Aβ海马

Aβ海马（通用7篇）

Aβ海马 篇1

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一类病因未明的神经系统变性疾病,资料表明氧化应激、免疫功能下调是其发病的原因之一[1]。姜黄素(Curcumin)是从植物姜黄根茎中提取的一种酚类化合物,具有抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、抗氧化等多种药理作用,毒副作用低[2],具有良好的临床应用潜力,受到国内外的广泛关注。近年来发现姜黄素依靠其良好的抗氧化和抗炎等作用,在脑保护及治疗脑血管病方面具有良好的运用前景[3]。本实验以β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)Aβ1-42诱导的AD大鼠为研究对象,检测姜黄素对认知功能的影响,明确姜黄素对AD的防治作用。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

β淀粉样蛋白(Aβ1-42,美国Sigma公司)、姜黄素(美国Sigma公司,纯度>96%)。Morris水迷宫,脑立体定位仪(日本成茂公司)。

1.2 动物分组

健康雄性SD大鼠30只,体质量250～280 g,由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠适应性喂养1周后,经Morris水迷宫测试,4个象限测试中有2个象限超过2 min未找到安全平台者视为记忆障碍,淘汰后剩余大鼠被随机分为3组,每组10只,即假手术组、模型组和干预组。

1.3 Aβ1-42致大鼠认知障碍模型的制备及给药

用无菌生理盐水将Aβ1-42稀释成10μg/μL,37℃下孵育1周,使其变为聚集态Aβ。大鼠经3.5%水合氯醛腹腔麻醉,固定于立体定位仪上,颅顶部正中切开皮肤,按GEORGE PAXINOS等[4]1998年版《大鼠脑立体定位图谱》选择右侧海马CA1区为注射靶区,于前囟向后3.0 mm,中线旁开2.2 mm处,钻开颅骨,微量进样器自脑表面垂直进针2.8 mm,10 min内将Aβ1-42缓慢注入(10μL),留针5 min以保证溶液充分弥散,然后缓慢撤针,假手术组注入等体积生理盐水。姜黄素干预组:于建模后24 h给予腹腔注射姜黄素[姜黄素的用量按300 mg/(kg·d)计算],用约1 m L DMSO原液溶解,连续腹腔注射5 d。各组术后均单笼饲养至大鼠完全清醒。

1.4 Morris水迷宫行为学测试

造模1个月后,各组大鼠进行Morris水迷宫实验测定学习记忆能力[5]。Morris水迷宫为一不锈钢的圆形水池,直径150 cm,高50 cm,水深30 cm,水温控制在(25±1)℃。池壁标明4个入水点,由此将水池等分为4个象限,任选1个象限正中放置一直径11 cm、高29 cm的平台。训练期间平台和水池外参照物保持不变。

1.4.1 定位航行试验(place navigation)

通过对训练大鼠游泳寻找平台,观测其逃避潜伏期长短可检测动物的学习能力。历时5 d,2次/d,将大鼠面向池壁分别从2个入水点放入水中,记录其在2 min内寻找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency)和游泳路径。如果大鼠在2 min未找到平台,潜伏期记为120 s,并由实验者用木棒牵引其至平台上,让大鼠停留10 s,再放回笼中。

1.4.2 空间探索试验(spatial probe)

第6天撤除平台,任选一个入水点放入水中,记录2 min内大鼠在池中的游泳轨迹和时间,分别计算在各象限所停留时间的百分比。

2 结果

2.1 AD模型大鼠在Morris水迷宫中定向航行和空间探索试验的表现

各组大鼠平均逃避潜伏期随着游泳时间的延长而缩短,说明各组大鼠在5 d的游泳训练期间学习寻找平台的能力逐次提高,但其学习能力有很大差别。组间两两比较显示,从第2天开始,模型组平均逃避潜伏期较假手术组明显延长(P=0.014)。而姜黄素干预组较AD模型组定向航行试验平均逃避潜伏期明显缩短(P=0.021),显示学习记忆力明显减退,表明造模成功。见附表。

2.2 姜黄素对AD模型大鼠学习记忆能力的影响撤去平台后,大鼠轨迹图多以边缘式和随机式为主,以在原平台象限(第Ⅱ象限)的活动时间为指标,假手术对照组、AD模型组及姜黄素干预组原平台象限活动时间平均百分比分别为(54.01±9. 7 2)%、(26.48±6.71)%和(45.32±7.81)%,说明姜黄素对改善认知功能障碍大鼠的学习及记忆能力有一定作用。见附图。

(s,x±s)

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与AD组比较,P<0.05

1)与假手术对照组比较,P<0.01;2)与假手术对照组比较,P<0.05

3 讨论

AD是一类病因未明的神经系统变性疾病,其高致残率给社会和家庭带来了沉重的负担,寻找有效而安全的药物治疗方案是当前科学界的研究热点之一。目前对于AD治疗的药物仅限于对症治疗,并不能有效延缓AD的病理进程,同时因为毒副作用及价格昂贵等原因限制了其广泛应用。中药以其多靶位、低毒性的特点在改善和延缓早期轻度认知损害等方面显示出较好的疗效。

姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类物质,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用[6,7]。抗炎、抗氧化等功能,现代医学研究表明它可以改善癌症、糖尿病、代谢性疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化等多种疾病症状,用于治疗部分疾病,包括创伤性脑损伤、缺血性脑血病等[8,9]。随着研究的不断深入,姜黄素对AD等神经元退行性疾病的治疗作用已成为目前一大研究热点。

动物体内实验已有研究证据表明:姜黄素可以抑制AD小鼠脑内Aβ的沉积,甚至使已经沉积的神经纤维斑块体积变小[10,11]。王铜浩等[12]采用APP/PS1进行研究发现:APP/PS1转基因鼠随着病情发展脑组织、血清中TNF-α和IL-6水平逐渐升高,应用姜黄素治疗后细胞因子TNF-α和IL-6逐渐降低,并呈剂量依赖性。这些研究结果均支持姜黄素的抗炎及神经保护作用。因为Aβ1-42的神经毒性更大,其在脑内沉积、引发神经元凋亡是AD发病的中心环节,所以本实验采用Aβ1-42诱导的AD模型[13,14],观察姜黄素对于AD模型大鼠认知功能的改善程度。

本研究结果表明,和假手术组相比,Aβ1-42诱导的AD模型组大鼠学习记忆能力明显减退。给予姜黄素进行干预后,大鼠的认知功能较模型组明显改善,与尹红蕾等[15]观察到中等剂量姜黄素可改善Aβ1-40诱导的AD模型大鼠空间学习记忆障碍的作用结果基本一致。说明姜黄素对两种不同片段Aβ诱导的AD模型大鼠的认知功能均有明显的改善作用。

综上所述,实验研究表明姜黄素在改善AD认知功能方面具有良好效果,这为治疗阿尔茨海默病提供了新的思路,笔者将在后续研究中进一步探讨姜黄素改善AD大鼠认知功能的作用机制,寻找AD治疗的潜在靶标。

摘要：目的 探讨姜黄素(curcumin)对Aβ1-42诱导的老年痴呆(Alzheimer’s disease,AD)大鼠认知功能的影响及意义。方法 将SD大鼠随机分为AD大鼠模型,假手术组及姜黄素组,将Aβ1-42微量注射至大鼠右侧海马,制作AD大鼠模型,一个月后进行定位航行和空间探索水迷宫试验,分别检测大鼠的学习和记忆能力;姜黄素干预组于AD建模后24 h给予300 mg/(kg.d)二甲基亚砜(DMSO)溶解的姜黄素,连续腹腔注射5d;一个月后进行定位航行和空间探索水迷宫试验分别检测各组的学习和记忆能力。结果 与假手术组相比,AD模型组大鼠显示学习、记忆能力显著下降(P=0.013);与AD模型组分别对比,姜黄素干预后大鼠空间学习记忆能力明显改善(P=0.021)。结论 姜黄素有改善Aβ1-42诱导的AD模型大鼠空间学习记忆障碍的作用。

关键词：姜黄素,淀粉样β蛋白,认知功能损害,海马,大鼠

Aβ海马 篇2

1 材料和方法

1.1 实验材料

新生24h内SD大鼠,由佳木斯大学实验动物中心提供(动物质量合格证号:黑动字第99102001)。Aβ1-42(Sigma公司);Caspase-3免疫组化试剂盒(武汉博士德公司);山羊抗小鼠Ig G(tritc)、山羊抗兔Ig G(FITC)(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

取24h内新生SD大鼠,暴露大脑半球双侧海马,用镊子夹取海马放入预冷的DMEM/F12一倍液中漂洗2~3次。胰酶消化,将消化后的组织液用200目筛网过滤去除脑膜及纤维组织。离心弃上清,加入DMEM/F12完全培养液制成单细胞悬液,接种于24孔板中置37℃、5%的CO2培养箱中培养,每3天半量换液一次,每7~8天传代一次,每天连续观察细胞生长情况及细胞形态,并拍照观察细胞生长情况。海马神经元细胞鉴定。将培养7d的海马神经细胞分为5组,加入Aβ1-42,使其终浓度分别为:A组(对照组)0μmol/L;B组2μmol/L;C组5μmol/L;D组10μmol/L;E组20μmol/L,继续培养,制备Aβ1-42诱导原代海马神经细胞建立阿尔茨海默病细胞模型。MTT法测细胞存活率,TUNEL法测定细胞凋亡率。

正常海马神经细胞作为正常对照组,10μmol/L Aβ1-42致伤海马神经细胞作为模型组。模型组分为BDNF低、中、高剂量组和空白对照组,每组分别加入BDNF至5ng/m L、20ng/m L、100ng/m L、0ng/m L终浓度。分别以Ng、Nm为一抗,行免疫荧光细胞化学染色,激光共聚焦显微镜下,采集图像,测定神经元树突Ng和轴突Nm的平均荧光强度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,各组数据均以均数±标准差(±s)表示,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马神经元细胞原代培养形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察,培养至第5天神经元胞体进一步增大,突起继续增粗增长,末端分叉明显,己交织成网;至第7天神经元生长旺盛,胞体大,突起长,分枝连接成网;至第9天神经元发育成熟,呈团状聚集,整个细胞生长分布不均,神经元个体难以分出。NSE免疫细胞化学染色显示,神经元胞浆内可见棕黄色阳性颗粒,阴性对照组未见相应的免疫反应;经阳性细胞计数,培养神经元纯度为90%以上。

2.2 不同浓度Aβ1-42对海马神经细胞生存率、凋亡率的影响

正常对照组以着棕黄色细胞居多,被染色细胞的胞体较大,突起长,轴突远端生长锥染色明显。与正常对照组相比,2μmol/LAβ1-42、5μmol/LAβ1-42组着色细胞无明显减少,轴突生长锥染色少;10μmol/LAβ1-42组着色细胞减少,被染色的细胞多为胞体较小,突起较短;20μmol/LAβ1-42组细胞明显减少,残存细胞胞体小,突起断裂、消失。随着Aβ1-42浓度的增加,神经细胞生存率逐渐降低,10、20μmol/L,Aβ1-42孵育24h的神经细胞生存率明显降低(P<0.05、P<0.01)。凋亡神经元胞体明显缩小,折光性下降或消失,突起开始回缩,分枝连接出现大面积回缩断裂,细胞周围光晕消失,细胞呈点状散在分布。随着Aβ1-42浓度的增加,神经细胞凋亡率逐渐上升,凋亡神经元胞体明显缩小,折光性下降或消失,突起开始回缩,分枝连接出现大面积回缩断裂。细胞周围光晕消失,细胞呈点状散在分布,10、20μmol/L Aβ1-42孵育24h的神经细胞凋亡率明显升高(P<0.05、P<0.01)。见表1,图1~3。

(免疫细胞化学,DAB显色,×100)

(免疫细胞化学,DAB显色,×200)

(免疫细胞化学,DAB显色,×200)

*与对照组比较,P<0.05;**与对照组比较,P<0.01。

2.3 BDNF对Aβ致伤海马神经细胞突触形态及Ng、Nm表达的影响

正常对照组,分化后的细胞突起逐渐延长、密集,与邻近分化细胞交织成网状。Aβ致伤后,细胞较少,胞体较小,突起变短或消失;与0ng/m L相比,BDNF5ng/m L、20ng/m L、100ng/m L浓度组随着浓度增高,神经细胞存活状态有所恢复,有较多的圆形细胞,多数细胞突起较少且较短。见图4~11。不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,致伤神经细胞Ng的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Ng的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01);BDNF中、高剂量组间荧光强度差异无显著性意义(P>0.05)。不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,致伤原代海马神经细胞Nm的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Nm的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01)。见表2,图4~11。

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

*与正常对照组比较,P<0.05;**与正常对照组比较,P<0.01;#与空白对照组比较,P<0.01。

3 讨论

NSE鉴定发现,培养的海马神经元胞浆内见棕黄色阳性颗粒,阴性对照组无相应的免疫反应,培养神经元纯度均在90%以上。由于AD时产生较多的Aβ1-42,且Aβ各亚型中Aβ1-42毒性最强,对AD的发生及发展起着重要作用。所以本实验采用Aβ1-42制备模型。发现10μmol/L Aβ1-42可致伤海马神经细胞,导致细胞凋亡,海马神经细胞突触缩短、数目减少。因此,本实验将10μmol/L确定为Aβ1-42致伤海马神经元的较佳浓度。在影响突触结构和功能的诸多因素中,BDNF在神经元突触形成和学习记忆中起重要作用。BDNF通过调节突触的数量,促进轴突更多地分叉,增加突触可分布的领域,来提高神经元环路结构和功能上的复杂性[1];BDNF还可以调节突触囊泡的数量,通过BDNF分泌增加参与了神经前体细胞突触形成[2]。同时BDNF对多种神经元的发育、存活、分化和轴突再生中发挥的重要作用亦是由激活不同的信号转导通路完成的。神经颗粒素(Neurogranin,Ng)是一种神经元特异性蛋白。主要存在于大脑皮层、海马和嗅球,Ng分布于成熟神经元的胞体、核周、树突和树突棘,同时,少量Ng和突触后膜的致密斑有疏松联系,且多数Ng仍积聚于树突的胞质内,可作为一种中枢神经系统病变树突受损的一种标记物[3]。Ng与学习、记忆相关的海马、神经递质及其受体、蛋白激酶等物质基础,突触可塑性、尤其是LTP等神经机制的关系密切,是海马CA1区神经元与LTD及LTD的重要调节因子[4]。作为一种与细胞及组织整体发育有关的蛋白,生长相关蛋白-43(Growth Associated Protein-43,GAP-43)广泛存在于神经元细胞,是特异性分布于突触前膜上的一种磷酸蛋白,也称神经调节素(Neuromodulin,Nm)。在生长和分化及再生轴突的末端其含量最多,对神经的生长、发育、再生和突触功能维持及递质的释放均发挥着重要的作用。研究发现AD患者海马腔隙分子层中Nm的表达升高,且升高程度与AD认知功能障碍的严重程度正相关[5],推测在AD的发病机制中,神经退行性改变与神经突触可塑性的异常共存,二者处于一种危险的平衡,在AD记忆损害的进展中发挥同等重要的作用[6]。与非AD的其它神经系统退行性疾病和正常认知组比较,AD患者海马和额叶皮层Nm的表达显著下降,且分布存在区域特异性[7~9]。目前Nm已成为神经生长发育、损伤修复等神经可塑性研究的首选分子探针[10]。检测Ng、Nm这两种指标,能良好的反映出神经系统对损伤反应的可塑性。

研究发现,Aβ致伤后,细胞较少,胞体较小,突起变短或消失。不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,与0ng/m L相比,BDNF5ng/m L、20ng/m L、100ng/m L浓度组随着浓度增高,神经细胞存活状态有所恢复,有较多的圆形细胞,多数细胞突起较少且较短。致伤原代海马神经细胞Ng的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Ng的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01)。同时,不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,致伤原代海马神经细胞Nm的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Nm的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01)。说明10μmol/L Aβ1-42可导致海马神经元Ng、Nm表达降低,BDNF一定程度上可逆转损伤神经元Ng、Nm表达的降低,提高神经细胞内Ng、Nm浓度。提示BDNF可通过促进神经元的分化、轴突再生,影响突触可塑性,发挥神经损伤的修复作用。

参考文献

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Aβ海马 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

B27添加剂、DMEM/F12、胎牛血清购自GIBCO, GAP-43及Aβ25～35均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元的原代培养

选用出生1d内的Wistar大鼠, 解剖分离出海马, 经0.125%胰酶消化8～12min, 用含有10%胎牛血清的DMEM/F12种植液终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收集细胞, 用种植液制成密度为5×105个/mL的单细胞悬液, 接种于预先铺有多聚赖氨酸的24孔培养板内, 置于37℃, 5%CO2培养箱中培养。24h后换含2%B27的DMEM/F12培养基。每隔3d半量换液1次。

1.2.2 实验分组及Aβ25～35寡聚体干预

海马神经元培养7d后, 弃原培养液。加入DMEM培养液及Aβ25～35寡聚体, Aβ25～35寡聚体的制备参考王建秀等文献[1,2]。实验分为三组, 使Aβ25～35寡聚体的终浓度分别为0.2、1、5umol/L, 同时设不加Aβ25～35寡聚体的对照组。每组设8孔。1h后终止培养, 以GAP-43为一抗, 进行免疫细胞化学染色。

1.3 统计学处理

每组数据以均数土标准差undefined表示, 应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

Aβ不同浓度组对GAP-43表达的影响, 见表1。

与正常对照组比较#P>0.05, △P<0.05, *P<0.01, 1umol/L 组与5umol/L 组比较, P<0.01。

3 讨论

以往对Aβ神经毒性研究集中于聚集态, 近来研究表明, Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态即Aβ寡聚体亦可产生神经毒性作用。AD早期, 非纤维状、寡聚的Aβ可在极低浓度即迅速引起突触功能紊乱[3], 其神经毒性远强于其他不可溶性类淀粉样蛋白, 而突触功能障碍及缺失是与认知功能下降关系最为密切的病理变化[4]。脑内突触结构和功能的可塑性已被证实是学习记忆的重要神经生物学机制, 而可溶性Aβ寡聚体能够直接参与AD中突触可塑性和记忆的损伤[5], 故研究Aβ寡聚体致伤与突触蛋白的改变对于阐明AD的发病机制很有益处。GAP-43是神经组织特有的一种磷酸蛋白, 具有高亲水性并可能通过与膜脂肪酸共价连接而与神经元膜结合, 分布于突触前膜和生长锥上, 特别是在生长、分化及再生的轴突末端含量最高。突触可塑性变化与GAP-43的表达相关, 首先突触形态结构变化可导致GAP-43表达的变化。其次, 由长时程增强和长时程抑制所引发的突触效能的变化, 可影响GAP-43的磷酸化状态和mRNA的表达。有研究发现GAP-43磷酸化程度与长时程增强的表达呈正相关。因此, GAP-43可作为研究与认知相关的脑区发生突触可塑性改变的重要标志。本研究结果表明, Aβ25～35寡聚体能低GAP-43的表达, 呈剂量依赖性, 5umol/L Aβ的致伤作用非常显著。可以推测, 在此浓度作用下轴突生长基本停止, 递质释放受到抑制, 突触后信号转导和整合出现障碍, 突触可塑性严重受损。随着对Aβ寡聚体、突触可塑性机制的深入的研究与了解, 可进一步揭示AD的发病机制, 将会促进靶向Aβ寡聚体的药物的开发和临床应用, 可能会在神经变性之前阻断Aβ寡聚体对突触的损害, 重新建立神经突触, 为AD的早期干预、治疗以及新药物的研发开拓了新的思路与方向。

关键词：Aβ2535寡聚体,原代培养,神经元突触

参考文献

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Aβ海马 篇4

1 材料与方法

1.1 主要试剂

六氟异丙醇 (HFIP) 、无酚红F12购自Sigma公司, B27添加剂、DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco, Ng及Aβ25-35均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35寡聚体的制备:

将Aβ25-35肽从-20℃冰箱取出放在冰上, 在通风橱内将HFIP放在冰上预冷, 每1mg Aβ25-35加入220μLHFIP, 盖上离心管盖在室温放置60min, Aβ25-35充分溶解后放回冰上10min, 再将Aβ25-35-HFIP溶液放置室温下挥发、过夜。次日再置于通风橱内使HFIP挥发殆尽 (约2h) 。每管加44μLDMSO, 吹打混匀后, 每管加9386μLF12培养基, 4℃孵育24h, 4℃, 14000rpm离心10min后, 转移上清液至新管, 分装, 放入-20℃, 储存浓度为100μmol/L。

1.2.2 海马神经细胞的原代培养:

选用出生3d内的Wistar大鼠, 解剖分离出海马, 经0.125%胰酶于37℃培养箱中消化8~12min, 用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收集细胞, 用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基制成细胞密度为5×105个/m L的单细胞悬液, 接种于预先铺有多聚赖氨酸的24孔培养板内的盖玻片上, 置于37℃, 5%CO2培养箱中培养, 24h后换含2%B27的DMEM/F12培养基, 每隔3d半量换液1次。

1.2.3 实验分组及Aβ25-35寡聚体干预:

海马神经细胞培养7d后, 弃原培养液, 加入DMEM培养液及Aβ25-35寡聚体。实验分为三组, 使Aβ25-35寡聚体的终浓度分别为5、10、20μmol/L, 同时设不加Aβ25-35寡聚体的对照组 (以相应体积的DMEM培养液代替) , 每组设8孔, 1h后终止培养, 进行免疫细胞化学染色。

1.2.4 免疫细胞化学染色:

4%多聚甲醛固定10min, PBS洗涤后, 加入0.3%Triton X-100, PBS洗涤, 滴加0.3%H2O2甲醇30min, 5%正常马血清室温封闭60min。加入一抗Ng (1∶200, 阴性对照以PBS代替) , 室温反应2h后入4℃冰箱过夜。次日PBS洗涤后加入生物素化二抗工作液山羊抗兔Ig G, PBS洗涤后滴加辣根酶标记链霉卵白素, PBS洗涤后常规梯度乙醇脱水, DAB显色, 二甲苯透明, 封片。

1.3 图像分析与统计处理

倒置显微镜下, 以胞浆内有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。在200倍镜下分别计数5个孔各5个视野的阳性细胞数和总细胞数, 计算阳性细胞的百分比, 以此代表神经元纯度。倒置显微镜下 (LEICA DM4000 B) 采集图像, 进行灰度定量分析 (Leica Qwin V3) , 平均灰度值1~255 (白色平均灰度值为255, 黑色平均灰度值为0) 。

1.4 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析, 以均数土标准差 (±s) 表示, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马神经细胞原代培养形态学观察

倒置相差显微镜下观察, 接种24h后, 几乎全部细胞己贴壁, 可见光滑的突起。第3天, 神经细胞胞体增大, 突起延长并出现分枝, 胞体呈三角形或椭圆形;第5天, 神经细胞胞体进一步增大, 突起继续增粗增长, 末端分叉明显, 己交织成网, 胞体和突起晕光明显, 立体感强;第7天, 神经细胞生长旺盛, 胞体大, 突起长, 分枝连接成网, 见图1。

2.2 Aβ寡聚体不同浓度组致伤原代培养海马神经细胞的形态学观察

实验第一部分:分别以5、10、20μmol/L浓度的Aβ25-35与神经细胞共同培养1h后镜下观察发现, 10μmol/L组的细胞数目明显减少, 大部分神经元胞体缩小, 细胞间出现明显空隙, 突起数目减少, 断裂或消失, 并可见到少量细胞碎片。20μmol/L浓度的Aβ组细胞突起消失, 细胞胞膜已破裂, 有很多细胞碎片, PBS冲洗后, 碎片脱落, 无法做免疫细胞化学染色。

2.3 Aβ寡聚体不同浓度组对Ng表达的影响

实验第二部分:正常对照组, 棕黄色细胞多, 被染色的细胞多为胞体较大, 突起长, 树突多处可见棕黄色颗粒 (图2) 。与正常对照组相比, Aβ5μmol/L组着色细胞无明显减少, 突起较长, 平均灰度值略有增大, Ng表达略有减少, 但差异无显著性 (P﹥0.05) (图3) ;Aβ10μmol/L组着色细胞减少, 被染色的细胞多为胞体较小, 突起较短 (图4) , Aβ20μmol/L组细胞明显减少, 残存细胞胞体小, 突起断裂、消失 (图5) 。Aβ10μmol/L、20μmol/L组灰度值增大, Ng表达减少, 差异有显著性 (P<0.01) ;其中, Aβ10μmol/L组最明显, 与Aβ5μmol/L组比较 (P<0.01) , 差异具有统计学意义。Aβ引起的PSD-95减少具有剂量依赖性, 以Aβ10μmol/L为致突触损伤的适宜浓度见表1。

与正常对照组比较﹟P>0.05, *P<0.01;10μmol/L组与5μmol/L组比。

3 讨论

目前认为, Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件, 超前于其它脑区损伤和临床症状数年[4]。然有大量的证据显示Aβ纤维发挥了多种对神经元的毒性, 然而最近有研究表明, Aβ由可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节, Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态, 即Aβ寡聚体亦可产生神经毒性作用。动物实验研究表明, Aβ寡聚体可以在生理水平明显抑制大鼠海马的突触传递[5,6], 提示可溶性Aβ寡聚体可能是导致AD病人脑内突触功能障碍和突触丢失的主要效应物。

突触可塑性是学习和记忆的基础, 在AD早期主要表现为显著的记忆损害, 资料表明这一表现起始于海马突触功效的微弱改变, 而此改变早于显著的神经元退行性变[2,3], 而突触丧失与AD患者的痴呆程度直接相关[7]。

神经颗粒素 (Neurogra-nin, Ng) 属Calpacitin蛋白家族, 是一种神经元特异性蛋白。主要存在于大脑皮层、海马和嗅球, Ng分布于成熟神经元的胞体、核周、树突和树突棘, 但多数Ng仍积聚于树突的胞质内, 可作为一种中枢神经系统病变树突受损的一种标记物[8,9]。Ng与学习、记忆相关的海马、神经递质及其受体、蛋白激酶等关系密切, 在正常生理状态下, 即细胞内Ca2+水平低时, Ng与Ca M结合, 而在细胞内高Ca2+浓度状态下, Ng与Ca M分离, 释放出游离的Ca M, 从而实现对Ca M及Ca2+/Ca M依赖性蛋白酶, 如Ca2+/Ca M-依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium-calmodulin-dependentkinaseⅡ, Ca MKⅡ) 及Ca2+/Ca M-依赖性腺苷酸环化酶等活性的调节。Ng在突触的发育、突触的稳定性和可塑性中起重要作用[10], 因此, 我们以Ng做为突触结构和功能可塑性的观察指标, 摸索Aβ25-35寡聚体致突触损伤的浓度, 亦可用做观察药物突触保护作用的指标。

实验中我们以5、10、20μmol/L浓度的Aβ25-35寡聚体加入原代培养7d的大鼠海马神经元培养基中, 观察发现, 10μmol/L Aβ25-35寡聚体组细胞数目减少, 大部分神经元胞体缩小, 突起数目减少, 断裂或消失, 并可见到少量细胞碎片, 而20μmol/L寡聚体浓度组细胞突起消失, 细胞胞膜已破裂, 有很多细胞碎片, PBS冲洗后, 碎片脱落, 无法做免疫细胞化学染色。免疫细胞化学染色后采集图像, 进行灰度定量分析, 白色灰度值最高为255, 黑色最低为0, 灰度值越低, 表明着色越多, Ng表达越强。结果, 5μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达略有减少, 但与正常组比较差异无显著性 (P﹥0.05) ;10μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达减少较明显;20μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达明显减少。试验再重复2次, 结果相同。故认为Aβ25-35寡聚体引起的Ng减少具有剂量依赖性, 致突触损伤模型的最佳有效浓度为10μmol/L。

本研究结果表明, Aβ25-35寡聚体能降低Ng的表达, 呈剂量依赖性, 10μmol/L Aβ的致伤作用非常显著。可以推测, 在此浓度作用下突触后信号转导和整合出现障碍, 突触可塑性严重受损, 此数据可为AD早期突触损伤模型的建立提供实验依据。

随着对Aβ寡聚体致伤机制的深入了解, 对AD复杂的病因及发病机制的不断探究, 特别对于AD早期认知障碍与突触功能损害的进一步认识, 将为AD的发病机制研究探索出新的途径, 也为AD的早期干预、治疗以及新药物的研发开拓新的思路与方向。

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Aβ海马 篇5

关键词：淀粉样蛋白1-40,阿尔茨海默氏病,胰岛素样生长因子,海马

阿尔茨海默氏病 (Alzheimer’s disease, AD) 在老年人群中患病率、致残率以及致死率都很高[1]。给家庭和社会带来的负担非常严重。现有各种治疗手段, 均为依据相应病因和发病机制假说而进行的尝试。AD发病机制中已经被广为接受的一种观点是:脑中淀粉样斑块积聚是引发AD系列病理改变的触酶[2]。这种包括淀粉样蛋白β (amyloid β, Aβ) 的老化斑块是AD的神经病理标志, 并且是AD的突出病理特征, Aβ淀粉样蛋白的神经毒性可能是导致AD 痴呆重要原因之一, 寻找使Aβ减少的特殊药物, 则是一种“治本”的方法[3]。

在不断探索AD的过程中, 胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1) 走入了研究者的视野, 并成为目前前景广阔的治疗AD的候选因子[4,5]。IGF是一种多功能细胞增殖调控因子[6], 因其化学结构与胰岛素原类似而得名, IGF系统主要包括两种多肽, IGF-1与胰岛素原60%同源, IGF-2与胰岛素原40%同源。IGF-1对细胞正常生长和发育、骨再建、胚胎发育、神经生长、肿瘤免疫、防止脑损伤等方面起着十分重要的作用。已有研究表明, IGF-1对维持神经元的存活、生长、分化及神经损伤后的修复与再生具有十分重要的作用, AD病人脑内IGF-1的改变可能与AD的发病有一定的关联[7]。为进一步探讨IGF-1对AD的保护作用, 本实验利用大鼠AD模型, 皮下注射IGF-1作为干预, 对大鼠认知行为、病理以及海马区Aβ1-40表达进行观察, 为合理应用IGF-1治疗AD提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Aβ1-40 (美国Sigma公司提供) , 大鼠脑立体定位仪 (STW-1三维推进器, 成都仪器厂) , 数显电热恒温水浴箱 (HH.W21.600S, 上海跃进医疗器械厂) , Morris水迷宫 (中国医学科学院药物研究所) , 摄影显微镜 (OLYMPUS U-SPT 型) , 重组IGF-1 (英国Peprotech EC公司) , 抗Aβ1-40多克隆抗体 (美国Sigma公司提供) , 免疫组化检测试剂盒 (武汉博士德公司) 。

1.2 实验动物和分组

健康雄性Wister大鼠 (黑龙江省哈尔滨兽医研究所提供) , 体重300 g±20 g, 分笼饲养, 每笼8只。将大鼠随机分为4组, 每组8只。 模型组;立体定向双侧海马CA1区注射Aβ1-40;正常对照组:不进行任何处置;盐水治疗组:造模1 d后每日08:00给予生理盐水 (1 mL/kg) 腹部皮下注射, 用药21 d;IGF-1组:造模1 d后每日08:00给予IGF-1 (50 μg/kg) 腹部皮下注射, 用药21 d。 根据文献[8]及预试验结果选择此给药剂量。

1.3 Aβ1-40的预处理

用无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成2 μg/μL, 置入电热恒温箱37 ℃孵育1周, 使其变为凝聚态的Aβ1-40。

1.4 AD动物模型的复制[9]

手术大鼠经10%水合氯醛 (3 mL/kg) 腹腔注射麻醉, 颅顶部沿纵轴切一纵向切口 (约1.5 cm) 达颅骨, 参照大鼠脑立体定位图谱[10], 开颅暴露硬脑膜, 向海马内缓慢注入凝聚态Aβ1-405 μL。常规饲养。IGF-1组给予IGF-1皮下注射, 术后14 d, 作行为学检测, 术后21 d取脑做病理学观察和免疫组化。

1.5 行为学检测 (水迷宫)

设定训练时间已到, 计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹, 自动计算出动物在水池中所游过的路程、找到平台所需的时间 (即潜伏期) 及初始角度 (入水瞬间大鼠身体长轴与入水点平台连线之间的夹角) 。分别记录大鼠潜伏期, 并记录每只大鼠在2 min内经过平台的次数以及在平台所在象限内逗留的时间 (空间探索试验) , 作为评价大鼠学习成绩的指标。大鼠的潜伏期越短而定向航行、空间探索指标越大, 则这只大鼠越聪明。

1.6 病理学观察

行为学测试后进行心血管灌注固定法。冠状切面经固定、石蜡包埋, 连续冠状组织切片, 分别行HE、刚果红染色及免疫组化。

1.7 免疫组织化学检查

免疫组化染色采用PV二步法。

1.8 图像分析

以海马神经细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒沉着为阳性结果。每组取8张脑片, 每个视野计数100个细胞, 计算出各个视野中阳性细胞数, 取其均值。

1.9 统计学处理

计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用SPSS 13.0分析。

2 结 果

2.1 定向航行试验

大鼠造模14 d后, 用Morris 水迷宫法检测。定向航行试验结果在5 d的训练中, 4组逃避潜伏期均不断缩短, 且从第3天开始, 大鼠逃避潜伏期IGF-1组与正常组相比无统计学意义, 与模型组、盐水组相比有统计学意义 (P<0.01) 。详见表1。

2.2 空间探索试验

(见表2) 在5 d训练结束后, 于第6天撤去站台, 以大鼠穿越站台次数及大鼠在第Ⅲ象限活动时间作为衡量记忆好坏指标, 模型组穿越站台次数比正常组少55%, 模型组大鼠在第Ⅲ象限活动时间比正常组少40%, 与盐水组相似, IGF-1组与正常组比较无统计学意义 (P>0.05) 。

2.3 Aβ1-40海马注射后局部病理改变

光镜下正常组大鼠海马区未见神经元损伤, 神经元排列规则、紧密、形态完整。模型组及盐水对照组大鼠海马区注射点附近可见颗粒细胞带明显受损, 局部神经元大量缺失, 细胞排列疏松紊乱, 部分细胞缺失, 注射点附近出现弥漫性胶质细胞反应, 细胞增生、聚集, 核小深染, 成扁圆形, 判断为胶质细胞增生, 锥体细胞数量较对照组明显减少。IGF-1注射组颗粒细胞带轻度受损, 神经元排列尚规则, 与模型组之间有明显差异。刚果红染色模型组可见细胞排列紊乱, 胞浆内可见深染, 提示为淀粉样蛋白聚集, 正常组染色较浅, 细胞排列规则, 且胞浆未见异常改变, IGF-1组染色较浅, 细胞形态完整, 接近正常组。

2.4 海马CA1区Aβ1-40的表达

模型组及盐水对照组海马CAl区可见大量棕褐色阳性细胞, 胞质及轴突、树突均清晰着色, 正常组大鼠海马CA1区偶见Aβ1-40免疫阳性神经元;同拟AD模型组比较, IGF-1组大鼠海马CA1区Aβ1-40免疫阳性神经元明显减少或消失 (P<0.01) 。详见表3。

3 讨 论

AD是一种以慢性进行性记忆、认知等智能障碍为主要临床表现、与增龄相关的中枢神经系统 (CNS) 退行性疾病, 其典型的病理变化是脑内出现大量的因β-淀粉样蛋白积聚所形成的老年斑、因 tau 蛋白异常磷酸化导致的神经元纤维缠结和神经元丢失等。海马作为边缘系统的重要组成部分, 是近记忆回路的重要结构, 是学习记忆的重要解剖基础和神经中枢, CA1在学习、记忆中担负重要作用[11], 海马与机体衰老、阿尔茨海默病及癫痫发作有着非常密切的关系[12]。

IGF-1及其受体能调节乙酰胆碱的合成与释放[13], 抑制蛋白的高度磷酸化, 从而揭示了IGF-1影响认知功能的可能机制。在老年动物中枢神经系统中, 尤其是海马结构中IGF-1表达呈年龄相关性下降, 而IGF-1有着类似于神经生长因子 (NGF) 的促进神经突触形成和维持神经细胞功能的作用, 可改善老龄动物的记忆学习能力[14]。相反, 给予IGF-1抗体的大鼠学习记忆能力显著下降。2000年Guan等[15]证实外源性IGF-1可增强并维持海马区胆碱乙酰转移酶活性, 故推测IGF-1通过催化乙酰胆碱的形成, 保护胆碱能神经元, 改善脑功能, IGF-1在以智能丧失和行为异常为主要表现的老年性痴呆的治疗中可能具有一定的临床价值。Tham等[16]发现AD患者血清IGF-1水平较正常人明显升高, 血清IGF-1水平的升高是AD患者IGF缺乏敏感性的一种代偿。Murialdo等[17]认为AD患者血清IGF-1较正常为低。

本实验采用海马微量注射凝聚态Aβ1-40的方法建立拟AD大鼠模型, 对注射部位、注射量及注射药物的孵化作了改进, 本实验评价学习记忆障碍的设备是带摄像装置及分析软件的水迷宫, 实验数据不受任何人为因素的影响, 更为客观、真实可靠。本实验发现, 拟AD大鼠模型组大鼠的学习记忆能力明显下降, 而应用IGF-1后, 大鼠在定向航行试验、空间探索试验中学习记忆能力明显改善, 表明IGF-1具有改善AD大鼠学习记忆的作用。在海马HE、刚果红染色方面, 模型组表现颗粒细胞带明显受损, 局部神经元大量缺失, 细胞排列疏松紊乱, 部分细胞缺失, 注射点附近出现弥漫性胶质细胞反应, IGF-1组颗粒细胞带轻度受损, 神经元排列尚规则。IGF-1皮下注射3周的拟模型大鼠, 与模型组比较, CA1区Aβ1-40表达明显减少或消失, 提示IGF-1具有改善拟 AD模型大鼠脑组织病理改变及降低Aβ1-40表达的作用, 在实验中, 设立了盐水治疗组, 结果显示生理盐水对治疗没有影响。据此推论, IGF-1皮下注射拟 AD模型大鼠使Aβ1-40表达减少可能是大鼠学习记忆能力改善的机制之一, 临床上尚缺乏足够资料, 需要进一步验证, 对 IGF-1的深入研究是探讨人类认知障碍机制的重要途径之一。

Aβ海马 篇6

关键词：β-细辛醚,海马,B细胞淋巴瘤/白血病-2,Bax

抑郁症 (depression) 是临床较为常见的精神疾病性障碍, 病因较为复杂, 病程较长, 发病率呈逐年上升趋势[1,2]。中药石菖蒲具有提神醒脑、开窍益智的作用, 是中医治疗脑病常用药物之一, 现代药理学研究提示, 石菖蒲具有较好的抗抑郁作用[3]。本实验通过研究石菖蒲主要有效成分β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马区的作用, 探讨其对海马神经元凋亡因子Bax (Bcl-2 associated X protein, Bax) 、B细胞淋巴瘤/白血病-2 (B cell lymphoma/leukemis-2, Bcl-2) 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

2~3个月龄的清洁级雄性SD大鼠, 体重180~200 g, 由大连医科大学实验动物中心提供, 许可证号:SCXK (辽) 2008-0002。

1.1.2 药品

盐酸氟西汀胶囊 (由苏州俞氏药业有限公司提供) , β-细辛醚标准品 (由天津一方科技有限公司提供) 。

1.1.3 其他材料

试剂兔抗鼠Bax抗体 (购于Abcam公司) 、兔抗鼠Bcl-2抗体 (购于Abcam公司) 。免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂、PBS缓冲液 (购于福州迈新生物技术开发有限公司) 。

1.1.4 仪器

光学显微镜CX11R BSF (Olympus) , 图像分析系统DP801 (Alphamiager公司) 。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

大鼠适应性喂养1周, 自由进食水。保持环境干燥, 通风, 温度18~20℃, 无噪声, 无人为光源。进行敞箱实验 (Open-field-test) , 选取得分相近的80只大鼠进行分组, 按随机数字表法分为四组:正常组、β-细辛醚组、氟西汀组、模型组, 每组20只。

1.2.2具体方法

除正常组外每笼单只饲养, 正常组不给予任何刺激。β-细辛醚组、氟西汀组、模型组, 均接受慢性轻度不可预见性应激刺激 (Chronic unpredictable mild stress stimulation, CUMS) :每天进行一种不可预知的刺激, 持续21 d, 每种刺激使用不超过4次, 避免大鼠适应刺激, 刺激方法根据Katz法改进。具体方法:摇晃 (30 min) , 倾斜鼠笼 (45°, 24 h) , 禁食水 (24 h) , 束缚 (24 h) , 热刺激 (45℃, 5 min) , 冰水游泳 (4℃, 5 min) , 夹尾 (3 min) , 潮湿环境 (100 g垫料中加入200 m L水, 24 h) 。造模开始计为第1天。第2天起, β-细辛醚组给予10 g/L的β-细辛醚组混悬液, 按25 mg/ (kg·d) 灌胃给药。氟西汀组给予10 g/L的氟西汀混悬液, 按1.2 mg (/kg·d) 灌胃给药。模型组给予等量生理盐水, 每天灌胃一次。

1.2.3免疫组织化学法检测大鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白表达

石蜡切片脱蜡和水化后进行抗原修复。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶 (SP) 法进行免疫组织化学染色, 并DAB显色, 经过苏木素复染、PBS洗涤、盐酸乙醇分化后返蓝, 常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野, 使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像采集处理, 图像分析系统进行分析, 测出Bax、Bcl-2蛋白抗原表达的总面积、阳性细胞数和平均吸光度IA, 计算其积分吸光度。

1.3 统计学处理

运用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料采用 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马区Bax蛋白表达

模型组大鼠海马区Bax蛋白表达较正常组显著增强, 两组积分光密度比较差异有统计学意义 (P<0.05) , β-细辛醚组、氟西汀组与模型组比较积分光密度明显降低 (P<0.05) , 见图1、表1。

2.2 各组大鼠海马区Bcl-2蛋白表达

模型组的Bcl-2蛋白表达明显低于正常组, 积分光密度显著降低 (P<0.05) 。β-细辛醚组、氟西汀组积分光密度介于两者之间, 与模型组比较明显升高 (P<0.05) , 见图2、表1。

注:正常组 (图1a) ;模型组 (图1b) ;氟西汀组 (图1c) ;β-细辛醚组 (图1d)

3 讨论

抑郁症的发病率逐年增高, 并且呈现年轻化的趋势。通过孤养大鼠模拟抑郁症情境, 探讨抑郁症的发生与发展机制, 是目前一种可靠的研究手段。前期大量试验证实, CMUS结合孤养模式建立的大鼠抑郁模型, 可以稳定的模拟抑郁症行为学表现[4,5]。并且已经发现抑郁症的发生与大鼠海马神经细胞凋亡密切相关[6]。Bcl-2是凋亡蛋白家族中最重要的一种调控蛋白, 和Bax、Bad、Bak等共同构成了Bcl-2蛋白家族。有研究证实, Bax/Bcl-2的比值变化趋势更能描述细胞凋亡发生[7]。其比值升高, 说明细胞发生凋亡的可能性增加, 反之降低。

注:正常组 (图2a) ;模型组 (图2b) ;氟西汀组 (图2c) ;β-细辛醚组 (图2d)

*与正常组比较, P<0.05;△与模型组比较, P<0.05

该实验结果表明, 模型组经过21 d造模后, 产生明显抑郁症状, HE染色示海马组织发生明显改变, 与前期研究结果一致[8,9]。氟西汀组及β-细辛醚组经过药物灌胃后, 抑郁症状减轻, 并且抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加, 促凋亡蛋白Bax表达降低。

抑郁症的病理机理非常复杂, 目前所做的研究基本是基于某一特定通路展开的研究, 然而其发生与发展是多种通路共同协作产生的结果, 为了更好地结合现有的研究, 需要进一步完善各个通路之间的关系, 以期找到治疗抑郁症的靶向因子, 并使其尽早应用于临床治疗。

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Aβ海马 篇7

1材料

1.1动物

雄性、7月龄清洁级C57小鼠, 体重 (23±2) g, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证号:SCXK (京2012-0001) 。

1.2药品

AEWH由黑龙江中医药大学周忠光教授购买, 田明教授制备成水煎剂、烘干后制备成干粉、-20℃保存于冰箱中备用。实验使用时加热, 临时配制成AEWH溶液。吡拉西坦由湖南迪诺制药有限公司生产, 批号:130325。

1.3仪器

TGL-16G台式离心机:上海安亭科学仪器厂生产;PLZOZ-S型电子天平:梅特勒-托利多仪器有限公司生产;6100型RT-雷杜酶标仪:美国RT公司生产。

1.4试剂

Aβ1-42:Sigma公司生产;IL-1β酶联免疫试剂盒:南京建成生物工程研究所生产, 批号:20140401;其他试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1 AEWH的提取

实验称取300g通天草放高颈烧瓶中, 加5 000m L蒸馏水, 搅匀, 浸泡2h, 煎煮2h, 含通天草的药液用干净纱布过滤、拧干, 得到第一次滤液。第一次水提物残渣再放入高颈烧瓶中, 再加入5 000mL蒸馏水, 重复上面的过程, 会得到第二次的滤液。合并2次滤液, 浓缩, 制备成干膏、干粉, -20℃保存备用。

2.2 AD模型的复制

C57小鼠水合氯醛麻醉后, 小鼠双侧脑室一次性注入5μL凝聚态Aβ1-42 (浓度为80pmo·lμL-1) 。同时对照组C57小鼠双侧脑室注射等量生理盐水。

2.3分组

复制AD模型小鼠共24只, 随机分为4组, 其中模型组6只、吡拉西坦组6只、AEWH高剂量组6只、AEWH低剂量组6只。另设对照组C57小鼠6只。

2.4给药

选择对照组、模型组给予生理盐水灌胃;吡拉西坦组给予吡拉西坦0.62g·kg-1·d--1灌胃;AEWH高剂量组给予AEWH2.0g·kg-1·d-1灌胃;AEWH低剂量组给予AEWH 0.5g·kg-·1d-1灌胃, 灌胃持续时间18d。

2.5海马IL-1β的检测

实验结束后冰台上操作, 小鼠断头迅速取海马, 匀浆, 静置1h, 4℃离心机3 000romin-1离心20min, 吸取上清液, 分装EP小管中, -20℃低温保存于冰箱中备用。按酶联免疫试剂盒说明书进行操作, 450nm波长处测定各孔吸光度 (A) , 根据标准曲线求出IL-1β的含量。

3结果

根据标准曲线求出方程:Y=0.002 3 X+0.420 6, R2=0.874 2, 计算出小鼠海马组织IL-1β含量 (见图1) 。结果表明, 与对照组比较, 模型组小鼠海马组织IL-1β含量明显升高 (P<0.05) ;与模型组比较, 吡拉西坦组 (0.62g·kg-·1d-1) 、AEWH高剂量组 (2.0g·kg-1·d-1) 小鼠海马组织IL-1β含量明显降低 (P<0.05) ;与模型组比较, AEWH低剂量组 (0.5g·kg-1·d-1) 小鼠海马组织IL-1β的含量降低不明显 (P>0.05) (见表1) 。

4讨论

采用酶联免疫的方法检测IL-1β的结果表明, 与对照组比较, 模型组小鼠海马组织IL-1β含量明显升高 (P<0.05) , 提示模型组海马组织IL-1β含量明显升高, 产生明显的炎症反应, 引发AD疾病;与模型组比较, AEWH高剂量组 (2.0g·kg-1·d-1) 小鼠海马组织IL-1β含量明显降低 (P<0.05) , 说明高剂量的AEWH可通过影响IL-1β的水平改善AD临床症状;而与模型组比较, AEWH低剂量组 (0.5g·kg-1·d-1) 小鼠海马组织IL-1β的含量降低不明显 (P>0.05) , 说明低剂量AEWH不可通过影响IL-1β的水平改善AD临床症状。以上综合提示采用AEWH高剂量 (2.0g·kg-·1d-1) 治疗AD效果较好, AEWH可以通过抑制IL-1β来达到治疗AD的目的。

参考文献

[1]孙博, 费洪新, 姜波, 等.阿尔茨海默病发病机制初探[J].中医药信息, 2014, 31 (3) :26.

[2]魏铁花, 李宝龙, 刘旭, 等.通天草提取物对拟阿尔茨海默氏病模型大鼠学习记忆能力及其海马区组织相关蛋白表达的影响[J].吉林中医药, 2013, 33 (2) :179-181.