谷胱甘肽相关酶（共9篇）
谷胱甘肽相关酶 篇1
摘要：为了探讨维生素E对吉富罗非鱼肝脏谷胱甘肽含量及其相关酶活力的影响,试验选用400尾大小均匀、平均体重为(3.25±0.02)g的健康吉富罗非鱼分别投喂添加0,25,50,250,2 500 mg/kg维生素E的饲料。结果表明:饲喂添加维生素E饲料的吉富罗非鱼肝脏中谷胱甘肽含量均显著高于对照组(P<0.05),在添加量为250 mg/kg时谷胱甘肽的增加量最高;γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)活力却显著低于对照组(P<0.05),在维生素E的添加量为250 mg/kg时,γ-GCS的活力最低;维生素E对吉富罗非鱼肝脏中谷胱甘肽硫转移酶(GST)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响与对照组相比差异不显著;对谷胱甘肽还原酶(GR)活力与对照组相比有增加趋势,其中维生素E的添加量在25 mg/kg时GR的活力与对照组差异显著(P<0.05),其他组差异不显著;不同添加量的维生素E对γ-GCS mRNA表达产生不同影响。说明影响谷胱甘肽及其相关酶含量是维生素E在罗非鱼体内发挥作用的途径之一。
关键词：维生素E,吉富罗非鱼,谷胱甘肽,谷胱甘肽相关酶
维生素E(vitamin E)是一种脂溶性抗氧化剂,它已被证明可以作为大部分鱼的营养因子,其对机体的保护作用是通过维生素E作为电子供体存在于细胞表面,拦截具有强氧化能力的自由基,使细胞不被氧化而达到对细胞的保护作用。维生素E 作为水生动物体内和饲料里主要的抗氧化剂,在脂质抗氧化方面发挥了十分重要的作用[1]。J.Dandapat 等[2]研究发现,在罗氏沼虾的鳃和胰腺里添加维生素E无论是对体内还是体外脂质过氧化反应均有很明显的抑制作用。有学者研究发现,生物系统里的维生素E 能够有效清除超氧阴离子。笔者前期研究证实,饲料中维生素E添加量为250 mg/kg时,能提高吉富罗非鱼幼鱼生长性能,增强肝脏、胰腺超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低肝脏丙二醛(MDA)和羟自由基含量。
维生素E作为一种脂溶性的抗氧化剂,它可以通过多种途径来影响脂质过氧化反应,如影响组织里的抗氧化酶活性、非酶的抗氧化剂含量以及一些生化指标等,其中谷胱甘肽(GSH)就是一个重要指标。谷胱甘肽在机体内的生化防御体系起重要作用,具有多方面的生理功能。它的主要生理作用是能够清除掉体内的自由基,作为体内一种重要的抗氧化剂,保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基,在抵御氧化应激、蛋白质与DNA 的生物合成、酶的活性代谢等方面发挥着重要作用[3]。此外,谷胱甘肽还具有整合解毒作用,尤其是肝细胞内的谷胱甘肽能参与生物转化作用,从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质,排泄出体外。因而,GSH含量的多少是衡量机体抗氧化甚至免疫能力大小的重要因素之一[4]。为了消除过多的活性氧,机体会启动抗氧化防御系统,GSH及其相关酶,如谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)等在机体的抗氧化防御系统中发挥着重要作用。
研究以吉富罗非鱼为试验动物,探讨维生素E对吉富罗非鱼肝脏GSH含量及其相关酶活力的影响,并初步分析了维生素E对γ-GCS mRNA表达的影响,为揭示维生素E抗氧化功能的机理提供基础数据。
1 材料及处理
吉富罗非鱼,购自广州番禺罗非鱼良种场,体重为(3.25±0.02)g,健康状况良好。将鱼随机分为对照组和4个试验组,每组设4个重复,每个重复20尾。
维生素E,购自Sigma公司,活性成分为α-生育酚,为微黄绿色黏稠液体,维生素E含量≥96%。各组饲料中分别添加0(对照),25,50,250,2 500 mg/kg 维生素E,测得饲料中维生素E的实际含量分别为8.5,33,56,220,2 580 mg/kg,试验饲料组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎后过60目筛,于搅拌机中混匀30 min,边搅拌边缓慢加入豆油和鱼油,然后再加入30%的水,最后用双螺旋挤压机挤压成直径为1.5 mm的面条状,再制成粒状饲料,自然风干后,于-20 ℃的冰柜中保存,备用。
2 方法
2.1 样品的采集
生长试验结束后, 停食24 h,每缸随机选取6尾规格一致的试验鱼, 用丁香酚麻醉后解剖取肝脏, 液氮速冻,-80 ℃冻存,备用。
注:维生素预混合料(不含维生素E)为自行配制,每千克中含有对氨基苯甲酸 5.00 mg,生物素 0.60 mg,肌醇 200.00 mg,泛酸钙 10.00 mg,维生素B6 4.00 mg,维生素B2 5.00 mg,烟酸 6.05 mg,维生素B1 5.00 mg,视黄醇 0.40 mg,维生素K 4.00 mg,叶酸 1.50 mg,氯化胆碱400.00 mg,维生素C 3.95 mg。矿物质预混料由海因特公司(广州)提供,每千克中含有锰 2.4 g,锌 4.5 g,铜 0.8 g,铁 13 g,钾 24 g,钠 13 g,镁 25 g,钴 0.25 g,碘 0.25 g,硒 0.06 g;载体为轻质碳酸钙,水分≤10%。
2.2 样品的检测
肝脏内GSH含量和γ-GCS、GST、GSH-Px、GR的活力采用南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒测定。将保存于-80 ℃的组织样品在冰上解冻,取组织块约1 g在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,用滤纸拭干,称重,放入匀浆玻璃管中,按一定比例(1 g样品加10 mL 生理盐水)加入冰冻生理盐水,用玻璃匀浆机匀浆。将制备好的10%组织匀浆在4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min,取上清液参照说明书分别检测GSH含量和相关酶的活力。
γ-GCS mRNA的表达采用实时荧光定量PCR进行检测。参照美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上的cDNA序列,以Premier Primer 5.0软件设计荧光定量PCR( RT-PCR)扩增特异性引物,同时以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参。所有引物均由广州莱德尔生物科技有限公司合成,引物序列见表2。将保存于-80 ℃的组织样品在液氮中研磨,TRIzol法提取总RNA。根据AMV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录,合成cDNA第1链,反应体系(8 μL):Oligo(dT)0.5 μL,引物0.5 μL,10 mmol/L dNTP 20 μL,RNA酶抑制0.5 μL,5×Buffer 4 μL,M-MLV 0.5 μL。然后采用ABI BI Stepone plus 嵌合荧光法进行RT-PCR扩增,所用试剂盒为SYBR Green PCR Master Mix(2×),反应体系(20 μL):cDNA 5 μL,上、下游引物各0.5 μL,2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,ddH2O 4 μL。将样品混匀后放入ABI PRISM® 7500 Seqtence Detection System反应。反应程序为 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 32 s,共40个循环。反应完成后,用分析软件分析结果。
2.3 数据统计与分析
结果用平均值±标准误表示,γ-GCS mRNA的表达以β-actin为内参,以对照组的基因表达量为基准,应用2-△△Ct计算mRNA的相对表达量。所有数据采用Excel 软件进行整理,用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,用Duncan’s 法作多重比较, P<0.05表示平均数间差异显著。
3 结果
3.1 不同添加量的维生素E对吉富罗非鱼肝脏中GSH含量的影响(结果见图1)
注: 图中标注的字母不同表示差异显著(P<0.05),相同 表示差异不显著(P>0.05)。
由图1可见:试验组吉富罗非鱼肝脏中GSH的含量均显著高于对照组(P<0.05)。维生素E的添加量在25 mg/kg与2 500 mg/kg时,GSH的增加量比较接近;在添加量为250 mg/kg时,GSH的增加量最高,达到4.34 mg/gprot;在添加量为2 500 mg/kg时呈下降趋势;维生素E添加量低于250 mg/kg时,随着维生素E添加量的增加,GSH的含量不断增加。
3.2 不同添加量的维生素E对吉富罗非鱼肝脏中γ-GCS活力的影响(结果见图2)
注:图中标注的字母不同表示差异显著(P<0.05), 相同表示差异不显著(P>0.05)。
由图2可见:试验组吉富罗非鱼肝脏中γ-GCS的活力均显著低于对照组(P<0.05)。维生素E的添加量在25 mg/kg与2 500 mg/kg时,γ-GCS的活力降低量比较接近;在添加量为250 mg/kg时,γ-GCS的活力达到最低;维生素E添加量低于250 mg/kg时,随着维生素E添加量的增加,γ-GCS的活力不断降低。
3.3 不同添加量的维生素E对吉富罗非鱼肝脏中GST活力的影响(结果见图3)
注:图中标注的字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由图3可见,试验组吉富罗非鱼肝脏中GST的活力与对照组相比有一定的下降趋势,但差异不显著(P>0.05)。
3.4 不同添加量的维生素E对吉富罗非鱼肝脏中GSH-Px活力的影响(结果见图4)
注:图中标注的字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由图4可见,试验组吉富罗非鱼肝脏中GSH-Px的活力与对照组相比有一定的升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。
3.5 不同添加量的维生素E对吉富罗非鱼肝脏中GR活力的影响(结果见图5)
注:图中标注的字母不同表示差异显著(P<0.05), 相同表示差异不显著(P>0.05)。
由图5可见,试验组吉富罗非鱼肝脏中GR的活力与对照组相比有增加趋势,其中维生素E的添加量为25 mg/kg时GR的活力与对照组相比差异显著(P<0.05)。其他添加量组间差异不显著(P>0.05)。
3.6 不同添加量的维生素E对吉富罗非鱼肝脏中γ-GCS mRNA表达的影响(结果见图6)
注:图中标注的字母不同表示差异显著(P<0.05),相同 表示差异不显著(P>0.05)。
由图6可见:不同添加量的维生素E对γ-GCS mRNA的表达产生不同的影响。维生素E的添加量在25 mg/kg与2 500 mg/kg时,γ-GCS mRNA的表达量比较接近,均显著低于对照组(P<0.05);在添加量为50 mg/kg时,γ-GCS mRNA的表达量与对照组差异不显著(P>0.05);而添加量为250 mg/kg时,γ-GCS mRNA的表达量却显著高于对照组(P<0.05)。
4 讨论
维生素E是一种脂溶性抗氧化剂,它已被证明可以作为大部分鱼的营养因子,可以通过多种途径来影响脂质过氧化反应。前期的研究发现,饲料中添加维生素E能提高吉富罗非鱼幼鱼的生长性能,增强肝脏SOD的活性,降低肝脏MDA和羟自由基含量。为了进一步探讨维生素E在罗非鱼体内的抗氧化作用的其他机制,本研究检测了饲料中添加不同水平的维生素E对吉富罗非鱼肝脏GSH含量及其相关酶活力的影响,并初步分析了γ-GCS mRNA表达的变化,结果表明:添加不同剂量的维生素E时吉富罗非鱼肝脏中GSH的含量均显著高于对照组;添加量为250 mg/kg时,GSH的增加量最高。相反,γ-GCS的活力却显著低于对照组,在添加量为250 mg/kg时,γ-GCS的活力最低。维生素E对吉富罗非鱼肝脏中GST活力、GSH-Px活力的影响与对照组相比有一定的变化趋势,但差异不显著(P>0.05);GR的活力与对照组相比有增加趋势,其中维生素E的添加量在25 mg/kg时GR的活力与对照组差异显著(P<0.05),其他组差异不显著(P>0.05)。
GSH是机体内重要的抗氧化剂,对维持体内正常的糖代谢有重要的作用。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物, 其结构中含有1个活泼的巯基(-SH),易被氧化脱氧,这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。当细胞内产生H2O2时, 在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下, 把H2O2还原成H2O, 其自身被氧化为GSSH,在谷胱甘肽还原酶的催化作用下,接受H还原成GSH,使体内自由基的清除反应能够持续进行[4,5];因此,GSH在细胞抗氧化系统中起着重要的作用。本研究发现,不同维生素E添加量的吉富罗非鱼肝脏中GSH含量均显著高于对照组(P<0.05),说明维生素E在体内的抗氧化作用可能与调节GSH含量有关。彭士明等[6]认为,维生素E可以消除体内自由基,与GSH具有协同的作用,饲料中添加维生素E可以减轻GSH的负担,进而使GSH的含量升高,本研究结果与这一观点一致。苏忠兰等[7]研究了α-生育酚对永生化人角质形成细胞内GSH生成的影响及其机制,结果表明,α-生育酚对皮肤细胞发挥抗氧化作用的主要途径是影响细胞内GSH的生物合成。
γ-GCS是GSH合成过程中的关键酶(限速酶),对GSH合成起关键作用,其活性直接影响GSH水平[8]。GSH的合成分两步:1)γ-谷氨酸与半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;2)γ-谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸合成GSH。以上两步反应分别由γ-GCS和谷胱甘肽合成酶催化。GSH合成主要受合成底物半胱氨酸和γ-GCS调节,而谷胱甘肽合成酶无调节作用;GSH浓度对γ-GCS的活性具有反馈调节作用[9]。苏忠兰等[7]认为,α-生育酚对永生化人角质形成细胞内GSH生成影响的主要作用机制是,通过调控细胞内谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平,从而加速细胞内GSH的生物合成。与之不同,本研究中维生素E促进GSH的合成,却降低γ-GCS的活力,这可能是由GSH对γ-GCS的反馈调节作用所致。另一方面,机体在解毒过程中消耗了大量的GSH,为了维持解毒的需要,GSH必须不断地得到补充。其补充有两种途径:一种是通过GR的催化将GSSG还原为GSH;另一种就是GSH的从头合成,其中γ-GCS是GSH合成循环中的限速酶[4]。本研究中GR的活力与对照组相比有增加趋势,其中维生素E的添加量在25 mg/kg时,GR的活力与对照组相比差异显著(P<0.05),其他组间差异不显著(P>0.05),说明GSH含量的增加可能主要通过GR途径补充。
目前,普遍认为通过调节γ-GCS表达,可以调节细胞内外GSH浓度。γ-GCS活性的调节可在基因转录水平、转录后水平、翻译后水平等环节, 但主要在基因转录水平[10]。本研究结果表明,维生素E的添加量为250 mg/kg时显著高于对照组(P<0.05),这一变化与γ-GCS活力变化相反,说明γ-GCS活性的调节也可以发生在翻译后水平[11]。不同添加量的维生素E对γ-GCS mRNA的表达产生不同的影响。在25 mg/kg与2 500 mg/kg时,γ-GCS mRNA的表达量比较接近,均显著低于对照组(P<0.05),这说明不同剂量的维生素E对γ-GCS mRNA的表达调节机理可能不同,这一点有待于进一步的研究。
GSH还是GST和GSH-Px的底物,为这两种酶分解氢过氧化物所必需。本研究中,维生素E对吉富罗非鱼肝脏中GST活力和GSH-Px活力的影响与对照组相比有一定的变化趋势,但差异不显著(P>0.05),说明GST和GSH-Px在此过程中可能不发挥主要作用。
本研究中,2 500 mg/kg维生素E添加量对各个指标的影响与其他剂量有较大差别;前期研究的2 500 mg/kg维生素E添加量对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、SOD等指标的影响与其他组也有差别,这是由于维生素E虽然作为一种天然抗氧化剂,能提高鱼类抗氧化能力,增强免疫抗病力,但是过量维生素E可能会导致动物抗氧化能力和免疫力降低,此时,过量的维生素E可能成了促氧化剂,即促进细胞膜上磷脂中的不饱和脂肪酸与自由基发生脂质过氧化反应,从而改变细胞膜的结构和性质,降低机体的免疫防御功能,因而在实际应用中,一定要注意维生素E的添加量。
4 结论
在饲料中添加维生素E可显著提高吉富罗非鱼肝脏中GSH的含量,并影响GSH相关酶的活力及γ-GCS mRNA的表达。影响GSH及其相关酶是维生素E在吉富罗非鱼体内发挥作用的途径之一。
参考文献
[1]PALACE V P,BROWN S B,BARON C L,et al.An evaluation ofthe relationships among oxidative stress,antioxidant vitamins andearly mortality syndrome(EMS)of lake trout(Salvelinus namay-cush)from Lake Ontario[J].Aquat Toxicol,1998,43(2/3):195-208.
[2]DANDAPAT J,CHAINY G B,RAO K J.Dietary vitamin-E mod-ulates antioxidant defence system in giant freshwater prawn,Macro-brachium rosenbergii[J],Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharma-col,2000,127(1):101-115.
[3]邹朝霞,何志文,冉丕鑫.吸烟对大鼠肺内谷胱甘肽与γ-GCS的影响及乙酰半胱氨酸的干预作用[J].中国病理生理杂志,2007,23(1):86-89.
[4]程时,丁海勤.谷胱甘肽及其抗氧化作用今日谈[J].生理科学进展,2002,33(1):85-90.
[5]BALLATORI N,KRANCE S M,NOTENBOOM S,et al.Glutathi-one dysregulation and the etiology and progression of human diseases[J].Biol Chem,2009,390(3):191-214.
[6]彭士明,陈立侨,侯俊利,等.氧化鱼油饲料中添加VE对黑鲷幼鱼及肝脏抗氧化酶活性的影响[J].上海水产大学学报,2008,17(3):298-304.
[7]苏忠兰,王宏伟,吴迪,等.α-生育酚对永生化人角质形成细胞内谷胱甘肽生成的影响及其机制研究[J].中国美容医学,2009,18(12):1769-1771.
[8]PINKUS R,WEINER L M,DANIEL V.Role of quinone-media-ted generation of hydroxyl radicals in the induction of glutathioneS-transferas gene expression[J].Biochemistry,1995,34(1):81-88.
[9]王英,罗敏,李卉.谷胱甘肽的水平及氧化还原状态与炎症性肠病的关系[J].实用医学杂志,2008,24(17):3079-3081.
[10]RAHMAN I,MACNEE W.Regulation of redox glutathione levelsand gene transcription in lung inflammation:the rapeutic approaches[J].Free Radic Biol Med,2000,28(9):1405-1420.
[11]KITTERINGHAM N R,POWELL H,CLEMENT Y N,et al.Hepa-tocellular response to chemical stress in CD-1 mice:induction ofearly genes and gamma-glutamylcyseine synthetase[J].Hepatolo-gy,2000,32(2):321-333.
谷胱甘肽相关酶 篇2
谷胱甘肽是植物中普遍存在的硫醇,在还原硫的贮存和运输、蛋白质合成及植物抗逆性方面均有重要作用.介绍了谷胱甘肽的测定方法和在植物中的生理作用,概述了谷胱甘肽在小麦、水稻、烟草、果树及蔬菜上的`研究进展.并提出了对谷胱甘肽在植物体内合成、降解、运输的调控机制及对植物抗氧化作用机理研究的重要性.
作 者：李志刚 许自成 苏永士 陈彦春 胡皓月 张蕊 杜娟 作者单位：李志刚,许自成,胡皓月,张蕊,杜娟(河南农业大学,烟草学院,河南,郑州,450002)
苏永士,陈彦春(河南省烟草公司,三门峡市公司,河南,三门峡,47)
谷胱甘肽相关酶 篇3
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.03.207 文章编号：1004-7484（2014）-03-1379-02
1 病例资料
一患者男，27岁，主因体检时发现抗-HCV阳性一周而入院，另一患者女，45岁，主因体检时发现HBsAg阳性半个月而入院，均为一般肝炎患者。遵医嘱给予注射用还原型谷胱甘肽2.4g，加入5%的葡萄糖液100ml中静脉点滴，滴入后，患者即感到头痛、嗓子发痒、咳嗽、分泌物增多等呼吸道症状，喉头阻塞感、胸闷、气急、喘鸣、憋气、面色潮红，马上通知医生，诊断为过敏，紧急给予抢救治疗，即刻给予地塞米松10mg静脉注射，鼻导管吸氧2L/min，观察5-10分钟后，症状逐渐缓解，面色、呼吸逐渐转正常。
2 原因分析
2.1 药物说明
2.1.1 主要成分 含还原型谷胱甘肽钠盐643.0mg/321.5mg（相等于还原型谷胱甘肽0.6g/0.3g）。
2.1.2 药理作用 谷胱甘肽（GSH）是人类细胞质中自然合成的一种三肽，由于氨酸、半胱氨酸和甘氨酸残基组成，含有巯基（-SH），在体内起活化氧化还原系统、激活SH酶、解毒等重要作用，并参与体内多种重要的生化代谢反应。谷胱甘肽可以残存在肝脏内参与肝纤维化等损害作用的发生。经药理学研究证实，谷胱甘肽对大鼠由乙醇所致急性肝损伤、四氯化碳所致慢性损伤，具有防治作用；对小鼠由四氯化碳和D-氨基半乳糖所致急性肝损伤，具有防治作用。通过巯基与体内的自由基结合，可以转化成容易代谢的酸类物质，从而加速自由基的排泄。通过转四基及转丙氨基反应，谷胱甘肽还能保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能，并促进胆酸代谢，有利于消化道吸收脂肪及脂溶性维生素（A、D、E、K）。
2.1.3 适应症 适用于各类肝病：病毒性肝炎、重症肝炎、活动性肝硬化、脂肪肝、酒精性肝炎、药物性肝炎。
2.1.4 注意事项 注射前必须完全溶解。外观澄清、无色。
2.1.5 禁忌症 对本品有过敏反应者禁用。
2.1.6 不良反应 即使大剂量、长期使用，亦很少有不良反应。
2.1.6.1 偶有过敏或类过敏症状。
2.1.6.2 偶有食欲不振、恶心、呕吐、胃痛等消化道症状。
2.1.6.3 注射局部轻度疼痛。
2.1.7 用法用量 静脉注射：将谷胱甘肽无菌冻干粉针以250-500ml15%葡萄糖注射液或生理盐水溶解稀释后使用。滴注时间为1-2小时。肌肉注射：将谷胱甘肽规格0.3g的无菌粉针加3毫升注射用水溶解后使用；规格0.6g的无菌粉针加4毫升注射用水溶解后使用。各类肝病：病毒性肝炎：1200mg，qd，iv，30天；重症肝炎：1200-2400mg，qd，iv，30天；活动性肝硬化：1200mg，qd，iv，30天；脂肪肝：1800mg，qd，iv，30天；酒精性肝炎：1800mg，qd，iv，14-30天；药物性肝炎：1200-1800mg，qd，iv，14-30天。
2.2 过敏 绝大多数过敏性休克是典型的Ⅰ型变态反应，在全身多器官，尤其是循环系统的表现。外界的抗原性物质（某些药物是不全抗原，但进入人体后有与蛋白质结合成全抗原）进入体内能刺激免疫系统产生相应的抗体，其中IgE的产量，因体质不同而有较大差异。这些特异性IgE有较强的亲细胞性质，能与皮肤、支气管、血管壁等的“靶细胞”结合。以后当同一抗原再次与已致敏的个体接触时，就能激发引起广泛的Ⅰ型变态反应，其过程中释放的各种组胺、血小板激活因子等是造成多器官水肿、渗出等临床表现的直接原因。
2.3 过敏体质 过敏常发生在一部分相对固定的人群，因为是具有过敏体质的人属于先天性免疫功能异常，往往由遗传而来，也就是说，具有这种体质的人，发生过敏性的可能伴随终生。过敏体质的形成以及过敏的发作都与机体的健康杀手—自由基过多的堆积有关，而且日趋严重的环境污染、化学品滥用及辐射问题，造成自由基在体内的堆积。
综上所述，追述二人的病史，均为过敏性体质，均有过敏史。
3 临床特点及临床表现
发生突然、来势凶猛，100%在接受抗原物质后的五分钟内表现症状。以上病例以呼吸系统表现最为突出，由于喉头、气管、支气管水肿及痉挛或肺水肿引起呼吸道分泌物增多，出现呼吸急促、胸闷、憋气、喘鸣。用药后应该密切观察1-5分钟。如症状未明显缓解，立刻加用其他抗过敏药。
4 搶救措施及治疗护理用药
4.1 必须当机立断、不失时机的积极处理。
4.2 立即停止入药并移除过敏源。
4.3 应及时静脉注射地塞米松10mg。地塞米松为肾上腺皮质激素类药，抗炎、抗过敏和抗毒作用较泼尼松更强，水钠潴留和促进排钾作用很轻，可肌注或静滴对垂体-肾上腺抑制作用较强。
4.3.1 抗炎作用 本产品可减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。激素抑制炎症细胞，包括巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放。可以减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。
4.3.2 免疫抑制作用 包括防止或抑制细胞介导的免疫反应，延迟性的过敏反应，减少T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞的数目，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合能力，并抑制白介素的合成与释放，从而降低T淋巴细胞向淋巴母细胞转化，并减轻原发免疫反应的扩展。可降低免疫复合物通过基底膜，并能减少补体成份及免疫球蛋白的浓度。
4.4 给予鼻导管氧气吸入2L/min。氧气吸入疗法是常用的急救措施之一，通过给氧，以提高血氧含量及动脉血氧饱和度，纠正缺氧。
4.5 病人保持平卧，保持呼吸道通畅。
4.6 病人多在5-10分钟后恢复正常，严密观察生命体征。
5 预 防
5.1 用药前仔细询问过敏史，有阳性病史应停用或慎用。
5.2 用量减少不必注射用药，改为口服药。
5.3 过敏体质病人在注射后用药观察15-20分钟 还原型谷胱甘肽片，主要用于解药物毒性，防止抗癌药物的副作用，预防和治疗放射线损害；对抗自由基，抗氧化；提高机体免疫力。可以预防、减轻、中止、组织细胞的损伤，改变病理生理过程；可用于肝损伤、肾损伤、化放疗保护、糖尿病、缺血缺氧性脑病等。还原型谷胱甘肽片不良反应：偶有食欲不振，恶心，呕吐，上腹痛等症状；过敏症：偶有皮疹等过敏症状。如果出现皮肤过敏现象，应该寻找原因，如果发现是因使用药物引起的，应该立刻停止使用。
参考文献
[1] 过敏性休克.《医药导报》，2011，（1）.
谷胱甘肽相关酶 篇4
真鲷(Pagrosomus major)为海水名贵养殖品种,在中国南、北方均有广泛分布。目前对真鲷的研究主要集中在养殖技术的改进、环境因子对其生长发育的影响,以及各种常用农药和工业废水中常见金属离子对真鲷的毒性[8,9,10,11,12,13]。谷胱甘肽转硫酶(GST)广泛分布于动物的各种组织器官中,主要功能是催化内源性或外源性有害物质的亲电子基团与谷胱甘肽(GSH)的巯基偶联,增加其疏水性使其穿越细胞膜,分解后排出体外,从而达到解毒的目的,保护细胞免受损伤。生物体内GST活性与w(GSH)由于外源性污染物曝露而产生的变化程度可以作为生物体自由基含量的指标。PFOS对水产养殖生物毒性作用的研究报道尚不多见,笔者以真鲷为试验生物,通过观察PFOS半静态曝露和净水恢复条件下真鲷鳃和肝组织中的w(GSH)和GST活性的变化,探讨PFOS对真鲷的致毒机理,为科学评价PFOS污染对经济鱼类正常生理生化指标的影响及养殖水质监测指标提供更多的理论依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
真鲷购自深圳南澳育苗场,实验室驯养1周,选取游泳活泼、体色健康、大小均匀的个体(全长6.0±0.5 cm)进行试验。试验在农业部南海渔业资源环境重点野外科学观测试验站进行,试验容器为200 L圆型玻璃钢材质育苗桶。试验海水取自实验站附近,经沉淀池沉淀和砂滤后待用。试验期间海水pH为7.6～8.0,盐度为30～34,温度为18～22 ℃。试验过程中昼夜曝氧。
全氟辛烷磺酸钾(PFOS-K)购自Sigma公司,纯度为AR级。GST、GSH与蛋白质试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均购自广州化学试剂公司,纯度为AR级。
1.2试验方法
1.2.1 毒性试验
根据急性毒性试验结果,参考安全浓度设置0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1 3个质量浓度组进行慢性毒性试验,同时设空白对照组。每个玻璃钢投放120尾真鲷,PFOS胁迫15 d后,各浓度组真鲷转入清洁海水中,进行7 d的净水恢复试验。试验过程中早、晚各投饵1次,每隔24 h更换1/3体积同浓度的溶液并昼夜曝氧。
1.2.2 酶液的制备和提取
分别于胁迫期的第1、第2、第3、第7、第15天和净水释放的第1、第2、第3、第7天取样,每浓度组分别取8～10尾鱼,用预冷的生理盐水洗净置于冰盘上快速解剖,取出鳃组织和肝组织并用生理盐水洗涤后用滤纸吸干并置于液氮内保存待用。酶液制备根据杨涛等[14]的方法进行,GST活性、w(GSH)的测定根据试剂盒说明书进行。GST活性定义为每毫克组织蛋白在37 ℃反应1 min扣除非酶促反应,使反应体系中GST浓度降低1 μmol·L-1为1个酶活力单位(U·mg prot-1);w(GSH)单位为mg·g prot-1;总蛋白质量浓度单位为mg·mL-1。所有指标吸光值均采用UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司出品)测定,每个指标测定3个平行组,以减小试验误差。
1.3数据处理
w(GSH)和GST活性指标采用SPSS 13.0软件进行One-Way ANOVA方差分析,统计结果用平均值±标准偏差undefined)表示,P<0.05为显著相关性,P<0.01为极显著相关性。
2 结果
2.1PFOS胁迫对鳃、肝组织中w(GSH)的影响
真鲷鳃组织中w(GSH)受PFOS胁迫的响应见图1-a。整个试验过程中鳃组织w(GSH)的变化呈显著的时间效应,先降低后升高,未表现出剂量效应关系。第1天中、高剂量组的鳃组织中w(GSH)的抑制率分别为16.19%和27.10%,胁迫中期各剂量组w(GSH)没有明显的变化规律,到胁迫结束时各剂量组处于诱导阶段,第15 天中浓度组的诱导率为108.68%。净水恢复阶段鳃组织的w(GSH)很快降至抑制水平,在释放7 d后仅有高剂量组恢复至对照组水平,其他2组与对照组相比仍存在显著差异(P<0.05)。
*.与对照组相比P<0.05;**.P<0.01;r1～r7.释放第1天至第7天,后图同此*.compared with the control P<0.05,**.P<0.01;r1～r7 indicate 1stday～7thday recovery.The same case in the following figures.
真鲷肝脏组织中w(GSH)受PFOS胁迫的响应见图1-b。真鲷肝脏组织中w(GSH)的变化在整个胁迫阶段表现为低浓度组先降低后升高,高浓度组先升高后降低,有明显的剂量效应和时间效应。胁迫开始时各浓度组的GSH变化无显著的规律。胁迫第7天w(GSH)在低浓度组的抑制率为33.01%,中、高浓度组的诱导率分别为49.38%和53.51%;在第15 天时低浓度组的w(GSH)转为诱导状态,诱导率为31.97%,中、高浓度组中的w(GSH)与对照组相比显著降低(P<0.05),其抑制率分别为48.28%和74.91%。在净水恢复期结束时各浓度组与对照组仍有显著性差异(P<0.05),释放第7天时低、中、高3个浓度组肝脏组织中w(GSH)分别比对照组分别高出13.83%、15.48%、12.26%。
2.2PFOS胁迫对鳃、肝组织中GST活性的影响
PFOS曝露对真鲷鳃组织中GST活性的影响见图2-a。整个PFOS胁迫过程中鳃组织GST活性整体呈先升高后下降再升高变化趋势,具有显著的时间效应关系。第1天低浓度组和高浓度组均处于诱导阶段,诱导率分别为56.12%和48.70%;第3天低、中、高3个浓度组鳃组织中GST活性与对照组相比分别下降了33.67%、24.96%和46.01%,在第15 天分别比对照组高65.25%、155.39%和70.26%。净水恢复阶段鳃组织中GST活性变化无规律性,释放结束时各浓度组与对照组相比仍处于抑制阶段(P<0.05),释放第7 天时低、中、高3个浓度组的抑制率分别为28.95%、22.92%和19.09%。PFOS曝露对真鲷肝脏中GST活性的影响见图2-b。各处理组真鲷肝脏组织中GST活性在胁迫开始时呈现诱导效应(P<0.05)。低浓度组在整个胁迫期均处于诱导状态,第3天时的诱导率为95.79%,此后诱导率有所下降,到第15天的诱导率为19.65%。中、高浓度组的GST活性为先升高再降低的趋势,第3天中、高浓度组的GST活性分别比对照组高129.02%和11.84%,而在第15天则比对照组低30.68%和48.93%。净水恢复阶段各浓度组肝脏GST活性随时间的延长逐渐恢复,释放结束时只有中浓度组恢复至对照组水平,其他2个浓度组与对照组相比仍有显著性差异(P<0.05),低浓度组的诱导率为10.19%,高浓度的抑制率为22.69%。
3 讨论
GSH的生物化学重要性表现在多个方面,如清除多种自由基、修复氧化损伤、可以作为某些酶的辅助因子等[15]。多项研究结果表明很多污染物胁迫均可引起w(GSH)的变化,郑微云等[16]的研究指出,不同浓度的0号柴油水溶性成分的污染剂量与真鲷幼体内脏组织中GSH的诱导量呈负相关;HU等[17]报道Hep G2细胞中w(GSH)随培养液中PFOS浓度的升高而降低。在此试验中,真鲷鳃组织中w(GSH)在曝毒阶段随时间的延长先降低后升高,在肝脏组织中表现为低浓度组先降低后升高,高浓度组先升高后降低,有明显的剂量效应和时间效应。有研究表明PFOS可以使细胞中的活性氧自由基增加1.25倍[18],而活性氧自由基含量是引起细胞中w(GSH)变化的原因之一。由于鳃的生理结构和功能特点导致外源毒物不会在鳃组织中大量蓄积,仅受外环境和血液中外毒物的影响。此试验PFOS胁迫开始时GSH适应性的降低,在出现免疫应答后w(GSH)大幅上升以清除由于胁迫产生的自由基,使组织内氧压维持在正常水平上。而肝脏的生理功能多种多样,且与GSH相关的反应也很多,导致各浓度组肝脏中w(GSH)在胁迫中前期没有表现出明显的变化规律,在经过15 d胁迫后w(GSH)表现出低浓度组升高,而中、高浓度组降低,说明PFOS的胁迫已经影响到真鲷肝脏的整个抗氧化系统。中浓度组的鳃和肝脏中的w(GSH)相比另2个浓度组的变化要剧烈,说明真鲷组织内GSH的调控系统对中浓度PFOS的敏感性较高。
含有巯基的蛋白质极易受到自由基的攻击而降低甚至丧失活性[19],GSH不仅与GST催化降解自由基直接相关,而且可以通过调节细胞内的氧化还原的水平调控GST的基因表达[20],BEUTLER等[21]的研究指出由于GSH合成酶缺陷造成GSH缺乏的患者,其红细胞中的GST活性降低75%。从此研究的结果可以看出,鳃组织内w(GSH)和GST活性的变化趋势十分相似,而肝脏中的w(GSH)和GST活性的变化在胁迫第15天同样表现出相似的剂量效应关系。笔者认为GSH和GST在PFOS曝露的早期可以参与细胞内氧化水平的调控,抵御污染物对细胞造成的损伤,随着组织内PFOS含量的增加,氧化损伤的加重,GSH和GST出现代谢紊乱,失去调整细胞内氧水平的能力,随着细胞损伤的加重,GSH和GST代谢受到影响而低于正常水平。此试验中鳃组织和肝脏组织在胁迫期内均出现紊乱现象,而在胁迫第15 天鳃组织中的GSH和GST依然高于对照组水平,肝脏内出现了明显的剂量效应,原因是生理功能的差异使PFOS在肝脏组织较鳃组织更容易蓄积,造成的组织损伤重于鳃组织。
该研究中净水恢复阶段内w(GSH)和GST活性与对照组的差异随着释放时间的延长而减小,在恢复阶段结束时仅鳃组织中高浓度组的w(GSH)和肝脏中浓度组GST活性恢复至对照组水平。穆景利等[22]报道黑鲷(S.macrocephlus)在苯并[a]芘胁迫2周后,净水恢复1周肝脏中的GST活性与对照组无差异。在PFOS长时间曝露后对机体已造成相当的损伤,虽然经过净化可以排出部分体内的PFOS,通过自身的调节和修复可以恢复,但不能在短期内完全恢复至正常水平。
谷胱甘肽相关酶 篇5
1 对象与方法
1.1 研究对象
调查2003-2006年在包钢三医院就诊的孕妇及其新生儿,其中低出生体重儿57名,正常对照儿108名。低出生体重儿的入选标准:(1)孕周>28周 ,体重<2 500g;(2)正常分娩 ,剔除意外情况引起的早产儿;(3)剔除双胎或多胎、先天畸形儿。正常对照儿入选标准:选择与低出生体重儿同一医院出生的孕周≥28周、体重≥2 500g、出生时间相差 < 7 d、单胎正常活产婴儿。
1.2 调查内容与方法
1.2.1 问卷调查
采用统一问卷调查表,由经培训的调查员对每个孕妇进行逐一询问,获得详细人口统计资料,包括:一般情况,疾病史、健康状况、职业史、吸烟饮酒史、饮食习惯、月经和生育史。
1.2.2 新生儿调查
根据产房病例记录了解新生儿出生时状况,包括孕周、新生儿性别、出生体重等。
1.2.3 血样收集及DNA提取
用EDTA抗凝管经无菌操作取母亲外周血2 mL, 4 ℃保存, 24 h内按标准法提取基因组DNA。
1.2.4 基因型检测
GSTT1基因的遗传多态性为大片段基因缺失,其PCR扩增引物5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′和5′- TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′反应体系同时加入CYP1A1基因同时扩增,产生320 bp基因片段为PCR反应的阳性对照,其引物5′-GCTCCACTCACTTGACACTTCTG-3′和5′-CAGCTGCATTTGGAAGTGCT-3′(引物上海生物工程公司合成),反应体系:12.5 μL PCR反应体系中含有10×Buffer (Mg2 + 15 mmol/L)1.25 μL, dNTP (0.2 mmol/L)0.25 μL,上游引物 (5 μmol/L)0.1 μL,下游引物 (5 μmol/L)0.1 μL,基因组 DNA 2.0 μL, Taq DNA聚合酶(2 U/μL)0.5 μL,灭菌双蒸水 8.3 μL)。PCR反应条件为94 ℃变性5 min,94 ℃ 45 s,56 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,扩增35个循环,最后72 ℃延伸7 min。PCR产物用2 %的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色(Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture、Marker购自大连TaKaRa宝生物公司,琼脂糖等试剂购自上海生物工程公司)。GSTT1存在基因型个体扩增出480 bp和320 bp两个片段,而GSTT1缺失型个体仅显示出一条320 bp片段。
1.3 统计学分析
用SPSS11.0统计软件进行统计分析。根据等位基因的频率,用χ2检验对GSTT1基因型分布进行遗传平衡检验。用Logistic回归法分析母亲GSTT基因型与新生儿出生体重的关系,并调整主要混杂因素。
2 结果
2.1 研究对象一般特征
调查研究对象包括57名病例组和108名对照组的孕妇和她们的新生儿。研究对象一般特征见表1、表2。病例组和对照组T检验结果显示:母亲收缩压、舒张压、心率、月经首龄、分娩孕周、睡眠时间差异存在显著性,P值均<0.05。
2.2 GSTT1基因型分析结果
母亲的GSTT1基因型分布见表3。经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.173,P>0.05)。
2.3 基因多态性与低出生体重关系
单因素分析,GSTT1缺失基因型与存在基因型相比未增加低出生体重发生的危险性 (OR=1.357, 95 % CI0.695~2.646,P=0.335),Logistic多因素分析,调整影响出生体重的影响因素包括:身高、体重、文化程度、健康状况、收缩压、舒张压、孕前体重、分娩孕周、情绪、失眠、多梦、紧张、使用计算机时间、看电视时间及家人关照程度后,仍未显示GSTT1缺失基因型可增加低出生体重的危险性(OR=2.047, 95 % CI0.762~2.854,P=0.107)。结果见表4。
3 讨论
分娩代表胎儿在宫内生长发育的终点,它受母亲、胎盘、胎儿和一系列生物和环境因素的影响。以往研究主要集中在社会环境或临床因素,对低出生体重的遗传影响因素研究相对较少。有证据表明,出生体重受遗传和环境因素的影响。在同胞之间出生体重的相关系数为0.36~0.62(中位数约为0.5)[3]。有人观察到低出生体重存在着代与代之间的遗传,说明遗传因素在低出生体重的发生中起一定作用。
谷胱甘肽转硫酶(GST)是一组PhaseⅡ主要的解毒酶,具有保护细胞免受亲电子细胞毒物质和致畸物影响的作用,基因缺失可导致其解毒功能的损失,进而增加了个体对许多疾病的易感性[5,6]。可溶性GST家族为二聚体酶,它催化谷胱甘肽与大量的亲电子物质结合,进而脱毒,并协助排出体外。GSTT1基因位于22q11.2,由5个外显子组成[7]。大量证据表明GST酶的表达水平是决定细胞对有毒化学物质敏感性的决定因素。在人体内,GSTT基因的表达水平存在显著的个体差异,人的GSTT1蛋白的不表达可导致膀胱癌、结肠癌、皮肤癌和肺癌的易感性增加[5]。
Wang等[8]研究发现同时具有CYPIA1 Aa/aa基因型和GSTT1缺失基因型的母亲,在怀孕期间吸烟,可显著增加分娩低体重儿的危险性。陈大方等[9]研究发现具有芳香族暴露史的妇女,其GSTT1基因多态性与新生儿出生体重无显著相关性,但发现同时具有GSTT1缺失基因型与EPHX1 His139His纯合基因型新生儿可显著降低其出生体重。原因可能是胎儿GSTT1缺失基因型造成GSTT1酶不表达因而影响胎儿的生长导致低体重。陈大方等[9]在另一项研究中显示GSTT1缺失基因型与新生儿出生身长不相关,但GSTT1缺失基因与MSPI杂合子/突变纯合子基因型这一组合可显著降低新生儿出生身长。我们研究PhaseⅡ基因GSTT1 的多态性对新生儿出生体重的影响。在调整了混杂因素前后,GSTT1缺失基因型与存在基因型比较,均未见导致增加低出生体重的危险性。这一结果与上述的研究结果相一致。因收集低出生体重样本困难,我们收集的病例样本数量较少,可能影响分析结果,今后将进一步扩大样本量,进一步探讨两者关系,及基因与环境的交互作用对低出生体重的影响,为低出生体重发生的病理机制提供科学依据。
参考文献
[1]林良明,刘玉琳,张新利,等.中国低出生体重儿抽样调查结果[J].中华预防医学杂志,2002,36(3):149-153.
[2]Dyson DC,Danbe KH,Bambe rJA,et al.Monitoringwomen at risk for preterm labor[J].New Engl J Med,1998,338:15-19.
[3]Wang XB,Zuckerman B,Coffman GA,et al.Aggregationof low irth weight among whites and blacks in the UnitedStates[J].New Engl J Med,1995,333:1744-1749.
[4]Wildschut HJJ,Lumey LH,Lunt PW.Is preterm deliverygenetically determined[J].Paediatr Perinat Epidemiol,1991,5:363-372.
[5]Hayes JD,Pulford DJ.The glutathione S-Transferasesupergene family:regulation of GST and the contributionof the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug re-sistance[J].Cirt Rev Biochem Mol Biol,1995,30:445-600.
[6]Abdel-Rahman SZ,Anwar WA,Abdel-Aul WE,et al.GSTM1 and GSTT1 gene are potential risk modifiers forbladder cancer[J].Cancer Detect Prev,1998,22:129-138.
[7]Cotton SC,Sharp L,Little J,et al.Glutathione S-trans-ferase polymorphisms and colorectal cancer:a huge review[J].Am J Epidemiol,2000,151:7-32.
[8]Wang XB,Zuckerman B,Pearson C,et al.Matemal ciga-rette smoking,metabolic gene polymorphism,and infantbirth weight[J].JAMA,2002,287:195-202.
谷胱甘肽相关酶 篇6
1 材料与方法
1.1 试验材料
小盐芥、拟南芥。
1.2 试验方法
提取盐芥、拟南芥总RNA, RT-PCR为CDNA。实时定量PCR检测。
盐芥GPX:5′引物TCGTCCTCTTCCTTTATCGACA ACG;3′引物CGCATCCTTCACGGTGAAATCATAG。
拟南芥GPX:5′引物TCTCTTCCAATTTCTACAACG GGA GC;3′引物CTTAGCATCCTTGACGGTGAAATCG。
反应条件:94℃3min (94℃40sec;56℃30sec;72℃1min) 30个循环, 72℃7min。
2 结果与分析
由表1可知, 拟南芥盐激处理及对照:以肌动蛋白为内参, 2-△△CT值为2.776 626 901>1, 表明拟南芥盐激处理后, 谷胱甘肽过氧化物酶表达有所上调且上调较多;盐芥盐激处理及对照:以肌动蛋白为内参, 2-△△CT值为0.915 945 29<1, 表明盐芥盐激处理后谷胱甘肽过氧化物酶表达有所下调。
3 讨论
本试验把未经盐激处理的样品作为参照因子, 经内标基因均一化处理后, 通过2-ΔΔCT方法计算。根据定义, 对于未经处理的参照样, △△CT=0, 而20=1, 即未经处理样本的倍数变化为1, 而对于那些经过处理的样本, 相对于参照因子基因表达的倍数为2-△△CT。出现这种结果有几种可能:一是盐处理的浓度过高, 植物体内产生的活性氧超出了抗氧化系统的清除能力, 对植物造成伤害, 从而使植物的基因组转录受到影响;二是植物为了防御盐胁迫, 适应性地降低了植物基因组的转录, 从而更有效地利用体内资源;三是在盐胁迫下谷胱甘肽过氧化物酶通过活性的升高对清除活性氧起到积极作用, 通过表达谷胱甘肽过氧化物酶的方式提高耐盐性;四是此次试验仅仅检测了谷胱甘肽过氧化物酶同工酶中的1种, 并不能代表全部的谷胱甘肽过氧化物酶情况, 植物对盐胁迫的耐受机制可能很复杂, 还需要进一步试验。
参考文献
[1]沈成国.植物衰老生理与分子生物学[M].北京:中国农业出版社, 2001:57-58.
[2]李晓燕, 宋占午, 董志贤.植物盐迫生理[J].西北师范大学学报, 2004 (3) :106.
[3]徐文东, 杨强, 徐志伟.谷胱甘肽及其相关酶在生物体内的作用[J].福建热作科技, 1999 (24) :42.
[4]YUCHEN MIAO, DONG L V, PENGCHENG WANG.An Arabidopsis Glutathione Peroxidase Functions as Both a Redox Transducer and a Scavenger in Abscisic Acid and Drought Stress Responses[J].The PlantCell, 2006 (18) :2749-2766.
谷胱甘肽相关酶 篇7
传统治疗TBI的方法是早期实施外科手术,同时结合药物、亚低温手段。随着神经外科技术的发展和重症医疗救护能力的提高,绝大多数患者都能得到及时救治,特别是早期实施开颅减压能减轻脑水肿对正常脑组织进一步损害,挽救患者的生命。但后期TBI患者神经功能的缺失却一直是无法解决的问题,患者无法生活自理,甚至一些患者呈永久植物状态生存。经多中心临床研究表明,药物及亚低温治疗对重型TBI患者功能恢复并无太多益处[1,2,3,4]。而高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)作为一种新生的治疗手段,经研究证实,不仅可以在早期起到降低颅内压[5,6,7]、减轻脑水肿[8]的“内科减压”治疗作用,同时在细胞及亚细胞水平上阻断脑水肿病理过程的进一步发展,防止二次损伤[9,10,11],对后期神经功能改善起到积极的治疗作用[12,13],但HBO是否增加氧化损伤一直存在争论。
本实验通过比较脑损伤组、HBO治疗组及空白对照组大鼠脑血清谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活力、丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)含量的差别,寻找TBI模型大鼠氧化-抗氧化指标在HBO治疗干预下的变化规律,为临床HBO治疗TBI患者提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
液压撞击仪系统(HPD-1700,31.28 m V/psi,美国Dragenfly有限公司生产),电子天平(YP1200,上海第二天平仪器厂生产),电动牙科打磨机(90型,佛山市安友伴医疗器械有限公司生产),电动离心机(KA100,上海安亭科学仪器厂生产),单人纯氧舱(NG90-ⅢBd单人医用高压氧舱,宁波高压氧舱总厂生产),分光光度计(ultrospec 3000 pro分光光度计,由海军总医院中心实验室提供)。GSH-Px活力、MDA含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 实验分组及HBO治疗方案
雄性Wistar大鼠80只随机分为8组,每组10只,其中1~4组为脑损伤组,分别于建模后24 h内、第5天、第10天、第15天处死;5~7组为HBO治疗组,5组建模当天开始行HBO治疗至第5天处死,6组建模后第5天开始行HBO治疗至第10天处死,7组建模后第10天开始行HBO治疗至第15天处死;8组为空白对照组。按损伤后阶段划分,2组(脑损伤组)与5组(HBO治疗组)、3组与6组、4组与7组相对应。脑损伤组与HBO治疗组大鼠都进行液压撞击建立模型,治疗组大鼠行HBO治疗,治疗压力2.0 ATA,氧气洗舱时间5 min,加压时间5 min,减压时间5 min,稳压吸氧45 min,舱内温度(23.3±2)℃。1次/d,共5次。
1.3 TBI模型的建立
采用侧位液压撞击(lateral fluid percussion,LFP)法建立TBI大鼠模型[14,15],清洁级雄性Wistar大鼠(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,批号:SCXK-(军)2007-004,共80只,体重(276±26)g。大鼠术前均禁食12 h,禁水6 h[16],称重后以10%水合氯醛(按3.5 g/kg麻醉剂量)[17]腹腔内注射麻醉后,俯卧位于固定板上固定,去除大鼠头部正中线处毛发暴露皮肤,安尔碘常规消毒。沿正中线由颅底部向鼻部剪开头皮,钝性分离头皮下筋膜直至右侧冠状缝至人字缝之间颅骨完全暴露。使用电动牙科打磨机于矢状缝右侧4 mm、冠状缝后侧4 mm交点处钻孔,钻孔直径约4 mm,穿透颅骨,硬脑膜完整[18]。以37℃生理盐水注入撞击仪储液装置内,连接大鼠露骨钻孔处,按电压-力量换算公式计算打击力度的电压值[19,20],使用相同重锤下落高度,液压撞击仪撞击1次,经示波器读取电压值,换算为打击力度。撞击结束后安尔碘常规消毒切开皮肤,缝合头皮。
根据文献选择打击力度,通过调节重锤下落距离调整打击力量,调节至示波器显示(1.24±0.023)v[(273.27±5.07)k Pa,中~重度损伤][20]。
1.4 指标测定
GSH-Px活力测定采用比色法,MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,计量资料统计学描述采用均数±标准差。表示。多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组总体GSH-Px活力、MDA含量比较
结果显示,GSH-Px活力损伤组显著低于空白对照组(P<0.01),治疗组显著高于损伤组(P<0.01);MDA含量损伤组显著高于空白对照组(P<0.01)。见表1。
注:与空白对照组比较,aP<0.01;与脑损伤组比较,b P<0.01
2.2 各组不同阶段GSH-Px活力、MDA含量比较
GSH-Px活力不同阶段治疗组均高于相应时期损伤组,其中6组(建模后第5天开始行HBO治疗至第10天处死)显著高于3组(建模后第10天处死)(P<0.01),损伤组1至4组呈时间相关性升高;MDA含量损伤组1至4组呈时间相关性下降,其中1、2组均显著高于空白对照组(P<0.01)。见表2。
注:与空白对照组比较,aP<0.01,bP<0.05;与3组比较,c P<0.01
3 讨论
TBI发生后,损伤局部脑血流量减低、氧弥散功能障碍导致损伤局部脑组织缺血缺氧,有氧代谢减少、无氧代谢增加,结果是酸性产物增多、细胞能量消耗增加。能量供给不足,细胞膜转运功能失调,发生细胞内钙离子超载等细胞内水、电解质紊乱。异常的细胞内环境导致兴奋性氨基酸及大量自由基释放。大量自由基释放作用于生物体膜结构,导致细胞膜及亚细胞膜(如线粒体)结构及功能损害,进而引发以脂质过氧化反应(lipid peroxidation,LP)为主要机制的病理生理变化过程[4]。所以,TBI发生后机体发生氧化应激(oxidative stress,OS)损伤是一个必然的病理过程,其实质是氧化-抗氧化不平衡[21],即活性氧过量生成和/或抗氧化防御系统受损,导致超氧阴离子(O2)、过氧化氢(H2O2)等氧自由基及其相关代谢产物过量聚集,而对细胞产生多种毒性作用。在这个过程中,GSH-Px作为清除自由基主要组成部分,反映机体的抗氧化能力;MDA为膜结构发生脂质过氧化反应的代谢产物,间接反映氧化损伤的程度。
HBO作为TBI治疗的一种重要手段已得到一致认可,它可以改善损伤后局部组织缺氧、减轻水肿,而目前HBO治疗是否增加氧化损伤仍存在争议。本实验中,脑损伤组与空白对照组比较,GSH-Px活力显著降低(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01),说明TBI模型大鼠损伤后存在明显的氧化-抗氧化失衡,氧化损伤明显。同时,脑损伤组GSH-Px呈时间相关性升高,且均低于空白对照组;MDA含量呈现时间相关性降低,直至第15天仍高于空白对照组,说明TBI模型大鼠氧化应激在1~2 d达到高峰后,机体自身的抗氧化能力缓慢提高,但仍处于氧化-抗氧化失衡状态。
谷胱甘肽相关酶 篇8
1 材料与方法
1.1 主要药物与试剂
还原型谷胱甘肽 (重庆药友制药有限责任公司);4.25%葡萄糖腹膜透析液 (美国百特公司);注射用乳糖酸红霉素(湖南中南科伦药业有限公司);DNA抽提缓冲液;ELISA检测试剂盒(日本老年病研究所):红细胞裂解液;定量PCR试剂:BBIGreen-2-Go q PCR Mastermix-ROX(2x)。引物设计合成:上海生工生物工程有限公司.
1.2 实验动物及分组
健康雄性SD大鼠60只[动物批号:SCXK(渝)2007-0005],10周龄,体重200~250 g。按随机数字法分为3组:对照组(n =20,A组):每只大鼠每天腹腔注射生理盐水25 ml;模型组(n =20,B组):每只大鼠每天腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液25 ml+ 每周1次腹腔注射红霉素6.25万IU;治疗组(n =20,C组):每只大鼠每天腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液25 m L+GSH溶液150 mg/(kg·d)+ 每周1次腹腔注射红霉素6.25万IU。常规饲养SD大鼠,实验周期为8周。
1.3 标本取材
于实验最后1天给予4.25%葡萄糖腹透液25ml注入腹腔后保留4 h,断头法处死所有大鼠,吸取腹腔液体,混匀用于白细胞计数;避开穿刺部位,留取壁层腹膜组织约10 mm×5 mm×3 mm大小,固定于10%甲醛溶液12 h以上。同时游离出净4 cm×4cm大小并应用分析天平称取重量,分别用PBS缓冲液和DEPC处理后生理盐水清洗锡纸分装,放入冷冻管 -80℃保存。红细胞裂解液裂解红细胞,改良Neubauer计数板计数腹腔液体白细胞数目,超过3 000个 /ml为并发感染,退出实验。
1.4 HE 染色和 Masson 染色
取石蜡包埋的壁层腹膜组织,作5μm切片,常规方法行HE和Masson染色,光镜下观察腹膜组织病理改变。
1.5 基因组 DNA 抽提、DNA 酶解、ELISA 检测和荧光定量 PCR 等均按常规方法进行操作
1.5.1荧光定量PCR组织中总RNA的提取:取出保存在 -80℃冰箱中经PBS缓冲液清洗后的腹膜组织,取50~100 mg组织液氮研磨至粉末状,置1.5ml离心管中,加入1 ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。加入0.2 ml氯仿,剧烈振荡15 s,静置3 min。4℃离心,12 000 r/min离心10 min,取上清,置于另一1.5 ml无菌离心管中加入0.5 ml异丙醇,混匀,冰上静置20~30 min。4℃离心,12 000 r/min离心10min,弃上清。加入1 ml 75%乙醇,洗涤沉淀。4℃,7 500 r/min×5 min,弃上清。室温放置晾干,加入适量的Rnase-free H2O溶解。
1.5.2 c DNA合成在0.2 ml PCR管中加入以下试剂:总RNA,随机引物p (d N)6 (0.2μg/μl),Rnase-free dd H2O后70℃温浴5 min,冰浴10 s,离心加入反应缓冲液等试剂,37℃温浴5 min,42℃温浴60 min,70℃温浴10 min,终止反应。将上述溶液-20℃保存。
1.5.3引物设计及合成从Gen Bank获得目的基因m RNA的全长序列,用Primer Express设计引物序列,经过Blast分析,引物序列具有特异性。所用的引物及管家基因引物均委托上海生工公司合成。引物序列见表1。
1.5.4 Realtime PCR反应1配制反应混合液;2PCR循环条件:保持10 min,95℃;循环15 s,95℃;1min,60℃(需40个循环)。PCR反应结束后,运用PCR分析仪自带软件计算出平均阈值循环数,即Ct值,按下列公式计算样本中的R-rogg1的相对表达量:△Ct(目的基因)= 目的基因Ct- 内参照基因Ct;△△Ct=△Ct(目的基因)-△Ct(标准值);目的基因的相对总量为2-△△Ct。
1.6 统计学处理
实验所得计量资料以均数±标准差 (±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析。分析前进行方差齐性检验,方差齐时用LSD法,若方差不齐则用Tamhane’5法(q检验)。使用Excel及SPSS11.5统计学软件进行分析,P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物转归
8周时,60只大鼠均无死亡,各组大鼠均出现不同程度的活动减少,反应迟钝现象。
2.2 腹腔液体白细胞计数
先用红细胞裂解液裂解红细胞,再用改良Neubauer计数板计数,白细胞计数超过3 000个/ml为并发感染,退出实验。经过细胞计数未发现大鼠发生感染。
2.3 各组大鼠壁层腹膜组织形态学变化(HE 染色及 Masson 染色)
光镜下,对照组腹膜覆盖着一层扁平间皮细胞,细胞核呈扁平的不规则形状,为蓝紫色,胞浆较少,粉红染色,其下为纤维结缔组织,细胞数较少,无明显损伤或损伤轻微,腹膜结构完整。模型组和治疗组可见腹膜间皮细胞变为圆形、柱形,间皮细胞肥大脱落,间皮下结缔组织增厚,可见血管生成以及纤维素样物质沉积,成纤维细胞及单核巨噬细胞浸润,在模型组表现尤为明显。见图1。Masson染色中,与对照组相比,模型组显示有胶原沉积,治疗组与模型组相比,胶原沉积有所减少。见图2。
2.4 各组大鼠壁层腹膜组织间皮细胞中 8-OHd G检测结果
与对照组比较,模型组与治疗组大鼠壁层腹膜组织间皮细胞8-OHd G表达均有明显增高,模型组增高最为明显,组间差异有统计学意义(P <0.05),见表2。
2.5 各组大鼠壁层腹膜组织中 r OGG1 表达
经荧光定量PCR检测扩增、溶解曲线,r OGG1在各组中的表达量不同,r OGG1在模型组中表达最低,治疗组最高,各组间差异有统计学意义 (P <0.05)。见表3。
注:1)与对照组比较,P <0.05;2)与模型组比较,P <0.05
注:1)与对照组比较,P <0.05;2)与模型组比较,P <0.05
3 讨论
持续性不卧床腹膜透析 (continue a peritonealdialysis,CAPD)长期而有效的进行,很大程度上取决于腹膜结构和功能的完整性。腹膜纤维化是CAPD的严重并发症之一,其所导致的超滤失败、透析效能降低是大多数CAPD患者退出腹膜透析治疗的主要原因[3,4]。由于透析液的生物不相容性,长期的高糖刺激作用下能使腹膜间皮细胞的连接出现障碍,导致腹膜表层间皮细胞损伤,并抑制损伤后的再修复,最后使得腹膜间皮细胞剥脱,剥脱后的空间被胶原结缔组织占据而形成腹膜纤维化改变[5,6],同时腹膜间皮细胞在此发展过程中既是受害者又是主动参与者,其表型转变被认为是腹膜纤维化的一个重要机制[7]。
CAPD患者存在氧化应激状态,通过多种途径产生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),从而对腹膜间皮细胞造成损害[8],是高糖损伤腹膜间皮细胞的重要机制[9]。8-OHd G作为国际公认的DNA氧化损伤标记物[10,11],是活性氧自由基攻击DNA分子中鸟嘌呤碱基第8位碳原子后发生DNA链断裂、碱基修饰和DNA蛋白交联而产生的一种氧化性加合物[12,13]。长期的高糖容易加剧细胞内的氧化应激,高水平的8-OHd G在内皮的损伤中起着重要作用,高浓度葡萄糖促使细胞凋亡及DNA的氧化应激损伤[14,15],随着氧化损伤的进一步加重,导致细胞自身的抗氧化酶系活性下降,不能及时清除机体内聚集的代谢废物维持代谢平衡,从而发生细胞的凋亡[16]。r OGG1是体内能够特异性识别8-OHd G的酶,是单碱基切除修复酶的一种,具有修复DNA的氧化损伤,和其他修复基因表达的酶类共同维护DNA的稳定性[17]。r OGG1的表达主要受氧化应激及外界因素的诱导两方面相关,但各研究结果并不相同,大多认为[18]在一定范围内的氧化性损伤中,在抗氧化剂保护作用下,r OGG1表达上调,酶活性升高。
谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽转移酶在底物GSH的作用下,可清除自由基,使其转化成脂肪酸和水,而GSH被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)。巯基是GSH最重要的功能基团。巯基参与机体内多种重要生化反应,保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活而保证能量代谢和细胞利用。GSH能与自由基相结合,对抗氧化剂的破坏上的巯基,含巯基的蛋白质保护细胞膜和含巯基的酶破坏作用。
本实验中,B组HE染色及Masson染色可见腹膜间皮细胞变为圆形、柱形,间皮细胞肥大脱落,间皮下结缔组织增厚及纤维素样物质沉积,还可见成纤维细胞及单核巨噬细胞浸润,而C组中损害的腹膜间皮细胞结构上有所恢复。同时B组腹膜间皮细胞8-OHd G表达明显上调,r OGG1表达明显减少,提示机体在受到氧化应激损伤时修复酶r OGG1m RNA表达下调,考虑腹膜纤维化过程中氧化应激损伤可能参与其发生发展,与DNA修复酶r OGG1m RNA活性下降可能有关。C组8-OHd G表达下降,r OGG1表达上调,修复酶的活性增强,这与多数学者认为[19]的抗氧化剂可下调体内8-OHd G水平,上调r OGG1 m RNA的表达是一致的。GSH可能通过加强腹膜间皮细胞DNA修复酶r OGG1的糖基化酶活性作用,对大鼠腹膜间皮细胞DNA具有保护和修复作用,从而保护腹膜间皮细胞膜上的含巯基蛋白,减轻腹膜间皮细胞DNA受氧化损害的程度,延缓腹膜纤维化的发展。
摘要：目的 观察还原型谷胱甘肽(GSH)对高糖致大鼠腹膜间皮细胞8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)及其修复酶8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(r OGG1)表达的影响,探讨其对高糖所致腹膜间皮细胞DNA氧化损伤的保护作用。方法 将60只健康雄性SD大鼠按随机数字法分成3组:对照组(n=20,A组):每天1次腹腔注射生理盐水25 ml;模型组(n=20,B组):每天1次腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液25 ml+每周1次腹腔注射乳酸红霉素6.25万IU;治疗组(n=20,C组):每天1次腹腔注射4.25%葡萄糖腹透液25 ml+GSH溶液150 mg/(kg·d)+每周1次腹腔注射乳酸红霉素6.25万IU。8周后分别处死每组各20只大鼠,取腹膜组织分别行HE及Masson染色病理学检查、酶联免疫吸附法(ELISA)测定壁层腹膜间皮细胞8-OHd G水平、实时荧光定量PCR检测壁层腹膜间皮细胞r OGG1的表达。结果 1与A组比较,B组腹膜间皮细胞8-OHd G表达上调(0.8843±0.0068,5.0733±2.0068,P<0.05),C组8-OHd G表达低于B组(5.0733±2.0068,1.6867±0.4867,P<0.05);2与A组比较,B组腹膜间皮细胞r OGG1表达减少(0.7576±0.0701,0.2226±0.0565,P<0.05),C组r OGG1表达增高(0.7576±0.0701,1.4793±0.3895,P<0.05);3与A组比较,HE染色时B组和C组可见腹膜间皮细胞变为圆形、柱形,间皮细胞肥大脱落,间皮下结缔组织明显增厚,可见血管生成以及纤维素样物质沉积,还可见成纤维细胞及单核巨噬细胞浸润,在B组表现尤为明显;4与A组比较,Masson染色显示腹膜组织有胶原沉积,B组比C组改变更明显。结论 高糖致大鼠腹膜间皮细胞DNA氧化性损伤标记物8-OHd G表达增高,GSH可能通过上调DNA修复酶OGG1m RNA表达,对大鼠腹膜间皮细胞DNA具有保护和修复作用。
谷胱甘肽相关酶 篇9
葡萄糖耐糖因子(GTF)分泌不足导致的Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的80%以上,其典型症状主要是高血糖,高血糖可导致并发症,例如肾、眼、足等衰竭性病变。因此,治疗Ⅱ型 糖尿病须 保证体内 的GTF充足。
GTF是以Cr3+为中心离 子,由甘氨酸、谷 氨酸、半胱氨酸构成的短肽和烟酸(NA)螯合的、分子量为1500的化合物,主要功能是协调血液中葡萄糖、胰岛素与胰岛素受体三者的作用,维持体内血糖平衡。GTF普遍存在于哺乳动物的肝和肾等器官中,由于含量极低,器官收集困难,因此,一般以有机铬制品补充“耐糖因子”。目前,市售的有机铬制品主要有烟酸类铬、蛋氨酸铬及酵母 铬。与GTF相比较,烟酸类铬仅由烟酸和Cr3+构成,蛋氨酸铬仅由蛋氨酸和Cr3+构成,缺乏GTF具备的短肽,因而吸收和利用率均低;酵母铬是从酵母细胞中提取,组成最接近GTF,吸收、利用率均高的天然有机铬[1],是补充“耐糖因子”的最佳来源,但是,生产酵母铬需要大规模培养酵母菌,加之其在酵母细胞中含量极低、制备高纯 度产品困 难,价格高昂,难以广泛 应用[2]。
GTF是由Cr3+与烟酸、谷氨酸-甘氨酸-胱氨酸短肽螯合的水溶性小分子,其中Cr3+外围有3个半满轨道及6个空轨道。谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸缩合成的三肽,与GTF中螯合Cr3+的短肽类似,其-NH、-OH、-SH、-COOH均能与Cr3+相互作用;NA的吡啶N、-COOH也能提供孤对电子或负 电荷与Cr3+配位或形 成离子键。因此,以NA,GSH和CrCl3·6H2O为原料,可制备出结构与功能均类似于GTF的GSH-Cr3+-NA螯合物。本研究以NA,GSH和CrCl3·6H2O为原料,制备高纯度GSH-Cr3+-NA螯合物 ,分析影响合成螯合物的主要因素,获得最佳合成工艺,并对获得的螯合物进行表征,确定其螯合比例。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
CrCl3·6H2O、还原型谷胱甘肽(GSH)及烟酸(NA)(上海源叶生物科技有限公司,分析纯),pHS3C精密pH计(上海雷磁科学仪器厂),E52-1旋转蒸发仪(上海沪西分析仪器厂),D-1型真空冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司),971型增力无极恒速搅拌器(郑州长城科工贸有限公司),50Ⅱ红外光谱仪(美国品尼高公司),H4-200生物倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司),FM.IPC-208B原子力显微(重庆大学恒瑞公司),其他试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1制备螯合物冻干粉
称取适量CrCl3·6H2O,边搅拌边溶解,按照Cr3+∶GSH∶NA(mol/mol/mol)=1∶(2~6)∶(2~6)的比例依 次将NA和GSH溶解于其 中,在60℃、pH3~7下反应1~7h。反应完成后,10000rpm离心10 min,收集上清液并真空浓缩,直至浓缩液体积降低至上清液的1/20~1/12时止。收集浓缩液,加入30倍体积的95%乙醇,搅拌均匀后静置3h,抽滤,并用超纯水反复洗涤滤渣,直至洗涤液中检测不出Cl-、GSH、NA及Cr3+时为止。最后,将洗净的 滤渣置于 -18℃冰箱中 预冻后于58℃、40Pa的条件下冷冻干燥24h,获得螯合物冻干粉。置于棕色瓶中,密闭备用。
1.2.2螯合物分析
1Cr3+分析
采用高锰酸钾氧化-二苯碳酰二肼分光光度法测定螯合物中Cr3+含量[3];
2采用紫外法于262nm测定NA[4];
3采用谷胱甘肽荧光检测试剂盒测定GSH。
1.2.3螯合物表征
1晶体形态
分别取少量CrCl3·6H2O、NA、GSH及螯合物冻干粉,用光学显微镜观察其晶体形态。
2熔点
取适量NA、GSH、CrCl3·6H2O和螯合物 冻干粉,分别均匀分布于干净载 玻片上,盖上盖玻片后,用熔点测定仪观察其初熔和全熔时的温度。
3红外光谱分析
各取NA、GSH和螯合物冻干粉,采用KBr压片法分析[5]。
4原子力显微镜形貌分析
取洁净干燥的导电载玻片三张,先均匀涂抹薄层甲醛稀溶液,用无菌空气风干,再分别均匀涂抹薄层NA,GSH和螯合物,置于超净工作台上用无菌空气再次风干,最后用AFM.IPC-208B原子力显微镜(AFM)分别观察形貌。
2结果与讨论
2.1合成GSH-Cr3+-NA2螯合物的优化工艺
2.1.1反应时间
螯合反应是配体的孤对电子与中心离子形成配位键,由于配位键形成,配体荷负电基团也临近中心离子,释放出质子并与正电荷中心离子形成离子键,于是体系pH降低。因此,体系pH是否变化可作为确定螯合反应是否完成的定性指标。图1为螯合反应中体系的pH与反应时间的关系。由图可知,当螯合时间<3h时,体系pH随反应时间增加而逐渐降低,当螯合时间>3h,体系pH不再随时间增加而升高。因此3h为最佳反应时间。
2.1.2pH 值
螯合物的形成一方面得益于中心离子和配体在体系中的溶解状态,另一方面得益于配体给出孤对电子的能力。就Cr3+而言,假定铬的浓度是0.01mol·L-1,开始沉淀时候的pH是4.6(氢氧化铬),须在pH4.6以下螯合;NA的pKa为4.8,在pH低于4.8时几乎均为羧酸,由于质子未离去,羰基氧原子电子云密度低于负离子型,不利于其临近及螯合,所以,从理论上 讲,升高pH有利于形 成NACr3+螯合物;就GSH而言,pH对酰胺键羰基氧和亚氨基氮参与配位没有影响,但巯基解离有利于与Cr3+形成离子键,当pH较低时,GSH中的巯基由于受H+竞争的影响,配位能力较弱[6],随着pH的增大,GSH配位能力增强,但由于Cr3+发生水解形成氢氧化物沉淀,导致GSH含量降低。
图2中a为pH值对Cr3+参与螯合形成GSHCr3+-NA2螯合物的贡献。从该图可以看出 ,当pH<5时,随着pH值的升高,Cr3+的贡献率增大,即螯合物中Cr3+百分含量随着pH升高而增大;当5<pH<6时,Cr3+对形成GSH-Cr3+-NA2 螯合物的贡献率则随pH升高而降低,但当pH由6升至7时,Cr3+的贡献率增加。
图2中b为pH值对GSH参与螯合 形成GSH-Cr3+-NA2螯合物的贡献。由图可知 ,当pH<4.5,随着pH增大,GSH的贡献率增加,即螯合物中GSH百分含量随着pH升高而增大;当pH超过4.5时,GSH对形成的GSH-Cr3+-NA2 螯合物贡献率则随pH值的升高而降低。
图2中c为pH值对NA参与螯合形成GSHCr3+-NA2螯合物的贡献。从该图可以看出 ,在pH为3~5区间,随pH升高,NA的贡献率增加,即螯合物中NA百分含量随着pH升高而增大;当pH>5时,NA对形成GSH-Cr3+-NA2螯合物的贡献率则随pH值的升高而降低。
综合以上结果,当pH为5时,GSH,NA与Cr3+的络合能力均接近最佳,最有利于形成接近天然GTF的螯合物,所以选择pH=5为合成GSHCr3+-NA2螯合物的最佳pH。
2.1.3摩尔比
配体与金属离子反应的摩尔比决定螯合物的结构及稳定性,是影响螯合反应的重要因素[7]。通过改变CrCl3·6H2O、NA及GSH的反应配比,制备不同摩尔比的螯合物,其结果如表1所示。
由表1可知,保持NA不变,螯合物中GSH的比例随着GSH的增大而上升;同理,保持GSH不变,螯合物中NA的比例随着NA的增加而上升。显然,这是配位势随其浓度上升而增大所致[8]。从该表还可 以看出,当Cr3+/NA/GSH (mol/mol/mol)=1∶2∶4时,制备出的螯合物中Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶1,其组成与 天然GTF最为接近,因而应用价值最高。综上所述,可以得出:NA、GSH与Cr3+发生配位反应,其中NA中的-C=O、GSH中的-NH、-C=O参与配位,生成Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶1的螯合物,反应如图3。
2.2螯合物的表征
2.2.1晶体形状
袁润章[9]认为物质结构差异会导致其结晶性及晶体形状差异,因此,观察物质的晶体形状可判断物质种类。从图4可以看出,NA晶体呈扁 立方体,GSH为针状,CrCl3·6H2O呈长锥方体,而Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶1时形成的螯合物为长方 形薄片,明显不同 于NA、GSH及CrCl3·6H2O。这表明合成的螯合物是一种不同于NA、GSH和CrCl3·6H2O的新物质。
2.2.2熔点
熔点是物质本身的一种特征属性,物质不同,其熔点不同[10],是判断物质种类的特征指标之一。由表2的数据可知:CrCl3·6H2O、GSH和NA的熔点与文献值相近;CrCl3·6H2O与GSH、NA混合物的熔程也仅为170~210℃,螯合物的熔点超过300℃,远远高于CrCl3·6H2O、GSH、NA以及它们的混合物,故可通过熔点的显著差异,判断该螯合物为新物质。晶体熔点与化学键有关,其中离子型晶体的熔点与离子键键能有关,分子型晶体与分子间作用力(如氢键)有关。Cr3+的外层空轨道可容纳孤对电子,可与GSH和NA配位合成螯合物,其正电荷可与配体的负电荷羧基氧形成离子键,而且螯合物配体中的氢键供体或受体均可与临近的氢键受体和供体形成氢键。所以,该螯合物从理论上讲既有离子型、又有分子型晶体的性质,即熔点包含了离子键和氢键的贡献,因此远高于CrCl3·6H2O、GSH和NA。另一方面,Cr3+可与3倍量的羧基形成离子键,而GSH分子具2个游离羧基,一个游离氨基,其中α氨基与α-羧基一般形成内盐[11],仅剩余1个游离羧基,而烟酸仅一个羧基。所以,该螯合物的离子键理应是在1个GSH羧基与两个NA羧基之间形成,这正好对应于其化学构成GSH-Cr3+-NA2,也从另一视角理论证明GSH-Cr3+-NA2晶体为分子型。
℃
2.2.3红外光谱
图5是GSH,NA和螯合物的红外光谱。从该图可知,与GSH(a)相比,螯合物(c)的-NH-伸缩振动峰从3249.85cm-1处蓝移至3264.72cm-1,这是N原子参与配位,导致其电子云密度增大而引起的;其中NHC=O中-C=O的吸收峰从1600.86cm-1处红移至1538.55cm-1,说明该C=O也参与配位,导致其周围的电子云密度减小所致[12];与-C=O相连的-CH2反对称伸 缩振动峰 从2943.36cm-1处红移至2926.17cm-1,是C原子向N原子靠近引起的,这从另一角度证明N原子参与了配位;-SH吸收峰的消失,是-SH与Cr3+形成离子键引起的。
陈强等[13]研究发现,NA(b)若以羧基 与铬配位,则其吸收峰会红移。螯合物羧酸基团的-C=O特征吸收峰从1707.49cm-1处红移至1642.71cm-1,说明其参与了配位反应[14];其-OH伸缩振动吸收峰消失 表明-OH去质子化,-COOH以-COO形式的存在或其H被铬取代[15]。=C-N的伸缩振动峰在形成配合物前后基本没有变化,所以吡啶N没有参与配位[16,17]。
由此可以说明:GSH分子提供酰胺键的-NH、C=O、-SH,NA分子提供 羧酸-OH和-C=O参与Cr3+的配合反应,合成GSH-Cr3+-NAn螯合物。
图5GSH,NA和螯合物的红外光谱注:a为 GSH;b为 NA;c为螯合物(Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶1)Fig.5InfraredspectrogramofGSH,NAandchelateNote:aisGSH,bisNA,cischelate(Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶1)
2.2.4原子力显微镜扫描(AFM)
原子力显微镜(AFM)利用原子间的相互作用力在纳米水平上呈现样品的表面特性。基于样品的结构特征、键长和键角,勾画出基团、原子的形貌,逐步应用于生命、材料科学等领域,用于研究离子通道[18]、萃取蛋白质[19]和短肽[20]等,是一种表征物质结构和相互作用机制的高效工具。
图6、7、8分别是NA、GSH以及螯合 物的AFM形貌。图中的红色、蓝色分别为高点和次高点,表示样品的原子或基团;绿色处为无样品的低点。从图6(b)可看到大量 六元环状 结构,相似于NA的吡啶环;从图7(b)可看到大量的链状结构,与GSH的结构基本一致;从图8(b)可以看到,一直径约0.0612nm的粉色圆点被两个与图6基本一致的六元环、一条与图7基本一致的链状物“临近”,其中,直径约0.0612nm的粉色圆点为Cr3+,六元环为NA的吡啶环,链状物为GSH。吡啶环羰基与Cr3+的距离约0.18nm,与NA的-C=O与中心离子Cr3+形成配位键的键长相近;GSH与Cr3+的距离约0.17nm,与GSH中的-NH与Cr3+形成的配位键键长相近,其中0.17nm和0.18nm均在配位键健长范围内，由此可知，整合物以cr2+为中心离子,与至少一个GSH和两个NA配位而成。
3结论