间的联系，避免游客走“回头路”，提高游客的时间利用率。
二是实现管理设施现代化。建立和完善红色基地的防火防盗等安全系统，标识、导航和监视设备，卫生休息相关设施，进一步实现管理的人性化与现代化。一方面，缓解了旺季员工不足的情况，另一方面也方便游客自助旅游，在降低运营成本同时提高了管理效率。
三是多样化展出方式，丰富讲解内容。多样化的展出方式可以让游客获得更加丰富的视听感受，满足了大部分游客在追求历史真实性的同时也希望利用现代科技手段更为直观的了解史实。同时，导游应针对不同的游客群体选择恰当的讲解方式，也应该结合时政要问、趣味知识等综合阐述自己的讲解内容。
3.4 完善基础配套设施，扩展资金渠道
交通、食宿等基础设施落后一直都是梁弄镇红色基地景区内存在的问题，加之近年来梁弄镇红色旅游的迅猛发展，该景区内基础配套设施的完善速度跟不上旅游业的发展节拍，这已经制约了该景区的的长远发展，因此加强景区的配套设施建设是当务之急。
通过完善配套基础设施，提高了红色基地的宜人性，满足了游客需求。另一方面也扩展了资金的来源渠道，同时为当地居民提供一定的就业岗位。
3.5 总体发展应因地制宜，与时俱进
梁弄镇红色基地的发展应因地制宜，量力而行，要充分利用现有的设施和条件，结合当地环境综合发展，切不可不管环境承载能力大小，一律盲目跟风扩大规模建设。其次，梁弄镇红色基地的发展要与时俱进，对传统历史的内涵应该深度挖掘，将优良传统和时代精神有机结合，在赋予红色基地更为丰富内涵的同时也易于现代大众对于红色精神的接受和吸收。
4 结语
通过对梁弄镇多处红色基地的实地调查，可知该处红色基地的发展状况呈稳步上升趋势，其教育功能、政治功能、文化功能、经济功能均得到较为成功的体现。其中，该基地特别重视把红色基地所弘扬的革命传统、民族精神同加强和改进青少年思想教育工作相结合，对普及周边中小学生的爱国主义教育做出巨大贡献，获得社会各界的一致好评。到现阶段为止，该旧址的整体规划、文物保护、服务质量等板块都深受游客好评。自该旧址的多处红色基地被重新整合规划以来，游客量已经明显提升，待到2010年对外施行免费门票制度以来，客流量得到飞速提升，从而也带动了该红色基地各项配套设施的发展。
参考文献
[1]阎友兵、陈非文、方世敏、刘建平, 2009年全国旅游发展现状调查与思考[A].湘潭大学学报, 2009 (06) .
[2]缪金生, 红色旅游发展讨论[A].现代商贸工业, 2011 (12) .
红色走读调查报告 篇3
1 研究目的和意义
通过对《国家学生体质健康标准》的实施, 正确、合理的对学生进行体质健康状况和锻炼效果的评价, 促进学校在“健康第一”思想指导下的体育课程全面改革, 改变课程结构和教学策略, 纠正和改变学生体质健康状况的突出问题, 培养学生科学锻炼的意识, 激发学生自觉参加体育锻炼, 形成终身进行体育锻炼的理念。
2 研究对象和方法
2.1 测试对象
北京联合大学筛选合格样本:男生958名、女生2299名, 共计3257名走读大学生。
2.2 测试方法
测试项目为六项:包括形态指标 (身高、体重) 、机能指标 (台阶试验、肺活量) 和素质指标 (立定跳远、握力) ;采用大连UOSIM测试系统, 对数据资料进行处理分析。
3 测试结果与分析
3.1 总体评价 (见表1)
从 (表1) 学生测试总分统计结果看, 测试样本在总体上呈现正态分布;良好、及格学生分别占45.59%和45.56%, 优秀学生占8.14%, 而不及格的学生只占0.71%;男生平均分为73.49, 女生平均分值为76.84, 其中男生优秀及良好率各占6.78%和34.66%, 女生的优秀及良好率各占8.70%和50.15%, 女生的总体成绩好于男生, 女生不及格只有9人占总人数的0.39%。
3.2 身体形态 (见表2)
身高是反映人体纵向发育的指标, 也是最直接反映人体形态的指标, 体重是直接反映人体的骨骼、肌肉、脂肪等及内脏器官发育状况的指标。进行身高、体重测量能够直接反映学生生长发育水平, 评价大学生的身体匀称程度和营养状况。
从表2测试结果看, 男生正常体重的占27.77%, 超重或肥胖者占45.51%;女同学正常体重占45.41%, 营养不良或较低体重者占总数的33.32%。从身高标准体重总评价可以看出, 男生超重、肥胖学生人数较多。而肥胖主要受遗传、吃喝太多、运动不足、情绪、饮食、摄食中枢神经障碍、荷尔蒙异常、激素分泌不正常或药物的使用等原因的影响。通过调查学生肥胖原因主要是健身意识、知识淡薄, 学生对体育健身的目的意义、健身方法认识不足。超重或肥胖的学生应科学安排体育锻炼和合理膳食, 以增加肌肉组织, 减少体内多余脂肪。女学生体重过轻、营养不良;究其原因主要有: (1) 与女生的形体审美观有关。目前女生追求形体美, 要有良好的身材, 能够呈现一种曲线美, 受到某些误导, 盲目减肥, 甚至一些正常体重、较低体重的女大学生也实施减肥计划; (2) 大学生的饮食习惯、经济状况、作息制度等因素也影响学生的生长发育和营养状况。这对我们体育工作者是一个急需解决的课题。
3.3 身体机能 (见表3、表4)
身体机能是人体组织器官和各系统表现出的生命活动力, 台阶指数是一项简易评价心血管机能水平高低的指标, 能有效反映学生心血管系统功能, 并间接推断机体的耐力。肺活量是测试学生肺的容积和扩张能力, 它是指人体尽全力深吸气后, 再尽全力呼出的气体总量, 即一次深呼吸的气量, 是呼吸动态过程中的一部分。
从 (表3、表4) 测试结果来看, 学生心肺系统功能处在优良健康状态, 良好优秀率达86.06%;肺活量优良率达到62.48%;证实我校实施特色体育教学中注重安排各种球类及有效的身体素质项目的运动, 改善了学生的心血管系统机能, 有效提高了学生的体质健康水平。但从男生9.08%不及格率来看, 主要是男生体重肥胖影响学生的体质健康水平。
3.4 身体素质 (见表5、6)
(表5) 反映学生握力的综合力量素质, 间接反映健康状况。从结果看, 男女学生的综合力量处于优良的有71.78%, 而男生及格与不及格率达到31.94%、3.44%, 这个测试结果说明男同学的上肢部分缺少练习。我院男学生身体的综合素质, 尤其是上下肢力量、爆发力方面能力有待进一步提高。
立定跳远是测试学生下肢爆发力的项目, 从 (表6) 测试结果分析看, 男女学生的下肢力量素质处于中下水平, 有近42.62%的学生处在及格、不及格的水平上, 尤其男生有近49.37%处于及格水平, 表明我校男学生腿部爆发力还有待提高, 今后在学生自主锻炼和体育教学中, 应加强力量项目的锻炼, 提高下肢力量素质。
综上所述, 学生身高标准体重主要表现出匀称程度较差, 男学生超重、肥胖学生人数较多、比率较大;女学生普遍偏瘦。心血管系统的机能、调节能力, 肺通气量发展与身体形态发展变化相适应, 耐力素质较好, 但是由于男学生体重偏胖较多, 心肺功能指标略有影响;而男学生上、下肢肌肉力量、运动能力水平需进一步发展。预计今后相当长的一段时期内, 学生的体重还有进一步增加的趋势, 肥胖学生的比率也将进一步增加, 超重、肥胖将会成为影响学生体质健康的主要因素之一, 今后在体育教学中应加强这方面的研究。
针对走读大学生: (1) 很多学生早晨起床较晚, 来不及吃早饭便去坐公交车或骑自行车上课;有的起床较早, 没有食欲;有的就索性取消了早饭;有的则在课间饿时随便吃些零食; (2) 暴饮暴食, 晚上回家后, 父母做些“营养价值高”的饭菜来补充一天的营养损失, 加之吃饭时或饭后长时间在电视前、电脑旁静坐; (3) 如今的零食名目繁多, 包装考究, 加之“减肥”思想作怪, 校园出现“零食当正餐”这一现象, 吃零食过量会影响食欲, 妨碍正餐的摄入量, 校园的这种隐性环境成为学生肥胖的催化剂, 从而影响了身体正常功能的发育。
另外学生的膳食失衡在结构方面存在的问题, 首先是学生的畜肉类及油脂消费过多, 谷类食物消费偏低, 膳食营养结构正在向一种不合理、不健康、失衡的方向发展。膳食失衡在能量摄入数量上表现为摄入的热量大大超过身体每日代谢所需的热量。医学研究表明, 肥胖是高血压、糖尿病、冠心病、高血脂症等慢性病的重要危险因素, 而摄入高热量食物过多又是形成肥胖的基础因素。因此, 摄入热量过多是造成体重肥胖的直接成因之一。
4 结论与建议
4.1 结论
生活方式的不规律, 营养膳食失衡造成男学生肥胖、女学生营养不良, 是影响大学生体质健康的一个主要因素, 当前对于走读大学生健康生活行为的教育尤为重要。
影响走读大学生体质的另一个因素是学生握力和立定跳远, 根据教学进度、场地器材和学生的身体素质情况, 有计划地在课内安排一定比例的素质练习。我们认为发展素质、增强体质的教材应占课时的40%左右是比较合理的, 并且应具有很强的针对性, 这对抑制三、四年级身体素质的下滑将会起到积极作用。
4.2 建议
建议学校开展健康教育, 在学生中加强营养卫生教育课, 让学生了解营养与身体发育的重要关系, 培养良好的饮食习惯, 提倡科学合理的营养配餐, 促进身体发育;同时也要讲究营养平衡, 防止男生体重肥胖, 女生营养不良的现象。
培养学生的体育与健康意识, 使学生在思想上正确认识健康的重要性, 建立符合现代社会发展趋势的体质健康的新理念, 增强学生主动参加体育锻炼, 强化学生体育参与意识, 提高健身知识;培养学生对体育运动的爱好, 使学生能够自觉在课内、课外进行体育锻炼, 从运动中得到乐趣, 达到强身健体、娱乐身心的双重目标, 把体育作为生活内容的一部分, 从而形成“终身体育”的意识。
对于体质健康测试不及格的学生, 尤其测试成绩达不到50分的学生开设“体能提高班”。通过体质测试提高课程, 把学生集中到一起强化练习, 有效地锻炼和提升参与者的心肺功能、协调性、腿部力量力、身高体重比值, 有效地提高参与者的肺活量、握力、台阶试验的成绩, 从而保证体质测试顺利过关。
建立“身体健康档案”网络系统, 定期监测与公布学生体质健康状况;开设素质提高课, 结合学生专业及未来职业特点的需要, 使学生掌握与所学专业相适用的运动技能。充分利用社团组织开展有计划的课外体育活动。
红色走读调查报告 篇4
成纤维细胞灶的形成是IPF关键的病理改变,其主要效应细胞是成肌纤维细胞[6]。目前大多数学者认为,损伤的肺泡上皮细胞通过上皮细胞-间质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是肌纤维细胞的主要来源[6]。EMT的过程表现为上皮细胞标志物的消失,转而表达间质细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)[7]。
α-SMA基因表达的异常激活与调控在肺泡上皮细胞向成肌纤维细胞转分化的过程中占有极为重要的地位,在EMT过程中细胞如何启动和调控α-SMA基因的表达尚未明了。为了探讨肺泡上皮α-SMA基因在肺纤维化微环境下的转录激活,本课题组构建了由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告载体,并在肺泡上皮细胞中进行表达和定位。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
人肺泡上皮细胞A549细胞株、大肠杆菌DH5α、VSMp8质粒(含小鼠α-SMA启动子序列)由本校实验室保存;质粒微量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒(优晶公司);红色荧光蛋白报告质粒空载体pDs-Red(Clontech公司);限制性核酸内切酶(宝生物公司);Lipofactine 2000转染试剂(Invitrogen公司);重组人TGF-β1(R&D公司);倒置荧光显微镜(德国Leica公司);凝胶成像系统(美国Kodak公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 α-SMA启动子红色荧光报告载体pDs-Red-SMAp的构建
已知α-SMA启动子区是插入在质粒VSMp8多克隆位点BamHⅠ和sphⅠ之间,用BamHⅠ和sphⅠ内切酶酶切VSMp8得到启动子序列,将其插入pGEM-7Zf质粒的BamHⅠ和sphⅠ位点之间;然后用BamHⅠ和ApaⅠ内切酶酶切再次得到α-SMA启动子序列;继而将启动子序列亚克隆于pDs-Red的BamHⅠ和ApaⅠ位点之间;最终得到重组质粒pDsRed-SMAp。重组子经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定、测序鉴定无误后,扩增备用。
1.2.2 细胞培养
A549细胞株培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,常规培养于5%的CO2、37℃人工培养箱。
1.2.3质粒转染
转染前1天,将A549细胞以1.5×104/mL细胞密度接种于24孔板,待24孔培养板中细胞融合至70%～80%时,依照Lipofectine 2000转染试剂的操作指南进行转染。
1.2.4 实验分组和TGF-β1刺激
实验分为4组,A组:转染对照空载体质粒pDsRed组;B组:转染对照空载体质粒pDsRed+TGF-β1组;C组:转染重组质粒pDsRed-SMAp组;D组:转染重组质粒pDsRed-SMAp+TGF-β1组。需用TGF-β1刺激的组,分别于转染后12 h加入终浓度为10μg/L的TGF-β1刺激4 h,在荧光显微镜下观察细胞内红色荧光蛋白表达。上述实验重复3次。
2 结果
2.1 pDsRed-SMAp重组载体的酶切鉴定
pDsRed-SMAp重组载体经BamHⅠ和ApaⅠ双酶切,凝胶电泳可见切出约4.1 kb和3.7 kb的两个片段,所得酶切片段与设计相符(图1)。
2.2 pDsRed-SMAp重组载体的测序鉴定
经上海生工生物工程有限公司T7通用引物测序,结果与预期序列完全一致,DNA序列和读码框完全正确。
2.3 pDsRed-SMAp红色荧光报告载体在上皮细胞中的表达
A组细胞转染红色荧光蛋白表达空载体质粒pDsRed,在荧光显微镜下该组肺泡细胞中未观察到红色荧光蛋白(图2A)。B组为转染了空载体质粒pDs-Red的细胞在TGF-β1刺激4 h以后,依然不能在荧光显微镜下观察到红色荧光(图2B)。C组细胞是转染α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,在镜下后可见到少量而微弱的红色荧光,但是表达荧光的细胞数量少,细胞呈颗粒状,缺少正常细胞形态(图2C)。D细胞在转染α-SMA启动子红色荧光报告载体12 h后加TGF-β1刺激4 h,在荧光显微镜下则可观察到细胞发出高亮度的红色荧光,表达红色荧光的细胞数量较多,细胞形态呈铺路石状贴壁生长,与正常的肺泡上皮细胞形态一致(图2D)。上述实验共重复3次,结果一致。
3 讨论
传统的观点认为特发性肺纤维化是由慢性炎症引起的,因此予以皮质激素和细胞毒性药物治疗IPF,可以抑制炎症造成的肺组织损伤,从而减轻和治疗肺纤维化[8,9]。但是临床治疗表明,使用糖皮质激素和细胞毒性抗炎治疗对于IPF无明确的疗效,并且许多确诊为IPF的病例中发现其病理组织炎性反应较轻微。近年来的研究表明,IPF的病理改变是由肺泡上皮细胞的损伤造成,反复的损伤刺激导致肺泡上皮细胞转分化为表达α-SMA的成肌纤维细胞,发生EMT。成肌纤维细胞由于其表达间质细胞标志物α-SMA,从而具有了收缩性,并且可以分泌大量的细胞外基质(ECM)沉积在肺组织中,成为IPF的主要效应细胞[10]。
TGF-β被认为是诱导器官纤维化(包括肺纤维化)的“总开关”,是促EMT作用最强的细胞因子,可以启动并完成整个EMT过程[10]。无论是离体实验或在体实验均证实,过表达的TGF-β能促进肺泡上皮细胞转分化,表达间质细胞标志蛋白α-SMA,加重肺纤维化[11,12,13]。因此,深入研究TGF-β诱导作用下上皮细胞α-SMA的分子调控机制对阐明IPF过程中肺泡上皮细胞发生EMT的病理机制非常重要。
红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)是海葵中分离出来的一种生物发光蛋白,能够在紫外线激发下发出红色荧光[14]。而本研究所采用的DsRed是Clontech公司商业化的一种低毒、低寡聚化及成熟快的红色荧光蛋白突变体[15]。由于荧光蛋白基因可以在未受任何损坏的活体细胞中检测其表达,DsRed被广泛地应用于报告基因的研究。报告基因技术是将一段顺式调控序列插入报告基因上游以控制报告基因的表达,从而直观地“报道”该顺式调控序列的表达调控以及与其相关信号转导通路的活动[16]。DsReD具有很高的消光系数和荧光量子产量,用作报告基因具有荧光亮度高的优势;DsReD发射荧光的强度要比罗丹明B等染料和最好的GFP突变体高得多;DsReD具有较强的抵御光漂白的能力;另外,DsReD对pH值不敏感,pH范围4.5～12时仍保持稳定,这使其使用范围更加广泛。同时,DsReD除了可在活体细胞连续观察的优点,较少受到外来荧光干扰,灵敏度与信噪比高[17]。
本研究构建的α-SMA启动子红色荧光报告载体pDsRed-SMAp是将α-SMA启动子序列插入红色荧光报告基因上游,通过紫外线激发检测红色荧光的强弱,从而示踪α-SMA启动子在活体细胞中的活化情况,对启动子的表达调控进行评估。本研究将成功构建的pDsRedSMAp重组质粒在人肺泡上皮细胞内进行转染后发现,在静息的上皮细胞可见到少量而微弱的红色荧光,但是表达荧光的细胞数量少,细胞呈颗粒状,缺少正常细胞形态,因此可以推测这些微弱的荧光并非由活体的上皮细胞发出,有可能是死亡细胞产生的非特异性荧光。说明在肺泡上皮细胞中缺乏α-SMA的表达,与既往研究结果一致。而在1 0 μg/L的TGF-β1刺激4 h后,可在荧光显微镜下观察到由α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白基因高水平表达,发出高亮度的红色荧光,表达红色荧光的细胞数量较多,细胞形态呈铺路石状贴壁生长,与正常的肺泡上皮细胞形态一致。表明在TGF-β1的刺激下诱导了α-SMA启动子活化,所构建的α-SMA启动子驱动的红色荧光报告基因系统具有完整的细胞内功能。
综上所述,本研究成功构建了α-SMA启动子红色荧光报告载体pDsRed-SMAp,具有稳定性好、荧光持续时间长、不破坏细胞结构及直接观察等优点,为研究肺纤维化EMT病理过程中α-SMA的基因调控提供了有效的工具。
摘要：目的 构建α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法 克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子(TGF-β1)刺激的反应。结果 酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论 成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。