β1-防御素（共7篇）
β1-防御素 篇1
牙周炎是一种破坏性疾病, 其主要特征为牙周袋的形成及袋壁的炎症, 可致牙槽骨吸收和牙齿逐渐松动, 它是导致成年人牙齿丧失的主要原因, 也是影响患者牙齿美观的不良因子。对于牙周炎继发错牙合及错牙合伴发牙周炎的患者正畸治疗是较为有效的治疗方法[1], 其可以显著改善患者的综合评估指标, 并对机体的较多的因子有较明显的影响, 因此这些指标也可以作为评估治疗方法有效性的指标[2]。本文中笔者就不同正畸术对牙周炎正畸治疗患者的疗效和龈沟液及血清p21活化激酶5、白细胞介素-1β (IL-1β) 、β-防御素2 (HBD-2) 水平的影响进行观察, 现报道如下:
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2007年1月~2011年3月于我院进行正畸治疗的48例牙周炎患者为研究对象, 将其随机分为A组和B组, 每组各24例。A组的24例患者中, 男10例, 女14例;年龄29~56岁, 平均 (36.3±3.5) 岁;牙齿松动1~2度22例, 3度2例;牙周炎继发错牙合患者9例, 错牙合伴发牙周炎患者15例。B组的24例患者中, 男9例, 女15例;年龄28~56岁, 平均 (36.1±3.6) 岁;牙齿松动1~2度23例, 3度1例;牙周炎继发错牙合患者10例, 错牙合伴发牙周炎患者14例。两组患者各项基本资料比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 治疗方法
A组采用固定矫治器进行治疗, 按照常规的治疗步骤进行矫治治疗, 主要为粘合托槽, 进行弓丝的弯制及调整, 然后进行固定及调牙合。B组采用钢丝结扎联合复合树脂夹板治疗, 采用结扎丝进行结扎, 进行调整及酸蚀处理, 粘结后覆盖复合树脂, 固化光照及抛光等处理, 然后进行后期处理调整。
1.2.2 检测方法
将两组患者的治疗总有效率及治疗前、治疗后1、3个月的牙龈指数 (GI) 、牙周袋深度 (PD) 、牙松动度 (TM) 、龈乳头探诊出血指数 (PBI) 、上颌骨突度 (SNA) 、下颌骨突度 (SNB) 、上、下颌骨间的矢状关系 (ANB) 、龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平进行统计及比较。其中, 血清p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平均取晨起空腹静脉血进行检测, 龈沟液则为搜集当天龈沟液送检, 试剂盒分别为p21活化的激酶5免疫组化试剂盒、人IL-1βELISA试剂盒及人HBD-2酶联免疫分析ELISA试剂盒进行检测。
1.3 评价标准
成功为牙周炎得到控制, 错牙合得到纠正, 咬牙合恢复正常;基本成功为牙周炎状况得到很大程度改善, 咬牙合也基本达到平衡状态;失败为牙周炎和咬牙合等均未得到改善或进一步加重[3]。总有效=成功+基本成功。
1.4 统计学方法
采用SPSS 15.0统计学软件包进行相应的统计学处理, 计量资料数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者治疗总有效率比较
将两组患者治疗总有效率进行比较, A组的治疗总有效率高于B组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:与B组比较, *P<0.05
2.2 两组患者治疗前后GI、PD、TM、PBI、SNA、SNB、ANB水平比较
由表2可见, 治疗前两组患者的GI、PD、TM、PBI、SNA、SNB、ANB水平比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) , 而治疗后1个月及3个月A组的GI、PD、TM、PBI均小于B组, SNA、SNB、ANB改善幅度大于B组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。
2.3 两组患者治疗前后龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平比较
由表3可见, 治疗前两组患者的龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平进行比较, 差异均无统计学意义 (均P>0.05) , 而治疗后1个月及3个月A组的龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β水平低于B组, HBD-2水平高于B组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。
注:与B组同期比较, *P<0.05
3 讨论
牙周炎是侵犯牙龈和牙周组织的慢性炎症, 是一种破坏性疾病, 绝大多数牙周炎患者都伴随着牙龈萎缩的症状, 调查发现, 在45岁以上的人群, 90%以上存在不同程度的牙龈萎缩现象[4], 且其长造成牙齿的错牙合情况, 即需要进行正畸治疗。而另外错牙合并发牙周炎的发生率也较高, 对于符合正畸治疗指征者也建议进行正畸治疗。
以往较多研究显示, 存在牙周炎需要进行正畸治疗的患者往往存在机体中多项评估检测指标的变化, 而这些指标的变化不仅可以反应疾病的存在状态, 也可以对治疗效果的评估起着一定的作用, 可以反应疾病的发展及转归[5]。p21活化激酶5是在牙周炎患者牙周细胞中呈现较高表达状态的一种蛋白, 其参与骨骼重构的过程, 在错牙合患者中呈现特别高的水平状态[6]。IL-1β具有细胞活化的作用, 且具有免疫调节的作用, 其在牙周炎患者中呈现高表达, 与其炎症存在的状态有着较大的相关性。HBD-2则具有免疫防御作用, 在机体的修整变化及重构过程中其一般呈现较低的状态, 反应机体的一种变化状态, 在牙周炎并正畸治疗的患者中其水平逐渐升高, 表示炎症得到控制及治疗的有效性[7]。
注:与B组同期比较, *P<0.05
本文中笔者就固定矫治器与钢丝结扎联合复合树脂夹板对牙周炎正畸治疗患者龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平影响及疗效进行比较, 通过比较发现固定矫治器占据较为明显的优势, 其临床效果突出, 表现在治疗总有效率的提高及GI、PD、TM、PBI、SNA、SNB、ANB等牙周炎和错牙合的疗效评估因子的改善方面, 另外对患者的血清和龈沟液的p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平研究也可以从一个方面反应机体的状态, 对疾病的改善有着积极的明确作用。
综上所述, 笔者认为固定矫治器在牙周炎正畸治疗患者中的综合优势明显, 可显著改善患者的多项评估指标。
摘要：目的:比较不同正畸术对牙周炎正畸治疗患者的疗效和龈沟液及血清p21活化激酶5、白细胞介素-1β (IL-1β) 、β-防御素2 (HBD-2) 水平的影响。方法:选取2007年1月～2011年3月于我院进行正畸治疗的48例牙周炎患者为研究对象, 将其随机分为A组和B组, 每组各24例。A组采用固定矫治器进行治疗, B组采用钢丝结扎联合复合树脂夹板治疗, 统计并比较两组患者的治疗总有效率及治疗前、治疗后1、3个月的牙龈指数 (GI) 、牙周袋深度 (PD) 、牙松动度 (TM) 、龈乳头探诊出血指数 (PBI) 、上颌骨突度 (SNA) 、下颌骨突度 (SNB) 、上、下颌骨间的矢状关系 (ANB) 、龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β、HBD-2水平。结果:A组的治疗总有效率高于B组, 治疗后1、3个月的GI、PD、TM、PBI均小于B组, SNA、SNB、ANB改善幅度大于B组, 龈沟液及血清p21活化激酶5、IL-1β水平低于B组, HBD-2水平高于B组, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) 。结论:固定矫治器在牙周炎正畸治疗患者中的综合优势明显, 可显著改善患者的多项评估指标。
关键词：固定矫治器,钢丝结扎联合复合树脂夹板,牙周炎,正畸,比较
参考文献
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β1-防御素 篇2
1 β-防御素的发现
防御素是抗菌肽家族中最大的亚家族, 是一类重要的内源性抗菌肽。已从脊椎动物体内分离出许多防御素, 根据其空间结构不同可分为3大类:α-防御素、β-防御素、θ-防御素。其中, β-防御素是1991年Diamond等[1]首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的短肽, 命名为TAP (tracheal antimicrobial peptide) , 后来又在牛的粒性白细胞中发现了13种与TAP的序列高度同源的短肽, 但其consensus序列与α-防御素不同, 故被命名为β-防御素。人的β-防御素 (Human β-defensin, HBD) 目前已发现有6种 (HBD1～6) 。 人的第1种β-防御素 (HBD-1) 最初是在血液中发现, 人的第2种β-防御素 (HBD-2) 是由角蛋白产生, 从牛皮癣患者的皮肤中发现的, 随后又发现在肾、尿液、宫颈黏液、下颌唾液腺、胰腺、气管、前列腺、胎盘、睾丸、胸腺及小肠细胞中都有HBD-2的表达。2000年Harder等[2]从银屑病患者的皮损组织中发现了人的第3种β-防御素 (HBD-3) , 并采用金黄色葡萄球菌亲和柱进行了分离纯化, 从蛋白水平上发现了HBD-3。通过局部比对搜索工具 (BLAST) , 发现了另外3种β-防御素 (HBD4～6) 。
2 β-防御素的分子结构
成熟的β-防御素包含36～50个氨基酸残基, 包括6个半胱氨酸残基 (Cysl-5, 2-4, 3-6) 以独特的空间模式形成二硫键, 与α-防御素相区别。Cys2-Cys4桥在多肽核内引入环状共价链。β-防御素分子内含3个反向平行的β-折叠链, 由3个分子内二硫键连接。β-片层与一个可变长度的α-螺旋片段连接, 形成分子N末端片段。α-螺旋和β-片层的连接位点是通过二硫键来稳定的 (Cysl-Cys5) 。β-防御素有形成多种低聚结构的潜能 , 这些低聚结构影响着防御素蛋白的生物学活性和功能[3]。
3 β-防御素的生物学活性
3.1 抗菌活性
β-防御素抗菌谱较广, 是机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障。在机体固有免疫防御中发挥重要作用。β-防御素能广泛杀灭G+菌和G-菌, 体外试验表明, β-防御素能够抑制大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母等, 除了对肺炎克雷伯氏菌没有明显的抑制效果外, 对以上几种病原菌和热带白假丝酵母有抑菌作用, 两者的最低作用浓度 (MIC) 为6～50mg/ml[4]。一般认为β-防御素的直接杀菌机制是由于该分子带正电, 能与带负电荷、呈阴性的细菌表面结合, 结合后其分子中的疏水区可插入到细菌胞膜, 而带电区 (带正电荷) 则与细胞膜上带负电荷的磷脂头部以及水分子相互作用。在细胞膜上多个β-防御素分子聚集形成孔隙或道。使正常情况下处于胞外的离子、多肽等流入胞内, 而胞内重要的盐类、大分子等泄漏到胞外, 造成物质泄漏, 最终导致不可逆性的菌体死亡[5]。
3.2 抗其他病原生物的活性
β-防御素能杀灭一些被膜病毒, 如人类免疫缺陷病毒、疱疹病毒、水泡型口炎病毒、流感病毒等, 但对无衣壳病毒却无效。β-防御素对病毒的杀灭作用依赖于其分子内二硫键的紧密程度、防御素的浓度等因素, 还与pH值、温度等因素有关, 在中性及低离子强度条件下, 防御素具有较强的抗病毒活性[6]。此外, β-防御素对某些真菌、梅毒螺旋体和钩端螺旋体、分枝杆菌等均有很强的抗菌活性, β-防御素还能有效地杀死引起人类及动物寄生虫病的病原体, 如疟疾、chagas氏病、利什曼病的病原体。1998年, Shahabuddin研究发现防御素对疟原虫感染蚊子的不同时期有不同的作用。疟原虫的卵囊期和子孢子期较其他时期对防御素敏感, 而且防御素对疟原虫卵囊期的损伤有时间依赖性, 一般感染3d后, 卵囊密度明显降低[7]。
3.3 抗肿瘤细胞的活性
在体外试验研究纯化的β-防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的作用情况, 发现β-防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞具有毒性作用, 并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。对人淋巴细胞及实体瘤细胞的细胞毒性作用更为显著, 尤其对抗TNF的U9TR 细胞、小鼠淋巴瘤YAC-1细胞和人组织细胞淋巴瘤U937细胞具有杀伤性[8,9]。
3.4 免疫活性
β-防御素不仅可以直接抵抗病原微生物, 而且还具有免疫活性作用。HBD-2是肥大细胞的趋化因子, 可引起肥大细胞活化和脱颗粒, 致组胺和前列腺素释放, 进一步使中性粒细胞在炎症部位移动和聚集[10]。这种趋化作用通过肥大细胞的高亲和力受体完成。同时, HBD-2不仅对幼稚树突状细胞有趋化作用, 还对记忆型T细胞有趋化性。近来Yang等报道, 小鼠β-防御素-2能刺激小鼠幼稚树突状细胞转化为成熟树突状细胞。β-防御素通过与趋化因子-6 (CCR6) 结合, 趋化诱导幼稚树突状细胞和记忆T细胞聚集到炎症部位, 介导共刺激分子 (如B7家族成员) 的表达上调和幼稚树突状细胞的成熟, 进而活化T淋巴细胞, 触发体内强有力的特异性免疫应答[11]。此外, 防御素还可以直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚, 也有研究表明β-防御素能够激活人的补体系统[12]。
4 β-防御素与呼吸道疾病的相关研究
4.1 β-防御素与上呼吸道疾病
目前已发现β-防御素广泛存在于鼻黏膜组织中, 其功能的失活与病原微生物定植、集落于黏膜上皮而导致严重的感染关系密切, 也可能参与鼻黏膜正常防御功能。β-防御素基因和蛋白质表达水平的上调与机体鼻黏膜系统发挥抗感染作用密切相关。Lee等[13]发现HBD-2 mRNA只在慢性鼻窦炎患者的下鼻甲黏膜和鼻息肉中检测到, 且在鼻息肉中的水平明显高于鼻甲黏膜, 这与参与鼻息肉形成的多种细胞因子, 包括白细胞介素-3、白细胞介素-5、嗜酸性粒细胞诱导了HBD-2表达有关。β-防御素与咽喉部疾病的关系主要体现在慢性扁桃体炎中。腭扁桃体是咽黏膜相关淋巴组织的重要组成部分。王成硕等[14]应用逆转录聚合酶链反应的方法检测了慢性扁桃体炎组和正常对照组的扁桃体组织中HBD-1和HBD-2 mRNA的表达, 实验结果表明:HBD-1在正常扁桃体和慢性扁桃体炎组织中均有表达, 而HBD-2在单纯增生的扁桃体组织仅微弱表达, 但在慢性扁桃体炎组织中表达明显升高。这表明HBD-1在扁桃体组织中为固有性表达, 而HBD-2则为诱导性表达。以上结果与HBD在其他组织中的表达特点一致, 说明扁桃体作为机体的“门卫”, 是通过天然免疫和获得性免疫两种系统相互协调、相互补充来共同发挥作用的。此外, 扁桃体上皮能够表达HBD这一事实, 也提示耳鼻咽喉科医师应充分认识到扁桃体的天然免疫功能而慎行扁桃体切除手术。
4.2 β-防御素与下呼吸道疾病
肺囊性纤维化患者气道有各种菌 (常见绿脓杆菌和金葡菌等) 定植和慢性感染过程, 但这种感染只局限于呼吸道, 而不造成全身扩散, 说明是呼吸道局部防御功能缺陷所致。肺囊性纤维化是常染色体隐形遗传性疾病, 是由囊性纤维化跨膜转导调节因子 (CFTR) 失去功能所致, CFTR是cAMP调节的氯通道。肺囊性纤维化的特点是气道中性粒细胞炎性反应, 慢性细菌感染和气道阻塞。气道过度炎性反应是CFTR丧失功能所致还是继发于感染, 在肺囊性纤维化患者的支气管肺泡灌 (BALF) 中能检测到HBD-1和HBD-2, HBD-2随着肺功能的恶化而下降。说明防御素活性的改变可能是CF患者容易感染的原因之一[15]。慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 与HBD-1的基因多态性的发生有关。吸烟者只有10%～20%会发生COPD, 因此除了环境因素外, 遗传因素参与COPD的发生。研究发现中国汉族人群中编码HBD-1的基因HDEFBl 668C/G多态性与COPD易感性有关, HBD-3表达于支气管和细支气管上皮细胞, 细菌性肺炎患者急性期血浆HBD-3浓度升高, 治疗结束后明显降低。说明HBD-2参与气道的抗微生物过程, 并且可作气道炎症反应的有用标志物[16]。
5展望
防御素不仅是新型高效的抗菌物质, 而且作为机体本身的一种活性物质, 相对不具有免疫原性, 病原菌也不易对其产生耐药性, 因此可以替代抗生素发挥广谱高效的抗菌作用。此外防御素能调节机体免疫应答和炎症反应, 调节组织创伤修复。因此, 可以诱导β-防御素的表达, 来增强机体抗感染能力和免疫力。目前已有的诱导剂由于其毒性作用, 难以直接作用于人体和用于今后的临床开发, 是否存在安全有效的诱导剂便成为研究关注的焦点。
数千年来中药在防治疾病方面发挥了重要的作用, 研究表明大多数具有良好抑菌作用的中药是通过全面提高机体免疫功能、增强机体抵抗力而达到抗菌目的。防御素的多种生物学活性给人们一个重要启示:中药有可能是通过诱导先天性免疫分子防御素的分泌发挥抗菌作用而启动机体有效的抗感染。如果中药确实能够增加内源性防御素的表达, 那么在天然防御素获得困难的情况下, 毫无疑问这一点对防御素开发成为抗生素也提供了新的思路。目前笔者研究团队开展了关于玉屏风散影响上呼吸道黏膜β-防御素mRNA表达情况的研究, 进而探索玉屏风散对上呼吸道黏膜非特异性免疫分子的作用机制, 促进中药诱导剂有效的研究及为中药的新药开发研究打下基础, 并期望将祖国传统医药作为解决临床耐药菌的新治疗途径。
摘要：近年来发现了一组具有抵抗外界微生物侵害的小分子多肽, 称为防御素。防御素具有十分广泛的生物活性, 是机体免疫系统的重要组成部分, 与多种临床疾病关系密切, 因此对于它的研究目前是一个研究热点。本文现就β-防御素的发现、其分子结构、生物活性及其与呼吸道疾病的关系做一综述。
β1-防御素 篇3
1 防御素的性质
1.1 概念
防御素是机体吞噬细胞中的一种富含半胱氨酸的小分子蛋白质, 具有抗菌和抗被膜病毒作用, 是生物界较广泛存在的一类抗微生物和恶性细胞的短肽, 主要产生于哺乳动物的白细胞、吞噬细胞或小肠的潘氏细胞 (特别是噬中性细胞) 。
1.2 分类
按结构和氨基酸序列可分为五大类:-防御素、-防御素、-防御素、昆虫防御素和植物防御素。其中-防御素分布于人、禽和哺乳动物的组织中。猪的-防御素广泛分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、心、肝、肾、脑、皮肤及肌肉等组织中, 其中舌及口腔粘膜最丰富。
1.3 作用
防御素是生物进化中的古老分子, 在先天性免疫系统的宿主防御机制中起重要作用, 是生物体在抵御病原体的防御反应过程中产生的一类抗微生物和一些恶性细胞的短肽。它既可亲水也可亲脂, 能与细胞膜的磷脂结合, 破坏细胞膜、阻止病毒进入细胞, 从而起到杀伤病原微生物的作用。
1.3.1 抗病原微生物作用
抗体外实验表明它具有十分广泛的抗菌谱, 可以抑制或杀死细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物, 哺乳动物防御素除了对细菌、真菌、被膜病毒有毒杀作用外, 还对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞有杀伤作用。对流感病毒、胃炎病毒、疱疹病毒和艾滋病病毒等, 均有很强的杀伤活性。
1.3.2 免疫调节作用
防御素除了本身对细菌、病毒的损伤以外, 还可以增强吞噬细胞吞噬细菌、病毒后溶解消化作用。防御素在免疫系统特别是非特异性免疫防御系统中也起重要作用。
1.3.3 提高机体生产性能作用
-防御素在基因工程表达中, 产生高活性的异黄酮、谷氨酸多肽、果聚糖、维生素B2、B6、B12E、K、青霉素酶等物质。高活性的异黄酮影响到母猪激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性。它是一种具有多种重要生理活性的天然营养因子, 是纯天然的雌激素, 容易被猪吸收, 能迅速补充营养。富含小肠绒毛促长因子和促消化物质, 寡糖、维生素、肠肽、极其适合在猪料尤其在高档乳仔猪料中添加使用, 显著减少断奶腹泻, 维持肠道结构功能快速修复, 实现乳仔猪早期断奶, 促进快速增重, 改善料肉比。
1.4 防御素对病毒作用机理
1.4.1 灭活
通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性 (影响病毒外壳蛋白的氨基酸序列而破坏病毒颗粒的组装) 。
1.4.2 干扰干扰病毒内核基因表达。
1.4.3 破坏
破坏囊膜病毒的膜结构, 对病毒被膜直接起作用, 而不是抑制病毒DNA的复制或基因表达。防御素对病毒的杀伤作用依赖于其分子内二硫键的紧密程度、防御素的浓度, 还与p H、温度等因素有关。
1.5 防御素对机体免疫调节作用机理
1.5.1 激活
可以激活、募集单核细胞、嗜中粒细胞、白细胞。这些细胞可以被特定的抗原激活而逐渐增多, 发挥免疫功能。
1.5.2 调理防御素在体内参与过敏反应, 对单核白细胞有很强的趋化作用, 同时起到调理素的作用。
2 防御素的应用
2.1 在临床医学中的应用
医学界对防御素的研究广泛而深入, 目前对人和动物产生防御素的组织部位、细胞、基因调控、种类、数量、作用机理等理论已全面掌握。但在临床治疗中的应用报道尚少。-防御素在抗肿瘤、抗癌变、抗爱滋病和控制烧伤感染中已开始尝试。第四军医大学在胃癌、肝癌、食道癌的治疗方面进行了研究;四川大学王同庆、魏于全等在肿瘤治疗中进行了试验;中国医学科学院曹韵贞教授研究证实:-防御素在体外可抑制艾滋病病毒的增值。德国柏林马克思普朗克传染病协会研究人员用-防御素治疗炭疽病获得了成功。
2.2 在畜牧兽医中的应用
畜牧兽医界对防御素的研究相对滞后, 深度和广度不及医学界。广州湛江市遂溪县陈理常应用瑞鑫百奥生物科技有限公司生产的“防御素抗菌肽”预防仔猪断奶应激症获得满意效果, 但在兽医临床中应用报道的尚少。
3 防御素防治猪腹泻病试验
为开发动物新型绿色环保药物、验证防御素的预防与治疗功效、开辟生物制剂防治猪腹泻病的途径, 笔者进行了临床应用初步试验。
3.1 材料
猪-防御素Z-100型 (液体) , 由哈尔滨福莱德动物保健品有限责任公司与中国人民解放军军事医学科学院共同研发, 哈尔滨福莱德动物保健品有限责任公司试生产。规格:5 000 m L/瓶。成分:-防御素、合生素、高活性异黄酮、青霉素酶、复合酶、粘膜上皮细胞修复剂。
3.2 方法
2010年10月15日, 吉林省舒兰市东富街道个体自繁自养73头约70 kg后备母猪, 严重腹泻, 经抗生素治疗无效。粪便送检, 经军事医学科学院兽医研究所电镜检查诊断为冠状病毒与轮状病毒混合感染。20日开始, 500 kg饲料中添加1 000 m L防御素混合均匀。连用15 d。为验证防御素的试验效果, 特设立5头病猪作为试验对照。
3.3 结果
9 d后 (29日) 回访, 畜主主诉有效, 但还有近一半患猪仍腹泻。笔者建议继续按原来方法应用至11月5日。11月7日回访时, 畜主告知:74头猪腹泻停止。而对照猪仍在腹泻, 而且有一头死亡。畜主认为, 此方法治疗猪腹泻有效。
4 讨论
4.1 防御素的应用效果
防御素在畜牧兽医生产中应用的确切效果报道较少, 本试验仅是在防治猪腹泻病中的初步结果, 尚没有规律性, 不能揭示其本质。目前, 在养鸡业、养猪业中应用防御素的研究已经开始。中国动物保健门户总监孙永刚先生正在进行“肉食鸡应用防御素提高生产性能的试验研究”, 长春市动物疾病诊疗防治中心的研究人员也正在进行“防御素预防猪病毒性腹泻症”的深入研究。
4.2 关于防御素的生产
防御素是含在中性粒细胞内的小肽, 其机体的含有量极少, 欲大批量体外生产并提纯, 技术工艺要求复杂、困难较大, 因而在养殖业中广泛应用受到很大限制。但经研究证明:昆虫防御素的某些序列与脊椎动物具有同源性。因此, 可应用基因工程技术扩大生产量, 满足养殖业的需求。
4.3 防御素的应用前景
β1-防御素 篇4
关键词：人β-防御素-2,肝细胞癌,PCR,细胞凋亡
β-防御素-2是由哺乳动物上皮细胞产生, 主要存在宿主-环境的界面位置, 是宿主抵御各种侵袭的第一道化学屏障的重要组成成分, 在机体免疫防御中发挥着极其重要的作用。β-防御素-2除对真菌、革兰阴性菌、革兰阳性菌、螺旋体、分枝杆菌及某些包膜病毒具有很强的杀伤活性外, 还可抑制肿瘤细胞生长。本研究通过检测人β-防御素-2在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达, 以及其对肝癌细胞凋亡的影响, 旨在探讨人β-防御素-2在肝癌发生、发展中的作用, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集2011年8月-2014年10月手术切除的原发性肝癌标本45例, 其中男34例, 女11例, 年龄37~69岁, 平均52.5岁, 病理学检查证实均为肝细胞肝癌, 所有标本术前均未进行化疗或放疗;肝癌癌旁组织30例;活检取正常肝组织 (均为肝内胆管结石肝叶切除肝组织) 20例。所有标本手术切除后立即放入液氮中-70℃冷冻保存, 并切取少量组织用10%甲醛固定, 石蜡包埋, 连续4μm进行病理切片。
1.2 实验材料
免疫组织化学试剂盒 (Invitrogeng公司, 美国) , Trizol (Gibco公司, 美国) , Primescript RT Master Mi X、Premix Taq Version2.0、实时聚合酶链反应 (realtime polymerase chain reaction, Real-Time PCR) SYBR Premix Ex Taq (Takara公司, 日本) , SP免疫组化试剂盒 (北京中杉生物技术有限公司) , d NTPS试剂盒 (Promega公司) 。HBD-2的上游引物5-CATGAGGGTCTTGTATCTCCTCT-3’及下游引物5-CCTCCTCAT-GGCTTTTTGCAGC-3’, 均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 方法
1.3.1 检测HBD-2 m RNA的表达
根据说明书, 采用Trizol法从所有肝癌组织、肝癌癌旁组织和正常肝组织标本中提取m RNA, 根据逆转录试剂盒说明, 将m RNA逆转录成c DNA;将c DNA用于Premix Taq Version2.0试剂做PCR分析表达情况。并将c DNA用于Real-Time PCR, 定量检测HBD-2 m RNA表达情况, 具体的方法按照试剂盒说明进行。Real-Time PCR工作条件:95℃4 min;94℃30 s, 65℃30 s, 72℃30 s, 进行40个循环;75℃5 min。对HBD-2 m RNA以及内参照β-actin分别进行实时荧光定量PCR进行扩增, PCR定量计算m RNA, 待测样品中的表达量用2-△Ct表示, 2-△Ct=2- (Ct目的基因-Ct内参基因) 。
1.3.2 检测HBD-2蛋白的表达
采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接 (SP) 法, HBD-2一抗工作浓度为1∶50。实验步骤依据试剂盒说明进行。结果判断:组织切片染色以胞浆中染成淡黄或棕黄色为阳性, 根据阳性细胞百分率分为:阳性细胞数<5%为阴性, 10%~50%为弱阳性, >50%为强阳性。
1.3.3 肝癌组织的细胞凋亡检测
采用原位末端标记法 (TUNEL法) , 在200倍镜下随机选取10个视野, 计算1000个肿瘤细胞中阳性染色细胞百分率, 根据以下公式计算细胞凋亡表达指数 (AI) , 凋亡指数 (AI) = (凋亡小体+凋亡细胞数) /细胞总数×100%。
1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验或秩和检验, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HBD-2 m RNA检测结果
PCR结果显示, 在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中均可检测到HBD-2 m RNA (图1) 。Real-Time PCR结果显示, HBD-2 m RNA在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达均值分别为 (1.469±0.519) 、 (3.742±0.394) 和 (3.835±0.256) , 三组间比较差异有统计学意义 (F=336.87, P<0.01) 。正常肝组织和癌旁组织中, HBD-2 m RNA的表达比较差异无统计学意义 (P=0.46) ;相对于正常的肝组织和癌旁肝组织, 在肝癌组织中HBD-2m RNA的表达明显下降, 比较差异有统计学意义 (P=0.00) 。
注:1为Marker;2为肝癌组织;3为癌旁组织;4为正常肝组织
2.2 HBD-2蛋白表达检测结果
HBD-2蛋白在正常肝组织及肝细胞癌组织中可呈阴性或阳性表达 (图2) ;HBD-2蛋白在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达率比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
注:SP法, ×200倍, a:HBD-2蛋白在正常肝组织呈阳性表达, 细胞浆内可见棕黄色细小颗粒沉积;b:HBD-2蛋白在肝细胞癌组织中呈阴性表达
2.3 不同肝癌组凋亡指数 (AI) 比较
HBD-2蛋白阳性表达肝癌组20例的凋亡指数为 (3.279±0.309) %, HBD-2蛋白阴性表达肝癌组25例的凋亡指数为 (2.072±0.289) %, 两组凋亡指数比较差异有统计学意义 (t=13.501, P=0.000) 。
3 讨论
人体的防御素主要可分为两大类, 即α-防御素和β-防御素, HBD-2属β-防御素家族成员。防御素在天然免疫功能中扮演多种作用, 据报道人类的HBD具有抗肿瘤的作用[1]。HBD-2是由41个氨基酸残基阳离子构成的短肽, 富含半胱氨酸。含6个氨基酸残基构成的3个二硫键结构及3束β片层结构。HBD-2表面有较多正电荷, 其空间结构可分为带电区和疏水区。HBD-2独特结构使其既有亲水性又有亲脂性, 可在多种微生物细胞膜上形成孔道, 破坏微生物细胞膜, 文献[2]指出HBD-2可能参与了尖锐湿疣的免疫反应过程并发挥了一定的作用。HBD-2是天然免疫的重要组成成分, 存在于全身各种组织细胞中如皮肤、牙龈、扁桃体、肺、胃、小肠、结肠、膀胱、血管、骨髓等[3,4,5]。另外, 在一些肿瘤组织也存在, 如口腔鳞状细胞癌、食管癌、前列腺癌等[6]。
目前已在多种肿瘤组织中如泌尿生殖系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤等发现防御素[7,8]。体内防御素水平及其发生变异可能与某些肿瘤发生、治疗及预后相关[9,10,11]。低浓度的防御素不影响正常细胞, 但有明显抗肿瘤作用, 其抗肿瘤作用可能与细胞骨架有关[12]。细胞膜可能是防御素作用的靶之一, 当细胞发生癌变后, 细胞膜表面的负电荷增加, 利于带正电荷的防御素与肿瘤细胞膜结合, 导致细胞骨架改变。研究发现, 鼠β-防御素可增加肿瘤抗原的可识别性, 在肿瘤体液免疫和细胞免疫中发挥作用[13]。此外, β-防御素可以破坏肿瘤细胞的骨架, 防止纺锤丝形成及阻止细胞的有丝分裂, 从而抑制肿瘤的生长, 还可以破坏肿瘤细胞的线粒体引起肿瘤细胞死亡或诱导肿瘤细胞凋亡[14]。另外, β-防御素可通过体液免疫方面抵抗癌细胞的入侵[15]。
β1-防御素 篇5
本实验利用转基因技术将编码BPI以及BD3的目的基因导入腺病毒载体,使其转染C3H10T1/2细胞后,能够表达BPI-BD3融合蛋白,以期为日后的抗感染治疗奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
含目的基因BPI-BD3的原始质粒、C3H10T1/2细胞由军事医学科学院细胞生物学实验室保存, HEK293细胞、重组穿梭载体骨架p Shuttle-CMV、 DH5α 菌株、重组腺病毒载体骨架p Adxsi购自北京赛诺基因有限公司,T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶购自英国NEB公司,DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)、质粒小 / 中量提取纯化试剂盒、 DNA纯化试剂盒购自北京威格拉斯生物技术有限公司,预染蛋白分子质量标准品、BCA蛋白定量Kit购自美国Thermo公司,DNA Marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司,兔抗人BPI、兔抗人h BD3购自美国Santa Cruz公司,辣根酶标记的山羊抗兔Ig G购自北京中杉金桥生物技术有限公司,浓缩型DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。
1.2实验方法
1.2.1重组穿梭载体p Shuttle-BPI-BD3的构建与鉴定参照文献[5]具体步骤,使用Bam H I/Eco R I酶分别进行酶切重组穿梭载体p Shuttle-CMV与含有目的基因BPI-BD3的原始质粒,CIP去磷酸化处理后进行切胶回收,分别得到3.4 kb的载体片段与1.6 kb的目的基因片段,酶切后行1%的琼脂糖凝胶电泳,切胶回收载体片段与目的片段,处理回收的载体片段与插入片段,使用Taq4 DNA连接酶将两者连接后得到连接产物。将3μl连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株涂布到固体卡那抗性培养基中,然后将若干单克隆菌落接种到培养基中,摇床300 r/min于37℃振荡过夜。提取质粒后用Bam H I/ Eco R I酶切,并进行凝胶电泳,观察条带。
1.2.2重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3的构建与鉴定将验证正确的p Shuttle-BP1-BD3目的片段转移到空载体p Adxsi上,得到p Adxsi-BP1-BD3腺病毒质粒,酶切处理,CIP去磷酸化处理后,乙醇沉淀法回收载体。酶切重组穿梭载体p Shuttle-BPI-BD3, 凝胶电泳后回收含有目的基因的片段,处理载体片段与含有目的基因的插入片段。Taq4 DNA连接酶连接载体片段与目的基因插入片段得到连接产物, 将3μl DH5a菌株涂布于氨卞抗性固体培养板,并选若干单克隆菌落接种于培养基中过夜,提质粒。用Xho I酶切重组 腺病毒载 体p Adxsi-BPI-BD3和p Adxsi空载体,通过凝胶电泳鉴定。
1.2.3重组腺病毒p Adxi-BPI-BD3的扩增及滴度测定将HEK293细胞以5×105个 / 孔接种于6孔板,培养过夜,待细胞生长至80%~90%融合后,Swa Ⅰ限制性内切酶线性化重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3后,Lipofectamine 2000脂质体进行转染。于37℃、二氧化碳CO2培养箱中培养6 h,弃去上清液后更换完全培养基,在大部分细胞贴壁能力下降,开始脱落时收毒,将孔内所有细胞及培养液收集于离心管中,反复冻融3次,3 000 r/min离心10 min,收集上清液即为第一代毒种(P1)。从P1代毒种上清液中取2 ml感染75 cm2中的293细胞(>90%融合), 同上述步骤进行P2代病毒的扩增及收集。将最终收集的病毒上清用Cs Cl2梯度离心纯化后分装于冻存管中。病毒滴度及活性测定使用半数组织培养感染量法 (median tissue culture infective dose, TCID50)。
1.2.4p Adxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2细胞的初步实验于转染前1天将C3H10T1/2细胞按5× 105个接种于75 cm2培养瓶,细胞长至50%~60% 融合时,以重组腺病毒p Adxsi-BPI-BD3 (A组)、 p Adxsi空载体(B组)转染C3H10T1/2细胞,并以未转染的C3H10T1/2为对照 (C组),37℃、5%CO2培养箱中培养6 h后更换含10%FBS的 α-MEM,置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h。
1.2.5RT-PCR检测p Adxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后m RNA表达转染C3H10T1/2 72 h后,分别收集上述3组5×106个细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录为c DNA,以BPI-BD3为目的基因, 进行PCR反应。参照文献[5]设计BPI-BD3引物,BPIBD3的上游引物:5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC3';下游引物:5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3', 扩增产物为750 bp。PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性20s,51℃退火20 s,72℃延伸20 s,共35个循环,72℃继续延伸5 min。反应结束后,所有PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像体系查看电泳结果并拍照。
1.2.6Western blot检测p Adxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后蛋白的表达转染72 h后,分别收集上述3组细胞,采用RIPA法分别提取各组细胞的总蛋白。变性后,15%SDS-PAGE行蛋白电泳,转膜至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭,洗膜,加入1∶200稀释的兔抗人h BD3(或兔抗人BPI)一抗,4℃过夜, 洗膜后加入1∶1 000稀释的羊抗兔Ig G二抗,37℃ 孵育30 min,洗膜后,DAB显色凝胶成像系统采集分析目的蛋白。
1.2.7p Adxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2对细胞增殖率的影响将C3H10T1/2用培养基制成单细胞悬浮液,浓度为5×103个 /ml,接种至3块96孔板,每板42孔,每孔100μl。在37℃、5%CO2培养箱培养过夜贴壁后,吸弃培养基,分别于每板中转染p Adxsi-BPI-BD3(A组)、p Adxsi空载体(B组),另一板不加转染液作为对照组(C组)。以后每天每板取6孔细胞加入MTT溶液20μl,4 h后吸弃培养液,加入DMSO 150μl,在全自动酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔吸光光度值(A值),连续观察7 d,并绘制各组细胞生长曲线。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,各组间均数比较用单因素方差分析,组间多重比较用SNK-q检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1酶切重组穿梭载体pShuttle-BPI-BD3的鉴定
使用Bam H Ⅰ /Eco R Ⅰ 酶切重组 穿梭载体p Shuttle-BPI-BD3,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定可观察到3.4和1.6 kb 2条带(见图1),与切胶回收分别得到3.4 kb的载体片段与1.6 kb的目的基因片段一致,提示p Shuttle-BPI-BD3重组穿梭载体构建成功。
2.2酶切重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3的鉴定
使用Xho Ⅰ 酶分别酶 切重组腺 病毒载体p Adxsi-BPI-BD3与腺病毒空载体p Adxsi,产物行1% 琼脂糖凝胶电泳,观察显示,重组腺病毒载体酶切产物共7个条带:14.50、11.70、2.66、2.47、2.45、1.45和0.60 kb;同时对照组腺病毒空载体酶切产物共6个条带:14.50、11.70、4.00 kb、2.47、1.45和0.60 kb(见图2),表示重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3构建成功。
2.3重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3的扩增及滴度测定
使用构建的p Adsxi-BPI-BD3转染293细胞培养24 h后,观察可见60%细胞病变,细胞核变大变圆,细胞贴壁能力下降,46 h后细胞完全病变,对照组细胞无此变化。经Cs Cl2纯化后,TCID50法测定所得病毒滴液为1.2×1010pfu/ml。
2.4转染后细胞形态学观察
经重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3及空载体p Adxsi转染后C3H10T1/2细胞与未转染的C3H10T1/2细胞相比,贴壁生长状态基本一致,状态良好,形态完整,为长梭形,未见形变。见图3。
2.5pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后BPIBD3基因的表达
RT-PCR结果表明,重组腺病毒载体p AdxsiBPI-BD3转染C3H10T1/2细胞后,PCR产物为750 bp,与目的基因BPI-BD3(750 bp)一致,腺病毒空载体p Adxsi组与未转染的细胞组BPI-BD3表达为阴性。见图4。
2.6pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后蛋白的表达
p Adxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后72 h, Western blot检测显示,与抗BD3抗体反应可呈现出1条显色条,同时与抗BPI抗体反应,在同一位置同样出现显色条带,而p Adxsi空载体转染组与未转染组无反应,说明BPI-BD3融合蛋白表达成功。见图5。
2.7pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2对细胞增殖率的影响
MTT检测7d结果显示,重组腺病毒载体p AdxsiBPI-BD3组与空病毒载体p Adxsi组、未转染组比较, 增殖随时间呈递增趋势,第1、2天增殖较为缓慢,3~ 5 d进入对数生长期,5~7 d为平台期,并开始凋亡,A组与B、C组比较,在第4天差异有统计学意义(P < 0.05),其余各时间差异无统计学意义(P >0.05),说明重组腺病毒p Adxsi-BPI-BD3对细胞增殖无明显影响(见附表和图6)。
注:P1:A 组与 B 组比较;P2:A 组与 C 组比较;1)与 B 组比较,P <0.05;2)与 C 组比较,P <0.05
3讨论
大面积的皮肤及黏膜烧伤、创伤后常常合并感染,目前治疗手段仍以抗生素为主。然而,多种耐抗生素病原菌株的出现,使细菌耐药性问题成为治疗创伤合并感染的最严峻挑战[6]。目前,内源性抗生物多肽家族在寻找新的抗感染途径过程中,得到各国学者的关注。抗菌肽独特的抗菌机制提示其作为新型抗菌药物将在临床上发挥重要作用[7]。
防御素是一类广泛存在于动物和植物体内的抗菌活性肽,具有高效广谱的杀菌作用,其抗菌机制独特,通过抗菌肽分子表面的正电荷与富含磷脂(带负电荷)的细菌表面结合,在细菌表面形成孔道,破坏细胞膜的完整性,导致菌体不可逆性死亡,这种作用机制与传统抗生素不同,细菌对其几乎无耐药性[8]。 h BD3作为防御素大家族中的一种,在预防及治疗感染性疾病方面发挥重要作用,其在很小剂量时就表现出对革兰阳性菌的抗菌活性,且其抗菌活性不受高盐浓度的影响,也不引起溶血,分子量小,弥散快, 不会损伤人体组织细胞,是理想的抗菌活性肽[9]。除广谱的抗菌活性,h BD3还具有机体免疫调节活性, h BD3能通过G蛋白偶联CCR6受体(Gi-proteincoupled receptor,Gi PCR) 募集树突状细胞和记忆T淋巴细胞,吸引其向感染局部皮肤或黏膜迁移,从而在获得性免疫中发挥调节作用,提高机体抵抗微生物感染的免疫反应水平[10]。BPI于1979年由WEISS等[11]发现并分离,主要存在于中性粒细胞的噬苯胺蓝颗粒中,在机体的天然免疫和抗感染免疫中发挥重要作用。BPI由于其强大的抗革兰阴性菌活性,中和革兰阴性菌所产生的内毒素的特性引起广泛的关注[12]。同时,BPI是目前发现的唯一既能非特异性杀伤革兰阴性菌,又能中和内毒素,同时具有免疫调节作用的抗菌物质[13]。BPI的加入,使BPIBD3融合蛋白具有更强的杀菌功能。
有研究表明,BPI-BD3融合蛋白可于毕赤酵母系统中成功表达[5]。但是酵母表达系统属真核表达系统,合成人源性蛋白时,在起始信号、加工、分泌和糖基化等方面不如病毒载体。而相对于其他病毒载体,腺病毒载体具有以下优点[14]:1作为DNA双链无包膜病毒,腺病毒可以同时感染分裂期和静止期细胞;2腺病毒的表达效率与转导效率较高;3腺病毒安全性能好,在感染细胞的过程中其所携带的基因不会整合至宿主染色体,同时对细胞的自身性能无影响;4腺病毒载体相比其他载体具有较大的承载空间,能够同时插入多个不同基因。而C3H10T 1/2作为胚胎间充质干细胞细胞系,能够迁移至创伤或炎症部位,分化、分泌各种生长因子,促进受损细胞的恢复,发挥免疫调剂与抗炎作用[15]。并且相对原代间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,MSCs), C3H10T1/2细胞类型单一,生长快速稳定,可无限传代,是一种良好的外源基因表达载体。因此,本实验构建p Adxsi-BPI-BD3重组腺病毒载体,使其转染C3H10T1/2细胞,以期更好地发挥抗菌肽BPI-BD3作用,提高防御及抗感染能力。
本实验成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3,实验结果显示,构建并纯化后的p Adxsi-BPIBD3可高效转染鼠胚胎间充质细胞C3H10T1/2。 RT-PCR和Western blot检测转染后的C3H10T1/2可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,MTT结果显示,本实验构建的重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2细胞后,对细胞增殖无明显影响,对细胞无毒性作用,从而为进一步研究转染后的C3H10T1/2细胞,开展创伤组织的感染防御以及促进组织损伤恢复奠定基础。
摘要：目的 构建人β-防御素3(h BD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体p Adxsi-BPIBD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达。方法 酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到p Shuttle-CMV得到p Shuttle-BPI-BD3,验证后将插入片段转移至p Adxsi载体构建重组腺病毒质粒,线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化后,TCID50测定重组腺病毒滴液。p Adxsi-BPI-BD3及空载体p Adxsi(作为对照组)转染C3H10T1/2。RT-PCR、Western blot检测BPI-BD的表达;MTT法检测其对细胞增殖的影响。结果 成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,纯化后病毒滴度达1.2×1010pfu/ml。p AdxsiBPI-BD3转染C3H10T1/2后,RT-PCR、Western blot结果显示,BPI-BD3融合蛋白表达成功。MTT结果显示,转染的C3H10T1/2生长无明显影响(P>0.05)。结论 成功构建重组腺病毒载体p Adxsi-BPI-BD3,且转染C3H10T1/2后可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,为进一步研究应用抗菌肽BPI-BD3奠定基础。
β1-防御素 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康清洁级C57BL/6种雌性小鼠50只, 3月龄10只, 重量 (20±2) g;14月龄40只, 重量 (28±3) g, 实验动物使用许可证号:SYXK (苏) 2011-0035, 由常州卡文斯实验动物有限公司提供, 饲养于宁夏医科大学动物实验中心。
1.2 实验药物
实验所用方药由人参、生黄芪、甘草等组成, 购自宁夏医科大学中医门诊部, 常规水煎2次, 合并滤液浓缩至生药含量1g/mL, 4℃冷藏保存。灌胃时用生理盐水稀释至所需浓度。
1.3 仪器与试剂
LEICA CM1510S冰冻切片机 (德国徕卡公司) , LEI-CA EG1150C组织包埋机 (德国徕卡公司) , Glanz WD800微波炉 (广东格兰仕有限公司) , Olympus荧光显微镜 (日本OLYMPUS公司) 等均有宁夏医科大学解剖实验室提供。整合素β1抗体及荧光二抗 (abcam公司) 等。
1.4 实验分组
清洁级C57BL/6种雌性小鼠50只, 3月龄10只, 设为年轻组。14月龄40只, 随机分为4组, 每组10只, 分别设为老年组, 补益营卫高剂量组、中剂量组和低剂量组。补益营卫方高、中、低剂量组分别按6、3、1.5g/kg剂量每天灌胃给药, 每周禁食称重1次, 连续6周。6 周后, 脱臼处死动物, 剪下背部皮肤, 尽可能剪去背毛, 取1.0cm×1.0cm, 分成数份, 置于4%多聚甲醛中固定, 将固定标本取出, 包埋, 切片, 切片厚度为5μm。
1.5 实验方法
5μm冰冻切片经PBS洗5min;枸橼酸缓冲液加热至90℃, 微波修复1min冷却后移至PBS;0.25% TritonX100室温透化5min, PBS漂洗5min×3次;加20%正常牛血清, 室温结合30min;加入K19 一抗, 4℃ 孵育过夜;PBS漂洗5min×3次;加结合荧光素的二抗, 室温孵育1h;PBS漂洗5min×3次;封片, 荧光显微镜观察并拍照。
1.6 指标测定
结合软件Image-Pro Plus 6.0对组织玻片荧光图像进行分析。用DAPI蓝色荧光精确定位胞核位置, 细胞质中可见不同强度的绿色荧光, 以对图片中细胞个数、面积、荧光强度等参数提取并计算各个细胞和细胞核的面积及荧光强度, 细胞的荧光强度等于对应标号的像素点灰度总值除以细胞面积总值, 即mean density= (IODsum) / (areasum) 。
1.7 数据处理
应用SPSS11.5软件统计分析, 实验数据用 (±s) 表示, 样本均值比较采用单因素方差分析, 方差分析采用LSD法比较组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
在荧光显微镜下, 绿色为胞浆中角蛋白荧光染色, 蓝色为细胞核。年轻组整合素β1的荧光强度表达强, 老龄组则明显较弱, 组间比较有统计学差异 (P<0.05) 。应用补益营卫方中、低剂量组处理后, 可显著增高对整合素β1的表达, 其中低剂量组较高, 与其他剂量组比较有统计学意义 (P<0.01) ;高剂量组与中剂量组之间无统计学差异 (P>0.05) , 见表1。
注:与老年组比较, *P<0.01。
3 讨论
随着人类社会的发展和进步, 人们生活质量逐渐提高, 对延缓皮肤衰老的要求越来越迫切。皮肤衰老作为机体衰老的重要组成部分, 最先表现于外, 衰老的皮肤不但影响容貌靓丽, 亦影响社交。因此预防和延缓皮肤衰老已成为美容医学研究的热点, 中医药在数千年的发展中积累了丰富的抗衰老理论和经验, 《伤寒论·平脉法》第69条说:“寸口脉微而涩, 微者卫气衰, 涩者荣气不足, 卫气衰, 面色黄, 荣气不足, 面色青。”指出营卫充盛, 则肌肉健壮, 容光焕发, 没有衰老之象;反之, 营卫不足, 则面色青黄, 衰象显露[1]。因此皮肤的健康, 疾病以及衰老与营卫密切相关。
从《伤寒论》和《金匮要略》中与营卫相关方剂的挖掘、整理与分析, 以“营气不足”导致身疼痛为病机的桂枝新加汤证中选取益营气的人参, 从治虚劳的黄芪建中汤证选取益卫的生黄芪, 再加益气调和药性的炙甘草组成了补益营卫方。本实验从补益营卫的角度出发, 探讨补益营卫方对衰老皮肤表皮中整合素β1的表达影响。
在正常皮肤中, 皮肤基底层细胞通过其表面的整合素与基底膜及细胞外基质黏附。基底层表达的整合素主要有α2β1、α3β1及α6β4, 整合素β1表达水平的高低与细胞体外克隆形成能力呈正相关, 高表达整合素β1的表皮细胞具有更高的克隆形成能力, 传代次数显著多于低表达细胞, 整合素β1丢失导致皮肤创面愈合不良, 表明整合素β1高表达的细胞中富含干细胞[3]。而β1整合素是被作为表皮干细胞的一个较好的表面标记物[4]。表皮干细胞 (epidermal stem cells, ESCs) 是皮肤组织特异性干细胞, 增殖能力强, 可以增殖分化为各种表皮细胞, 具有维持表皮自我更新、保持正常表皮结构以及促进创面修复等作用[5]。衰老人皮肤角质形成细胞干细胞年龄依赖的减少, 研究显示人皮肤衰老与干细胞标志物整合素β1表达减少关联[6]。
本研究采用免疫荧光技术通过对衰老小鼠皮肤表皮整合素β1的表达, 探究补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。实验结果显示, 衰老的皮肤中整合素β1的表达比正常的皮肤中表达水平低, 表明衰老表皮上皮干细胞的自我更新能力即再生增殖能力较正常受到明显的抑制。而经补益营卫方高、中、低剂量组干预后, 整合素β1的表达有所增强, 低剂量组整合素β1的表达较高剂量组、中剂量组高, 与老龄组比较差异性显著 (P<0.01) 。
综上所述, 补益营卫方可通过有效促进衰老皮肤表皮中整合素β1表达而延缓皮肤衰老。
参考文献
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β1-防御素 篇7
关键词：葛根素,软骨细胞,细胞增殖,细胞培养
骨性关节炎是一种常见的骨关节疾病,以软骨变性为特征。软骨细胞过度凋亡在骨性关节炎的发生发展中起着重要作用[1]。研究表明,IL-1β在改变正常软骨细胞结构、抑制软骨细胞基质的合成、促进软骨细胞的凋亡等发面发挥重要作用[2,3]。葛根素(Puerarin,Pue)是中药葛根的提取物,也是葛根的主要有效成份之一。笔者前期研究证实,葛根素能够抑制基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的生成,从而起到抑制细胞外基质中胶原的降解、减缓骨性关节炎的病程进展的作用[4]。本研究从软骨细胞着手,通过细胞培养研究葛根素对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响,旨在理论上阐明葛根素治疗膝骨性关节炎的相关机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料及设备
SPF级10日龄大鼠(武汉同济医学院实验动物中心提供)、CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)、超净工作台(苏净安泰)、生物倒置显微镜(重庆光电仪器总公司)、台式离心机(Heal Force)、酶标检测仪(美国Rayto公司)、光学显微镜及照相系统(重庆光电仪器有限公司)。
1.2 主要试剂
DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰蛋白酶(Amresco公司)、Ⅱ型胶原酶(北京博奥森生物技术有限公司)、噻唑蓝(MTT,AMRESCO Inc公司)、重组大鼠白介素-1β(rrat IL-1β,Pepro Tech公司)、地塞米松磷酸钠注射液(Solarbio公司);葛根素标准品(Sigma公司)、4%中性缓冲福尔马林、无钙镁磷酸缓冲液(PBS)、二甲基亚砜(DMSO,AMRESCO Inc公司)、Ⅱ型胶原抗体(北京博奥森生物技术有限公司)、免疫组化试剂盒(Dako Denmark A/S公司)、DAB显色试剂盒(Dako Denmark A/S公司)。
1.3 软骨细胞的培养及鉴定
1.3.1 软骨细胞的原代培养
取SPF级10日龄大鼠,脱颈处死后,在无菌条件下取出髋膝关节处的软骨组织块,于超净工作台内置入含10%双抗的PBS培养皿中,清洗1遍,再用不含双抗的PBS清洗3遍。然后将软骨组织块移入EP管,向EP管中滴入2~3滴PBS,然后用眼科剪将组织块剪至约1 mm3大小。将EP管中的PBS吸出,加入0.2%Ⅱ型胶原酶使组织块处于悬浮状态,置于37℃条件下消化过夜。消化完成后,将EP管在振荡器上振荡2 min,使消化下来的细胞从组织中离散。离心弃上清,取出下层细胞加入盛10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。72 h后更换培养液,观察细胞生长情况,以后隔2 d更换1次培养液,当细胞长满单层的80%~90%后进入传代培养。
1.3.2 软骨细胞的传代培养
将培养瓶中的培养液吸弃,用PBS冲洗2遍,加入0.25%胰蛋白酶2 m L消化5 min左右,在倒置显微镜下见细胞变圆后,立即弃去消化液终止消化,加入含血清的培养液冲洗、吹打,使细胞悬浮起来,根据需要调节细胞浓度分瓶接种于新的培养瓶中。置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
1.3.3软骨细胞的鉴定
Ⅱ型胶原是软骨基质中的一种结构蛋白,是软骨细胞的特征性分泌产物。软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫细胞化法检测后,Ⅱ型胶原呈异染性,细胞核及核周可见棕褐色颗粒染色呈片状或块状,据此可以确定体外分离培养的细胞是否为软骨细胞。具体方法:在超净工作台内放置无菌六孔板,加入灭菌盖玻片。将细胞悬液滴加至盖玻片上,置于CO2培养箱中培养约2 h至细胞贴壁,再加入2 m L细胞培养液继续培养,使细胞于玻片上生长增殖。24 h后吸弃细胞培养液,将细胞爬片在六孔板里用PBS浸洗3次,每次5 min,然后用4%多聚甲醛固定30 min。固定后用PBS浸洗,再加50~100μL破膜工作液,室温孵育10 min。再次PBS浸洗,每张爬片加入约50μL稀释的Ⅱ型胶原抗体覆盖细胞,4℃过夜。用PBS洗3次,每次5 min。去除PBS液,每张切片加50~100μL相应种属的二抗,室温下孵育50 min。用PBS洗3次,每次5 min。甩去PBS液,每张爬片加50~100μL新鲜配制的DAB溶液,显微镜控制显色。显色完全后,蒸馏水或自来水冲洗,苏木素复染,盐酸酒精分化,自来水冲洗,氨水返蓝。爬片经过梯度酒精(70%~100%)脱水干燥,吹干,中性树胶封固并拍照。
1.4 葛根素对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响
1.4.1 分组
根据实验需要分组如下:正常组;IL-1β组,按浓度5μg/L加入IL-1β10μmol;(3)IL-1β(5μg/L)10μmol+地塞米松(10-9mol/L);Pue 50组、Pue 100组、Pue 200组加入IL-1β(5μg/L)10μmol同时分别加入葛根素50、100、200μmol/L。
1.4.2 试验方法
取生长良好的传代软骨细胞,用0.25%胰蛋白酶常规消化,用培养液配制成浓度为1×105个/m L细胞悬液,接种于96孔板中,每孔加200μL,置于37℃,5%CO2恒温培养箱中。待培养24 h细胞贴壁后,分别加入含IL-1β和药物的培养基,共设6组,每组3孔。72 h后终止实验,在终止实验前2 h每孔分别加入50μL浓度为5 mg/m L新鲜配制的MTT溶液,培养箱中孵育2 h,使MTT还原为甲瓒(此时倒置显微镜下可看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体)。72 h时吸去上清液,每孔加入DMSO 200μL,用摇床摇匀,然后使用酶标仪570 nm波长下测定各孔的光密度值(OD值)。
1.5 观察指标
(1)检测软骨细胞增殖;(2)倒置显微镜观察细胞形态。
1.6 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 正常组软骨细胞的形态
倒置相差显微镜下观察,原代细胞在刚开始培养时很少见,1 d后开始贴壁,细胞接种3~5 d后可见分散的呈多角形的软骨细胞;接种1周后在镜下可见较多的圆形和多角形软骨细胞;大约在2周后原代细胞几乎贴满瓶壁,达到传代的标准。传代培养的细胞1 d左右开始贴壁。传代后,所有贴壁生长细胞呈多角形,并分泌出较多的细胞外基质,具有折光性。传代后第2代软骨细胞生长旺盛,大约5 d左右细胞即可贴满瓶壁,达到传代标准。从第4代开始,多角形细胞慢慢转化为梭形细胞,细胞外基质的分泌也逐渐减少。从第6代开始,传代培养的细胞以梭形为主,细胞活力下降,细胞外基质分泌几乎消失。
2.2 软骨细胞的鉴定
传代培养的软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫组化染色后,细胞核及核周可见棕褐色颗粒,并呈不规则的块状。因此可鉴定分离的细胞为软骨细胞,见图1。
2.3 实验组软骨细胞的形态
倒置显微镜观察下,IL-1β组软骨细胞分布松散,生长比其他组的细胞明显变慢,部分细胞可见皱缩,细胞活力下降。地塞米松组细胞形态和细胞活力较IL-1β组好,皱缩的细胞明显减少,但不及正常组和Pue组。Pue组随着剂量的增加,细胞的活力也增加,其中高剂量组的细胞生长情况与正常细胞相比未见明显差异。
2.4 葛根素对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响
IL-1β能损伤软骨细胞,抑制软骨细胞的增殖,其增殖率为-11.044%;地塞米松和Pue在一定浓度范围内均能对抗IL-1β对大鼠关节软骨细胞的损伤作用,其中,Pue是剂量依赖性的保护软骨细胞并促进细胞的增殖,随着剂量上升(50、100、200μmol/L)其增殖率逐步上升,为-2.424%、2.828%、5.387%。见表1。
注:与IL-1β组比较,△P<0.05;与地塞米松组比较,▲P<0.05;Pue:葛根素;IL-1β:白细胞介素-1β
3 讨论
一般认为,骨性关节炎是由于软骨细胞、细胞外基质(ECG)及软骨下骨这三者在力学及生物学等相关因素共同作用下,出现分解和合成代谢平衡失常,从而引起软骨损害、滑膜炎性改变为特点的疾病,其病变发病核心是从关节软骨退行性改变逐步累及软骨下骨质、滑膜、关节囊等关节重要结构,其中,关节软骨的退行性改变是骨性关节炎发病的病理实质,所以研究骨性关节炎的关键是防止软骨的退变[5,6]。
骨性关节炎发病与细胞因子相关,最密切相关的就是IL-1β[7]。IL-1β是一种促进炎性反应的细胞因子,也是造成关节软骨破坏的主要物质之一。Mendes等[8]证实,IL-1促进软骨细胞的凋亡。潘海乐等[9]研究表明,IL-1升高与骨性关节炎病变程度平行,二者呈高度正相关。随着年龄的增长,软骨细胞的数量和活性不可避免的下降,本研究选用IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞作为骨关节炎细胞模型,探讨葛根素对软骨细胞增殖的影响。
本实验发现,IL-1β对关节软骨细胞的损伤主要表现于细胞形态的变化及活力下降。由实验结果可以看出,地塞米松和Pue在一定浓度范围内对软骨细胞的增殖均有促进作用,而Pue是剂量依赖性地保护软骨细胞并促进细胞的增殖,随着剂量的升高使其增殖率逐步上升。提示Pue可以促进软骨细胞的代谢,促进软骨细胞的增殖,为Pue的临床应用提供了理论依据。
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