逆转录病毒（精选7篇）
逆转录病毒 篇1
目前, 基因传递主要包括病毒法和非病毒法两种。非病毒法是使用物理刺激和化学介质, 如通过电转染、基因枪、直接注入DNA及脂质体介导等方法进行基因传递。非病毒法操作简便, 但转染效率和整合效率较低而难以达到预期效果。病毒法是利用病毒RNA能整合到宿主细胞基因组的特性, 通过辅助系统将目的基因传递到受体细胞。研究表明, 一旦细胞被逆转录病毒感染, 其病毒DNA在转录和整合后即插到宿主基因组中, 并能在宿主细胞中终身维持[1]。由于逆转录病毒可以作为载体来传递基因, 具有灵活、有效及靶细胞的特异性而被广泛使用。近年来, 对逆转录病毒载体的研究已经逐渐深入, 为了使其更好地应用于分子生物学、遗传学和基因治疗等领域, 笔者主要从逆转录病毒的分类与基因结构、载体的发展及构建特点等方面进行了详细的阐述。
1 逆转录病毒的分类与基因结构
Coffin等根据逆转录病毒的基因结构将其分为肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科和泡沫病毒亚科。 肿瘤病毒亚科的基因结构研究较透彻, 病毒DNA的基因组包括两个长末端重复序列 LTR 和中央编码序列, LTR 又被分为 U3 区、R 区和 U5区。其中 R 区在反转录和复制过程中起重要作用, Carl A等发现一些病毒的 R 区包含调控基因表达的元件, 如 MLV 的 R 区域包含多腺苷酸化信号。中央区编码序列主要编码结构蛋白gag、pol和包膜蛋白 (env) , 其中包膜蛋白基因是由一个剪接的 mRNA 表达的, 包膜蛋白基因编码病毒的糖蛋白外壳, 决定病毒宿主的范围。慢病毒亚科除了上述结构以外还编码其他辅助蛋白, 如反式激活因子编码蛋白 (Tat) 、序排特异性RNA结合蛋白 (Rev) 、Nef、Vif、Vpr和 Vpu。Hu W等[2]认为Tat是转录激活因子, 它连接病毒 RNA 的 tar 域和一些宿主蛋白。Rev 调控剪接或非剪接病毒 RNA 从核到胞质的转运;Nef下游调控 CD4受体, 并在病毒发病机理上有重要作用;Vif 影响病毒的感染性;Vpu 能启动CD4降解并增加病毒体释放。另外, Mansky L等发现 Vpr 在病毒体中大量存在, 并在细胞周期停顿上起重要作用, 但在病毒 DNA 的合成和一些细胞的复制中具有保守性。泡沫病毒亚科在逆转录病毒中是最长的也是最特殊的, 大约 12 kb, 且与乙型肝炎 B 病毒有相似性[3]。人的泡沫病毒除了包含基本的基因结构外, 还含有3个辅助基因 bel 1、bel 2、bel 3。近几年的研究表明, 泡沫病毒的基因表达调控有许多不同于其他逆转录病毒的特点。Yu S等发现, Pol 蛋白是直接由剪接 mRNA 翻译产生的, 而不象其他逆转录病毒一样需产生 Gag-Pol 前体。
2 逆转录病毒载体的发展
逆转录病毒几乎被研究了100年, 近几十年来由于逆转录病毒载体的发展使其发挥了巨大的作用, 并最终应用到基因治疗。
2.1 复制缺陷型载体 (RDR)
复制缺陷型载体与辅助系统构建于1981年, 最初科学家们设计第1个逆转录病毒载体的目标就是减少插入突变和致癌基因的危险。RDR感染靶细胞后能运载目的基因, 但不能复制, 也不能2次感染接触的细胞, 从而减少了无意扩散和致癌基因激活的可能性, 提高了载体的安全性。1990年, 该载体系统经过修饰后应用于临床, 开创了基因治疗的先河。目前, 使用RDR载体导入基因到造血干细胞, 治疗原发性免疫缺陷征, 如X重症联合免疫缺陷和腺苷脱氨酶缺乏征重症联合免疫缺陷 (ADA-SCID) 取得了显著的成绩。RDR载体系统由于缺失了部分基因, 因此需要辅助系统才能完成病毒的包装。最早的包装系统于1983年构建, 基因组整合了仅仅缺失包装信号的MLV前病毒基因组, 包装的病毒颗粒为单嗜性。如果将其包膜蛋白基因换成鼠4070A病毒的双嗜性包膜蛋白, 则能产生双嗜性病毒的包装细胞[4]。但这些包装系统的安全性很差, 只要与载体之间发生1次重组, 就可以产生有复制能力的野生型病毒。因此, 之后的工作是从减少同源重组的可能性入手。如PA317细胞, 在5′端进行反式作用序列缺失后, 在3′LTR端用SV40晚基因的多聚腺甘酸序列代替, 提高了生物安全性[5]。但此时的逆转录病毒载体系统仍存在病毒效价较低, 不能感染静止细胞的缺陷。水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSV-G) 的发现改变了这一局限性。该蛋白整合于病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞, 具有广泛的宿主范围和更高的转染效率, 可高效地转染静止细胞, 并能抵抗血清补体灭活的作用。
2.2 复制型逆转录病毒载体 (RCR)
最早的复制型载体构建于1984年, 之后Dillon P等以MLV为基础设计的RCR载体通过在3′LTR端的U3区插入一个转基因框, 允许LTR驱动目的基因表达。Solly S等利用剪接受体位点在包膜蛋白基因下游添加转基因框, 允许伴随剪接作用而使目的基因表达。但是这些设计在遗传学上并不稳定, 因此Logg C等人利用完整的逆转录病毒基因组和IRES- 转基因框, 将目的基因直接插入载体中。在体外的试验结果表明, 与RDR相比少量的RCR达到了急剧扩增, 并仅能在分裂的细胞中整合并复制, 因此RCR载体有适于基因治疗的优点。鼠体内试验结果表明, 瘤内注射1×104个RCR载体的感染单位, 能扩散到全部的皮下及颅内肿瘤, 但没有扩散到正常组织[6]。
2.3 半复制型逆转录病毒载体 (s-RCR)
虽然RCR在基因治疗上有高效性, 但也被认为存在生物安全的风险, 因此学者们又研究了半复制型逆转录病毒载体。s-RCR比RDR更有效、更安全。2005年, Trajcevski S等人将s-RCR应用于基因治疗中, 这种RCR设计基于2个互补的RDR, 一个转移目的基因, 一个转移gag-pol 或包膜蛋白基因, 通过直接静脉注射将骨髓移植到MLV敏感的小鼠之后, 没有检测到s-RCR载体的扩散或白血病的产生[7]。
2.4 病毒样质粒载体 (Reo-VLP)
随着基因治疗的发展, 基因疫苗逐渐被学者们所关注, 但是在对健康受体使用时, 上面提到载体都存在巨大的安全隐患。而无基因组的Reo-VLP符合制作基因疫苗安全高效的标准。其实VLP已经从30个不同的病毒中获得, 并被证明能安全有效地引起体液免疫和细胞免疫, 并有希望进入第2阶段和第3阶段临床试验。而以Reo-VLP为基础的预防乙型肝炎B病毒的疫苗已经被出售[8]。
3 逆转录病毒载体的构建特点
3.1 基础逆转录病毒的表达载体
最初载体的设计是利用 U3 启动子驱动目的基因的表达, 将目的基因插入在 5′端和3′端非翻译区, 通过 U3 启动子转录全长的RNA。不久出现了利用内部启动子进行表达的载体, U3 启动子转录的全长 RNA 表达 A 蛋白, 内部启动子转录的 RNA 表达 B 蛋白。这种设计有时会出现2个启动子相互干扰的缺陷, 如在 SNV 为基础的逆转录病毒载体上 SNV 的 U3 启动子和单纯疱疹病毒激酶启动子会相互干扰。不过 Amendola M等[9]人最近发现了一种新的载体, 它包含双向启动子, 一个来源于巨噬细胞的核心启动子, 而相反方向是一个广泛性表达的启动子, 这样在2个方向基因都能高效表达, 从一定程度上克服了相互干扰的问题。另外, 双顺反子的引入也实现了2个以上外源基因的表达, 拓宽了逆转录病毒载体的应用。双顺反子载体通过插入 IRES 来实现, 首先IRES在小核糖核酸病毒中被发现, 以能翻译没有 CAP 的 mRNA 为特点 [10]。虽然逆转录病毒双顺反子载体能应用于大部分细胞和组织, 但其转染效率不同, 以皮肤中角化细胞 (KC) 和成纤维细胞 (FB) 为例, 利用双顺反子逆转录病毒转染 GFP 和多药耐受性 MDR 基因, 在2个基因的共表达上KC是FB细胞的2倍。因此Dupuy F 等人认为, 一些双顺反子逆转录病毒载体有细胞取向性。
3.2 其他逆转录病毒表达载体
3.2.1 自我失活载体
如Choulika A等发现的 cre/loxp 载体。当 Cre 基因在靶细胞表达时, Cre 重组酶被合成, 并介导删除病毒 DNA 上2个loxP 位点间的序列, 而靶细胞最终只包含1个表达目的基因的 LTR序列。当然, Cre/loxP 系统也能删除逆转录病毒载体中的其他序列, 如包装细胞上的辅助结构、选择标记等, 从而避免启动子干扰或转染细胞的免疫反应。最近 Torne C 等人开发出了另一种新颖的能自我删除的逆转录病毒载体, 这种载体携带一段能被病毒整合酶识别的添加序列, 它作为一种有趣的和安全的逆转录病毒载体可以应用于基因转移试验。
3.2.2 自我失活和自我激活型载体 Delviks K等利用载体所包含目的基因 A
被剪切成2个重叠片段而设计了这个载体。其中1个片段包含5′端序列, 第2个片段包含3′端序列。包装信号放在2个重复序列之间。病毒 RNA 在反转录期间, 反转录酶能删除一个重复的拷贝和高频率的内含子, 形成的病毒不仅缺失了包装信号, 而且包含一个再生的、完整的基因 A, 此过程由于重组了基因 A 使载体自我激活, 而包装信号的删除使载体自我失活。
3.2.3 打靶到特定细胞的载体
基因治疗的目的就是靶基因传递到特定的细胞类型或组织。至少有两种方法能达此目的, 首先设计能直接传递基因进入宿主细胞的病毒载体, 这可以通过使用天然的或修饰的壳蛋白与特定细胞类型受体相作用后实现。使用特定壳蛋白, 即利用病毒膜蛋白和细胞受体之间的关系, 在转录和翻译过程中, 壳蛋白的 SU 蛋白和细胞受体相作用, 从而实现打靶到特异细胞。其次通过使用组织特异性启动子, 如 Christian M等利用杂合鼠病毒启动子、人的 EII-Pa1AT promoter和T淋巴细胞因子结合位点等构建的小鼠 MLV 复制完全型载体, 通过完全替换或部分融合 U3 启动子的方法, 成功地打靶到特定组织和肿瘤细胞。
4 逆转录病毒载体的应用及展望
由于逆转录病毒的高感染率和与细胞染色体整合不发生基因重排等特点, 使得它成为真核系统基因转移的有力工具。在20世纪70年代, 逆转录病毒载体主要用于研究被转移基因的应用及基因表达机制。如使用逆转录病毒载体先后表达了单纯疱疹病毒TK基因、小鼠IL-s基因及人的腺苷脱氢酶 (ADA) 和苯丙氮酸脱氢酶 (PAH) 基因等。直到1985年, Viiala N等首次利用逆转录病毒载体将外源基因导入小鼠, 才使得逆转录病毒载体在基因治疗领域成为最常用技术。一个成功的范例是利用逆转录病毒载体治疗腺苷脱氢酶缺失症。另外, 利用逆转录病毒载体还可进行基因功能失调、癌症、骨髓移植后的并发症和传染性疾病等的治疗。最近有研究表明, 逆转录病毒在治疗血友病上有显著突破。
逆转录病毒载体还可以应用于胚胎组织用以调查其发育功能, 尤其在鸟类的研究上可用于研究鸟类的骨骼发育模式, 或可利用该载体研究基因功能, 如在斑马鱼上利用逆转录病毒载体来研究基因表达模式和突变情况。当然, 逆转录病毒载体还可以通过感染胚胎或ES细胞而生产转基因动物, 如转基因鼠、鸡等。2000年, 随着显微注射技术的发展, 逆转录病毒载体与显微注射方法相结合产生了转基因牛, 2001年产生了转基因恒河猴, 2008年逆转录病毒载体与体细胞核移植相结合得到了表达红色荧光蛋白的转基因猪, 如果使用这一系统将新的遗传物质引入农牧业, 必将产生巨大的经济效益。总之, 随着生物科学研究的不断深入、人们对基因结构的深入了解及定位整合的实现, 逆转录病毒载体将成为生物学领域重要的工具。
参考文献
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逆转录病毒 篇2
逆转录病毒(retroviruses)是一种单链RNA病毒,它是能够在逆转录酶的作用下将RNA转变成cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。一般来说,逆转录病毒RNA基因组的核心部分都包括三个开放的读码结构:gag-编码病毒的核心蛋白、pol-编码逆转录酶、env-编码病毒的被膜糖蛋白[1]。有的逆转录病毒还带有癌基因,即有致癌作用。人们根据逆转录病毒的一些特性设计出的一种复制缺陷性病毒,使其成为能够携带某种特异目的基因的表达载体,即逆转录病毒载体。逆转录病毒载体与其他用于真核表达的载体相比,具有以下优点:(1)逆转录病毒寄主范围广泛;(2)逆转录病毒具有强启动子,能够高效稳定表达外源基因;(3)具有很高的病毒滴度及转染效率,且不会致死寄主细胞;(4)对宿主细胞没有毒副作用;(5)可以携带较大的目的基因;(6)只能感染分裂细胞(腺病毒,泡沫病毒除外[2]);(7)大多数情况下,其携带基因能够在正常的细胞中转录[1,3]。
1 载体类型及其应用机理
目前,应用的逆转录病毒表达载体主要有四个类型:(1)辅助病毒互补的逆转录病毒载体;(2)不需要辅助病毒互补的逆转录病毒质粒载体;(3)广寄主范围的逆转录病毒载体;(4)逆转录病毒表达载体。而应用较多的是不需要辅助病毒互补的逆转录病毒质粒载体,这种病毒表达载体是将gag、pol、env等三个基因的大部分或全部除去,由于没有gag、pol、env三个基因的存在而不能够产生有感染性的病毒颗粒,因此,人们又设计出了一种特殊的包装细胞株。这种包装细胞株能够表达逆转录病毒的全部蛋白,逆转录病毒载体在整合入宿主基因组后,可以与包装细胞形成的病毒缺失蛋白重组成具有感染能力的病毒颗粒[1]。将收集的病毒颗粒感染靶细胞就可以将目的基因整合到靶细胞染色体上,基因活性得到表达。而目的基因可以通过细胞分裂传给下一代子细胞。永久稳定地表达目的蛋白。
2 应用
2.1 用于基因治疗
逆转录病毒载体无疑是在基因治疗中传递目的基因最有效的运载工具,广泛应用于人类基因治疗的研究中。当前,人们发现有多种疾病与人类的基因有关,但只有很小部分被探明与人类基因组哪一部分相关,而一些隐性遗传疾病更是不容易被察觉[4]。应用逆转录病毒载体,携带所要表达的目的基因,可以用于基因相关疾病的检测及治疗。另外,基因治疗不仅要求将外源基因导入到细胞内,而且要求外源基因能够在细胞中稳定表达,而逆转录病毒表达载体的特性正迎合了这种需要。
2.1.1 用于腺苷脱胺酶缺陷症的治疗
1990年,W.French Anderson在美国实施的第一例基因治疗就是应用逆转录病毒载体治疗腺苷脱氨酶缺陷症(ADA)。腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症是一种严重的免疫缺陷症,腺苷脱氨酶的缺乏可使T淋巴细胞因该酶缺乏后一些代谢产物的累积而死亡,从而导致严重的联合性免疫缺陷症(SCID)。手术取得了良好的效果,术后并没有发现患者的不良反应[5]。
1999年,Alain Fischer和他的同事同样应用逆转录病毒载体对11名患有X-重度免疫缺陷症的儿童进行了临床研究。Alain Fischer等人应用患者的骨髓细胞,将携带有γC基因的逆转录病毒载体整合到骨髓细胞的染色体上,使其表达患者所缺少的一组必要细胞因子的受体亚单位蛋白。多数患者在接受治疗后表现出良好的临床症状[5]。但在3年之后,Fischer的研究小组又报道了他们当年治疗的患者中有3例患上了T-细胞白血病,后研究发现这可能与逆转录病毒载体的染色体插入位点有关[6]。逆转录病毒载体插入到宿主基因的染色体上后有可能诱发癌基因的启动,这是逆转录病毒载体的应用时的一大弊端,针对这一问题,有研究表明:载体的插入是在起始前体复合物包括前病毒DNA,逆转录酶以及整合酶的共同作用下完成的,同时也包括一些宿主蛋白诸如:细胞转录因子、染色体整合因子等[7]。Kunkai Su[8]等人设计出了一种融合蛋白用于逆转录病毒载体的靶向插入,即将整合酶与一段特异性DNA序列编码的蛋白相结合,这段特异性蛋白可以识别染色体上的特殊位点并在这个特殊位点的临近部位相结合,经实验论证,逆转录病毒载体载体成功的插入到了预想区域。这种方法为解决逆转录病毒载体在宿主基因染色体上的靶向插入提供了一个新的思路。
虽然基因治疗还有一定的局限性。但逆转录病毒载体基因治疗的出现,与传统方法相比是在基因水平上的治疗,其治疗效果更彻底,可以从根源上彻底消除疾病,给我们治疗一些用传统疗法难以治愈的疾病带来了新的希望。
2.1.2 用于癌症的治疗
目前,逆转录病毒载体在癌症治疗方面被广泛的研究,传统的化疗方法虽然能够抑制癌细胞的生长,延长患者的生命,但对患者的机体也有很大损害,因此,人们开始研究在分子水平上抑制或消灭癌细胞,逆转录病毒载体在此方面具有着巨大的应用潜力。
刘颖斌[9]等人将对癌细胞具有抑制作用的ANGPTL4基因与逆转录病毒载体相连,用脂质体法将重组病毒粒子感染人肝癌细胞HepG2。结果显示人肝癌细胞生长速度明显减缓,重组逆转录病毒载体所介导的人 ANGPTL4基因转移很可能是一种有效的肝癌基因治疗方式。
顾红祥[10]等人将能特异地诱导人肝癌、淋巴瘤等癌细胞凋亡的凋亡素基因(VP3)与逆转录病毒载体连接,构建重组逆转录病毒凋亡素载体,包装出病毒粒子后感染人肝癌细胞系HepG2。结果显示:凋亡素基因经逆转录病毒表达载体导入人肝癌细胞HepG2后,可在四环素调控下表达凋亡素并诱导HepG2细胞凋亡。为肿瘤的可控性基因治疗提供了基础。
逆转录病毒载体在后天获得性遗传疾病如艾滋病及其基础性研究[11],神经系统疾病[12,13]等疾病的治疗方面同样有着巨大的应用潜力,因此受到人们的广泛研究。已经有基因治疗应用了逆转录病毒载体并得到了良好的效果,但是,研究者们依然清醒地认识到,逆转录病毒载体应用于基因治疗大多数还只是停留在理论的基础上,要想更多地应用于实践,还需要研究者不懈的探索。
2.2 外源基因表达
2.2.1 用于基因工程疫苗的研制
20世纪80年代以来随着生物技术的发展,以及传统疫苗应用缺陷的显现,人们开始将基因工程技术应用于新型疫苗的研发,逆转录病毒载体作为一种表达载体,可以整合到动物细胞染色体上,不断的表达其所携带的蛋白。应用这一特性,将编码主要致病基因的保护性抗原基因连接在载体上,使其在哺乳动物细胞中表达蛋白,刺激机体产生相应抗体,为制备动物基因工程亚单位疫苗、基因工程DNA疫苗的研制开辟了一条新的路径。
刘建玲等[14]利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体并将重组质粒经包装细胞包装后感染猪肾细胞PK-15,后经流式细胞仪分析E2基因在PK-15细胞膜上成功表达,将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为猪瘟基因工程疫苗的研究奠定了基础。
李炯等[15]将口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因依次插入逆转录病毒载体构建重组逆转录病毒载体,将重组质粒包装后,感染幼仓鼠肾细胞BHK-21。研究结果表明:绿色荧光蛋白和口蹄疫病毒衣壳前体蛋白在BHK-21细胞中能稳定表达。口蹄疫病毒衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。
Jeanette Neumann等[16]通过构建了一种特殊的逆转录病毒包装细胞株,并将编码HIV-1型薄膜蛋白基因插入到逆转录病毒载体pMgSLDelS,重组质粒经包装细胞包装成假病毒,感染人类和猕猴的CD4阳性细胞,经过流式细胞仪分析成功诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫,进一步证实了用逆转录病毒载体携带有治病抗原的基因可以诱导相应的抗体,为研制艾滋病疫苗,预防艾滋病的发生奠定了基础。He Xiao-Song等[17]将编码乙肝分子表面抗原和人类或鼠的B7-1分子基因(一种细胞表面蛋白,用于T细胞激活的一种辅助刺激因子)分别与逆转录病毒载体和腺病毒载体相连,包装后感染人细胞A549,结果表明:两种抗原蛋白都得到了有效的表达,为乙型肝炎DNA疫苗的研制奠定了基础。
基因工程亚单位疫苗及基因工程DNA疫苗面临的一个共同问题是:由逆转录病毒载体所携带的基因整合到宿主基因的染色体上后所表达的蛋白,在机体免疫系统的作用下会很容易被快速的清除,降低了疫苗的免疫效果,为解决此问题,人们可以应用融合蛋白方法,即将一种宿主免疫细胞识别的蛋白因子,如CD47白细胞分化抗原[18],与我们所要表达的目的蛋白融合,使表达的蛋白含有可以被机体识别的小分子蛋白,能够被宿主细胞识别而不被清除。
2.2.2 用于组织工程
组织工程就是应用生命科学与工程学的原理与技术,在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上,研究、开发用于促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态恢复的生物材料,可用于组织修复、重组,再生以及替换。
有许多生长因子,如骨形成蛋白(BMPs)、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等可以刺激骨骼的生长[19],其中,骨形成蛋白的应用尤其广泛。王树军[20]等将猪的Fasl基因与逆转录病毒载体连接,成功构建重组逆转录病毒载体,并在转染的软骨细胞上高表达具有生物学活性的FasL,为建立同种异体软骨细胞移植的免疫耐受提供了实验依据。周海斌等[21]将胰岛素样生长因子基因与逆转录病毒载体连接,并在骨髓基质干细胞获得有效表达,这样转染后的骨髓基质干细胞不仅可提供了生长因子的局部来源,而且提供了成骨前体细胞,有助于骨愈合并使其在人骨髓基质干细胞有效表达,为骨缺损的基因治疗提供了有效的手段。
2.3 RNA干扰
简单地说,RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达,因此,RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。
逆转录病毒载体介导的RNAi技术可以长期稳定表达siRNA,从而实现基因的稳定沉默。刘超武等[22]人将肌肉生长抑制素的干扰序列表达盒hU6-siGDF-8与逆转录病毒载体连接,构建重组质粒,经包装细胞包装后,收集病毒粒子感染肌成纤维细胞C2C12,结果表明,GDF-8基因的表达得到了有效地抑制,同时细胞生长增殖没有受到影响,因此基于逆转录病毒载体的干扰系统可以用于肌肉生长调节的相关研究,对于肌肉萎缩症的治疗具有指导作用。Makoto Yamagishi等[23,24]用逆转录病毒载体携带shRNA特定的靶向序列在HIV-1启动子序列,可以在体外有效地延长病毒复制的转录基因沉默,对于HIV-1疾病的治疗有重要的作用。此外,逆转录病毒介导的RNAi技术在治疗神经疾病[25]等方面亦有很大的潜力。
3 问题
目前,逆转录病毒载体虽然被广泛应用于基因治疗、目的基因传递等方面,但其还是存在着诸多问题,主要有五个方面。
3.1 对环境条件要求高
包装重组后的逆转录病毒对环境要求较高,在不适条件下,重组逆转录病毒会失去其感染能力,因此,保持逆转录病毒的存在最适条件是非常关键的。有研究表明,逆转录病毒对温度(在37℃下重组逆转录病毒的感染力会减弱。所以通常情况下人们会在4℃下操作,效果较好)、pH值(研究发现在偏酸或是偏碱的情况下,逆转录病毒的感染力都会减弱。有研究发现,最适pH值范围是pH 5.5~8.0),渗透压、盐浓度、包装细胞株的类型都有较高要求[26]。另外,不同的逆转录病毒载体经过包装后产生的逆转录病毒对于以上各种条件的要求也不同,因此,对于不同的载体都要熟悉其最适生长条件。
3.2 插入诱变
逆转录病毒载体经过包装后产生的病毒插入到基因组中可引起基因突变。如上述所提到的,在11例患有X-重度免疫缺陷症的病人中,有3例患者在接受了逆转录病毒基因治疗3年后患了白血病。这种插入突变与逆转录病毒的插入位点有关。近些年研究者也一直在对逆转录病毒的插入位点进行研究,逆转录病毒在宿主基因组上的整合与病毒的整合酶有紧密的联系,有研究者将病毒整合酶与识别宿主基因特殊位点的蛋白组成融合蛋白,提高了插入靶向性,应用此方法可以减少基因突变的产生[27]。
3.3 癌基因激活
由于逆转录病毒载体的插入,使原来存在于宿主染色体上的癌基因被激活,而引起癌症,也是逆转录病毒载体应用于基因治疗的弊端,有报道表明在动物模型及人类的基因治疗中,由逆转录病毒转导的造血干细胞发生癌症肿瘤的机会上升[28]。这就需要我们能够找出合适的插入为点,并能够准确地进行定位插入,避免插入后引起癌基因的激活。
3.4 引起机体免疫反应而被清除
逆转录病毒载体用于基因治疗最终会用于体内,由于机体内复杂的免疫环境,有可能当逆转录病毒进入体内,在没有整合到染色体上时就被清除,这样就影响了重组逆转录病毒所携带的目的基因的表达,而起不到基因治疗的效果。因此,逆转录病毒载体要有较低的免疫原性[29]。基于此原因,在设计逆转录病毒载体时可以使其携带有某种能够被宿主识别的蛋白因子基因并得到表达,以减小免疫反应对其的清除。
3.5 错配率高
逆转录病毒用于基因治疗的另一个不利之处在于其在逆转录过程中有很高的错误率,这种逆转录过程错误率可导致在基因治疗过程中宿主细胞程序性死亡或基因突变[30]。如何提高逆转录过程碱基的准确配对,也是我们今后研究的一个重点。
4 应用前景
目前,基因治疗被越来越多应用于疾病治疗,而作为基因治疗中不可或缺的目的基因运载工具,逆转录病毒载体以其能够稳定,永久地整合到宿主染色体上,并稳定表达目的基因,日益受到更多的科研工作者的关注。但由于目前我们所涉及的领域更多的还是体外研究,当逆转录病毒载体用于体内治疗时就会更多地涉及到应用安全问题、载体产物问题、基因在寄主细胞中的表达控制问题等,如:逆转录病毒载体在经过包装之后,其病毒感染力会降低,其相应的变化机制还不很清楚,这也是逆转录病毒载体在今后应用方面的一个瓶颈,如何提高病毒的感染效力,并持久稳定地表达目的基因是今后研究逆转录病毒载体应用的一个重要内容。因此,虽然逆转录病毒载体介导的基因治疗有着广阔的应用前景,但我们必须慎重对待,不能只追求其医疗作用,而忽略其危害。
当前,逆转录病毒载体的应用多集中在基因治疗方面,而逆转录病毒载体的应用范围极其广泛,如我们可以在疾病疫苗研究方面多做研究,应用逆转录病毒载体的特性,用相应疾病的抗原基因构建表达载体,同时,可以对载体进行改造,减少机体对表达蛋白的免疫作用,提高目的基因的蛋白表达量。另外,国外已有学者将逆转录病毒载体应用于生殖细胞研究[31],其意义更加深远,也为逆转录病毒载体的研究打开了新思路,让机体从最初就形成某些疾病的抗体。易产生对疾病的永久免疫。
摘要：着重介绍逆转录病毒载体在基因治疗、外源基因表达、RNA干扰三方面的最新应用现状并对其应用前景进行展望,同时介绍了逆转录病毒载体存在的应用缺陷。
逆转录病毒 篇3
1 材料和方法
1.1 动物与细胞株
人胃癌细胞株MGC-803、PA317细胞株、NIH3T3细胞株购自中科院上海细胞库;pCMV-Cdx2-HA质粒、逆转录病毒载体pLXSN由本实验室保存;40只雄性鼠龄5～6周的裸小鼠(BALB/CA nu/nu)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证编号:scxk(京)2007-0001],购买后在广西医科大学动物实验中心饲养。
1.2 主要实验试剂
鼠抗人Cdx2多克隆抗体购自Bio Genex公司(美国),兔抗鼠IgG抗体购自KPL公司(美国),DMEM、脂质体LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司(美国),G418试剂、引物合成购自上海生物工程公司(中国),逆转录试剂盒购自大连Ta Ka Ra公司(中国)。
1.3 实验方法
1.3.1 重组逆转录病毒载体pLXSN-Cdx2的构建
以包含Cdx2基因全长的质粒pCMV-Cdx2-HA为模板进行PCR反应,回收1 000 bp左右的目的基因片段,将PCR产物和逆转录病毒载体pLXSN进行EcoR I和Bam HI双酶切、连接,连接产物转化感受态细菌,挑取阳性克隆扩增,扩增产物进行酶切鉴定。带有EcoR I(GAATTC)和Bam HI(GGATCC)酶切位点的Cdx2引物:上游5'-CGGAATTCGCCACCA TGTACGTGAGC-3',下游5'-CGGGATCCTCACTGG GTGACGGTGGG-3',长度为961 bp。
1.3.2 病毒滴度的测定
脂质体法将空载体pLXSN或重组体p LXSN-Cdx2转染PA317包装细胞,建立逆转录病毒载体包装细胞系PA317/EV或PA317/Cdx2,RT-PCR进行鉴定。Cdx2上游引物5'-CGCCGCAGAACTTCGTCA-3',下游引物5'-TC-CGCATCCACTCGCACA-3',长度为432 bp。分别收集不同稀释度的逆转录病毒载体包装细胞系PA317/EV或PA317/Cdx2的病毒液上清,感染NIH3T3细胞,G418筛选阳性克隆,Gimesa染色后镜下计数。病毒滴度=平均阳性克隆数×稀释倍数。
1.3.3 裸鼠人胃癌皮下瘤动物模型的建立
体外培养MGC-803细胞,培养、传代,调整细胞浓度为5×106个/m L,备用。取10只裸鼠接种0.2 m L(约1×106个细胞)细胞悬液于右背侧皮下,正常喂养。待皮下瘤生长至直径≥1 cm时将组织切下,剪成1～2mm3接种于另30只裸鼠单侧腋下。将30只裸鼠随机分为pLXSN-Cdx2组、空载体pLXSN组和对照组,每组10只,继续饲养。待所有裸鼠传代瘤最大径≥1 cm时,分别向3组动物的皮下瘤内隔天注射pLXSN-Cdx2病毒颗粒、pLXSN病毒颗粒或生理盐水0.2 m L,共7次。
1.3.4 裸鼠人胃癌皮下瘤生长情况
每天注射前注意裸鼠各种生活变化,每两天用游标卡尺测量瘤体的短径(a)与长径(b),并计算瘤体体积(TV):公式TV=1/2×(a2×b)。第15 d脱颈椎处死裸鼠,切取肿瘤组织测量。为便于组间比较,计算相对瘤体体积(RTV):公式RTV=Tn/T0×100%(Tn为每次测量肿瘤的TV,T0为第1次测量肿瘤的TV),并绘制肿瘤生长曲线。
1.3.5 裸鼠人胃癌皮下瘤组织病理学观察
将上述所取的裸鼠皮下瘤组织以10%甲醛常规固定、石蜡包埋,HE染色后采用光镜观察其形态学变化。
1.3.6 半定量R T-PCR检测裸鼠人胃癌皮下瘤中Cdx2 mR NA的表达
用Trizol法提取肿瘤组织的总RNA,按逆转录试剂盒说明进行逆转录获取c D-NA,PTC 200型PCR仪(MJ Research公司,美国)扩增。Cdx2上游引物5'-CGCCGCAGAACTTCGTCA-3',下游引物5'-TCCGCATCCACTCGCACA-3',长度为432 bp。内参GAPDH上游引物5'-CCCATCAC CATCTTCCAG-3',下游引物5'-CCCCAGCCTTCTCC AT-3',长度为112 bp。反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,进行30个循环;最后72℃延伸10 min。将PCR产物经1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像获取的图片经Quantity One V462软件(Bio-rad公司,美国)进行分析,以目的条带与内参灰度值的比值反映Cdx2 m RNA的表达水平。
1.3.7 TUNEL法检测裸鼠人胃癌皮下瘤凋亡情况
按试剂盒说明书操作,随机选取不重复的10个高倍视野,计数各组凋亡细胞,并算出凋亡细胞占所观察细胞总数的百分比值,即凋亡指数AI。检测结果判断:以二氨基联苯胺(DAB)为底物,细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞;而正常非凋亡细胞和阴性对照照片核被苏木素复染呈蓝色,核相对较大,形态大小较为一致。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5和Origin 5.0统计软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 重组逆转录病毒载体pLXS N-Cdx2酶切鉴定结果
重组逆转录病毒载体pLXSN-Cdx2构建成功,酶切后得到Cdx2插入片段,长度约为961 bp;空载体pLXSN酶切后无此片段显示。见图1。
2.2 病毒滴度测定
通过G418共筛选出4株包含pLXSN-Cdx2的PA317包装细胞,即PA317/Cdx2,RT-PCR扩增出清晰而明亮的特异性条带,长度约为432 bp;而正常的PA317细胞则无此Cdx2特异性条带。见图2。分别收集两组包装细胞的病毒上清液,pLXSN组病毒滴度为3.0×105 CFU/m L,pLXSN-Cdx2组病毒滴度为2.4×105 CFU/m L。
2.3 裸鼠人胃癌皮下瘤生长情况
各组动物成瘤情况为pLXSN-Cdx2组8只、空载体pLXSN组7只、对照组7只。注射病毒后,如图3所示,pLXSN-Cdx2组裸鼠皮下瘤生长缓慢,肿瘤生长速度低于pLXSN组和对照组;裸鼠处死后,pLXSN-Cdx2组肿瘤体积为(14.15±2.17)mm3,明显低于pLXSN组和对照组的肿瘤体积(23.12±2.11)mm3和(25.54±2.37)mm3(P<0.05)。
2.4 裸鼠人胃癌皮下瘤的病理学观察
肉眼可见3组裸鼠人胃癌皮下瘤均呈椭圆形或分叶状生长,质地硬,切面灰白。光镜下可见移植瘤细胞形状不规则,大小不均一,核大而浓染,核浆比例明显增大,核异型性明显,有病理性核分裂像,确认所取组织为恶性肿瘤组织。见图4。
2.5 裸鼠人胃癌皮下瘤中Cdx2 mRNA的表达
pLXSN-Cdx2组皮下瘤组织在432 bp左右处出现较亮的特异性条带,而pLXSN组和对照组皮下瘤组织在432 bp处条带较暗,见图5;半定量RT-PCR结果表明,pLXSN-Cdx2组Cdx2 m RNA的表达量(2.71±0.65)高于pLXSN组(1.42±0.24)和对照组(1.25±0.21)P<0.05。
2.6 裸鼠人胃癌皮下瘤凋亡检测
pLXSN-Cdx2组、pLXSN组和生理盐水组的凋亡指数分别为(14.4±5.3)%、(7.6±2.2)%和(7.7±2.3)%,pLXSN-Cdx2组的凋亡率明显高于pLXSN组和生理盐水组(P<0.05)(见图6)。
3 讨论
尾型同源盒基因Cdx2主要通过介导Hox基因的表达而维护肠道细胞的正常形态。在成人,Cdx2表达仅局限于肠道的上皮细胞,它参与肠细胞发育过程中多个过程的调节,包括细胞增殖、分化、黏附、迁移以及癌变,尤其是在早期肠分化过程中起着重要作用。有研究显示,肠上皮细胞中Cdx2基因缺失或者表达受阻,将导致肠上皮进一步分化,即由鳞状上皮替代肠型上皮细胞,从而出现癌变[5]。ZHU等[6]发现,Cdx2能促进肝癌细胞凋亡,明显降低肝癌细胞体外生存能力,提示Cdx2具有抑制肝癌进展的作用。但有关Cdx2对胃癌影响的报道则较少。
逆转录病毒载体是目前应用最广泛、转基因效率最高的载体,它具有靶细胞多、不引起宿主细胞的插入突变等优点[7]。本研究中将外源基因Cdx2连接到逆转录病毒载体上,注入裸鼠皮下瘤中,观察其对裸鼠人胃癌皮下瘤生长的影响。结果显示:pLXSN-Cdx2组裸鼠皮下瘤中Cdx2 m RNA的表达增加,肿瘤生长速度和体积则明显低于空载体组及对照组。这说明转入的外源基因Cdx2在裸鼠人胃癌皮下瘤内过表达,并且促进了胃癌细胞的凋亡,抑制了瘤体的生长,这和本组早期的体外实验结果[8]相一致,Cdx2过表达能够抑制胃癌细胞增长,降低胃癌细胞的运动能力及侵袭性。并且还有实验[9]表明Cdx2能够抑制胃细胞异型增生及胃癌的发生,其主要是通过阻滞细胞周期于G1期[10],从而明显控制裸鼠胃癌的增殖与分化。SATAKE等[11]将Cdx2转染到TMK-1胃癌细胞中,亦观测到肿瘤细胞被大量阻滞在G0/G1期,凋亡增加,生长明显受到抑制。这些研究结果均与本实验的结论相一致。这些证据都表明,与在结直肠癌中一样Cdx2在胃癌细胞中所起的作用为抑制肿瘤生长。
Cdx2基因影响肿瘤细胞生长的具体作用机制尚不明确,但可能有以下几个方面:(1)当Cdx2基因在瘤体内过表达后,通过增强m RNA的表达稳定性而上调p21的表达活性[12],进而抑制β-连环蛋白或T细胞因子的转录活性,从而降低细胞周期蛋白D1的基因表达水平[13],减少其直接激活周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK4/6并与之结合成联合体来促进癌细胞生长的作用,并且还阻止了联合体结合、隔绝p21Cip1和p27Kip1有效激活CDK2的功能,使细胞停滞在G0/G1期,减少肿瘤细胞增殖[14];(2)瘤内Cdx2的过表达也可能引起pRb和P130蛋白的亚磷酸化,从而降低周期蛋白依赖性蛋白激酶的活性,起到减少细胞周期蛋白D1表达的作用,达到抑制瘤体生长的目的[15];(3)Cdx2基因还可能与人细胞周期蛋白D1启动子的邻位核因子κB结合位点D1-κB2结合而抑制其表达,进而降低细胞周期蛋白D1的转录活性、减少细胞DNA合成、促进肿瘤细胞凋亡[16]。
逆转录病毒 篇4
1 材料和方法
1.1 载体、菌株与主要试剂
含人神经生长因子的pAAV-SP质粒由美国教授Fred.Gage和Lynne Moore惠赠,KOD Plus高保真酶,KOD Plus Buffer,dNTPs,Mg Cl2,Ligation high连接酶,BamhⅠ,HindⅢ内切酶购自Toyobo公司;pEGFP-N1由本实验室保存(由本实验室郑亚东博士转赠,载体结构见图1);Lipofectamine 2000购自英骏公司;出生3～5 d的SD乳鼠6只(由华中科技大学同济医学院动物房提供,合格证号:SYXK2004-0028),DMEM/F-12购自Hyclon公司,卡那霉素、G418、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 人神经生长因子β基因的获取
以含人神经生长因子的pAAV-SP质粒为模板,PCR扩增NGFβ基因。PCR所用的上游引物为5'-CCAAGC TTGGATGTCCATGTTGTTCTAC-3',下游引物为5'-CGGGATCCTCAGGCTCTTCTCACAGC-3'。上下游引物分别含HindⅢ和Bam HⅠ内切酶酶切位点(由上海英骏公司合成),扩增产物约为750 bp。扩增条件为94℃5 min,94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,30个循环,72℃延伸10 min。反应结束后,取3μL反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察结果。
1.2.2 重组逆转录载体的构建及其鉴定
用DNA纯化试剂盒纯化PCR反应产物,步骤按试剂盒说明书进行。用HindⅢ和Bam HⅠ双酶切纯化后的PCR产物和EGFP-N1载体,用切胶回收的方法回收线性载体和目的片段,用Ligation high进行连接,按Ligation high说明书进行操作。将连接混合物常规转化感受态的DH5α,挑单克隆进行扩增,提取质粒做双酶切鉴定,酶切产物用0.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像系统观察结果。将质粒送上海英骏生物公司测序。
1.2.3 施万细胞的取材、纯化及鉴定
见参考文献[6]。
1.2.4 重组载体转染施万细胞及产物活性鉴定
根据lipofection2000转染试剂的说明书进行,转染24孔板,转染48 h后在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况并用400μg/m L的G418进行筛选,两周后用200μg/m L进行维持筛选。4周后用ELISA法测定2×105转染和未转染施万细胞分泌神经生长因子的量(步骤按博士德ELISA试剂盒说明书进行)。
1.3 统计学方法
用SPSS15.0统计软件分析,用两独立样本的检验来比较转染和未转染组NGF的表达量。
2 结果
PCR产物凝胶成像显示目的条带在750 bp左右,和预期的大小相一致。
由图2可见1条带在500和1 000 bp之间,条带较亮,为以AAV-SP为模板扩增的PCR产物(右侧),左边条带为D2000marker,分别为100 bp、250bp、500 bp、1 000 bp、1 500 bp和2 000 bp,最亮条带为1 000 bp。
重组质粒双酶切显示两个条带,大小与预期大小相符。
由图3可见两个单酶切和1个双酶切产物,双酶切产物大小在750 bp和4.5 kb左右,为正确的重组子,另外两条分别为HindⅢ和Bam HⅠ单酶切结果,片段大小在5.4 kb左右。最右侧为10 kb marker。
施万细胞转染后在荧光显微镜下观察见细胞有绿色荧光,见图4。ELISA检测2×105转染和未转染施万细胞分泌的神经生长因子水平,未转染细胞的24h分泌量为(83.22±31.85)pg,转染细胞的24h分泌量为(307.62±28.17)pg,浓度是未转染细胞的近4倍,两组比较有统计学差异(P<0.05),见图5。
图5示第1组为转染的施万细胞24 h表达NGF的量,第2组为未转染的施万细胞24 h表达施万细胞的量,两者比较,P<0.05,差异有统计学意义。
3 讨论
神经生长因子有α、β、γ3个亚基按α2βγ形式通过非共价键结合而成。β亚基为NGF的活性单位。NGF可以促进神经干细胞向神经元细胞的分化,并且可以促进神经轴突的再生,在神经系统的损伤修复和神经系统疾病治疗中发挥重要的作用[7]。神经生长因子可以促进神经干细胞向神经元细胞分化和轴突的生长,而且在突触形成中也发挥重要的作用[8,9,10]。在脊髓损伤后,NGF高亲和力受体TrkA表达增高要早于NGF表达的增高,如果能够在早期给予NGF治疗,可能能更好的保护受损伤部位的细胞,减少或避免细胞凋亡的发生[11]。
施万细胞在外周神经中可以形成髓鞘,并且可以分泌多种神经营养因子和细胞外基质,为神经损伤的修复和再生提供适宜的微环境[12]。研究表明,激活的施万细胞能够明显的促进脊髓损伤后大鼠的轴突再生和后肢运动功能的恢复[13]。
NGF为细胞旁分泌型细胞因子,在体外培养的施万细胞或是其他细胞均有表达。用ELISA法检测体外培养细胞的上清中NGF的含量,可以准确的反应NGF作用于周围细胞的浓度,为下面的研究提供依据。
逆转录病毒 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2005年10月-2013年11月《艾滋病综合防治信息系统》HIV/SIDS抗病毒治疗资料。将符合《国家免费艾滋病抗病毒治疗药物治疗手册》标准[1]。经患者本人同意, 治疗前签署免费抗病毒治疗知情同意书, 进行服药依从性教育, 且接受HAART治疗满1年的147例艾滋病病毒感染者确定为本次观察对象。其中男119例, 女28例, 男女比4.25:1;年龄17~73岁, 平均 (40.35±12.08) 岁;婚姻状况中未婚32例, 已婚或同居90例, 离异或分居16例, 丧偶6例, 不详3例;感染途径中输血1例, 单采血浆2例, 静脉吸毒3例, 同性传播62例, 异性传播76例, 尚不明确3例。观察期内无死亡病例。
1.2 方法
选用符合国家抗病毒治疗标准的方案, 选择一种非核苷类逆转录酶抑制剂 (NNRTI) 加2种核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTIs) , 初始方案共分为7组, 最终方案共分为9组。所用药物为:拉米夫定 (Lamivudine, 3TC) 、齐多夫定 (Zidovudine, AZT) 、司他夫定 (Stavudine, d4T) 、克力芝 (Lopinavir and Ritonavir, Kaletra) 、替诺福韦 (Tenofovir, TDF) 、奈韦拉平 (Nevirapine, NVP) 、依非韦伦 (Efavirenz, EFV) , 药物组合使用方案, 详见表1。服药方法:3TC, 300 mg, 1次/d;AZT, 300 mg, 2次/d;d4T, 30 mg, 2次/d;Kaletra, 200 mg, 50 mg/片, 2片, 2次/d;TDF, 300 mg, 1次/d;NVP, 14 d以前, 即导入期200 mg, 1次/d, 14 d后200 mg, 2次/d;EFV, 600 mg, 1次/d。
1.3 观察指标
治疗前后CD4+T淋巴细胞计数, 治疗1年后病毒载量。
1.4 统计学处理
应用SPSS 16.0统计软件进行描述性和单因素重复测量方差分析统计分析。
2 结果
2.1 抗病毒治疗情况
按照《艾滋病抗病毒治疗指南》规定结合治疗前体检结果、有无合并机会性感染等确定6种初始治疗方案, 治疗中根据药物副反应及耐药情况更换治疗方案, 最终治疗方案为9种。初始和最终方案均以NVP+AZT+3TC为主, 各治疗方案及其构成比见表1。
例 (%)
2.2 CD4+T淋巴细胞计数变化情况
147例患者治疗前CD4+T淋巴细胞计数为7~449个/μl, 平均 (212.72±108.25) 个/μl其中≤50个/μl者14例, 51~200个/μl者49例, ≥201个/μl者84例;治疗6个月后, CD4+T淋巴细胞计数为26~884个/μl, 平均 (336.95±165.55) 个/μl, 其中≤50个/μl者1例, 51~200个/μl者32例, ≥201个/μl者114例;治疗12个月后, CD4+T淋巴细胞计数为26~1045个/μl, 平均 (344.81±169.28) 个/μl, 其中≤50个/μl者2例, 51~200个/μl者30例, ≥201个/μl者115例;各时间段CD4+T淋巴细胞计数比较, 结果有统计学意义 (F=109.99, P=0.000) , 详见表2。
2.3 病毒载量的检测结果
HAART12个月后, 病毒载量检测结果为HIVRNA<50copies/ml者115例 (78.23%) , 50~1000 copies/ml者6例 (4.08%) , >1000 copies/ml者26例 (17.69%) 。
3 讨论
艾滋病 (AIDS) 是人类免疫缺陷病毒 (HIV) 侵入人体后引起的以特异性免疫功能受损为主要特点的全身性疾病。最终因感染者免疫功能部分或完全丧失, CD4+T淋巴细胞数量减少, 继发机会性感染和肿瘤等死亡。HAART治疗虽不能根除体内的HIV, 但可使被HIV破坏的免疫功能获得恢复或部分恢复, 而使艾滋病患者长期存活[2]。临床上主要是根据CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量的检测来了解抗病毒治疗的效果[3]。本组147例患者CD4+T淋巴细胞计数在HAART治疗6个月后均值为 (336.95±165.55) 个/μl, 较基线平均上升124.23个/μl, 治疗1年后CD4+T淋巴细胞均值为 (344.81±169.28) 个/μl, 较治疗6个月后平均上升7.86个/μl, 3次CD4+T淋巴细胞计数经单因素重复测量方差分析差异有统计学意义 (P=0.000) 。结果表明经抗病毒治疗后CD4+T细胞数在6个月内增加最快, 以后增加缓慢, 经HAART治疗后, HIV可以快速有效的得到控制, 使破坏了的免疫系统得到一定的重建[4]。
根据Hill等[5]报道, 病毒载量低于检测下限 (<50 copies/ml) 即达到病毒学治疗目标, 可以作为治疗终点。本次观察147例治疗患者, 经HAART12月后, 有78.23%的患者病毒载量<50copies/ml, 达到了病毒学治疗目标, 高于姚正林等[6]67.57%的结果, 但与刘小利等[7]的80.00%相仿, 可能与病毒载量的检测时治疗时间长短有关。17.69%的患者病毒载量>1000 copies/ml, 较汤恒等[8]的32.63%要低, 可能与抗病毒治疗监督管理, 患者治疗依从性及治疗时间等不同有关。文献[9]报道治疗后病毒载量的检测>1000 copies/ml时, 病毒耐药性增加, 这提示在抗病毒治疗过程中必须要注意对病毒载量的监测, 对于病毒载量>1000 copies/ml的患者须要进行耐药检测, 及时调整用药方案。
摘要：目的:评价HIV/AIDS高效抗逆转录病毒治疗 (HAART) 方案的疗效。方法:对治疗满1年的147例艾滋病病毒感染者的CD4+T淋巴细胞及病毒载量的检测结果进行统计分析。结果:HAART的患者CD4+T淋巴细胞在6个月后有了明显的升高, 6个月、12个月CD4+T淋巴细胞计数分别为 (336.95±165.55) 个/μl、 (344.81±169.28) 个/μl;HAART的患者病毒载量12个月后, 有78.23%的患者<50 copies/ml。结论:HAART疗效明显, 但在抗病毒治疗过程中必须要注意对病毒载量的监测, 对于病毒载量>1000 copies/ml的患者要进行耐药检测, 及时调整用药方案。
关键词：艾滋病,HAART,CD4+T淋巴细胞计数,病毒载量
参考文献
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[3]林旭东, 徐莲芝, 冯毅, 等.病毒载量和T淋巴细胞计数在HIV感染者临床治疗疗效观察中的应用[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2002, 16 (3) :211-214.
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[5]Hill A, Miralles D, Vangeneugden T, et al.Should we now adopt the HIV-RNA<50 copy endpoint for clinical trials of antiretroviral-experienced as well as naïve patients?[J].AIDS, 2007, 21 (12) :1651-1653.
[6]姚正林, 苏慧勇.148例AIDS患者抗病毒治疗疗效分析[J].传染病信息, 2009, 22 (6) :359-361.
[7]刘小利, 王少杨.HAART治疗20例艾滋病患者疗效评估[J].中国艾滋病性病, 2006, 12 (2) :101-116.
[8]汤恒, 鲁发先.湖北省2006年艾滋病抗病毒治疗耐药监测结果分析[J].公共卫生与预防医学, 2007, 18 (5) :26-28.
逆转录病毒 篇6
为了证明h RI是否是肿瘤抑制因子, 本研究将已构建的针对h RI基因的si RNA表达载体p KD-ds RI[6的H1 Promotor和MCS区段亚克隆至逆转录病毒载体p LNCX的MCS中, 获得有新霉素抗性的干扰载体p LNCX-p KD-ds RI, 为下一步探讨h RI抗肿瘤作用及抗肿瘤基因治疗的应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒p LNCX、E.coli DH5α 由大连大学医学院 (以下简称“我院”) 生物化学与分子生物学教研室保存;针对人核糖核酸酶抑制因子si RNA表达载体p KDds RI (图1) 由我院生物化学与分子生物学教研室构建。
限制性内切酶、DNA Marker、T4DNA连接酶购自Ta Ka Ra;DNA快速凝胶产物回收试剂盒购自博大泰克公司;琼脂糖、氨苄青霉素和链霉素购自华美生物公司;LB培养基购自Invitrogen/GIBCO;G418 和RTPCR kit购自BBI;CellfectinR购自Invitrogen;Trizol、DEPC H2O购自上海生物工程有限公司;核酸序列分析软件primer 5.0、质粒绘制软件plasmid 2.0。
1.2 方法
1.2.1重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建及鉴定
质粒pLNCX用HindⅢ单酶切质粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP补平、CIAP去除5'-磷酸末端后, 用乙醇沉淀法回收得到约6.2 kb的平末端的线性化、去磷酸化的载体大片断。质粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后, 经1%琼脂糖电泳切胶回收, 获得目的片断 (H1Promotor-dsRI) ;同样处理pKD, 获得目的片断 (H1Promotor-MCS) 。载体与片段用T4DNA连接酶连接、转化后, 获得重组载体pLNCX-pKD-dsRI。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI, 筛选得到正向连接的阳性克隆。挑取单克隆, 提取质粒, 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI, 筛选得到正向连接的阳性克隆。将酶切筛选阳性克隆送TaKaRa测序鉴定。
1.2.2 HepG2细胞培养和转染
细胞用DMEM培养基进行培养, 补加0.03%谷氨酰胺, 0.2%NaHCO3, 0.59%Hepes (pH 7.2) , 10%热灭活 (56℃, 30 min) 的胎牛血清及双抗 (青霉素和链霉素各100 U/mL) , 培养条件为5%的CO2, 培养温度37 ℃。 细胞按4×104个/孔铺板于24 孔板, 至90%~95%汇片时, 按CellfectinR说明书转染并分组:①空白组 (正常细胞) ;②空载体组 (p LNCX-p KD载体转染组) ;③干扰组 (p LNCX-p KDds RI载体转染组) , 每组2 复孔。每组质粒共用0.8 μg、脂质体2 μL, 转染后24 h, 换成含600 μg/m L G418的培养基培养选择2 周, 挑取G418 的抗性单克隆, 繁殖、扩增。
1.2.3 mRNA转录水平的检测
采用Trizol试剂分别提取各孔中细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒按照两步法进行RT-PCR反应。以总RNA逆转录合成的cDNA为模板进行PCR反应。用于检测内源表达的RT-PCR引物:5'-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3', 5'-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3', 上游引物位于hri基因的No.27 bp, 下游引物位于hri基因的No.559 bp, 产物长度约为527bp。β-actin引物5'-gctgtccctgtacgcctctg-3', 5'-tgccgatggtgatgacctgg-3', 产物长度约为300 bp。由Bio-Rad凝胶成像仪摄取图像, Image LabTM软件对各个条带测定其面积及灰度值。用目的基因条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的基因的相对表达强度。干扰率= (相对表达强度空载体组-相对表达强度干扰组) /相对表达强度空载体组。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 11.5 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组载体p LNCX-p KD-ds RI的构建及鉴定
2.1.1重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建
质粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后获得约618 bp的目的片断pkd-dsRI;同样处理pKD, 获得约534 bp的目的片断pkd (图2) 。质粒pLNCX用HindⅢ单酶切质粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP补平和CIAP去除5'-磷酸末端后, 回收得到约6.2 kb的平末端的线性化、去磷酸化载体大片断 (图3) 。
M1：DL2000 Marker；1：pKD-dsRI/PVUⅡ；2：pKD/PVUⅡ
M1:λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker;1:pLNCX/HindⅢ
2.1.2酶切鉴定阳性重组质粒pLNCX-pKD-dsRI-Neor和pLNCX-pKD-Neor
用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI, 得到5523 bp和1305 bp两条片段 (图4) ;同样处理pLNCX-pKD-dsRI, 得到5523 bp和1221 bp两条片段 (图5) 。
M1:DL2000 Marker;M2:λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker;1:pLNCX-pKD-neor/BamHⅠ+XhoⅠ
M1:DL2000 Marker;M2:λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker;1:pLNCX-pKD-dsRI-neor/BamHⅠ+XhoⅠ (5523 bp和1221bp) ;2:plasmid of pLNCX-pKD-neor
2.2 m RNA转录水平的检测
RT-PCR结果显示, 空白组hri基因的相对表达强度为0.790±0.014, 空载体组的相对表达强度为0.904±0.027, 干扰组的相对表达强度为0.361±0.048。与空白组和空载体组对比, 干扰组中hri基因均显著下调 (P < 0.05) , 抑制率大于80%。 可见, hri基因在转录后水平上分别被沉默 (图6) 。
M:DL2000 Marker;1:空白组中β-actin的表达;2:空白组中hri基因的表达;3:空载体组中β-actin的表达;4:空载体组中hri基因的表达;5:干扰组中hri基因的表达被干扰;6:干扰组中β-actin的表达
3 讨论
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是双链RNA (double-strand RNA, ds RNA) 介导的序列特异的转录后基因沉默 (posttranscriptional gene silencing, PTGS) 现象。 2001 年Elbashir等[7]证明合成的双链si RNA在哺乳动物细胞中可实现靶基因特异沉默作用, 由此RNAi被广泛用于特异基因的生物学功能的研究。 目前常用的si RNA的制备方法有化学合成法、体外转录法、RNase Ⅲ消化法、si RNA质粒表达载体法、si RNA表达盒细胞内表达法等[8], 其中, 质粒载体表达si RNA法, 最常利用哺乳动物细胞启动子RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子如鼠和人U6-sn RNA启动子、人RNase P (H1) 启动子、人Val-t RNA启动子等调控表达si RNA或sh RNA, 但存在转染效率低等问题。 由于逆转录病毒载体能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因组中, 并随细胞分裂而传给后代, 所以使用逆转录病毒载体转染可以获得长期稳定的RNA干扰效果[9]。 如Clontech的RNAi-Ready p SIREN-Retro Q-Ds Red-Ex press[10]、Oligoengine的p SUPER retro[11]、Ta Ka Ra的p SINsi系列载体、Ambion公司的p SilencerTM5.1 Retro[12等。 基于2002 年Xia[13]等报道, 细胞内RNA聚合酶Ⅱ依赖的启动子也能高效表达si RNA, Ambion公司的RNAi载体p SilencerTM4.1 -CMV neo利用改良Cytomegalomavirus (CMV) 启动子表达sh RNA, 也实现了稳定RNA干扰作用。
本研究在瞬时载体p KD-ds RI基础上, 将p KD的H1 promoter及其下游的MCS序列亚克隆至逆转录病毒p LNCX的MCS中, 得到耐受新霉素的稳定表达沉默h RI的载体p LNCX-p KD-ds RI-neor。双酶切鉴定及在Hep G2 细胞内RT-PCR结果表明了干扰h RI基因的稳定表达载体构建成功。这为以后研究hRI基因的抗肿瘤作用及在基因治疗中的应用奠定了基础。
摘要：目的 构建针对人核糖核酸酶抑制因子 (hRI) 的shRNA逆转录病毒载体, 为探讨hRI抗肿瘤作用机制打下基础。方法 用亚克隆法将目的片段pkd-dsRI和pkd从表达载体pKD-dsRI克隆到pLNCX上, 用双酶切筛选得到阳性克隆后, 用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中, 用800 mg/L G418筛选2周, 产生稳定的细胞克隆后, 用RT-PCR检测细胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表达的变化。结果 双酶切鉴定为阳性克隆。RTPCR表明, 对比空白组 (0.790±0.014) 和空载体组 (0.904±0.027) , 干扰组hri基因表达 (0.361±0.048) 明显下调, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 成功构建了针对hRI的shRNA逆转录病毒载体。
逆转录病毒 篇7
1 对象与方法
1. 1 对象选取2011 年8 月至2014 年3 月在我院接受艾滋病HAART的患者45 例, 所有患者来自门诊, 3 例曾接受住院治疗。其中男39 例, 女6 例, 年龄23 ~ 64 岁, 平均40. 1 岁。其中性传播途径感染40 例, 静脉注射吸毒感染4 例, 输血感染1 例。
1. 2 治疗方案根据患者病情选用治疗方案。12 例采用口服齐多夫定300 mg、2 次/d, 拉米夫定300 mg ( 次·d) , 奈韦拉平200 mg、2 次/ d。6 例采用口服齐多夫定300 mg、2 次/d, 拉米夫定300 mg ( 次·d) , 依非韦伦600 mg ( 次·d) 。22 例采用口服替诺福韦300 mg ( 次·d) , 拉米夫定300 mg ( 次 · d ) , 依非韦伦600 mg ( 次·d) 。5 例采用口服替诺福韦300 mg ( 次 ·d) , 拉米夫定300 mg ( 次·d) , 奈韦拉平200 mg、2 次/ d。
2 结果
治疗后观察发现, 45 例患者均出现药物不良反应, 经对症处理及护理或更改方案后症状均得到缓解, 患者能继续接受HAART。主要不良反应为胃肠道反应, 发生率82. 22 % ; 其次为皮疹, 发生率为64. 44 % 。见表1。
3 护理措施
3. 1 心理护理因艾滋病预后不好, 社会对艾滋病的恐惧与歧视态度, 做好对艾滋病患者的心理护理尤为重要。建立良好的护患关系, 尊重患者人格, 争取家属及亲友的支持, 促进患者间良好的交流; 尊重患者的隐私。
3. 2 胃肠道反应的护理食欲减退、恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应是出现最早、最常见的不良反应, 主要与艾滋病防护药 ( azidothymidine AZT) 、奈韦拉平NVP有关, 多数患者服药后1 ~ 2 周出现胃肠道反应, 主要与药物损害胃肠道黏膜上皮细胞有关。建议患者少食多餐, 进食清淡易消化食物, 避免高脂、辛辣或奶制品。重者可遵医嘱使用止吐药物。腹痛者予局部热敷或解痉药物。大部分患者消化道症状随着时间延长逐渐好转[2]。
3. 3皮疹的护理皮疹一般出现于服药后1 周至4 个月时, 临床表现为全身对称性红斑、丘疹、斑丘疹伴有瘙痒, 出现皮疹时可延长用药导入期, 症状轻者嘱患者保持皮肤清洁、干燥, 穿棉质宽松衣裤, 避免阳光暴晒、使用碱性沐浴用品, 以免刺激皮肤。伴瘙痒者嘱患者勿抓挠, 给予温水擦身, 或遵医嘱予炉甘石洗剂涂擦。必要时遵医嘱使用抗过敏药物, 一般口服迪皿5 mg/d, 3 次/d, 观察皮疹消退情况。严重者可暂停用药, 酌情使用糖皮质激素类药物, 无效者可更改治疗方案。
3. 4四肢麻木、疼痛的护理于服药后2 ~ 4 周出现症状。当患者四肢疼痛麻木时, 可用温水浸泡, 进行肢体按摩, 使用神经营养药物如各种复合维生素、维生素B等可帮助减轻症状。若症状未见好转应立即告知医生, 遵医嘱调整治疗方案。
3. 5 高脂血症的护理高脂血症一般于用药后10 个月出现, 各药物组合均可能引起高脂血症。护士应告知患者饮食上应摄取低胆固醇、低饱和脂肪酸食物, 并适当补充含多不饱和脂肪酸丰富的食物, 增加蛋白质摄入量, 多吃新鲜蔬菜及水果, 戒烟、酒, 必要时可适当使用降脂药如辛伐他汀。
3. 6肝功能异常一般在用药后3 个月易出现肝功能损伤表现, 主要为乏力、纳差、厌油腻、尿黄等。初期可表现为恶心、呕吐、腹痛和腹胀等, 应嘱患者多注意休息, 避免熬夜, 禁烟酒以及进食辛辣等刺激性食物, 饮食上以少量多餐为宜, 并遵医嘱予保肝药物治疗。
3. 7 骨髓抑制的护理骨髓抑制多由AZT引起, 主要表现为贫血或白细胞减少、血小板降低等。艾滋病患者免疫力低, 护理人员应指导患者增强自我防护意识, 注意个人卫生, 做好口腔护理和皮肤清洁。必要时可遵医嘱给予铁剂、利血生、鲨肝醇等药物治疗[3], 严重者可暂停用药或更换方案。
4 小结
艾滋病护理工作已从对多种晚期致命性并发症的处理及临终关怀转变为积极的抗病毒治疗的护理支持。HAART能减轻感染机率, 提高患者生活质量, 延长患者生命, 但抗病毒药物的不良反应给患者再次带来生理上的伤害, 从而使患者失去治疗信心。本文报告说明及时进行针对性的护理措施能降低药物不良反应, 提高患者的生活质量。护理人员应向患者说明按时、足量服药及坚持终身服药的重要性, 并帮助患者建立健康的生活方式, 杜绝艾滋病的三大传播途径。并且告诉患者定期随访的必要性。
参考文献
[1]陈谐捷, 贾卫东, 谭行华, 等.高效联合抗反转录病毒治疗对艾滋病患者生存质量的影响[J].实用医学杂志, 2011, 27 (19) :3498-3501.
[2]陈秀敏, 张丽, 张敏, 等.60例多样化护理干预对抗逆转录治疗致消化道不良反应的影响[A].2014年河南省传染病护理研究进展与临床实践学术会议论文集[C].2014:3.