人参皂苷Rb1论文（共6篇）
人参皂苷Rb1论文 篇1
田七花为五加科植物田七的干燥花蕾, 田七花既是名贵中药药品, 又可作为食品、保健品, 也可用于泡茶[1], 还可与其他食物一起炒肉、煲汤等[2], 长期食用对治疗高血压、咽痛音哑和养生颇有裨益[3,4]。田七花中含有皂苷、多糖、挥发油等多种化学成分[5,6], 皂苷是其主要生理活性成分, W.Z.Yang等[7]从田七花中鉴定出170种单体皂苷, 其中以人参皂苷Rb1含量较多[8]。关于田七的研究大都集中在其块根, 由于田七花使用区域受限, 因此研究也较少。虽然有关于应用HPLC法控制其质量的报道[9,10], 但HPLC法较耗时, 运行时间一般都在40 min以上, 为此笔者参照参考文献[11]对试验条件进行优化, 建立了HPLC-MS/MS分析方法, 以期为田七花总皂苷 (SF-PN) 及以其为主要成分的保健食品、药品含量检测提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 药品
人参皂苷Rb1 (批号为110704-201223) , 购自中国药品生物制品检定所;紫杉醇 (批号为100382-201201) , 购自昆明科翔生物科技有限公司;田七干燥花蕾, 购自云南文山田七研究所。
1.2 主要试剂
D101大孔吸附树脂, 购自泰州恒泰器化玻有限公司;乙腈、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等, 均购自扬州科能生物科技有限公司。
1.3 主要仪器
串联四级杆质谱仪 (型号为API4000) , 配有电喷雾离子源 (ESI) 及Analyst 1.4.1数据处理系统, 购自美国ABI公司;液相色谱系统 (型号为Agilent1100, 包括四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱) , 购自美国Agilent公司;旋转蒸发仪 (型号为RE-3000) 、循环水真空泵 (型号为SHZ-Ⅲ) , 购自上海亚荣生化仪器厂。
1.4 HPLC-MS/MS分析条件
1.4.1 液相色谱条件
色谱柱为BDS HYPERSUL C18 (150 mm×2.1 mm, 5μm) ;流动相为乙腈 (B) 和水 (A) ;柱温为30℃;流速为0.3 m L/min;进样量为10μL。
1.4.2 质谱条件
采用电喷雾离子源 (ESI) 负离子模式进行检测, 检测模式为多反应离子监测模式 (MRM) 。具体参数:离子喷雾电压 (IS) 为4 100 V;离子源雾化温度 (TEM) 均为450℃;去集簇电压 (DP) 为110 V;激发碰撞电压 (CE) 为-65 V。用于定量分析的对照品离子对为人参皂苷Rb1 (m/z1 107.9→783.7) , 内标物紫杉醇 (m/z 852.5→525.3) 。
1.5 样品处理
1.5.1 对照品及内标溶液的配制
精密称取人参皂苷Rb14.33 mg于10 m L容量瓶中, 得到对照品储备液。精密称取内标物紫杉醇1.01 mg于10 m L容量瓶中, 加入甲醇至刻度, 超声溶解30 min;取上述溶液100μL至10 m L容量瓶中, 加入甲醇至刻度, 蜗旋振荡1 min, 即得内标溶液。
1.5.2 样品溶液的制备
参照参考文献[12]中的方法制备田七花总皂苷。精密称取田七花总皂苷粉末0.2 g, 加甲醇定容至10 m L, 超声溶解, 得样品储备液;量取内标溶液100μL和样品储备液100μL, 加甲醇定容至1 m L, 涡旋振荡溶解, 经0.45μm微孔滤膜过滤, 得样品溶液。
2 结果与分析
2.1 方法专著性考查结果
按照1.4中的条件对田七花总皂苷中人参皂苷Rb1进行测定, 记录离子流色谱图, 结果在选定色谱条件下, 对照品人参皂苷Rb1和内标物紫杉醇分别在约7.84, 9.35分钟时被洗脱出来, 对照品和内标物的峰形和分离度较好, 灵敏度强, 同时用保留时间和离子对的响应强度进行分析, 更有效地避免了其他物质对这种皂苷测定的干扰, 具有较好的专属性和特异性。
2.2 标准曲线与线性范围的考查结果
精密量取对照品储备液适量, 加入适量内标溶液, 配制成人参皂苷Rb1浓度分别为0.159, 0.399, 1.60, 3.99, 16.0μg/m L的对照品溶液, 取10μL注入质谱仪, 以样品峰面积与内标物紫杉醇峰面积之比为纵坐标, 对照品溶液浓度为横坐标, 用加权最小二乘法进行回归, 求得直线回归方程为y=0.613x+0.068, r=0.995 2, 线性范围为0.159~16.0μg/m L。
2.3 精密度试验结果
精密量取同一对照品溶液10μL, 重复进样6次, 结果人参皂苷Rb1峰面积和内标物紫杉醇峰面积比值的相对标准偏差 (RSD) 为1.96%, 表明仪器精密度良好。
2.4 稳定性试验结果
精密吸取按照1.5.2中的方法制备的同一样品溶液10μL, 将样品溶液分别在0, 2, 4, 8, 12, 24小时时进样并测定, 结果样品中人参皂苷Rb1峰面积和内标物紫杉醇峰面积比值的RSD为1.65%, 表明样品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5 重现性试验结果
取同一样品 (批号为20130809) , 按照1.5.2中的方法平行制备6份样品溶液, 参照1.4中的色谱条件测定样品中人参皂苷Rb1含量。结果样品中人参皂苷Rb1的平均含量为1.58 mg/g, RSD为1.38%, 表明本方法重现性良好。
2.6 加样回收率试验结果
取已知含量的样品 (批号为20130215) 6份, 0.2 g/份, 精密称定, 按照1.5.2中的方法制备样品储备液, 取样品储备液100μL和内标物紫杉醇溶液100μL, 精密加入一定量的对照品储备液, 并用甲醇稀释至1 m L, 涡旋振荡2 min, 经0.45μm有机滤膜过滤, 即得样品溶液, 按照1.4中的色谱条件进行操作, 求得样品峰面积与内标物峰面积的比值, 再代入至2.2中的回归方程求出样品溶液中皂苷的含量, 计算回收率, 结果见表1。
2.7 样品含量的测定结果
称取3份田七花总皂苷样品各0.2 g, 按照1.5.2中的方法制备样品溶液, 参照1.4中的色谱条件进行操作, 采用标准曲线计算田七花总皂苷中人参皂苷Rb1的含量, 结果见表2。
mg·g-1
3 结论与讨论
1) 田七花的组成成分复杂, 含有大量叶绿素, 在测定人参皂苷Rb1时, 必须排除主要基质成分或色素成分的干扰。本研究参照参考文献[12]中的方法, 以乙醚萃取去除叶绿素等脂溶性物质, 以正丁醇萃取出大部分皂苷类物质, 再选用D101大孔吸附树脂进行柱层析, 用水洗去多糖, 最后收集90%乙醇洗脱液, 此方法可较好地对田七花皂苷类成分进行富集和纯化。
2) 人参皂苷Rb1的最大吸收波长为203 nm, 田七花总皂苷里面含有多种成分, 紫外末端吸收多, 采用普通的HPLC紫外检测器难以进行高灵敏度检测, 且专属性较差。皂苷类化学成分极性大、难挥发、热不稳定, 经典的电子轰击电离 (EI) 对其进行结构分析也很困难。而电喷雾离子源同时结合多级质谱功能, 可以较快地获得结构信息。在选定内标物时, 经筛选比较发现紫杉醇纯度高、易保存, 与被测成分的化学性质相似, 有较好的质谱响应, 稳定性较好, 内源物质无干扰。本试验建立的HPLC-MS/MS分析方法灵敏度高、重现性好, 符合食品和中药样品分析的要求, 较其他方法节省了大量时间和成本[9], 可用于人参皂苷Rb1的定量分析, 也为不同田七花保健食品、药品含量测定提供了参考。
摘要：为了测定田七花总皂苷中人参皂苷Rb1的含量, 试验采用HPLC-MS/MS分析方法, 以BDS HYPERSUL C18 (150 mm×2.1 mm, 5μm) 柱为色谱柱;乙腈-水 (梯度洗脱) 为流动相;柱温为30℃;检测模式为多反应离子监测模式 (MRM) , 用于定量分析的对照品离子对为人参皂苷Rb1 (m/z1 107.9→783.7) , 内标物紫杉醇 (m/z 852.5→525.3) 。结果表明:人参皂苷Rb1标准曲线的线性范围为0.15916.0μg/m L, 精密度和准确度等均符合样品分析要求。说明该方法准确、灵敏、特异性强, 适用于田七花总皂苷及其制剂中人参皂苷Rb1浓度的检测。
关键词：HPLC-MS/MS,人参皂苷Rb1,多反应离子监测模式 (MRM) ,田七花总皂苷,紫杉醇
参考文献
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人参皂苷Rb1论文 篇2
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1200系列高效液相色谱仪(G1322A脱气机,G1311A四元泵,G1313A自动进样仪,G1316A柱温箱,Chemstation色谱工作站)。
1.2 试药
三七皂苷R1对照品(批号:110745-200517)、人参皂苷Rg1对照品(批号:110703-200424)和人参皂苷Rb1对照品(批号:110704-200420),对照品由中国药品生物制品检定所提供,为含量测定用。乙腈为色谱纯,水为重蒸水,其他试剂为分析纯。冠心丹参胶囊样品3批,批号:090603、090607、090609,由国药控股深圳中药有限公司提供,批号090603的样品作为方法学考察的样品。
2 方法与结果
2.1 试液制备
2.1.1 混合对照品溶液
分别取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Rb1对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL分别含三七皂苷R1 0.0655mg、人参皂苷Rg1 0.198mg和人参皂苷Rb1 0.1802mg的混合对照品溶液,摇匀,即得。
2.1.2 供试品溶液
取装量差异项下的本品内容物,混匀,研细,取约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50mL,称定重量,放置过夜,置水浴中加热回流2h,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱Kromasil-C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0～12min 19%A;12～35min19%A→25%A;35～60min 25%A→40%A);流速:1.0mL·min-1;柱温:23℃;检测波长为203nm;进样量:10μL。在此色谱条件下,样品中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1与其他杂质峰可达到较好分离,缺味无干扰。结果见图1。
2.3 方法学验证
2.3.1 线性关系考察
分别精密吸取对照品溶液(三七皂苷R1 0.065 5mg/mL,人参皂苷Rg1 0.1980mg/mL、人参皂苷Rb10.180 2mg/mL的混合溶液)1、3、5、10μL;(三七皂苷R10.109 2mg/mL,人参皂苷Rg1 0.330 0mg/mL、人参皂苷Rb1 0.300 3mg/mL的混合溶液)10μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积,以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归,线性方程分别为:三七皂苷R1:Y=278.81X+2.656 7,r=0.999 8;人参皂苷Rg1:Y=281.83X+8.666 1,r=0.999 8;人参皂苷Rb1:Y=218.09X+4.641 3,r=0.999 9。结果表明:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1进样量分别在0.065 5～1.092μg/mL、0.198 0～3.299 7μg/mL、0.180 2～3.003 2μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.3.2 精密度试验
取混合对照品溶液(三七皂苷R1 0.0655mg/mL,人参皂苷Rg1 0.1980mg/mL、人参皂苷Rb1 0.1802mg/mL的混合溶液),按上述色谱条件,重复进样6次,测定峰面积,结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为1.1%,0.9%,1.1%,表明仪器精密度良好。
2.3.3 重复性试验
取同一批供试品(批号:090603)制备6份供试品溶液,按“2.1～2.2”项下方法测定,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的平均值(n=6)分别为3.44,19.87,17.39mg/g,RSD分别为0.1%,0.2%,0.2%,结果表明该方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验
取供试品溶液,室温下放置,分别于0,1.5,4,7,13,23h进样测定,记录色谱峰面积。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1色谱峰面积的RSD分别为0.5%、0.8%、0.2%,表明供试品溶液在23h内稳定。
2.3.5 回收率实验
取已知含量的样品(批号:090603,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量分别为3.44、19.87、17.39mg·g-1)6份,每份取约0.12g精密称定,置具塞锥形瓶中,分别加入0.4094mg·mL-1三七皂苷R1 1mL,1.2828mg·mL-1三七皂苷Rg1 3mL,1.1262mg·mL-1三七皂苷Rb1 2mL,按“2.1～2.2”项下方法测定,计算回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的平均回收率(n=6)分别为98.8%、100.3%、100.4%;RSD分别为0.9%、3.1%、0.5%。
2.4 样品测定
取各批次冠心丹参胶囊样品0.5g,精密测定,按“2.1～2.2”项下方法测定,以外标法计算含量,结果见表1。
(mg/粒)
3 讨论
3.1 提取条件的选择
分别考察了加热回流、超声提取法对3种成分的提取效率,结果表明回流提取法提取效率更高;提取溶剂考察了甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇,结果表明70%甲醇对3种成分提取效率较高;同时对70%甲醇用量25、50、100倍量进行考察,结果表明50倍量即可提取完全;对回流提取1h、2h、3h进行考察,结果表明回流提取2h即可提取完全。
3.2 柱温的考察
三七中人参皂苷Rg1与其附近的人参皂苷Re色谱峰分离比较困难,通过降低柱温,可使分离度达到1.5以上,故在分离人参皂苷Rg1和人参皂苷Re时,可适当降低柱温,选择23℃为宜。
4 结论
本法操作简便,测定结果正确,重复性好,可用于冠心丹参胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量测定。
摘要：目的:建立高效液相色谱法同时测定冠心丹参中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量的方法。方法:采用Kromasil-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,流速1.0mL.min-1,柱温23℃,检测波长203nm。结果:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1进样量分别在0.0655～1.092μg/mL(r=0.9998),0.1980～3.2997μg/mL(r=0.9998),0.1802～3.0032μg/mL(r=0.9999)范围内与峰面积呈良好线性关系;平均回收率分别为98.8%,100.3%,100.4%,RSD均小于3%。结论:所建立的方法操作简便,测定结果准确,重复性好,可用于冠心丹参胶囊的质量控制。
关键词：冠心丹参胶囊,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1,反相高效液相色谱法
参考文献
[1]中国药典委员会.中国药典[S].一部.2010:433.
[2]WAN XIAOQING,XIA BOHOU.Determination of saponninsin different processed products of Panax Notoginseng[J].CJTCMP,2011,26(4):841-843.
人参皂苷Rb1论文 篇3
1 仪器与试药
美国Agilent 1260HPLC仪(在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、G1314A VWD检测器);KQ-200E型超声机波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Sartorius BT25S十万分之一天平(德国)。定风止痛片(自制)。对照品:三七皂苷R1(批号:110745-200415)、人参皂苷Rg1(批号:110703-200424)、人参皂苷Rb1(批号:110704-200318)均购自中国食品药品检定研究院;色谱乙腈(美国TEDIA),双蒸水(自制);其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件[4]
采用Hypersil ODS C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);乙腈-水为流动相,梯度洗脱(梯度见表1);柱温:20℃,检测波长为203nm,流速:1.0mL·min-1。进样10μL。
2.2 对照品溶液配制
精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1标准品适量,置于棕色容量瓶中,用70%甲醇溶解,定容至刻度,摇匀,配制成10.15、38.24、30.36μg·mL-1混合标准品母液。
2.3 供试品溶液制备
取定风止痛片20片,研磨成细粉。取约0.2g,精密称定,置25mL容量瓶中,加70%甲醇20mL,超声提取30min,冷却至室温,用70%甲醇定容至刻度,摇匀,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。
2.4 阴性对照溶液制备
根据定风止痛片处方比例和工艺制备不含三七的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.5 专属性实验
分别精密取混合对照品溶液、供试品溶液与阴性供试品溶液各10μL,按“2.1”项下色谱条件注入色谱仪中测定,结果显示阴性无干扰。见图1、图2、图3。
1.三七皂苷R1;2.人参皂苷Rg1;3.人参皂苷Rb1
2.6 线性关系考察
分别精密吸取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1混合标准标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于1mL棕色容量瓶中,用70%甲醇定容至刻度,制备系列浓度的混合标准品,精密吸取10μL注入液相色谱仪。按照“2.1”项下色谱条件分别进样测定色谱峰面积。以标准品质量浓度(X,μg·mL-1)对峰面积(Y)进行线性回归,得回归方程,结果见表2。
(n=6)
2.7 精密度试验
精密吸取10μL混合标准品溶液,在上述色谱条件下重复进样6次。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的RSD值分别为1.12%、0.97%和1.51%,结果表明精密度良好。
2.8 稳定性试验
取“2.3”项下方法配制供试品1份,按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12h进样10μL,测定峰面积。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的RSD值分别为1.37%、0.83%、1.74%,说明供试品溶液在12h内稳定。
2.9 重现性试验
取同一批样品(批号:20121104)6份,精密称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下测定含量。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1的RSD值分别为1.28%、0.45%、1.42%,表明该方法的重现性良好。
2.1 0 加样回收率试验
取供试品粉末约0.1g(含0.64mg·g-1三七皂苷R1、2.71mg·g-1人参皂苷Rg1与2.31mg·g-1人参皂苷Rb1)精密称定,平行6份,分别精密加入浓度为12.98μg/mL三七皂苷R1、54.21μg/mL人参皂苷Rg1与47.08μg/mL人参皂苷Rb1的混合标准品溶液5.0mL,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定峰面积,计算平均回收率,结果见表3。
2.1 1 样品含量测定
取本品3个批号,按“2.3”项下方法制备样品溶液,各取10μL进样,测定含量,结果见表4。
(n=6)
3 讨论
在供试品溶液的制备过程中,本实验比较了以甲醇、不同比例的甲醇-水溶液为提取溶媒,并且对回流法、超声提取的效果进行考察,含量测定结果表明,70%甲醇超声提取30min效果最佳。在流动相的选择上,本实验比较使用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液等流动相系统,最终以乙腈-水作为流动相系统等梯度洗脱可将待测物质与杂质达到基线分离,理论塔板数高,峰形尖,分离效果最好。此外实验中发现柱温在20℃时比30℃的分离效果更好。
参考文献
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人参皂苷Rb1论文 篇4
1 材料与方法
1.1 细胞株及其培养
HepG2和K562由湖北科技学院基础医学院冻存, NK92为ATCC细胞株。HepG2的培养液为含10%FCS的DMEM, NK92的培养液为α-MEM完全培养液 (含10%FCS、10%HS和100U/mL IL-2) , K562的培养液为含10%FCS的1640。细胞都在含5%CO2的37°C培养箱内培养。
1.2 试剂与仪器
白消安注射液购自美国ESP PharmaInc, 人参皂苷Rb1购自天津马克生物技术有限公司 (41753-43-9, 纯度≥98%) 。Hsp70的ELISA试剂盒 (KCB1663) 购自美国R&D公司。马血清 (HS) 购自Sigma公司, 胎牛血清 (FCS) 购自杭州四季青生物工程材料有限公司。全自动酶标仪 (BIO-TEK) , CO2培养箱 (Forma Scientific) , 流式细胞仪 (BD LSR-II) 。
1.3 HepG2经过药物处理以及培养上清的制备
HepG2以1×106/孔的密度于接种于12孔板。实验分为白消安组、人参皂苷Rb1组、联用白消安和人参皂苷Rb1组以及未加入药物的对照组。培养基中白消安为60 mg/L;人参皂苷Rb1为80mg/mL。8h后弃去上清, 再加入不含药物的培养基, 24h后收集上清。
1.4 培养上清中的Hsp70的检测
按ELISA试剂盒说明书, 检测每组HepG2培养上清中Hsp70的含量。
1.5 检测NK92细胞对K562的杀伤率
用各组HepG2培养上清在24孔板内以1×106/孔的密度重悬NK92细胞, 24h后对NK细胞杀伤功能进行检测。方法采用流式检测法:用CFSE标记靶细胞K562, 在24孔板中1×106 NK细胞与K562按照10:1的细胞数量比混合。3h后加入PI (200μg/mL) 染色死亡的细胞, 30min后上机检测, CFSE和PI双阳性的细胞为死亡的K562, K562死亡率=[ (K562的死亡率-K562自发的死亡率%) / (100-%K562自发死亡率) ]×100%。
1.7 统计学分析
各种数据以均数±标准差表示, 通过软件SPSS13.0进行统计分析。均数比较用t检验, 多组间的均数比较采方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。上清中Hsp70的水平与NK细胞杀伤率的关系进行Spearman相关性分析, 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 经过白消安以及人参皂苷Rb1处理后HepG2分泌Hsp70增加
在未经过药物干预作为对照组的HepG2培养上清中, Hsp70的含量为64.2pg/mL。在白消安组、人参皂苷Rb1组以及两者联合干预组, HepG2培养上清中Hsp70的含量分别为167.3pg/mL、89.9pg/mL和192.1pg/mL。其中白消安和人参皂苷Rb1联合干预组上调HepG2释放Hsp70的效果最为显著 (P<0.01) , 如图1。
2.2 各组HepG2的培养上清对NK92细胞杀伤率的影响
未经过预处理的NK92对K562的杀伤率为38.5%。分别经过不同的HepG2培养上清预处理后, 对照组、白消安组、人参皂苷Rb1组以及两者联合干预组, NK92对K562的杀伤率分别为16.7%、28.1%、19.4%和32.5%。表明HepG2的培养上清 (对照组) 对NK细胞的杀伤功能有明显的抑制作用, 但是提前对HepG2进行白消安和 (或) 人参皂苷Rb1的预处理后, 其上清的抑制作用减轻, NK细胞的杀伤功能显著恢复, 其中白消安联用人参皂苷Rb1的效果最显著 (P<0.05) , 如图2。
2.3 HepG2培养上清中Hsp70的水平与NK92细胞杀伤率之间的关系
对各组HepG2培养上清中Hsp70的水平以及相应的NK92细胞杀伤率进行相关性分析, Hsp70的水平与NK92细胞杀伤率有正相关关系 (P<0.01) 。如图3。
3 讨论
NK细胞作为固有免疫系统的重要组分, 发挥着重要的免疫监视作用。但是在肿瘤的进展阶段, 癌细胞通过分泌抑制性细胞因子, 诱导表达抑制性受体的配体等多种方式抑制NK细胞的杀伤功能, 达到免疫逃逸。与之相应的是在多种恶性疾病中, NK细胞的活性与肿瘤患者的预后和治疗效果密切相关。近年来, 基于NK细胞的肿瘤免疫调节研究发现药物化疗能显著恢复NK细胞的活性。在本研究中发现化疗药物白消安以及中药人参皂苷Rb1都能拮抗肝癌细胞HepG2的培养上清对于NK细胞活性的抑制作用, 其中增加HepG2分泌NK细胞的活化因子Hsp70可能为其相关机制, 而且两者联用具有协同效应。提示在临床上合理联用化疗药物和中药能发挥更显著的抗肿瘤免疫调节效应。
虽然癌细胞通过多种方式抑制淋巴细胞的活性, 但另一方面肿瘤细胞亦能表达特异性抗原或释放出活化免疫系统的物质。因此, 肿瘤对于NK细胞等免疫细胞的影响是一个正负调节作用的综合效应。如何加强其免疫原性和免疫刺激因子的释放是肿瘤生物治疗的核心。近年有研究发现, 肿瘤细胞释放的Hsp70能直接活化NK细胞。在本研究中亦发现HepG2能组成性的释放Hsp70, 但是在白消安和 (或) 人参皂苷Rb1的作用下, Hsp70的释放显著增加。同时NK细胞的杀伤功能随着恢复增强。表明白消安和 (或) 人参皂苷Rb1具有免疫调节作用, 其机制可能与上调HepG2释放Hsp70有关。随后的统计学分析亦进一步证实了肿瘤上清中的Hsp70与NK杀伤活性成正相关。
虽然白消安和 (或) 人参皂苷Rb1能拮抗HepG2的培养上清对于NK细胞的抑制作用, 但是不能完全逆转或进一步提高。表明癌细胞对于NK细胞抑制作用是多方面, 需要进一步深入分析癌细胞的免疫抑制因子为治疗提供更多的实验依据。此外本研究亦提示体外构建Hsp70的重组蛋白, 或者以Hsp70为基础的基因工程抗体有可能在肿瘤的免疫治疗中发挥更大的效应。
参考文献
[1]de Saint Basile G, Menasche G, Fischer A.Molecular mechanismsof biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules[J].Nat RevImmunol, 2010, 10 (8) :568-579.
[2]Cai L.Functional impairment in circulating and intrahepatic NKcells and relative mechanism in hepatocellular carcinoma patients[J].Clin Immunol, 2008, 129 (3) :428-437.
[3]Nagasaki E.Combined treatment with dendritic cells and 5-fluo-rouracil elicits augmented NK cell-mediated antitumor activitythrough the tumor necrosis factor-alpha pathway[J].J Immunother, 2010, 33 (5) :467-474.
[4]Tai YT.Immunomodulatory drug lenalidomide (CC-5013, IMiD3) augments anti-CD40 SGN-40-induced cytotoxicity in humanmultiple myeloma:clinical implications[J].Cancer Res, 2005, 65 (24) :11712-1720.
人参皂苷Rb1论文 篇5
仪器与材料
仪器:日本SHIMADZU高效液相色谱仪;LC-10ATVP泵;SPD-10AVP检测器;N2000工作站;KQ3200型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 。
材料:人参果总皂苷由吉林集安益盛药业股份有限责任公司提供。人参皂苷Rd对照品 (批号111818-201001) 、人参皂苷Re对照品 (批号110754-200218) , 购自中国药品生物制品检定所。乙腈, 甲醇均为色谱纯, 水为蒸馏水, 其余试剂均为国产分析纯。
方法与结果
色谱条件:Apollo C18色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm) ;流速1.0ml/分;检测波长203nm;柱温25℃。流动相为乙腈-水梯度洗脱, 洗脱条件, 见表1。
在以上色谱条件下, 供试品色谱中, 在与人参皂苷Re对照品和人参皂苷Rd对照品色谱相同的保留时间处有色谱峰, 并与其他组分基本达到基线分离。见图1A、图1B。
对照品溶液的制备:取人参皂苷Re和人参皂苷Rd对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1ml含人参皂苷Re 0.726mg和人参皂苷Rd 0.434mg的混合溶液, 0.45μm滤膜滤过。
供试品溶液的制备:取人参果总皂苷粉末30mg, 精密称定, 置10ml量瓶中, 加甲醇超声使溶解并稀释至刻度, 0.45μm滤膜滤过, 取续滤液。
检测波长的选择:分别吸取人参皂苷Re和人参皂苷Rd对照品溶液适量, 以甲醇为空白, 在190~370nm波长处扫描, 结果可见人参皂苷Re及人参皂苷Rd对照品溶液在203nm处有最大吸收, 故最终选择203nm为测定波长。
线性关系考察:分别精密吸取对照品混合液4、7、10、13、19μl进样。以峰面积 (Y轴) 与对照品质量 (X轴) , 绘制标准曲线。结果表明, 人参皂苷Re2.904~13.794μg, 线性关系良好, 回归方程Y=182766X-12079, 相关系数r=0.9993;人参皂苷Rd 1.736~8.246μg, 线性关系良好, 回归方程Y=185851X-11006, 相关系数r=0.9990。
精密度试验:精密吸取供试品溶液10μl, 连续重复进样6次, 依法检测, 结果人参皂苷Re峰面积的RSD值0.9%, 人参皂苷Rd峰面积的RSD值1.8%, 表明仪器系统精密度良好。
稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液10μl, 分别在0、2、5、8、12小时进样, 依法检测, 结果人参皂苷Re峰面积的RSD值1.6%, 人参皂苷Rd峰面积的RSD值1.1%, 表明供试品溶液在12小时内稳定。
重现性试验:取同一批次的人参果总皂苷, 按供试品溶液制备方法制备6份样品, 分别检测, 计算人参皂苷Re、Rd含量, 结果人参皂苷Re平均含量19.1%, RSD值1.5%, 人参皂苷Rd平均含量12.8%, RSD值1.9%。
加样回收率试验:取重现性试验同批次的人参果总皂苷15mg, 6份, 精密称定, 分别精密加入人参皂苷Re和人参皂苷Rd对照品, 按供试品溶液制备方法制备供试品溶液, 依法检测, 计算人参皂苷Re和人参皂苷Rd回收率, 结果人参皂苷Re平均回收率98.5%, RSD值1.0%, 人参皂苷Rd平均含量97.8%, RSD值0.7%。见表2和表3。
样品含量测定及含量限度的确定:按含量测定项下方法, 测定了10批“人参果总皂苷”中人参皂苷Re和人参皂苷Rd的含量, 见表4。
根据上述测定结果, 10批样品中人参皂苷Re的平均含量19.35%, 且均高于14.0%;人参皂苷Rd的平均含量12.05%, 且均高于8.0%。考虑原料药产地、加工及生产等因素的影响, 限定本品含人参皂苷Re (C48H82O18) 计不得少于14.0%;含人参皂苷Rd (C48H82O19) 不得少于8.0%。
讨论
在本研究中曾对供试品溶液的制备和色谱条件分别进行了考察。在对供试品溶液制备方法考察中发现, 利用D101型大孔吸附树脂柱 (内径1.5cm, 柱高15cm) 法与超声法提取所得的样品, 经测定其色谱峰分离度及含量基本一致, 并且后者操作更简便、快速, 因此在制备供试品溶液时选用超声法。
在探索色谱条件的实验中发现, 采用乙腈-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱时, 色谱图基线有漂移现象, 选用乙腈-水为流动相进行梯度洗脱时, 各色谱峰峰型及基线均好, 进一步考察乙腈-水梯度比例, 最终采用梯度浓度为19:81, 29:71, 40:60和19:81, 24:76, 37:63时, 图谱中各色谱峰峰型及分离度均较好, 同时在70分钟内洗脱完毕, 故确定该流动相为人参果总皂苷中人参皂苷Re及人参皂苷Rd液相测定的流动相。
综上所述, 本试验建立了高效液相色谱法测定人参果总皂苷中人参皂苷Re和人参皂苷Rd含量的方法, 并规定了它们的含量限度, 为评价人参果总皂苷的质量提供了实验依据, 建议可将此方法收录于新版中国药典中。
参考文献
[1] 孙成贺.人参果中人参皂苷分离技术及提取物HPLC指纹图谱研究[D].北京:中国农科院, 2008.
人参皂苷Rb1论文 篇6
1仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-20A型高效液相色谱仪;AB204-N型电子天平、AG 135电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.2 试药
人参皂苷Rg1对照品(110703-200726,供含测用)、人参皂苷Re对照品(110754-200822,供含测用)均购自中国药品生物制品检定所;人参北芪片(海南新龙工药业有限公司提供,批号:20100108);乙腈为色谱纯;水为重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。
2实验方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:ODS-2HYPERSIL(250mm×4.6mm,5μm)。检测波长:203nm, 柱温:35℃ ,流速:1.0ml/min,进样量:10μl,流动相:乙腈-0.1%磷酸(20∶80)。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取人参皂苷Rg1对照品0.01012g,置25ml量瓶中,加甲醇使其溶解并稀释至刻度,为对照品溶液a;再取人参皂苷Re对照品0.01076,置25ml量瓶中,加甲醇使其溶解并稀释至刻度,为对照品溶液b;精密量取对照品溶液a和对照品溶液b各5ml,置25ml量瓶中,混匀,即得对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品30片,除去糖衣,研细混匀,取约6g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚适量,回流提取至无色,弃去乙醚液,残渣再加甲醇适量,回流提取至无色,甲醇液置水浴上蒸干,残渣加水25ml溶解,置分液漏斗中,以水饱和的正丁醇振摇提取5次(25、25、25、15、10ml),合并提取液,用氨试液洗涤3次,每次30ml,弃去氨试液,以正丁醇饱和的水洗涤3次,每次20ml,弃去水液。正丁醇液置水浴上蒸干。残渣加甲醇适量使溶解并转移至10ml的量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,取续滤液,即得。
2.4 阴性样品溶液的制备
取除人参的其他处方量药材,按工艺制备方法制备成缺人参的阴性样品,按上述供试品溶液制备方法制成缺人参的阴性溶液。
2.5 系统适用性试验
取上述配制的供试品溶液,对照品溶液和阴性样品溶液各10μl,按上述色谱条件,分别注入液相色谱仪。结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品色谱峰均可达基线分离,分离度为1.92,其理论板数分别为14781和13657。供试品色谱图中,在与人参皂苷Rg1及人参皂苷Re对照品保留时间相同处检出色谱峰,而缺人参的阴性样品在此保留时间无色谱峰,说明阴性样品无干扰,见图1～3。
(min)
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2.6 线性关系考察
精密吸取对照品溶液(含人参皂苷Rg1 0.2024mg/ml、含人参皂苷Re 0.2152mg/ml) 1、5、10、15、20、25μl注入液相色谱仪。按上述色谱条件,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的含量为横坐标,分别绘制标准曲线。计算其回归方程,A人参皂苷Rg1=287815C-66068,相关系数为0.9995(n=6); A人参皂苷Re=272964C-71687,相关系数为0.9998(n=6)。结果表明人参皂苷Rg1在0.2024～5.0600μg的范围内,人参皂苷 Re在0.2152～5.3800μg的范围内,均具有良好的线性关系。
2.7 精密度试验
精密吸取上述人参皂苷Rg1人参皂苷Re对照品混合溶液10μl。照HPLC法,按上述色谱条件,重复进样5次,结果人参皂苷Rg1峰面积积分值的RSD为0.65%,人参皂苷Re峰面积积分值的RSD为0.82%。
2.8 稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、12、24h进样10μl,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re峰面积积分值的RSD分别为1.02%和0.96%,结果表明供试品溶液在24h内稳定。
2.9 重复性试验
取同一批号(20090703)的人参北芪片,按含量测定方法项下方法制备9份供试品溶液,照HPLC法,按外标法计算人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量。平均含量为0.2109mg/片(平均片重:0.2812g),RSD=1.2%(n=9)。结果表明,本法重现性良好。
2.10 回收率试验
称取已知含量的人参北芪片(含人参皂苷Rg1 0.2142mg/g;人参皂苷Re 0.5357mg/g)约2.4、3.0、3.6g(每个浓度级称取3份,共9份),精密称定,每份中分别精密加入浓度为0.2516mg/ml的人参皂苷Rg1对照品溶液2.0、2.5、3.0ml和浓度为0.6456mg/ml的人参皂苷Re对照品溶液2.0、2.5、3.0ml。按正文含量测定方法进行测定,按外标法计算人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量,并计算回收率。结果:人参皂苷Rg1平均回收率为99.0%,RSD=1.04%(n=9);人参皂苷Re平均回收率为98.2%,RSD=0.70%(n=9),见表1、2。
2.11 样品测定
按上述条件和方法测定3批样品中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量,结果见表3。
3讨论
处方中人参是我国名贵的中药材[1],也是人参北芪片制剂的君药。其主要活性成分达玛烷系四环三萜类皂苷具有多种显著的药理作用。含人参的复方制剂[2]常以其作为指标进行含量控制。本实验采用高效液相色谱法同时测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量。试验表明,该法准确性好,灵敏度高。
实验表明供试溶液制备方法,能有效地除去了杂质的干扰,使有效成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Re完全被提取。
综上所述,本方法专属性强、重现性好,精密度高,回收率满意,可作为人参北芪片的含量控制。
摘要：目的 建立测定人参北芪片中人参的有效成分人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法 采用ODS-2HYPERSIL柱(250mm×4.6mm5μm);乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)为流动相;检测波长为203nm;流速1.0ml/min;柱温35℃。结果 人参皂苷Rg1在0.2024～5.0600μg具有良好的线性关系(r=0.9995),平均回收率为99.0%,RSD为1.04%(n=9);人参皂苷Re在0.2152～5.3800μg的范围具有良好的线性关系(r=0.9998),平均回收率为98.2%,RSD为0.70%(n=9)。结论 本法快速、准确,可同时测定人参北芪片中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re的含量。
关键词：人参北芪片,人参皂苷Rg1,人参皂苷Re,高效液相色谱法,含量测定
参考文献
[1]张贵君.常用中药鉴定大全[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1993:10.