克伦特罗(瘦肉精)（共3篇）
克伦特罗(瘦肉精) 篇1
盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride,CL)即瘦肉精。其化学名为:羟甲叔丁肾上腺素或2-[(叔丁氨基)甲基-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐,药品名为双氯醇胺、舒喘宁、克喘素等。盐酸克伦特罗由于其具有强力持久松弛支气管平滑肌的功能,首先被用来治疗动物肺部疾病和人类哮喘;由于其具有改变养分代谢途径、能量重分配等作用,因此不法商贩将其作为饲料添加剂,促进动物生长,减少脂肪沉积,明显促进肌肉合成。然而盐酸克伦特罗具有比较稳定的化学性质,在烹调过程中难以破坏其毒性,当人类食用残留瘦肉精过高的肉制品和内脏后可能引发中毒:失眠、低磷酸盐血症、瘫痪、肌肉震颤、血压升高、头晕、口干、心动过速、低血钾等,甚至会引发死亡[1]。因此,对盐酸克伦特罗检测方法的研究具有十分重要意义。本文对免疫分析法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等检测方法进行了探讨,并对各种检测方法进行了比较。
1 盐酸克伦特罗的实验室检测方法
1.1 高效液相色谱法(HPLC)
采用HPLC对盐酸克伦特罗分析时不需要进行衍生。其原理是C18或C8固定相能够与肾上腺素能激动剂分子相互作用,采用反相柱和质谱检测器、紫外检测器、电化学检测器对瘦肉精进行检测。HPLC具有高灵敏性、操作简便、分析自动化、节省时间、重现性好、效率成本比价高、假阳性率低等优点。其缺点是对设备要求高、价格昂贵、检测过程繁琐、样品处理时间长[2]。其具体方法如下:一是检测器为紫外检测器(UV)。波长为215~245 nm;色谱柱为Watersl50×3.9 mmd的symmetry Cl8柱;流动相为醋酸与醋酸铵的甲醇水溶液,梯度洗脱。二是检测器为电化学检测器。柱子为Lichrocart RP-SB;流动相为乙腈水溶液(30∶70),流速0.8 m L/min。工作电极为电压800 mV,参比电极为Ag/Ag Cl。三是检测器为质谱检测器。流动相为含0.05%甲酸和5%乙腈的水溶液,含0.05%甲酸的乙腈溶液,梯度洗脱检测离子为母离子m/z为277,子离子m/z为277、259、204、64;内标物为氘代的克伦特罗;源温为120℃,锥孔电压为19 V,碰撞塌压为-16 V。
1.2 生物传感器技术(BS)
BS是现在非常受关注的综合性很强的技术领域,该技术是将生物技术与微电子技术有机结合,采用生物体内抗原、抗体专一性结合从而改变电化学的特性设计成免疫生物传感器。将瘦肉精单克隆抗体微型化膜固定在换能器的表面,加入已知浓度的酶标激素于待测样品中,CL与标记抗原竞争性地附着在电极上的抗体,电极经过洗涤后与底物溶液接触,标记酶与底物发生化学反应,转变出来的电信号经过输出、处理分析直接显示残留CL的含量。Pizzariello通过分子标记聚合膜(MIP)作为分子识别系统测试了牛肝中盐酸克伦特罗的残留量,同时证明了生物传感器技术特异性强。酶标免疫传感技术[3,4]通过酶的化学放大特性,可将灵敏度提高到0.01 ng/g。同时能够在几分钟之内完成分析过程,相对于ELISA更快速、更简便和灵敏,而且能够测定各种抗原物质,尤其对体液中激素和药物的检测。
1.3 气相色谱-质谱联用法
气质联用通常用来检测血液和组织中残留的盐酸克伦特罗。其原理:在p H值为5.2的缓冲液中,样品用芳基硫酸酯酶或者盐酸葡萄糖醛苷酶进行消化,用MCX小柱净化萃取液,分离的残留样品通过双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后,采用GC-MS测定。检测步骤:①提取,用乙酸调整pH值至5.2。②用SCX柱净化样品。③双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化,用气质联用仪检测。
2 快速检验法
2.1 胶体金法
采用胶体金技术与膜层析技术相结合生产的克伦特罗金标检测试纸,无需检测设备,对检测人员的专业技能要求不高,在20 min内即可得到检测结果,比较适合宰前快速检测。因而作为筛查饲养场、生猪中转站、屠宰场筛查盐酸克伦特罗的重要手段,检测灵敏度为5 ng/mL,但其缺点是假阳性率较高。
2.2 酶免疫分析法(EIA)
由于EIA准确、灵敏、简便,如今已经出现一种新的并得到广泛应用的“瘦肉精”检测方法——酶免疫分析法(EIA)。最初用于盐酸克伦特罗检测的是一种选择性异源和双抗免疫分析,而如今通常都是采用竞争EIA原理。同时随着近年来试剂盒的开发,酶免疫分析法广泛应用在德国rbiophaim和英国Randox Laboratories Ltd公司。其优点是价格便宜,检测迅速,操作简便,灵敏度高。缺点是假阳性率高、不能实现现场检测,且要求样品处理、反应条件要尽可能一致。
2.3 毛细管电泳免疫分析—激光诱导荧光检测(CEIA-LIF)
CEIA-LIF是我国科学家研究的特异性强、灵敏、快速的检测“瘦肉精”的新方法。该法采用牛血清蛋白与盐酸克伦特罗偶联并用荧光素标记,在线毛细管电泳法和离线毛细管电泳分离来检测。在最佳条件下,离线和在线毛细管免疫电泳法的检测限分别为0.7 ng/m L和0.2 ng/mL,相对标准差(RSD)分别为0.88%~1.00%和0.56%~2.80%,回收率分别为88.0%~93.7%和90%~102%。研究出来的CEIA-LIF对CL的检测具有准确快速、可靠、高准确性、高自动化水平等优点。采用这种方法,将避免人为操作的误差和检测的灵敏度,试剂消耗量小,检测成本低,具有现实性和可操作性。
3 主要检测方法的比较
目前在国内,高效液相色谱仅作为瘦肉精的半定性方法,检测限为1~15 ng/g,其优点是假阳性率底、检测精度高;缺点是需贵重仪器、费用昂贵、检测过程繁琐、难以操作、检测时间长。GC-MS的优点是重复性好、准确性、检测灵敏度高,但所需要的仪器设备非常昂贵,同时样品前处理的技术要求很高、检测过程繁琐、难于操作,要求检测人员专业性强且具有丰富的实际操作经验。免疫分析法都是采用固定的试剂盒,检测灵敏度高,检测结果容易把握,成本低,最低检测限能够达到0.5 ng/mL,样品前处理简单,有些样品甚至不需要前处理,其缺点是假阳性高,不能实现现场检测。生物传感器是采用生物活性物质作为敏感元件器,与其他同类物质交叉反应低,特异性强,缺点是灵敏度低,反应时间长。
4 结语
虽然众多的科学家研发出了很多种检测瘦肉精的方法,但都不是非常完美。如GC-MS、HPLC等的检测限都在0.01 mg/kg以上,检测设备昂贵,检测方法繁琐难于操作,而且不能实现现场检测,对于畜产品的一线检测无实际意义。生物传感技术(BS)和金标免疫检测技术(DIGFA)能精确检测瘦肉精残留,使瘦肉精的检验和监测变得高效简单,同时定量和定性实现了现场监测,因此开发和研制瘦肉精的生物传感器或试纸条,对于提高检测效率具有较大的意义及发展前景,值得深入探讨。
摘要：综述了目前盐酸克伦特罗(瘦肉精)的检测方法,对各种检测方法进行了比较,以及分析了各种检测方法的应用。
关键词：盐酸克伦特罗,检测方法,比较,应用
参考文献
[1]刘国艳,柴春彦.如何全面认识“瘦肉精”[J].动物科学与动物医学,2009,19(6):l-3.
[2]杨志凌,陈杖榴,方炳虎,等.高效液相色谱——电化学检测法测定猪组织中的克伦特罗[J].色谱,2008,21(3):245-247.
[3]黄传峰,李晓华,吴宜群.克伦特罗检测方法进展[J].中国卫生检验杂志,2009,12(5):634-636.
[4]PIZZARIELLO.the method of Clenbuterolhydrochloride Compare[J].Rev-ista argentina de dermatologia,2002(63):85-88.
克伦特罗(瘦肉精) 篇2
摘 要
本实验采用了百睿TM盐酸克伦特罗快速检测卡对样品进行定性检测。盐酸克伦特罗快速检测卡适用于尿样、瘦肉、肝脏、肺脏、肾脏和饲料等样本中盐酸克伦特罗的测定。检出限为3ng/mL（3ppb）。关键词 盐酸克伦特罗快速检测卡
定性
检出限
前 言
盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CLB),又名瘦肉精,分子式为C12H18Cl2N2O•HCl,药品名为克喘素、氨哮素等,为白色或类白色的结晶粉末,无臭、味苦,易溶于水、甲醇、乙醇,微溶于丙酮、氯仿,不溶于乙醚和苯,化学性质稳定;它是一种人工合成的B-肾上腺素受体激动剂,具有扩张支气管的作用,常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病(Mersmann,1998)。当其应用剂量达到治疗量的5~10倍时,又具有能量重分配作用,可使肌肉合成增加,脂肪沉积减少,因此将其俗称为瘦肉精,在养猪业中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到饲料中(Kuip-er,1998),用以改善胴体的品质,但同时也造成了猪肉中盐酸克伦特罗的残留。当人们食用含有盐酸克伦特罗残留的肉品后,常常造成心动过速,低血钾,低磷酸盐血症,肌肉震颤,头晕,口干,失眠甚至于瘫痪等中毒症状,对心脏病患者更有生命危险。国家农业部农牧发[2002]1号文5关于发布食品动物禁用的兽药及其他化合物清单的通知6中,盐酸克伦特罗被列为所有食品动物禁止使用。
1实验步骤
（1）使用前将待测样本溶液恢复至室温
（2）取出检测卡平放，用移液枪吸取待测样品溶液100ul，垂直加于加样孔，开始计时
（3）结果应在3~5min读取，其他时间判读无效，根据示意图判定结果。
【结果判断】
阴性（-）：两条紫红色条带出现。表示样品中盐酸克伦特罗浓度低于3 ng/mL，或不含有。
阳性（+）：检测T线无显色，则表示样品中盐酸克伦特罗浓度高于3 ng/mL。
无效：未出现质控C线，表明操作过程不正确或检测卡已失效。实验结果
实验结果如下图 1
由图可知，左边表示样品中盐酸克伦特罗浓度低于3 ng/mL，或不含有盐酸克伦特罗；右边样品中盐酸克伦特罗浓度高于3 ng/mL。
3结果与讨论
3.1实验原理
若待测样品溶液中不含盐酸克伦特罗,当样品溶液进入测试端,盐酸克伦特罗金标单抗在硝酸纤维素膜上层析泳动,被硝酸纤维素膜上检测印迹处的盐酸克伦特罗-BSA偶联物拦截形成盐酸克伦特罗-BSA偶联物)金标盐酸克伦特罗单抗 复合物,并在该印迹处形成红色的条带(检测线);测试端多余的金标盐酸克伦特罗单抗在硝酸纤维素膜上继续层析可被对照印迹羊抗鼠IgG单克隆抗体捕获形成红色的对照条带(对照线)。当待测尿样中含有一定量的盐酸克伦特罗时,盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗金标单抗形成复合物,从而与硝酸纤维素膜上的盐酸克伦特罗-BSA偶联物形成竞争,抑制了检测印迹处包被的盐酸克伦特罗-BSA偶联物捕获盐酸克伦特罗金标单抗的量,而不能在检测线形成红色印迹或形成颜色较浅的红色印迹,多余的盒标盐酸克伦特罗单抗继续层析在对照印迹处形成对照线。根据该反应模式,检测线颜色深浅与样品中盐酸克伦特罗含量呈负相关,即检测线颜色越浅表示样品中盐酸克伦特罗含量越高。3.2 试纸条组成
1.样品垫的作用是尽快地将加样孔中的样品吸附到试纸中去，以利于继续加样； 2.结合垫中则是含有胶体金标记的盐酸克伦特罗单抗；
3.硝酸纤维素膜上则预先标记了两种物质，在检测线处标记的是盐酸克伦特罗-BSA偶联物。
4.吸收垫一般由吸水纸构成，主要作用是保持从加样垫到吸收垫之间的毛细管作用力[1]。
参考文献
克伦特罗(瘦肉精) 篇3
猪肉是我国人民的主要肉食消费品, 同时生猪生产又是当前添加盐酸克伦特罗的重灾区, 因此加大与普及对生猪 (特别是商品猪) 盐酸克伦特罗的检测力度刻不容缓。国家兽医卫生行政监督机构为确保人民的肉食品安全工作加大了以生猪为重点的盐酸克伦特罗检测工作的检测力度和普及程度。2009年底江苏省金湖县动物检疫站就在全县范围内开展了针对盐酸克伦特罗的检测工作, 取得了较好的效果, 现将笔者在实际工作中取得的一些经验与体会介绍如下。
1 检测过程
金湖县是猪肉消费大县, 全县约37万人, 年消费生猪达11万头。金湖县生猪饲养并不发达, 主要为1家1户生产的一种当地黑毛猪, 全县土种猪生产量不足4万头, 其余主要依靠从山东、河南、安徽等省调运。本地猪大部分是使用剩饭菜和农作物副产品作为饲料土法饲养, 很少存在“瘦肉精”的问题, 因此, 检测的重点主要集中在外调生猪上。全县共有1个县级生猪定点屠宰点和4个生猪交易市场, 生猪交易较发达, 特别是4个生猪交易市场已经逐步形成为江苏省黑毛猪交易的集散地, 从此中转发往南京等地, 因此对外调生猪的盐酸克伦特罗检测工作尤为重要。
目前应用于盐酸克伦特罗的检测方法主要有以下3种。一是金标检测卡定性检测, 主要用于对可疑生猪的初步检测, 该方法成本较低、检测速度快、操作简便, 但结果不易保存。二是酶联免疫法定量检测, 用于金标卡测试后的确认, 该方法检测灵敏度高, 可保存结果, 但易受到交叉反映干扰。三是气相色谱-质谱联用法定量确证检测, 该方法用于终审, 但投入大检测成本高适用于专业实验室笔者所在的基层动物检疫检验单位主要采用按一定比例随机抽检和根据经验定向抽检相结合的方法选择测试生猪, 主要采用盐酸克伦特罗快速检测卡 (广州景同生物科技有限公司) 进行检测, 该检测方法具有简单快速、无需特殊仪器设备的特点, 既可在实验室进行, 也可在生猪交易市场、屠宰场、养猪场等进行实地检测, 适用于对大量检测生猪的初步抽检。
1.1 样本的采集
1) 宰前采集。当外调生猪抵达交易市场或屠宰场后, 先让生猪下车并休息20～30 min后。通过仔细观察, 一般饲喂盐酸克伦特罗的生猪都具有皮毛异常光亮、皮肤白里透红、被毛少而松软, 后臀部饱满突出, 背部体表驱打后容易留下持久伤痕, 呼吸急促, 个别会出现腿抽搐、站立不稳、爬坡困难、行走不灵活、容易发生蹄损伤和跛行或非外因倒地不起等特征, 根据以上特征可以对可疑猪设法采集尿液作为样本进行检测, 采尿的方法主要有蹲守接尿法 (比较适合母猪) 和使用简易的接尿器接尿法 (比较适合公猪) 。
2) 宰后采集。根据对宰后生猪的感官检验选择可疑生猪, 含有盐酸克伦特罗的猪肉色泽比普通猪肉深, 肌肉特别鲜红, 后臀较大且肌肉饱满, 肌纤维比较松软, 瘦肉与脂肪间有黄色液体流出, 脂肪非常薄, 腹股沟的脂肪层内毛细血管分布较密, 甚至呈充血状态。对可疑猪在其开膛后, 用一次性注射器从膀胱中抽取尿液作为样本, 组织的采样一般以无菌采取肝组织较好。
1.2 抽取样品
1) 抽样数量的确定。在抽样前, 要准备好接尿用具、一次性注射器、采样瓶、以及抽样文书等。样本量一般按照10%的比例采取, 对出现肌肉震颤、站立不稳、异常丰满的可疑生猪, 要加大抽检比例;每头猪采取尿液量约100 mL, 平均分成3份, 每份约30 mL, 分别装入采样瓶并编号后密封, 抽样用具在每次使用前要彻底清洗;组织样品一般以采取肝组织为好。
2) 抽样记录。抽样时, 要如实填写抽样单, 注明生猪来源、抽样时间、同群数量等内容, 并由抽样人和畜主共同签名确认, 一式三联分别贴在3个重复的样品瓶上。3份抽样样品中, 2份由抽样人员带回用于检验和留样用, 另1份封存于被抽检单位, 作为对检验结果有争议时复检用。
3) 样品贮运。取样后, 样品应立即在0～4℃条件下冷冻保存。运输过程中, 样品温度不得超过4℃, 时间不超过24 h。
1.3 样本处理
样品必须收集在洁净、干燥不含任何防腐剂的塑料杯或玻璃容器内。有条件的可将尿液在4℃、3 000 r/min以上离心, 取上清液备用。肉样或组织样品可将样品剪碎, 装入1.5 mL离心管中, 盖紧管盖, 放在100℃水中加热5 min以上, 使有液体浸出, 取出离心管放至室温, 取上清液备用;也可称5克样品剪碎, 加入25、50 mmol盐酸溶液, 振荡3 min并静置5 min后取上清液1 mL, 加入氢氧化钠溶液, 再振荡3 min并静置5 min后取上清液备用。
1.4 样本的检验方法
取出试剂板 (在室温高于30℃, 在高度潮湿的环境中应尽快使用) , 将试剂板置于平坦的台面上, 用塑料吸管垂直滴加3滴尿样或处理过的样品 (约120μL) 于加样孔内, 等待紫红色条带的出现, 测试结果应在3～5 min时读取。超过时间结果无效。
1.5 结果判定
阳性 (+) :仅质控区 (C) 出现1条紫红色带, 在测试区 (T) 内无紫红色条带出现。此阳性结果表明尿液中含有克伦特罗残留物。阴性 (-) :2条紫红色条带出现。1条位于测试区 (T) 内, 另1条位于质控区 (C) 内。阴性结果表明尿液中不含有克伦特罗残留物。无效:质控区 (C) 不出现紫红色条带, 表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。具体示意图见图1。
1.6 检后处理
将检测结果及时通知货主及相关人员, 对经检测合格 (阴性) 的生猪允许屠宰或交易, 开具盐酸克伦特罗检测合格的报告单;对经检测不合格 (阳性) 的生猪禁止屠宰, 并就地封存, 及时上报上级主管部门, 按有关规定处理。
2 检测结果
按照以上检测方法笔者于2009年11月和12月在全县范围内的1个县级生猪定点屠宰点和4个生猪交易市场按照不同场所、不同产地、以整车为单位按照10%的比例共计检测生猪227头。检测结果见下表1, 通过共计30个批次的检测结果汇总情况来看, 其检测结果都为阴性, 阴性率为100%, 没有出现盐酸克伦特罗残留问题猪。
3 讨论
在基层的盐酸克伦特罗实际检测中, 多数检测单位会选择猪尿作为样本, 因为使用盐酸克伦特罗快速检测卡检测尿样的方法比较简单方便。一般对猪的盐酸克伦特罗检测工作首先是在宰前进行, 即与宰前检疫同步实施, 对每批进场生猪随机进行抽检, 没有问题的生猪才能待宰或交易;但是生猪宰前尿样的采集有一定的难度, 一般可在猪下车后10～20 min或当猪进圈后休息一段时间后人为驱赶, 检测人员在一旁仔细观察, 当发现猪有排尿倾向后, 及时用长柄集尿盆收集 (此法比较适合母猪) , 而公猪的生殖器在腹下, 一旦伸出长柄集尿盆它就会发现, 立即会停止排尿, 因此对待宰前公猪尿的收集, 一般使用自制的简易接尿器接尿法, 有条件的可对猪进行卧式保定, 还可将猪关到小的自制隔离框 (2 m×2 m) 中进行采尿。一般生猪经过长途运输后, 体内的尿量已经很少, 条件许可的话, 可在猪卸车后适当补水, 这样有助于猪增加排尿次数以及宰后膀胱中的存尿量。
常用的盐酸克伦特罗检测方法多是使用快速检测试纸检测尿液。国内生产盐酸克伦特罗检测卡的厂家很多, 各个厂家的检出量和判定标准都不太一样, 在检测试剂的选择上应尽量选择权威部门推荐的生产厂家。测试前要将未开封的检测卡恢复到室温, 检测卡包装袋打开后要立即使用, 当发现有疑似阳性结果的标本时, 应对同头样本进行重复检测, 以增加检测的准确性。现在盐酸克伦特罗抽检率一般为10%, 在特殊时期可提高到20%, 如果发现某批次生猪有问题, 则需要进行100%的检验。尿液中的杂质会导致假阳性结果, 有条件的, 应离心后使用。
金湖县的盐酸克伦特罗检测工作具有一定的长期性和艰巨性, 因为金湖县的生猪来源主要是外调生猪, 原产地的情况笔者不了解, 也不能控制, 因此只有依靠加大本地的检测力度, 紧抓不懈, 同时应提高检疫手段、加强法规宣传以及加大对违法人员的处罚力度来加强金湖县的瘦肉精检测工作。目前盐酸克伦特罗检测的成本还很高。如果按照上级要求进行抽检, 还存在检测经费上的困难, 还需要地方政府的大力支持。
在盐酸克伦特罗作为一种畜牧业生产的违禁药品遭到严厉查处的同时, 就会出现部分盐酸克伦特罗的替代品, 目前发现的替代品有“盐酸莱克多巴胺”、“沙丁胺醇”等, 金湖县在紧抓常见盐酸克伦特罗检测的同时, 应密切关注替代品的检测。从检测结果看没有发现盐酸克伦特罗问题猪, 但是此结果并不能说明在金湖县在检测期间没有出现或今后不会出现盐酸克伦特罗问题生猪, 这一结果准确性有可能受到试剂或仪器的选择、检测水平、抽检比例等因素的影响, 下一步金湖县应加强检疫人员的业务培训, 提高业务水平, 并添置必要的检疫设备。同时要提高抽检率, 保证采样送检质量, 增加检测内容, 选用不同厂家、不同类型的快速检测卡进行配合检测, 如选用盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二合一快速检测卡, 以提高检测的准确性, 同时应加强对生猪重点产地的监控, 对相关部门通报的阳性高发地区的生猪应重点加以监控, 并及时加大检测力度, 提高检测频率和抽检率。
摘要：通过对金湖县2009年11、12月份的待宰猪盐酸克伦特罗的检测与结果分析, 阐述了金湖县主要工作方法、经验、以及对当前盐酸克伦特罗检测工作的建议。